Isolierung und Charakterisierung kleiner extrazellulärer Bläschen aus infrapatellaren Fettpads bei Arthrosepatienten

Zusammenfassung

ZUSAMMENFASSUNG Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Arbeitsablauf zur Isolierung und Charakterisierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) aus infrapatellären Fettpad-Geweben von Arthrosepatienten.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs), insbesondere kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), definiert als Vesikel kleiner als 200 nm, dienen als wesentliche Vermittler der interzellulären Kommunikation und werden von nahezu allen Zelltypen in verschiedene biologische Flüssigkeiten freigesetzt. Das infrapatellare Fettpolster (IPFP) ist eng mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Kniearthrose (OA) verbunden. Standardisierte Methoden zur direkten Isolierung von sEVs aus IPFP-Explants bleiben jedoch begrenzt. Wir präsentieren ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von sEVs, die aus IPFP-Geweben stammen, die von OA-Patienten gewonnen wurden. Das aus IPFP-Gewebekulturen gewonnene konditionierte Medium wird sequentiell durch langsame Zentrifugation von Zellen und Ablagerungen befreit, gefolgt von Ultrazentrifugation zur Anreicherung von Vesikeln im sEV-Größenbereich. Die resultierenden Vesikel werden anhand minimaler Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln (MISEV2023)-Empfehlungen charakterisiert, wobei eine Reihe repräsentativer Proteinmarker über verschiedene funktionelle Kategorien hinweg verwendet wird: CD63 als membranassoziiertes Tetraspanin, ALIX und TSG101 als zytosolische Proteine, die an der Biogenese beteiligt sind, vermittelt durch die Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT)-Maschinerie, und Calnexin als endoplasmatisches retikulum-residentes Protein zur Überwachungspotenzial nichtvesikulare Kontamination. Dieser Workflow liefert klar definierte sEV-Präparate, die für nachgelagerte Anwendungen wie funktionelle Assays oder proteomische Profilierung in der Arthroseforschung geeignet sind.

Einleitung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind ein heterogener Subtyp von extrazellulären Vesikeln, die laut der von der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) vorgeschlagenen operativen Klassifikation in den minimalen Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln (MISEV2023) als Vesikel definiert sind, die typischerweise kleiner als 200 nm im Durchmesser¹ sind. sEVs werden von nahezu allen Zelltypen in biologische Flüssigkeiten freigesetzt und haben aufgrund ihrer wesentlichen Rolle als Vermittler interzellulärer Kommunikation sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten zunehmende Aufmerksamkeit erregt^{. 2,3}.

Die Membran der sEVs ist mit mehreren funktionellen Proteinen angereichert. Unter ihnen sind Tetraspanine wie CD63 mit der Organisation der Vesikelmembran und Fusion⁴ assoziiert. Darüber hinaus sind zytosolische Proteine, die mit dem endosomalen Sortierkomplex für den Transport (ESCRT) assoziiert sind, wie ALIX und TSG101, integraler Bestandteil der sEV-Biogenese und -Sekretion. Daher dienen sie als verlässliche Marker zur Bestätigung des endosomalen Ursprungs der isolierten Vesikel ^5,6.

Das infrapatellare Fettpad (IPFP) wurde als aktives gelenkassoziiertes Gewebe erkannt, das eng mit dem Beginn und Fortschreiten der Arthrose (OA) verbunden ^ist7,8. Unter entzündlichen und degenerativen Bedingungen wird angenommen, dass sEVs, die aus IPFP abgeleitet werden, entzündliche Mediatoren und pathogene Signale transportieren und so zur Synovialentzündung und Knorpelabbau beitragen⁹. Die Charakterisierung von sEVs, die von IPFP-Geweben von OA-Patienten freigesetzt werden, kann daher wichtige Einblicke in krankheitsassoziierte interzelluläre Kommunikationsnetzwerke liefern.

Angesichts des zunehmenden Interesses an sEVs als molekulare Mediatoren und potenzielle therapeutische Wirkstoffe ist die Etablierung eines Isolationsansatzes mit hoher Erträge, hoher Reinheit und reproduzierbarer Isolation unerlässlich. Obwohl die differentielle Ultrazentrifugation eine der am weitesten verbreiteten^{Reinigungsstrategien} bleibt, sind Protokolle, die für Zellkultur-Supernatanten oder Biofluide optimiert sind, möglicherweise nicht direkt auf feste, fetthaltige Gewebe wie das IPFP anwendbar. Der hohe Lipidgehalt, die dichte extrazelluläre Matrix und die variablen enzymatischen Verdauungsbedingungen können die Wiederherstellung und Reinheit der Vesikel beeinflussen.

Die Gewebeexplantationskultur bietet einen physiologisch relevanten Ansatz, der die native zelluläre Architektur und Cell-Cell-Interaktionen erhält und gleichzeitig übermäßige enzymatische Störungen minimiert und so die Sammlung von sEVs unter nahezu natürlichen Bedingungen ermöglicht. Allerdings fehlt derzeit ein standardisierter Workflow, der speziell auf die Isolierung von sEVs aus IPFP-Explant-Kulturen zugeschnitten ist.

Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus infrapatellaren Fettpad-Explantkulturen von Arthrose-Patienten mittels differenzieller Ultrazentrifugation und bieten so einen reproduzierbaren methodischen Rahmen für nachgelagerte funktionelle und translationale Studien.

Protokoll

Die Verwendung von IPFP-Geweben von Arthrosepatienten in dieser Studie wurde vom Ethikausschuss des ersten Krankenhauses der Hebei Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer [2024] 018). Die Probenentnahme erfolgte innerhalb des genehmigten Zeitraums, und die schriftliche informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern vor der Gewebeaufnahme eingeholt.

1. Herstellung von Medium und Lösungen

1. Bereiten Sie 500 ml exosomen-depleiertes vollständiges DMEM/F12-Medium vor, indem Sie 445 mL basales DMEM/F12-Medium, 50 mL exosomfreies fetales Rinderserum (10 %) und 5 ml Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B (100 U/mL, 100 μg/mL bzw. 0,25 μg/mL) mischen. Filtersterilisieren Sie durch einen 0,22 μm-Filter.
2. Bereiten Sie den Western Blot Running Buffer vor, indem Sie 950 ml destilliertes Wasser (dH₂O) mit 50 mL 20x Running Buffer (Tris/MOPS/SDS) mischen.
3. Bereiten Sie den Western Blot Transferpuffer vor, indem Sie 800 mL dH_2Omit 100 mL 10x Transferpuffer und 100 mL absolutem Ethanol mischen.
   HINWEIS: Dieser Schnellübertragungspuffer wurde speziell für den Hochstrom-Nasstransfer (400 mA) bei Raumtemperatur optimiert. Aufgrund der geringen Wärmeentwicklung ist für Transferdauern unter 45 Minuten kein Eisbad erforderlich, da gezeigt wurde, dass es eine hohe Transfereffizienz für Proteine im Bereich von 10–250 kDa ermöglicht.
   VORSICHT: Absolutes Ethanol ist brennbar. Behandle sie in einem gut belüfteten Bereich und meide Wärmequellen.
4. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 50 ml 20 x Essel (200 mM Tris und 3 M NaCl bei pH 7,5–7,6) und 2 mL Tween-20 mit 950 mL dH₂O mischen.
5. Bereiten Sie eine chemilumineszierende Arbeitslösung vor, indem Sie gleiche Mengen Luminol/Enhancer-Lösung und Peroxidpuffer mischen (etwa 0,1 ml Arbeitslösung pro Quadratzentimeter Membran werden benötigt).
   VORSICHT: Chemilumineszente Substrate können reizend sein. Trage Handschuhe und Augenschutz. Entsorgung von chemischen Abfällen gemäß den örtlichen institutionellen Vorschriften.

2. Herstellung von IPFP-Gewebe und Sammlung von konditioniertem Medium

1. Waschen Sie frisch entnommenes IPFP-Gewebe (ca. 10 g) dreimal mit 50 ml vorgekühltem PBS pro Wasch durch sanftes manuelles Rühren im Zentrifugenrohr, um Restblut gründlich zu entfernen.
2. Zerkleinern Sie das IPFP-Gewebe in Stücke von etwa 2 mm x 2 mm x 2 mm mit steriler Schere oder einem Skalpell.
3. IPFP-Gewebestücke in T175-Kolben übertragen. Füge 50 ml exosomen-depleiertes DMEM/F12-Komplettmedium hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden und sanfter Bewegung.
4. Sammeln Sie das DMEM/F12-Komplettmedium (d. h. konditioniertes Medium) in 50-mL-Röhren auf Eis. Filtern Sie durch ein 70-μm-Sieb, um Gewebereste zu entfernen.

3. Isolierung von sEVs mittels differentieller Ultrazentrifugation

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte bei 4 °C oder auf Eis aus.

1. Anfängliche Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung von Geweberesten
   1. Zentrifugiere das konditionierte Medium bei 300 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie vorsichtig den Überstandsstoff auf und übertragen Sie ihn in neue 50-mL-Zentrifugenröhren.
   2. Zentrifugieren Sie das Überstandsmittel bei 3.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie das Supernatant ein und geben Sie es in neue Röhren, wobei das Pellet nicht gestört wird.
2. Zwischenzentrifugation und Filtration.
   1. Zentrifugieren Sie den Überstandsstoff bei 10.000 x g für 30 Minuten bei 4 °C.
   2. Sammeln Sie den Überstandsstoff auf und filtern Sie ihn durch einen 0,22 μm Vakuumfilter, um größere Vesikel und Schadstoffe zu entfernen.
3. Erste Ultrazentrifugation: sEV-Pelleting.
   1. Das gefilterte Überstand wird in 40-mL-Polycarbonat-Zentrifugenröhren übertragen.
   2. Ultrazentrifugieren Sie die Proben bei 110.000 x g für 70 Minuten bei 4 °C mit einem Rotor mit festem Winkel (k-Faktor = 70). Entfernen Sie vorsichtig das Überdeckmittel mit einer Pipette.
   3. Die Kugel wird in 10 ml vorgekühltes, steriles PBS wieder suspendiert. Filtern Sie die resuspendierte Lösung durch einen 0,22 μm Spritzenfilter, um die Entfernung aller verbliebenen Aggregate sicherzustellen.
4. Zweite Ultrazentrifugation: sEV-Reinigung
   1. Ultrazentrifugieren Sie die Federung erneut bei 110.000 x g für 70 Minuten bei 4 °C mit dem festen Winkelrotor (k-Faktor = 70).
   2. Entsorge das Supernatant vorsichtig und lasse das sEV-Pellet am Boden des Rohrs. Die letzte sEV-Kugel in 200 μL sterilem PBS wieder suspendieren.
   3. Teilen Sie die sEV-Federung in 20 μL Aliquots, um Schäden durch wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C für den langfristigen Gebrauch.

4. Charakterisierung von sEVs durch Western-Blot-Analyse

1. Bereite die sEV-Proteinproben vor.
   1. Mischen Sie das sEV-Pellet (ab Schritt 3.5.2) mit 80–120 μL RIPA-Lysepuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitoren.
      HINWEIS: Ziel ist ein Verhältnis von etwa 1 μL RIPA-Puffer pro 0,5–1,0 μg geschätztes Protein. Eine endgültige Proteinkonzentration von mindestens 1,0 μg/μL wird empfohlen, um eine effiziente elektrophoretische Trennung und eine hochwertige Signalerkennung während der Western-Blot-Analyse sicherzustellen.
      VORSICHT: Der RIPA-Puffer enthält Waschmittel und Reizstoffe. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung.
   2. Wirbeln Sie die Mischung kurzzeitig und inkubieren Sie die Proben 15–30 Minuten lang auf Eis mit sanftem Schaukeln.
      HINWEIS: Eine gründliche Mischung in diesem Stadium ist entscheidend für eine vollständige Membranstörung und optimale Proteinfreisetzung. Unzureichendes Vortexen kann zu unvollständiger Lyse und inkonsistenten Proteinkonzentrationen zwischen den Replikaten führen.
   3. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000–14.000 x g für 10–15 Minuten. Sammle das Supernatant vorsichtig ein.
   4. Bestimmen Sie die gesamte Proteinkonzentration des sEV-Lysats mit einem hochsensitiven Bicinconininsäure-(BCA)-Proteinassay.
      HINWEIS: Ein hochsensitiver BCA-Test wird dem Standard-BCA-Test für extrazelluläre Vesikelproben vorgezogen, da der niedrigere Nachweisbereich (0,5–20 μg/mL) eine genaue Quantifizierung der typischerweise niedrigen Proteinkonzentrationen aus gereinigten sEV-Präparaten ermöglicht. Führen Sie den Test gemäß dem Kit-Protokoll durch.
2. Western Blot Analyse.
   1. Mischen Sie die Proteinproben mit einem 5-fachen SDS-PAGE-Sample-Loading-Puffer.
      HINWEIS: Für die CD63-Detektion bereiten Sie Proben mit einem nicht reduzierenden 5x-Ladepuffer (ohne β-Mercapttoethanol) vor und inkubieren Sie bei 70 °C für 10 Minuten. Diese Bedingungen erhalten konformationelle Epitope und verhindern hitzeinduzierte Aggregation dieses Tetraspanin-Proteins. Für andere Marker, darunter ALIX (ALG-2-interagierendes Protein X), TSG101 (Tumor-Susceptibilitätsgen 101) und Calnexin, bereiten Sie Proben mit einem reduzierenden 5x-Ladepuffer mit 10 % β-Mercapttoethanol vor und erhitzen Sie bei 95 °C für 5 Minuten, um eine vollständige Proteindenaturierung sicherzustellen.
   2. Laden Sie die vorbereiteten Proben (typischerweise 20–40 μg Gesamtprotein) in ein vorgefertigtes Gradientengel (4%–12%).
   3. Laden Sie den Molekulargewichtsmarker des Proteins gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den zugewiesenen Brunnen.
   4. Führe das Gel in einem laufenden Puffer mit einer konstanten Spannung von 100 V.
   5. Setzen Sie den Lauf 1–1,5 Stunden fort oder bis der Ladefarbe den Boden des Gels erreicht.
      HINWEIS: Die Betriebszeit kann je nach Elektrophoresesystem und Gelanteil variieren.
   6. Übertragen Sie die Proteine vom Gel auf PVDF-Membranen mit einem feuchten Transfersystem bei 400 mA für 30 Minuten.
      HINWEIS: Die Übertragungsdauer kann je nach Marke des verwendeten Übertragungspuffers variieren.
   7. Blockieren Sie die Membranen in einem proteinfreien Blockpuffer, der in tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,2 % Tween-20 (TBS-T) für 30 Minuten bei Raumtemperatur und sanfter Bewegung hergestellt wird. Der Blockpuffer wird ohne Serumproteine, Biotin oder phosphorylierte Proteine formuliert, um unspezifische Bindungen und Hintergrundinterferenzen zu minimieren.
   8. Inkubieren Sie die Membran mit spezifischen primären Antikörpern, die in einem serumfreien Antikörperverdünnungspuffer mit proteinbasierten Stabilisatoren und antikörpererhaltenden Zusatzstoffen bei 4 °C über Nacht (12–16 Stunden) und sanfter Bewegung verdünnt werden.
   9. Waschen Sie die Membranen in einem Waschpuffer (TBST, der 0,2 % Tween-20 enthält) unter sanftem Rühren auf einem Shaker.
   10. Inkubieren Sie die Membranen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit sanfter Bewegung.
   11. Waschen Sie die Membranen erneut im Waschpuffer unter sanftem Rühren auf einem Shaker.
   12. Visualisieren Sie die Proteinbänder mit chemilumineszentem Substrat.
       VORSICHT: Chemilumineszente Substrate können Haut und Augen reizen. Tragen Sie geeignete Handschuhe und Schutzbrillen. Entsorgen Sie das Substrat gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle.

5. Charakterisierung von sEVs durch Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

1. Schalten Sie den Nanopartikel-Tracking-Analysator und das Spritzenpumpenmodul gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und lassen Sie das System mindestens 30 Minuten vor der Messung ausgleichen.
2. Die EV-Proben werden vorsichtig auf Eis aufgetaut und sie in steriler, partikelfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um eine optimale Partikelkonzentration innerhalb des empfohlenen Messbereichs (ca. 1 x 10^{8 bis 1} x 10^{9 Partikel} /mL) zu erreichen.
3. Füllen Sie 1 ml der verdünnten Probe in eine sterile Spritze und injizieren Sie die Probe langsam in die Messkammer, wobei keine Luftblasen entstehen.
4. Stellen Sie die Kamerapegel und den Fokus an, um einzelne Teilchen mit Brownscher Bewegung klar zu visualisieren.
5. Nehmen Sie drei Videos mit einer Dauer von 60 Sekunden pro Probe unter konstanten Durchflussbedingungen mit der Spritzenpumpe auf, um eine gleichmäßige Partikelverteilung sicherzustellen.
6. Analysieren Sie die aufgenommenen Videos mit NTA-Software mit einem Erkennungsschwellenwert von 12, der Unschärfegröße auf Auto und der maximalen Sprungdistanz auf Auto.
7. Generiere Partikelgrößenverteilung und Konzentrationsprofile mithilfe der automatisierten Analysefunktion der Software.
8. Exportieren Sie die Rohdaten, Partikelgrößenverteilungsdiagramme und Konzentrationsmessungen für weitere statistische Analysen.
9. Reinigen Sie die Messkammer gründlich mit sterilem, partikelfreiem Wasser, gefolgt von 70 % Ethanol, und spülen Sie erneut mit sterilem, partikelfreiem Wasser, um Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden.

6. Charakterisierung von sEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

1. Verwenden Sie kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter mit 200 Gittern. Führen Sie eine Glüutentladung auf den Gittern für 30 Sekunden mit einem Glühentladungssystem durch, falls verfügbar.
2. Trage 10 μL der sEV-Federung (in steriler, gefiltertem PBS) auf das Gitter auf und inkubiere 2–5 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Entferne überschüssige Flüssigkeit, indem du vorsichtig mit Filterpapier den Rand des Gitters berührst.
4. Waschen Sie das Gitter, indem Sie die mit Probe belastete Oberfläche nacheinander auf drei separate Tropfen ultrareines Wasser legen.
5. Geben Sie 10 μL 2 % Phosphotungstiksäurelösung (pH 7,0) auf das Gitter und inkubieren Sie 1–2 Minuten bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: Phosphotungstische Säure ist ein ätzendes saures Reagenz, das Haut, Augen und Atemwege reizen kann. Führen Sie es gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Augenschutz. Entsorgung von verfärbten Abfällen und kontaminierten Materialien gemäß genehmigten Verfahren für gefährliche chemische Abfälle.
6. Entfernen Sie überschüssige Flecken mit Filterpapier und lassen Sie das Gitter mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur vollständig an der Luft trocknen.
7. Untersuchen Sie die Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop, das mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV betrieben wird.
8. Erfassen Sie repräsentative Bilder mit geeigneten Vergrößerungen, um die Vesikelmorphologie zu beurteilen.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) aus humanen infrapatellaren Fettpad-Geweben (IPFP) wurde durch multimodale Charakterisierung bestätigt.

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte, dass die isolierten Vesikel die charakteristische becherförmige Morphologie mit klar definierten Lipid-Doppelschichtmembranen aufwiesen, was mit den strukturellen Merkmalen der sEVs übereinstimmt (Abbildung 1)¹¹.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen reproduzierbaren und praktischen Arbeitsablauf zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) aus menschlichen infrapatellaren Fettpad-(IPFP)-Geweben mittels Explantkultur gefolgt von differenzieller Ultrazentrifugation. Die isolierten Vesikel wurden durch komplementäre Charakterisierungsmethoden validiert, darunter Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Western-Blot-Erkennung etablierter EV-Marker

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40-mL PET-Zentrifugenröhren	himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Polyethylenterephthalat, 26 x 90 mm
70 & Mikro; m Zell-Sieb	Beijing Lanjieke Technologie	560049	Zur Entfernung von Geweberesten
Anti-Alix-Antikörper	Shanghai Abways Biotechnologie	CY7215	sEV-positiver Marker
Anti-Calnexin-Antikörper	Shanghai Abways Biotechnologie	CY5839	Negativer Marker (ER-Kontamination)
Anti-CD63-Antikörper	Affinity Biosciences	DF2305	Tetraspanin-Marker
Anti-TSG101-Antikörper	Shanghai Abways Biotechnologie	CY5985	sEV-positiver Marker
BCA-Protein-Assay-Kit	Shanghai YaMei Biotechnologie	ZJ102	Zur Proteinquantifizierung
Zellkulturkolbe (T175)	NEST Biotechnologie	560229	Für IPFP-Explant-Kultur
Zentrifugenröhre (50 mL)	BIOFIL	560041	Für anfängliche Schritte mit niedriger Geschwindigkeit
Exosom-depletiertes fetales Rinderserum	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Für Gewebekultur
HRP-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Shanghai Abways Biotechnologie	AB0101	Sekundärer Antikörper gegen WB
Sofortiger Protein-Ladepuffer (Denaturieren, Reduzieren, 5&x;)	Shanghai YaMei Biotechnologie	LT101	Zur Proteindenaturierung
Micro BCA Protein-Assay Kit	Thermowissenschaftlich	23235	Zur Proteinquantifizierung
Millex-GP Filtereinheit (0,22 & Mikro; m)	Beijing Lanjieke Technologie	560360	Steril, für Vesikelfiltration
Nanopartikel-Tracking-Analysator	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Für Größen- und Konzentrationsanalyse
Omni-Flash Eisfreier Schnelltransferpuffer	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS201S	Für den Transfer von Western-Blot-Proteinen
Phosphotungstische Säure (2 %)	Sigma-Aldrich	P4006	Für TEM-Negativfärbung
Protein-Ladepuffer (Denaturierend, Nicht-Reduzierend, 5& fach;)	Shanghai YaMei Biotechnologie	LT103	Zur Proteindenaturierung
Proteinfreier schneller Blockpuffer (5 & fach);	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS108	Für blockieren Sie die Membranen
RIPA-Lysepuffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Zur Extraktion von sEV-Proteinen
TBS(20×)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Zur Vorbereitung des Waschpuffers
Transmissionselektronenmikroskop	Hitachi	HT7800	Für morphologische Charakterisierung
Tris/MOPS/SDS-Elektrophoresepuffer	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS120	Für die Proteintrennung
Tween-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Zur Vorbereitung des Waschpuffers
Ultrazentrifuge	himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Hochgeschwindigkeits-Isolationssystem
Ultrasensitives chemilumineszentes Detektionsset	Shanghai YaMei Biotechnologie	SQ201	Zur Visualisierung des Proteinbands
Universeller Antikörper-Verdünnungspuffer	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS119L	Für primäre/sekundäre Antikörper