Methodenartikel

Neuprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzelllinien aus eingefrorenen Buffy-Coat-Proben

DOI:

10.3791/70522

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10. April 2026

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das aktuelle Protokoll beschreibt Schritte zur Fehlersuche der Derivation induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) von Patientenproben, die sich nach den Anweisungen des Herstellers schwer umprogrammieren ließen. Dieses Protokoll ist spezifisch für gefrorene Buffy-Coat-Proben, kann aber auch auf die Umprogrammierung gereinigter PBMCs angewendet werden.

Zusammenfassung

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Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind ein wertvolles Werkzeug zur Krankheitsmodellierung. Weitere Stammzellen können aus adulten somatischen Zellen, sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), umprogrammiert werden. Die iPSC-Technologie ermöglicht die Bewertung spezifischer Studienteilnehmer und -populationen sowie Unternehmungen in der personalisierten Medizin. Blut wird routinemäßig entnommen und für Forschungszwecke kryokonserviert. Diese Proben werden entweder als Buffy Coats, also als Blutprobe mit weißen Blutkörperchen und Blutplättchen, oder als periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) verarbeitet, die eine stärker gereinigte Population weißer Blutkörperchen ohne Eosinophile, Basophile, Blutplättchen oder rote Blutkörperchen darstellen. Beide sind eine leicht zugängliche und relativ nicht-invasive Quelle für reprogrammierbare somatische Zellen. Mehrere Berichte beschreiben die Umprogrammierung von PBMCs, während nur einer diesen Prozess bei gefrorenen Buffy-Coats beschreibt. Jüngste Erfahrungen haben gezeigt, dass PBMC-Umprogrammierungsprotokolle, die in der Literatur und von Herstellern verfügbar sind, bei der Anwendung auf gefrorene Buffy-Coat-Proben erfolglos sind, was die hier beschriebenen Anpassungen und Fehlerbehebungsstrategien erforderlich macht. Für viele Forscher, die iPSC-Technologien einsetzen, ist es unerlässlich, gründliche Protokolle mit hoher Erfolgsquote zu haben, insbesondere in Fällen, in denen Patientenproben nur wenige Zellen enthalten, in weiten Zeitintervallen entnommen werden, aus einem begrenzten Teilnehmerpool stammen oder anderweitig sehr wertvoll sind. Hier werden Kontrollpunkte und Fehlerbehebungsstrategien identifiziert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, menschliche gefrorene Buffy-Coats oder gereinigte PBMCS umzuprogrammieren. Letztlich ermöglicht dieses Protokoll Forschern, Prädiktoren für den Erfolg der Umprogrammierung zu identifizieren und alternative Ansätze zu entwickeln, um die Chancen auf eine erfolgreiche iPSC-Herleitung zu verbessern.

Einleitung

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Die humane pluripotente Stammzelltechnologie (hPSC) ist eine leicht skalierbare und erneuerbare Quelle menschlicher Zellen, die in jeden Zelltyp im Körper differenziert werden kann und es Forschern ermöglicht, Zell- und Gewebetypen zu untersuchen, die schwer zu erhalten oder bei Patienten unzugänglich sind. Darüber hinaus können induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) direkt aus somatischen Patientenzellen1 gewonnen werden. Dies ermöglicht die Differenzierung patientenspezifischer Zelltypen von Interesse, ein unschätzbares Werkzeug für Krankheitsmodellierung und Arzneimittelentwicklung. Daher sind rigorose, reproduzierbare und erfolgreiche Methoden zur Umprogrammierung somatischer Zellen zu iPSCs entscheidend.

Fibroblasten, Urinzellen und Blutzellen 2,3, jeweils mit eigenen Einschränkungen, gehören zu den am häufigsten verwendeten somatischen Zellquellen für die iPSC-Herleitung. Fibroblasten, historisch gesehen die beliebteste Wahl zur Reprogrammierungvon 3, sind nicht sehr leicht zu erhalten und erfordern eine etwas invasive Hautbiopsie. Reprogrammierbare Zellen können aus Urinproben gewonnen werden, die leicht zu gewinnen und nicht invasiv sind, aber der Reprogrammierungsprozess muss mit frischen Proben bis zu 48 Stunden nach derEntnahme 4 beginnen. Blut bietet eine hervorragende Quelle für reprogrammierbare Zellen, da es minimalinvasiv zu erhalten und leicht verfügbar ist. Es gibt viele verfügbare Umprogrammierungsprotokolle von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs), Blutzellen mit einem einzigen Kern, einschließlich Lymphozyten, Monozyten und natürlichen Killerzellen5. Da PBMCs weniger dicht sind als andere Blutzellen, können sie aus frisch isolierten Vollblutproben durch Dichtegradientenzentrifugation5 isoliert oder gereinigt werden. Alternativ trennt sich Vollblut nach der Zentrifugation in drei verschiedene Schichten: Plasma, Buffy-Coup und roteBlutkörperchen. Buffy Coats enthalten PBMCs sowie Thrombozyten und einige Erythrozyten. PBMCs sind jedoch in den meisten Biobanken weniger leicht verfügbar, während Vollblut- oder Buffycoats reichlich vorhandenund zugänglich sind. Trotz der Verfügbarkeit von Buffy Coats in Biobanken und des Vorhandenseins von reprogrammierbaren PBMCs in diesen Proben beschreiben nur sehr wenige Protokolle die Umprogrammierung von gefrorenen Buffy Coats8, sodass dies eine ungenutzte Ressource bleibt.

Derzeit gibt es viele veröffentlichte Protokolle 1,8,9 und kommerziell verfügbare Kits10, um die Umprogrammierung zu optimieren; Sie untersuchen jedoch nicht tiefgehend, wie man den Erfolg von Patientenspenderzellen, die schwer umprogrammierbar sind, maximieren kann. Es ist allgemein anerkannt, dass sich manche Zellen einfach nicht umprogrammieren lassen, und wenn dies passiert, versuchen viele Forscher es mit einem anderen Spender-Zelltyp oder einem anderen Patienten. Dies ist jedoch für viele Forscher oder Patientengruppen möglicherweise keine praktikable Option. Im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Protokollen 8,9 enthält dieses Protokoll einen Leitfaden mit Kontrollpunkten und Kriterien, auf denen der Erfolg der Reprogrammierung vorhergesagt werden kann, und verfolgt einen einzigartigen Ansatz, indem gefrorene Buffy-Coats mit Dichtegradientenzentrifugation beim Auftauen gereinigt werden.

Der Prozess beginnt mit der Blutentnahme von ausgewählten Personen und der Isolierung entweder PBMCs oder Buffy Coats. Für neue Experimente wird dies voraussichtlich die Rekrutierung neuer Spender einschließen, die unter IRB-Genehmigung und mit einem ordnungsgemäßen Einverständnisformular frisches Blut abnehmen lassen. Der nächste Schritt ist die somatische Zellexpansion, bei der eingefrorene Blutzellen aufgetaut und unter Bedingungen kultiviert werden, die die Proliferation hämatopoietischer Stammzellen und erythroidescher Vorläufer fördern – den Blutzellen, die die besten Kandidaten für die Reprogrammierungsind. Nach 10–14 Tagen sollten die Zellen bereit für die Umprogrammierung sein, wie eine deutliche Morphologie zeigt, die in früheren Protokollen nicht behandelt wurde, und anschließend durch Inokulation mit einem Sendai-Virus transduziert werden, das die Yamanaka-Faktoren Oct4, Sox2, c-Myc und Klf41 trägt. Nach der Transduktion beginnen die Zellen, die Yamanaka-Transkriptionsfaktoren zu exprimieren und kehren in einen pluripotenten Zustand zurück, der wiederum durch eine deutliche morphologische Veränderung und Proliferation in Stammzellkolonien gekennzeichnet ist. Neue Kolonien werden dann einzeln gepflückt, erweitert und kryokonserviert. Nach zehn Durchgängen validiert die Charakterisierung durch Bestätigung der Expression von Stammmarkern und Differenzierungspotenzial in die drei Keimschichten eine erfolgreich umprogrammierte iPSC-Linie.

Dieses Protokoll funktioniert am besten für kryokonservierte Buffy-Coats, die < 1 Monat gelagert wurden, oder für kryokonservierte PBMCs, die bis zu 2 Jahre mit mindestens 1 Million lebensfähigen Zellen nach dem Auftauen gelagert werden. Die beschriebenen Kontrollpunkte können jedoch helfen, die Fehlersuche bei der Umprogrammierung an jeder hochwertigen Blutprobe zu unterstützen. Zusätzlich können Details zur Anpassung neu programmierter iPSCs an feederfreie Bedingungen auf jeden iPSC-Umprogrammierungsworkflow anwendbar sein, unabhängig vom ursprünglichen somatischen Zelltyp.

Dieses Protokoll, das durch praktische Fehlerbehebung etabliert wurde, beschreibt die Neuprogrammierung von iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats und identifiziert morphologische Indikatoren für den Erfolg der Reprogrammierung, sodass es einen brauchbaren Leitfaden zur Neuprogrammierung schwieriger Proben bietet. Letztlich führt die Umsetzung dieser Strategien zu Zeit-, Geld-, Reagenzien und Probeneinsparungen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des ethischen Ausschusses für Humanforschung der University of Georgia. Alle Studien am Menschen wurden gemäß den Richtlinien der Erklärung von Helsinki der Weltärztevereinigung durchgeführt. Basierend auf Selbstbericht litten die Freiwilligen nicht an folgenden Krankheiten: Mukoviszidose, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Tuberkulose, Asthma, Diabetes oder akute Atemwegsinfektionen. Freiwillige im Alter von 18 bis 50 Jahren und beiden Geschlechtern wurden rekrutiert. Schwangere Frauen wurden aus der Studie ausgeschlossen.

1. Buffy-Coat- oder PBMC-Extraktion und Kryokonservierung

Entscheidungskriterien: Wenn die Proben lange gelagert werden, ist es am besten, Option 2 zu wählen. Wenn die Reagenzien für die PBMC-Reinigung nicht verfügbar sind oder die Proben für kurze Zeit gelagert werden, ist Option 1 geeignet.

  1. Option 1: Buffy-Mantel-Extraktion
    1. Führen Sie eine Phlebotomie (Venenpunktion zur Blutabnahme) gemäß den WHO-Best Practices12 durch und nehmen Sie 7–10 ml Vollblut in antikoagulantiumbeschichtete Blutabnahmeröhrchen ein. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
    2. Übertragen Sie 7–10 ml Vollblut in ein 15 ml konisches Rohr. Drehen Sie das Blut mit einer schwingenden Eimerzentrifuge bei 200 x g für 15 Minuten bei 4 °C mit ausgeschalteten Bremsen ab. Dies sollte 3 Schichten bilden, mit gelbem Plasma oben, der weißen Buffy-Schicht in der Mitte und den roten Erythrozyten unten.
    3. Sammeln Sie das Plasma mit einer sterilen serologischen Pipette, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören. Entsorge das Plasma. Übertragen Sie die weiße Buffy-Schicht in ein frisches 15-mL-konisches Rohr (ca. 1–2 ml).
      VORSICHT: Entsorgen Sie das Plasma in der entsprechenden biogefährlichen Abfalltonne.
      HINWEIS: Eine gewisse Plasmakontamination des Buffy Coat ist in Ordnung, da sie die Erholung nach dem Auftauen unterstützt.
    4. Füge DMSO zum Buffy-Coat hinzu, sodass die endgültige Zusammensetzung zu 10 % DMSO V/V ist, und friere sofort im Kryovial (1 mL/Fläschchen) bei -80 °C ein. Am nächsten Tag die Fläschchen in flüssigen Stickstoff zur langfristigen Lagerung umstellen.
      HINWEIS: Als Beispiel: Für 2 ml Buffy Coup 200 μl DMSO hinzufügen, gut mischen und dann in 2 Fläschchen aliquotieren. Dies führt typischerweise zu 1–3 gefrorenen Phiolen pro Probe.
  2. Option 2: PBMC-Reinigung
    1. Führen Sie eine Phlebotomie (Venenpunktion zur Blutentnahme) gemäß den WHO-Best Practices12 durch und nehmen Sie 7–10 ml Vollblut in antikoagulantenbeschichtete Blutabnehmrohre. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
    2. Gib 4 ml Dichtegradientenlösung 1 in ein frisches 15 mL konisches Rohr. Schichte vorsichtig 4 ml Blut auf die Dichtegradientenlösung 1.
    3. Zentrifuge mit einer Schwingschaufel-Zentrifuge mit 400 x g bei RT für 30 Minuten, wobei die Bremsen ausgeschaltet werden. Dies führt zu Plasma in der obersten Schicht, PBMCs in der mittleren Schicht und der Rest des Blutes befindet sich in der unteren.
    4. Sammeln Sie die PBMC-Fraktion in ein frisches 15-mL konisches Rohr und waschen Sie es dann 2–3 Mal mit 1x PBS, indem Sie in einer schwingenden Eimerzentrifuge mit 350 x g bei RT für 5 Minuten mit eingeschalteter Bremse zentrifugieren. Entsorge das Supernatant. Um die Kryokonservierung zu überspringen und sofort mit der Neuprogrammierung zu beginnen, gehe zu Schritt 2.3.4.
      VORSICHT: Entsorgen Sie das Supernatant in der entsprechenden biogefährdeten Abfalltonne.
    5. Pellet in Kryokonservierungsmedium (90 % Serum und 10 % DMSO) wieder suspendieren und sofort im Kryovial (1 ml/Fläschchen) bei -80 °C einfrieren. Am nächsten Tag die Fläschchen in flüssigen Stickstoff zur langfristigen Lagerung umstellen.
      HINWEIS: PBMC-isolierende Blutabnahmeröhrchen können anstelle einer Dichtegradientenzentrifugation zur PBMC-Reinigung aus frischem Blut verwendet werden. Es ist auch möglich, mit kommerziell erhältlichen alternativen Gefriermedien zu kryokonservieren. Die typische Ausbeute beträgt 1–4 gefrorene Fläschchen pro Probe.

2. Proben für die somatische Zellexpansion vorbereiten

  1. Medienvorbereitung
    1. Bereiten Sie Expansion Media (EM)9 vor, indem Sie 45 ml EM-Basis alizitieren. Fügen Sie 127,8 μL L-Ascorbinsäure (50 μg/mL aus 100 mM Lager) und 450 μL Penicillin-Streptomycin (100-fache Lager) hinzu.
    2. EM + Zytokine13 bis 4 ml EM vorbereiten, 2 μL Stammzellfaktor (SCF) (50 ng/mL aus 100 μg/ml Lager), 2 μL Interleukin-3 (IL-3) (10 ng/mL aus 20 μg/mL Lager), 16 μL Erythropoietin (EPO) (2 U/mL aus 500 μg/mL Lager), 4 μL insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF1) (40 ng/mL aus 40 μg/ml Lager) hinzufügen, und 4 μL Dexamethason (1 μM aus 1 mM Lager). Verwenden Sie EM + Zytokine am selben Tag, an dem es hergestellt wird.
      HINWEIS: Alternative kommerzielle Expansionsmedium-Systeme können verwendet werden.
  2. Option 1: PBMC-Reinigung aus dem gefrorenen Buffy-Mantel
    Entscheidungskriterien: Wenn Option 1 in Schritt 1 gewählt wurde (z. B. Buffy-Coat-Extraktion), dann wähle Option 1 in Schritt 2 (z. B. PBMC-Reinigung aus gefrorenem Buffy Coat).
    1. Holen Sie Dichtegradientenlösung 2 ab und lassen Sie Raumtemperatur erreichen. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Flasche umdrehen. Aseptisch wird die 3-mL-Dichtegradientenlösung 2 auf ein 15-mL konisches Rohr übertragen.
    2. Bereiten Sie ein weiteres 15 ml konisches Rohr mit 12 ml Dulbeccos Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (DPBS) vor.
    3. Holen Sie das Fläschchen mit dem gefrorenen Buffy Coat aus dem flüssigen Stickstoff. Kühlen lassen, bis es auftauen kann. Die Probe vorsichtig auftauen, indem Sie sie in einem 37 °C Wasserbad wirbeln. Entfernen, wenn nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist.
    4. Geben Sie den Inhalt des Fläschchens vorsichtig (tropfenweise) in das konische Rohr mit DPBS um. Spülen Sie das Fläschchen mit 1 ml DPBS aus und geben Sie die entnommenen Zellen in das konische Rohr.
    5. Zentrifuge mit einer Schwing-Eimer-Zentrifuge bei 200 x g bei RT für 10 Minuten. Entferne vorsichtig das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in 4 ml DPBS mit 1% fetalem Rinderserum (FBS).
    6. Schichte die Buffy-Coat-Mischung vorsichtig auf die Dichtegradientenlösung und achte darauf, das Mischen nicht zuzulassen. Zentrifugiere in einem schwingenden Eimer und zentrifugiere mit 800 x g für 20 Minuten bei RT mit ausgeschalteter Bremse.
    7. Mit einem Pipett wird die obere Plasmaschicht entfernt und entsorgt, ohne die Plasma-Gradienten-Grenzfläche zu stören. Mit einem Pipett wird die PBMC-Schicht an der Schnittstelle entfernt (Abbildung 1A) und in eine saubere 15-mL-Röhre übertragen.
      VORSICHT: Entsorgen Sie die anderen Schichten in der entsprechenden biogefährlichen Abfalltonne.
    8. Waschen Sie die PBMCs mit 3 mL EM durch Zentrifugation bei 200 x g für 10 Minuten bei RT. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet erneut in 2 mL EM + Zytokine. Platte in einem Schachtel einer 12-Schacht-Platte.
    9. Stellen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2.
  3. Option 2: Auftauen gefrorener PBMCs
    Entscheidungskriterien: Wenn Option 2 in Schritt 1 gewählt wurde (z. B. PBMC-Reinigung), oder wenn Bedenken bestehen, dass gefrorene Buffy Coats eine geringe Lebensfähigkeit haben (d. h. länger als einen Monat gelagert) (Abbildung 1B), wählen Sie Option 2 in Schritt 2 (d. h. Auftauen gefrorener PBMCs).
    1. Bereiten Sie ein 15 mL konisches Rohr mit 12 mL DPBS vor.
    2. Holen Sie das Fläschchen mit gefrorenen PBMCs aus flüssigem Stickstoff. Lass es auf Eis, bis es auftaureif ist. Tauen Sie die Probe vorsichtig auf, indem Sie sie in einem 37 °C Wasserbad wirbeln. Entferne es, wenn nur noch ein kleiner Kristall übrig ist.
    3. Den Inhalt des Fläschchens werden vorsichtig (tropfenförmig) in das konische Rohr übertragen. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Zellen aus dem Fläschchen entnehmen, indem Sie das Fläschchen mit 1 ml DPBS abspülen.
    4. Zentrifugiere in einer schwingenden Eimerzentrifuge mit 200 x g bei RT für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel und suspendieren Sie das Pellet (Abbildung 1C) in 2 mL EM, dann nehmen Sie 10 μL für einen Trypan-Blue-Ausschlusstest auf die Zelllebensfähigkeit und erhalten Sie eine Zellzahlvon 14.
      VORSICHT: Entsorgen Sie das Supernatant in der entsprechenden biogefährdeten Abfalltonne.
    5. Platte 1,0 x 106–2,0 x 106 Zellen /mL in 2 mL EM + Zytokine in einem Brunnen einer 12-Well-Platte. Stellen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2.

3. Somatische Zellexpansion (1 Tag nach dem Auftauen)

  1. Entferne vorsichtig 1 ml verbrauchtes Medium aus jedem Schacht. Verbrauchte Medien können in einem anderen Brunnen oder Zentrifugenrohr gesammelt und überprüft werden, um sicherzustellen, dass keine Zellen verloren gegangen sind.
  2. Ersetzen Sie verbrauchte Medien durch 1 ml frisches EM + Zytokine.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 und machen Sie jeden zweiten Tag Fotos von PBMCs, bis eine signifikante Veränderung der Morphologie festgestellt wird, mit hellen und runden Zellen großer und kleiner Größe (Abbildung 2A, oranger bzw. blauer Pfeil), die die Erythroblasten sind, also der Zelltyp, der neu programmiert werden soll. Dies dauert etwa 10–14 Tage.
    HINWEIS: Zellen, die diese Morphologien nicht aufweisen und typischerweise die größeren runden Zellen fehlen (Abbildung 2B), werden wahrscheinlich nicht erfolgreich umprogrammiert und können tot sein (Abbildung 2C).

4. Transduktion (10–14 Tage nach Auftauen)

  1. Bereite das Sendai-Virus vor
    1. Mit dem lot-spezifischen Titerwert berechnet man das Volumen jedes Virus, das für die Transduktion benötigt wird, von 2,0 × 105Zellen mit KOS: c-Myc: Klf4 und einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5:5:3, wie vom Hersteller empfohlen. Die Gleichung für diese Berechnung findet sich in den vom Hersteller bereitgestellten Produktdokumenten.
    2. Entfernen Sie Viren aus dem Gefrierfach und lassen Sie sie auf Eis, bis es Zeit zum Auftauen ist. Einen nach dem anderen tauen Sie die Viren sanft auf, indem Sie sie in einem 37 °C Wasserbad wirbeln.
    3. Bereite Aliquots vor, in denen alle drei Viren mit dem geeigneten Volumen für die Transduktion von 2,0 × 105 Zellen bei MOIs von 5:5:3 gemischt werden. Kühlen Sie Aliquots bei -80 °C ein, bis sie einsatzbereit sind.
      VORSICHT: Seien Sie sicher, alle Abfallstoffe gründlich zu bleichen, die mit dem Sendai-Virus in Kontakt gekommen sind.
      HINWEIS: Die Herstelleranweisungen empfehlen eine tatsächliche Zellzählung mit MOI-Berechnung zur Bestimmung des hinzugefügten Virusvolumens, aber die Annäherung von 2,0 × 105 war für die Zwecke dieses Protokolls erfolgreich. Aliquoting kann kostengünstiger sein und reduziert die Anzahl der Frost-/Tauzyklen bei Viren.
  2. Tag der Transduktion (d0)
    1. Wenn die PBMCs am Tag zuvor nicht gefüttert wurden, entferne 1 ml abgebranntes Medium und ersetze durch 1 ml frisches EM + Zytokine. Das Virus aliquot auf Eis auftauen, dann direkt in den Brunnen geben, die Medien aufwirbeln.
    2. Wickle die Platte in Parafilm und zentrifugiere die Platte in einer schwingenden Eimerzentrifuge mit 350 x g bei RT für 90 Minuten. Stellen Sie den Teller über Nacht bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2 in den Inkubator.
      VORSICHT: Seien Sie sicher, alle Abfallstoffe gründlich zu bleichen, die mit dem Sendai-Virus in Kontakt gekommen sind.
  3. 1 Tag nach der Transduktion (d1)
    1. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-konischen Rohr. Spülen Sie gründlich mit 2 ml EM ab und prüfen Sie unter dem Mikroskop, dass alle Zellen gesammelt wurden. Zentrifugiere Zellen mit 300 x g bei RT für 10 Minuten.
    2. Entferne vorsichtig das Supernatant und suspendiere es in 2 mL EM + Zytokine. In eine frische Mulde einer 12-Brunnen-Platte geben und die Platte bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2 in den Inkubator zurückbringen.
      VORSICHT: Bleichen Sie unbedingt alle Abfälle, die mit dem Sendai-Virus in Kontakt gekommen sind, gründlich.

5. Übertragene Zellen auf Zuführzellen umschichten

  1. Bereite die Zubringerzelle vor
    1. Zu 43,5 mL Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) werden 5 mL FBS (Endkonzentration 10 %), 0,5 mL Minimum Essential Medium nicht-essentielle Aminosäurelösung (MEM-NEAA) (aus 100x Bestand), 50 μL 2-Mercapttoethanol (55 μM aus 55 mM Lager) und 0,5 ml Antibiotikum-Antimykotikum (aus 100x Bestand) hinzugefügt.
    2. Bereiten Sie gelatinebeschichtete 6-Well-Platten vor, indem Sie 600 μL Gelatine (0,1 % aus 2 % Lager) zu 12 mL DPBS hinzufügen und pro Bohrloch 2 mL verteilen. 20 Minuten bei Zimmertemperatur bebrüten.
    3. Entnehmen Sie das gefrorene Fläschchen mit bestrahlten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) und tauen Sie sanft auf, indem Sie sie in einem 37 °C Wasserbad umwirbeln.
    4. Tropfweise in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml DPBS geben und das Fläschchen mit zusätzlichem 1 ml DPBS abspülen. Zentrifugiere mit 200 x g bei RT für 5 Minuten.
    5. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Fibroblast-Medien. Entfernen Sie 10 μL, um einen Trypan-Blue-Ausschlusstest auf die Zelllebensfähigkeit durchzuführen und so dieZellzahl 14 zu erhalten.
    6. Entfernen Sie die Gelatinelösung von den 6-Well-Platten und plattenbestrahlten MEFs bei 2,5 × 104 Zellen/cm². Inkubieren Sie im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2und 20 %O2 für 6–48 Stunden.
      HINWEIS: Zuführzellplatten müssen vor der Neubeschichtung der transduzierten Zellen vorbereitet werden. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn bestrahlte MEFs etwa 2 Tage lang inkubiert werden, bevor sie neu benetzt werden, aber eine Inkubation von mindestens 6 Stunden kann ausreichen.
  2. Re-Platten-transduzierte Zellen
    1. Bereite iPSC-Medien 90 mL DMEM/F12 mit 10 mL FBS (10 % Endkonzentration), 1 mL MEM-NEAA (aus 100x Lager), 1 mL L-Glutamin (2 mM aus 200 mM Lager), 1 mL Penicillin-Streptomycin (aus 100x Lager), 100 μL 2-Mercapptoethanol (55 μM aus 55 mM Lager) und 100 μL Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) (10 ng/mL aus 10 μg/mL Lager). Fügen Sie bei jeder Fütterung L-Ascorbinsäure (50 μg/mL) frisch hinzu.
    2. Am Tag 3 nach der Transduktion sammeln Sie alle Medien und Zellen aus dem transduzierten Brunnen in ein 15-mL konisches Rohr. Spülen Sie gründlich mit mindestens 1 zusätzlichem ml EM und zentrifugieren Sie in einer Schaukeleimer mit 300 x g bei RT für 10 Minuten.
    3. Das Pellet in 6 mL iPSC-Medium wieder suspendieren. Aspiratiere das Medium aus drei Wells der Platte mit bestrahlten MEFs.
    4. Platten-transduzierte Zellen in diese drei Wells mit bestrahltem MEF (2 ml/Brunnen). Inkubieren Sie im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2und 20% O2.

6. Pflege bis zum Aufbau der Kolonie

  1. An den Tagen 4, 5 und 6 nach der Transduktion fügen Sie jedem Bohrloch täglich 1 ml frisches iPSC-Medium hinzu. Dies verhindert unnötige Störungen der frisch umprogrammierten Zellen beim Ansammeln auf den Futterstellen und liefert ihnen gleichzeitig frische Nährstoffe.
  2. Am 7. Tag nach der Transduktion entferne alle alten Medien und ersetze sie durch 2 ml frisches iPSC-Medium pro Well. Füttere weiterhin jeden zweiten Tag iPSC-Medien, bis Kolonien entstehen.
  3. Bereite hES-Medien 78 mL DMEM/F12 mit 20 mL FBS-freiem Supplement (20 %) vor, 1 mL MEM-NEAA (100x), 1 mL L-Glutamin (2 mM aus 200 mM Lager), 1 ml Penicillin-Streptomycin (100x), 100 μL 2-Mercapttoethanol (55 μM aus 55 mM Lager) und 100 μL FGF2 (10 ng/mL aus 10 μg/ml Lager). Fügen Sie bei jeder Fütterung L-Ascorbinsäure (50 μg/mL) frisch hinzu.
  4. Sobald kleine Kolonien entstehen, erhalten Sie weiterhin die transduzierten Zellen, indem Sie alle zwei Tage mit hES-Medien füttern (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Kolonien beginnen bereits 7 Tage nach der Transduktion zu erscheinen. Wenn drei Wochen nach der Transduktion keine Kolonien entstanden sind, ist es unwahrscheinlich, dass diese jemals entstehen.

7. Sammeln Sie Kolonien, sobald sie größer geworden sind (Abbildung 3B)

HINWEIS: Manchmal durchlaufen transduzierte Zellen eine morphologische Veränderung, die nicht zu einer stammzellähnlichen Kolonie führt (Abbildung 3C). Dies gilt nicht als Kolonie, die zu einer erfolgreichen iPSC-Linie führen könnte.

HINWEIS: Ab dem Kolonieaufbruch müssen iPSC-Linien an die bevorzugten hPSC-Kultivierungsbedingungen im Labor angepasst werden. Dieses Protokoll wird zeigen, wie iPSC-Linien an feederfreie Bedingungen angepasst wurden, auf vitronectin-(VTN)-beschichteten Platten kultiviert und mit chemisch definierten und kommerziell verfügbaren hPSC-Medien versorgt wurden. Wenn sich die Kolonien nicht gut an die neuen Bedingungen anpassen, benötigen sie möglicherweise einen sanfteren Übergang, etwa indem sie mit hES-Medien auf Futterzellen aufgenommen werden.

  1. Bereiten Sie VTN-beschichtete Platten durch Auftauen und gründliches Mischen vor. Für eine 24-Well-Platte bereiten Sie 12 mL DPBS mit 120 μL VTN (5 μg/mL aus 500 μg/mL Lager) vor und verteilen Sie 0,5 mL VTN-Lösung/-Brunnen. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  2. Bereiten Sie hPSC-Medium vor, indem Sie eine Flasche hPSC-Supplement über Nacht bei 4°C auftauen. Nach dem Auftauen geben Sie 10 ml hPSC-Ergänzung in eine 500-ml-Flasche hPSC-Basalmedium.
  3. Bereiten Sie die Platten zum Picken vor, indem Sie VTN-Lösung aus den Bohrlöchern der 24-Well-Platte entfernen und 0,5 mL hPSC-Medien mit 0,5 μL Y-27632 (10 μM aus 10 mM Material) zu jedem Bohrloch hinzufügen.
  4. Bringen Sie die neue Platte, die 6-Well-Schicht mit den transduzierten Zellen/Kolonien, sterile Spritzennadeln sowie eine P200-Pipette und Spitzen unter sterilen Bedingungen zu einem Seziermikroskop.
  5. Platzieren Sie die Platte mit den transduzierten Cellen und den entstandenen Kolonien auf das Sezierungsmikroskop und verwenden Sie das Mikroskop, um eine Kolonie zu finden, die ausgewählt werden soll. Heben Sie den Deckel der Platte an, um den Brunnen freizulegen.
  6. Öffne die Spritze aseptisch und lege die Nadel frei. Geleitet vom Mikroskop verwenden Sie die Nadelspitze, um die Kolonie von den umliegenden Futterzellen zu lösen, indem Sie mit der Nadel die Umrisse der Kolonie nachzeichnen.
  7. Schneide die Kolonie mit der Nadelspitze in einige gleich große Stücke. Wenn sich die Koloniestücke noch nicht von der Platte gelöst haben, benutze die Seite der Nadel, um sie von der Platte zu schöpfen oder abzukratzen, damit sie schwimmen.
    VORSICHT: Werfen Sie die Nadel in den passenden Behälter für scharfe Gegenstände.
  8. Mit dem p200 verwenden Sie das Mikroskop, um die ausgewählte Kolonie neu zu lokalisieren. Aspirieren Sie die schwimmende Kolonie mit der Pipette und überführen Sie sie in einen Brunnen der vorbereiteten 24-Well-Platte. Versuche, die gesamte Kolonie in den Brunnen zu bekommen, ohne weitere Kolonien oder Futterzellen zu bekommen.
  9. Stellen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2.
  10. Füttere die gepflückten Kolonien täglich mit 1 ml hPSC-Medium, bis sie zusammenfließen.
    HINWEIS: Kolonien haben das Potenzial, genetisch voneinander zu unterscheiden. Jeder Brunnen der 24-Brunnen-Platte darf nur eine ausgewählte Kolonie enthalten. Jede ausgewählte Kolonie erhält einen eigenen Identifikator und wird von da an als eine andere Zelllinie im Vergleich zu anderen ausgewählten Kolonien behandelt. Für eine gründliche Umprogrammierung wähle mindestens 24 Kolonien aus und erweitere und charakterisiere mindestens 3.

8. Erweitern

  1. hPSC-Wartung
    1. Die ausgewählten Kolonien sind bereit zur Spaltung, wenn sie groß und rund mit leuchtenden Kanten sind (Abbildung 4A). Kolonien zerbrechen in mehrere Stücke, wenn sie ausgewählt werden. Wenn es mehrere Kolonien in einem Brunnen gibt, trennen Sie sie, bevor sie groß genug geworden sind, um Kontakt zu haben und sich zu unterscheiden.
    2. Bereiten Sie eine VTN-beschichtete 6-Well-Platte vor: Für eine 6-Well-Platte bereiten Sie 12 mL DPBS mit 120 μL VTN (5 μg/mL aus 500 μg/mL Material) vor und verteilen Sie 1 mL VTN-Lösung/-Brunnen. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die VTN-Lösung kann durch DPBS ersetzt und einen Monatbei 37 °C, 5 % CO2 gelagert werden. In den Bohrlöchern, in die aufgeteilt werden, wird DPBS abgesaugt und durch 1 ml hPSC-Medium ersetzt.
    3. Aspiriere das Medium aus dem Brunnen, um es zu spalten, und spüle dann einmal mit 1 ml DPBS. Aspiratiere das DPBS und füge 500 μL 0,5 mM EDTA-Dissoziationspuffer hinzu (vorbereitet in 500 mL DPBS mit 0,9 g NaCl und Filter sterilisiert)15. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2für 2 Minuten, bis sich die Kolonien lockern und die Zellen innerhalb jeder Kolonie sich aufsammeln und voneinander ablösen.
    4. Entferne die Platte aus dem Inkubator, aspiriere den EDTA-Dissoziationspuffer. Mit einer p1000-Pipette werden die Zellen mit 1 mL hPSC-Medium durch vorsichtiges Pipettern auf und ab aufgenommen, bis die Kolonien vollständig abgelöst und leicht zerbrochen sind. Übertragen Sie das 1 ml Medium und die Zellen in das neue 6-Bohrloch, das 1 ml frisches hPSC-Medium enthält. Diese erste Aufteilung erfolgt im Verhältnis 1:1, alle Zellen der ursprünglichen Platte werden auf die neue Platte übertragen.
    5. Platzieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 20 %O2. Fütte die iPSCs täglich, bis der Brunnen zusammenfließt und bereit zum Spalten ist.
      HINWEIS: Eine schlechte Stammzellmorphologie (Abbildung 4B) kann durch eine Anpassung des Spaltungs-Protokolls gemildert werden, etwa durch frühere Spaltung, eine kürzere EDTA-Inkubationszeit oder eine Anpassung des Teilungsverhältnisses.
    6. Dann zu einer 10 cm langen Schale ausdehnen.
      1. Sobald die Zellen in jedem Brunnen der 6-Brunnenplatten zusammengekommen sind, wird eine 10 cm große Schale mit VTN (7 mL DPBS mit 70 μL VTN (5 μg/mL aus 500 μg/mL Lager) beschichtet, die 1 Stunde bei RT inkubiert wird.
      2. Wiederholen Sie das Teilprotokoll, diesmal expandieren Sie vom 6-Brunnen in die 10 cm große Gewebekulturschale (Teilungsverhältnis 1:1). Verwenden Sie 7–10 ml hPSC-Medium pro 10 cm Schüssel.
      3. Sobald die Zellen in der 10-cm-Schüssel zusammenfließen, wiederholt man diesen Aufteilungsprozess (Passaging). An jeder Passage notieren Sie die Abschnittsnummer. Das Aufteilungsverhältnis hängt von der Zellmorphologie und -dichte ab. Ein typisches Verhältnis ist 1:10, wobei ein Zehntel der Zellen der ursprünglichen Platte auf die neue Platte übertragen wird.
  2. Freezebacks und Lagerzubereitungen
    1. Nach etwa drei Durchgängen entfalten Sie sich in vier 10 cm große Gewebekulturschalen für frühe Passagebestände. Sobald die Zellen in den 10-cm-Schalen zusammenfließen, sind sie bereit zum Einfrieren.
    2. Bereiten Sie Kryoviale vor und legen Sie sie zum Abkühlen in den Gefrierschrank. Achten Sie darauf, dass das Etikett die Zelllinie, den Klon, die Passagennummer und das Datum des Einfrierens enthält.
    3. Bereite Gefriermedium vor: 90 % hPSC medium und 10 % DMSO, du brauchst 1 ml pro Fläschchen (3 gefrorene Fläschchen pro 10 cm Schüssel).
    4. Führen Sie das Aufteilungsprotokoll wie gewohnt durch und verwenden Sie für jede 10-cm-Schüssel einen 4 mL 0,5 mM EDTA-Dissoziationspuffer.
    5. Nach der EDTA-Inkubation sollte man EDTA aspirieren. Gib vorsichtig 10 ml hPSC Medium in die Schüssel.
    6. Waschen Sie die Zellen vorsichtig vom Napf ab, indem Sie das Medium pipetten. Die Zellen kommen leicht vom Boden der Schüssel und mischen sich im Medium. Pipette nur 2–5 Mal, um die Kolonien sanft zu zerlegen, aber die Dissoziation in Einzelzellen zu vermeiden.
    7. Zentrifugiere 5 Minuten bei 200 x g bei RT. Sauge Supernatant ab und suspendiere das Zellpellet in einem Gefriermedium.
    8. Isolieren und sofort bei -80 °C einfrieren. Die gefrorenen Phiolen werden in den flüssigen Stickstofftank zur Langzeitlagerung überführt.
    9. Frieren Sie mehr Bestände auf die gleiche Weise ein, sobald die Charakterisierung abgeschlossen ist.

9. Charakterisierung der iPSCs:

  1. Ausdruck von Stammmarkern. Nach mindestens 10 Durchgängen, wenn die Kolonien in einem 24-Brunnen bereit sind, gespalten zu werden, fixieren Sie mit 4 % Paraformaldehyd und färben Sie mit Immunhistochemie auf den Stammmarker NANOG. Es wird mindestens 10 Durchgänge dauern, bis Kolonien negativ für das Sendai-Virus (SeV) sind, was durch Immunfluoreszenz bestätigt werden kann (Abbildung 4C).
  2. Testen Sie die Fähigkeit der Pluripotenz: Drei Keimschicht-Differenzierungen. Die iPSC-Pluripotenz wird durch erfolgreiche Differenzierung in jede der drei Keimschichten bestätigt. Jede Differenzierung beginnt mit einer zusammenfließenden 10 cm langen Schale mit guter hPSC-Morphologie (Abbildung 4A).
    1. Ektoderm16
      1. Am Tag vor Beginn der Differenzierung (Tag-1): Samen-iPSCs auf matrixbeschichteten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2,6 × 105 Zellen/cm² im hPSC-Medium mit Y-27632 (10 μM Endkonzentration) und XAV-939 (2 μM Endkonzentration).
      2. Tag 0–Tag 1: Ernährung mit 1 mL/Bohrloch-Differenzierungsbasis mit LDN (100 nM Endkonzentration), SB (10 μM Endkonzentration) und XAV (2 μM Endkonzentration).
      3. Tag 2–Tag 7: Nahrung mit 1 mL/Bohrloch-Differenzierungsbasis sowie LDN (100 nM Endkonzentration) und SB (10 μM Endkonzentration). Ab D3 jeden zweiten Tag füttern.
      4. Tag 8: Fixierung mit 4% Paraformaldehyd und Färbung mittels Immunhistochemie für den Ektodermmarker PAX617 sowie Bestätigung des Verlusts des Pluripotenzmarkers NANOG (Abbildung 4D).
    2. Mesoderm18:
      1. Am Tag vor Beginn der Differenzierung (Tag -1): Samen-iPSCs auf matrixbeschichteten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen /cm² im hPSC-Medium mit Y-27632 (10 μM Endkonzentration).
      2. Tag 0: Ernährung mit DMEM/F12 mit L-Ascorbinsäure (64 μg/mL Endkonzentration), Natriumselenit (13,6 ng/mL Endkonzentration), Holotransferrin (10 μg/mL Endkonzentration), chemisch definiertem Lipidkonzentrat (100x) und CHIR (5 μM Endkonzentration).
      3. Tag 1: Ernährung mit DMEM/F12 mit L-Ascorbinsäure (64 μg/mL Endkonzentration), Natriumselenit (13,6 ng/mL Endkonzentration), Holotransferrin (10 μg/mL Endkonzentration), chemisch definiertem Lipidkonzentrat (100x) und Heparin (0,6 U/mL Endkonzentration).
      4. Tag 2: Fixierung mit 4% Paraformaldehyd und Färbung mittels Immunhistochemie für BRACHYURY-T19 und Bestätigung des Verlusts des Pluripotenzmarkers NANOG (Abbildung 4E).
    3. Endoderm20
      1. Am Tag vor Beginn der Differenzierung (Tag -1): Samen-iPSCs auf matrixbeschichteten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 1,0 × 105 Zellen/cm² im hPSC-Medium mit Y-27632 (10 μM Endkonzentration).
      2. Tag 0–Tag 4: Bei D0 mit DPBS waschen und mit RPMI mit L-Glutamin-Substitut (100x), FBS (0,5 % Endkonzentration) und Activin A (100 ng/mL Endkonzentration) füttern. Von d0 aus täglich mit denselben Medien feeden.
      3. Tag 5: Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd und Färbung mittels Immunhistochemie für den Endodermmarker SOX1721 sowie Bestätigung des Verlusts des Pluripotenzmarkers NANOG (Abbildung 4F).
        HINWEIS: Differenzierungen erfolgten gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen. Nach unserer Erfahrung können Matrixbeschichtungen austauschbar sein.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Erfolg dieses Protokolls kann in verschiedenen Phasen nachverfolgt werden. Tabelle 1 bietet eine Zusammenfassung der Proben, an denen dieses Protokoll durchgeführt wurde. Startproben, die entweder kryokonservierte Buffy-Coats sein, die eine Woche lang gelagert wurden, oder kryokonservierte PBMCs, die beim Auftauen eine gute Probenqualität aufweisen und nach einer erfolgreichen 6/7-fachen Umprogrammierung des Zellwachstums ein deutlich morphologisches Erscheinungsbild...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die iPSC-Technologie hat enormes Potenzial im biomedizinischen Bereich in Bezug auf die Entdeckung von Krankheitsmechanismen, personalisierte Medizin und "klinische Studien in einer Schale"22,23. Effiziente und anpassungsfähige Protokolle zur iPSC-Neuprogrammierung aus Blutproben sind entscheidend, um das große Potenzial der iPSC-Technologie zu erschließen, da sie leicht zu sammeln und oft in Biobanken verfügbar sind. Obwohl es v...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschliche Probanden wurden rekrutiert und erhielten eine informierte Zustimmung zur Blutspende gemäß dem IRB-Protokoll UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 und Emory# 000002114. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences des National Institute of Health unter der Stipendiennummer 5T32GM142623 an J. Art, R01MH115174 an V. Michopoulos und R01NS114567 an N. Zeltner unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm Standard-GewebekulturschalenFalcon353003
12 BrunnenplattenFalcon353043
15-mL konische RöhrenFisher7200886
24 BrunnenplattenCorning7200740
4%-ParaformaldehydlösungThermowissenschaftlichJ19943-K2
6 BrunnenplattenFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activin ABiotechne338-n. Chr.
AF488-Esel & Alpha; ZiegeInvitrogenA11055
AF555-Esel & Alpha; RBTInvitrogenA31572
AF647-Esel & Alpha; mInvitrogenA31571
AF647-Esel & Alpha; RBTInvitrogenA31573
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)Fisher15 240 096 
Basix Polystyrol-Serologische PipetteFisher14955233
14955234
14955235
14955236
BD TuberkulinspritzenFisher14-826-87
BD Vacutaine Glass Mononukleare Zellvorbereitung (CPT) RöhrenFisher Scientific02-685-125PBMC Isolierende Blutabnahmeröhrchen
BD  Vakuum-Plastik-Blutabnahmeröhrchen mit K2EDTA: Hämogard-VerschlussFisher Scientific02-657-32Antikoagulente beschichtete Blutsammelröhrchen
B-MercaptoethanolFisher21 985 023 
RindergelatineSigmaG1393
Brachyury-T-Antikörper polyklonale Ziege IgGR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Zentrifuge 5702EppendorfEP022628102-1EA
chemisch definiertes LipidkonzentratFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
CO2 InkubatorSanyoMCO-20AIC
KryokonservierungsspeichersystemMaßgeschneiderte biogene SystemeV-1500AB
CryoStor CS10Stammzelltechnologien100-1061alternatives Gefriermedium
CytoTune-iPS 2.0 Sendai-UmprogrammierkitFisherA16517
DexamethasonSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X OHNE CA MG FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Erythropoeitin (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essential 6 Medium (E6)FisherA1516401Differenzierungsbasis 
Essential 8 Medium (E8)FisherA1517001hPSC Basalmedium
EVOS FL-MikroskopThermoAMF4300
Fetales RinderserumVWR45000-734
FGF basic (FGF2)Biotechne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Matrizenbeschichtung
Gibco MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061L-Glutamin-Substitut 
HeparinStammzelltechnologien7980
Histopaque 1077Sigma10771Dichtegradientenlösung 1 
HolotransferrinSigmaT0665
Menschlicher Stammzellfaktor (SCF)Peprotech300-07-100UG
Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleukin-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Isotemp 210 WasserbadFisher Scientific210
Knockout-Serum-Ersatz (KSR)Fisher10828028FBS kostenloses Supplement 
L-AscorbinsäureSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutaminFisher25030081
LymphoprepStammzelltechnologien7801Dichtegradientenlösung 2
MatrigelCorningCB-40234Matrizenbeschichtung
Mausembryonale FibroblastenFisherA34964 
Nanog polyklonale Ziege IgGR& DAF1997-SP
Nunc Biobanking und Zellkultur-Kryogene RöhrenFisher Scientific12-565-163N
Penicillin/StreptomycinFisher15140122
Purified anti-Pax-6 Antikörper polyklonales IgG für KaninchenBiolegende901301
QBSF-60 Serumfreies MediumQualitätsbiologisch160-204-101EM-Basis
Erholungszellkultur-GefriermediumThermo Fisher Scientific12648010alternatives Gefriermedium
rhVitronectin (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MittelFisher11875093
SB431542R& D1614
Sendai-Virus HN Monoklonaler Antikörper Maus IgG2aInvitrogen14649482
NatriumselenitSigmaS5261
Sox17-Antikörper polyklonale Ziege IgGR& Daf1924
StemSpan Erythroid Expansion SupplementStammzelltechnologien2692Alternatives kommerzielles Erweiterungsmedium Ergänzungsmaterial
StemSpan SFEM II-MediumStammzelltechnologien9605Alternatives kommerzielles Expansionsmedium
Ultra-Niedrigtemperatur-GefrierschrankThermo Fisher ScientificTSX60086A
Universelle Pipettenspitzen – gefiltertVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Biotechne3748/10
Y-27632 DihydrochloridBioGems1293823

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Induzierte pluripotente StammzellenBuffy Coat ReprogrammierungPBMC ReprogrammierungStammzellmorphologieSendai Virus TransduktionStammzellmarker NANOGErythroblastendifferenzierungImmunfluoreszenzf rbungDichtegradientisolierunghumane pluripotente Stammzellen

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