Bodenbasale Atmung als Methode zur Bestimmung des Einflusses von Bodenmanagement und mikrobieller Aktivität

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Bewertung der Bodenbasalatmung mit einem Infrarotgasanalysator (IRGA) vor, der eine kontrollierte, kontinuierliche Überwachung der CO₂-Dynamik im Boden unter kontrollierten Bedingungen sowie eine reproduzierbare Bewertung der mikrobiellen Aktivität ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Bodenatmung stellt den Transfer von CO₂ vom Boden in die Atmosphäre dar und ist einer der größten terrestrischen Kohlenstoffflüsse nach der Bruttoprimärproduktion. Da sie hauptsächlich durch die Stoffwechselaktivität der Bodenorganismen angetrieben wird, gilt sie weithin als sensibler Indikator für die biologische Aktivität im Boden, den Kohlenstoffumsatz und die Auswirkungen von Umwelt- oder Managementstörungen. Die Bodenatmung integriert mehrere CO₂-Quellen, darunter autotrophe Atmung von Pflanzenwurzeln und Rhizosphären-Mikroorganismen sowie heterotrophe Atmung, die mit mikrobieller Zersetzung organischer Substanz verbunden ist. Wenn die mikrobielle Atmung ohne externe Substrate oder frische Nährstoffzufuhren gemessen wird, wird sie als Bodenbasalatmung (SBR) bezeichnet.

Dieser Artikel stellt ein auf Infrarot-Gasanalysator (IRGA) basierendes Protokoll zur Quantifizierung von SBR unter kontrollierten Laborbedingungen vor. Um die heterotrophe Komponente, die allein auf den mikrobiellen Stoffwechsel zurückzuführen ist, zu isolieren, werden pflanzliche CO₂-Flüsse durch vorkonditionierte, siebte und homogenisierte Bodenproben unter standardisierten Feuchtigkeits- und Temperaturbedingungen ausgeschlossen, was die Quantifizierung der kumulativen C-CO₂-Entwicklung im Zeitverlauf ermöglicht und einen robusten Proxy für mikrobielle Biomasse, Aktivität und Bodengesundheit bietet. Das Protokoll umfasst Bodenvorbereitung, Feuchtigkeitsanpassung, versiegelte Röhrinung, IRGA-basierte CO₂-Messung und Berechnung der kumulativen Atmung.

In dieser Studie bewerteten wir SBR mit einem Infrarot-Gasanalysator (IRGA), der die Überwachung der CO₂-Dynamik im Boden unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass die Kompostzugabe die mikrobielle Atmung in trockenen Böden aus der Tabernas-Wüste verbesserte, was auf eine starke Stimulation mikrobieller Prozesse nach organischer Veränderung hinweist. Diese Ergebnisse unterstreichen die Nützlichkeit von SBR als Indikator für die Auswirkungen des Bodenmanagements auf die mikrobielle Aktivität, insbesondere in degradierten trockenen Umgebungen. Methodisch bietet das IRGA-basierte Protokoll ein praktisches Werkzeug für Forschungs- und Lehranwendungen im Zusammenhang mit der Bodenkohlenstoffdynamik.

Einleitung

Die Bodenatmung ist ein zentraler biogeochemischer Prozess, der den Fluss von Kohlendioxid (CO₂) von der Bodenoberfläche in die Atmosphäre umfasst. Es wird geschätzt, dass er nach der Bruttoprimärproduktion^{der zweitgrößte} terrestrische Kohlenstofffluss 1 ist und trägt wesentlich zum globalen Kohlenstoffkreislauf^bei. Dieser Prozess ist entscheidend für den Kohlenstoffumsatz in terrestrischen Ökosystemen und wird zunehmend als sensibler Indikator für die biologische Aktivität des Bodens und die Dynamik der Kohlenstoffbindung^{genutzt 3,4}.

Die Bodenatmung stammt aus mehreren Quellen und wird im Allgemeinen in zwei Hauptbiologische Komponenten unterteilt: autotrophe Atmung, die aus dem Pflanzenwurzelstoffwechsel und rhizosphärenassoziierten Mikroorganismen entsteht, sowie heterotrophe Atmung, die mit der mikrobiellen Zersetzung organischer Substanz im Boden assoziiert^{ist 5,6}. Nicht-biologische Quellen wie Karbonatverwitterung⁷ und Photodegradation⁸ können ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beitragen. Um die heterotrophe Komponente, die allein auf den mikrobiellen Stoffwechsel zurückzuführen ist, zu isolieren, müssen pflanzliche CO₂-Flüsse ausgeschlossen werden.

In diesem Zusammenhang wird mikrobielle Atmung definiert als die Produktion von CO₂ oder die Aufnahme von O₂ durch Mikroorganismen – darunter Bakterien, Pilze, Protozoen und Algen – infolge aerober oder anaerob^{Stoffwechselprozesse}. Wenn man unter Fehlen externer Substrate oder neuer Nährstoffzufuhr misst, spricht man von der mikrobiellen Atmung Basalatmung¹⁰. Die basale Atmung spiegelt die endogene Stoffwechselaktivität der einheimischen mikrobiellen Gemeinschaft wider und wird häufig als Indikator für mikrobielle Biomasse, Aktivität und Empfindlichkeit gegenüber Umwelt- oder anthropogenen Störungen verwendet^11,12.

Um die basale Atmung genau zu beurteilen, werden laborbasierte Messungen an vorkonditionierten, gesiebten und homogenisierten Bodenproben durchgeführt. Diese Vorbehandlung entfernt effektiv Wurzeln und Makrofauna, beseitigt so autotrophe Atmung und ermöglicht einen Fokus auf heterotrophe mikrobielle Aktivität. Obwohl Siebung die ursprüngliche Bodenstruktur verändert, verbessert sie die Homogenität und Reproduzierbarkeit der Proben und erleichtert die Untersuchung mikrobiell gesteuerter Prozesse isoliert⁹. Die Inkubation erfolgt typischerweise unter kontrollierten Umweltbedingungen, wie 25 °C und 60 % der Bodenkapazität, um die mikrobielle Aktivität zu optimieren, ohne spezifische funktionelle Gruppen^zu bevorzugen^. In diesem Zusammenhang sind Bodenfeuchte und Feldkapazität kritische Parameter, da die mikrobielle Atmung sehr empfindlich gegenüber der Wasserverfügbarkeit ist, die die Substratdiffusion, die Sauerstoffversorgung und den mikrobiellen Stoffwechsel reguliert. Aus diesem Grund werden Basalatmungsmessungen üblicherweise unter standardisierten Feuchtigkeitsbedingungen durchgeführt, die als Anteil der Feldkapazität angegeben werden. Das über eine Inkubationszeit entwickelte C-CO₂ wird als Maß für die basale Atmung¹⁵ quantifiziert.

Dieses Protokoll eignet sich besonders für kontrollierte Laborinkubationsstudien, die darauf abzielen, die mikrobielle Aktivität mittels basaler Atmung in vorkonditionierten Böden zu bewerten. Es ist besonders nützlich zum Vergleich von Böden, die verschiedenen Managementpraktiken unterliegen, wie organischer Bearbeitung oder anderen Störungen, unter Verwendung homogenisierter Proben unter standardisierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen. Da pflanzliche CO₂-Eingaben ausgeschlossen sind, ist die Methode am geeignetsten, um die heterotrophe Komponente der Bodenatmung und nicht die gesamte Bodenatmung unter Feldbedingungen zu bewerten.

Mehrere analytische Techniken wurden zur Quantifizierung der Bodenatmung entwickelt, wobei jede in Empfindlichkeit, Durchsatz und Betriebskomplexität^{variiert 9,16}. Klassische Ansätze umfassen Alkaliabsorption gefolgt von Titration, leitfähige Systeme, Gaschromatographie und Infrarotgasanalyse. Alkalibasierte Methoden sind robust und relativ kostengünstig, bieten jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung und können durch unvollständige CO₂-Absorption oder -Leckage beeinflusst werden. Leitfähige Methoden ermöglichen kontinuierliche Messungen, obwohl sie von Temperatur und Ionenfestigkeit beeinflusst werden können. Die Gaschromatographie liefert eine präzise CO₂-Quantifizierung des Kopfraums und ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung anderer Gase, erfordert jedoch spezialisierte Instrumentierung und geschultes Personal, und der Durchsatz kann begrenzt sein. Im Gegensatz dazu ermöglichen Infrarotgasanalysatoren (IRGA) eine schnelle und wiederholte Überwachung der CO₂-Konzentration unter kontrollierten Inkubationsbedingungen, was sie besonders nützlich für zeitaufgelöste Messungen der mikrobiellen Atmung macht. IRGA-Messungen erfordern jedoch auch eine angemessene Kalibrierung und sorgfältige Kontrolle der Inkubationsbedingungen, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, und können durch Signaldrift, Wasserdampfstörungen und verminderte Zuverlässigkeit bei hohen CO₂-Konzentrationen beeinflusst werden. Jüngste Entwicklungen haben die Verfügbarkeit von infrarot- und NDIR-basierten Bodenrespirationssystemen erweitert, einschließlich kostengünstigerer kammerbasierter und sensorbasierter Plattformen für Labor- und Feldanwendungen ^24,25. Bei geschlossenen Phiolinkubationen sollten das Verhältnis von Kopfraum zu Boden und das Intervall zwischen den Messungen entsprechend der erwarteten Atmungsrate angepasst werden, um eine übermäßige CO₂-Anreicherung während der Inkubation zu vermeiden. Neue, auf IRGA basierende Protokolle wurden ebenfalls veröffentlicht, um standardisierte Labormessungen der Bodenatmung unter kontrollierten Inkubationsbedingungen^{zu unterstützen (26,27}), und im aktuellen FAO-Protokoll²⁸ wurden standardisierte methodische Leitlinien für Messungen der Bodenatmung vorgeschlagen.In diesem breiteren Kontext kann die basale Atmung auch als eine Komponente der Bodengesundheitsbewertung in langfristigen landwirtschaftlichen Experimenten betrachtet werden. Sie spiegelt die mikrobielle Stoffwechselaktivität und die C-Mineralisation wider, während Indikatoren wie CO₂-Spülung, permanganat-oxidierbarer Kohlenstoff und organische Kohlenstoffabscheidung im Boden komplementäre Aspekte der Bodenfunktion^{ergänzen 29}. In dieser Studie haben wir eine IRGA verwendet, umdie basalen Atmungsraten aus inkubierten Bodenproben zu quantifizieren. Diese Methode ermöglicht eine wiederholte Überwachung des CO₂-Ausflusses während der Inkubationszeit und erleichtert so die Bewertung der mikrobiellen Stoffwechselaktivität unter definierten Feuchtigkeits- und Wärmebedingungen. Das folgende Protokoll beschreibt das Laborverfahren zur Messung der basalen Bodenatmung in Böden mit unterschiedlichen Managementbedingungen.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Probenentnahme:
   1. Nehmen Sie Proben pro Bodenhorizont oder zwischen 0 und 10 cm im Falle von Oberflächenuntersuchungen.
      HINWEIS: Verwenden Sie desinfizierte Werkzeuge und Handschuhe, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden.
   2. Stellen Sie die Proben in isotherme Beutel und transportieren Sie sie in einer gekühlten Box ins Labor.
   3. Wenn die Bodenvorverarbeitung nicht sofort durchgeführt werden kann, bewahren Sie die Proben bei 4ºC auf (vorzugsweise nicht länger als 48 Stunden).
   4. Lassen Sie die Proben mindestens 2 Stunden vor der Verarbeitung und Inkubation auf Raumtemperatur ausgleichen.
2. Materialvorbereitung und Bodenvorverarbeitung:
   1. Desinfizieren Sie Labormaterialien, indem Sie sie 30 Minuten lang in 10 % Bleichmittel oder 70 % Ethanol tauchen, dann gründlich mit destilliertem Wasser spülen und vor der Anwendung an der Luft trocknen lassen.
      VORSICHT: Verwenden Sie Handschuhe, Laborkittel und Brille, wenn Sie mit diesen Chemikalien arbeiten.
   2. Lassen Sie die Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur zur Stabilisierung stehen.
   3. Siebe die Proben auf 2 mm. Entsorge Wurzeln und grobe Ablagerungen mit einer Pinzette.
   4. Reinigen Sie das Sieb nach jeder Probe mit den Desinfektionslösungen und trocknen Sie sie mit einem Küchenpapier.
3. Bestimmen Sie die Bodenfeuchte (Menge des vorhandenen Wassers) und die Feldkapazität (Wasser, das den Boden halten kann)¹⁷.
   1. Berechnung der Bodenfeuchte: Bestimmung der Bodenfeuchte durch Ofentrocknung (105ºC) von 20 g Probe in einer Keramikkapsel während 24 Stunden¹⁸ [Gleichung 1].
      [Gleichung 1]
   2. Bestimmung der Feldkapazität mit einem "Richards"-Druckmembranapparat¹⁹.
      1. Legen Sie Bodenproben über die Keramikplatten des Geräts, die durch Kunststoffringe abgegrenzt sind.
      2. Gib destilliertes Wasser bis zur Sättigung hinzu und lasse mindestens 24 Stunden stehen. Später wird für weitere 24 Stunden ein Druck von −0,33 bar (−33 kPa) ausgeübt. Bestimme dann die Bodenfeuchte erneut gemäß Gleichung 1.
4. Bodendichte bestimmen (g·^mL-1). Füllen Sie ein geteert und bekanntes Volumenglas mit der ofengetrockneten Bodenprobe und notieren Sie das Gewicht des Bodens. Die Bodendichte ist das Verhältnis von Gewicht zu Volumen des Glases.
5. Probenvorbereitung für die Inkubation:
   1. Stellen Sie die Inkubatortemperatur auf 25 °C ein. Der UNE-EN ISO-Standard 16072:2002 (Soil quality: Laboratory methods for determination of microbial respiration, https://www.iso.org/standard/32096.html) schlägt vor, dass die Temperatur die Vergleichbarkeit zwischen den Studien ermöglicht).
   2. Feuchtigkeitsbedingungen schätzen: Berechnen Sie das für jede Probe benötigte Menge destilliertes Stoff, um 60 % der Feldkapazität von ihrem ursprünglichen Bodenfeuchtegehalt^20,21 zu erreichen. Dies ist der Feuchtigkeitsstand zu Beginn des Experiments, und während der Inkubationszeit ist keine Wasseranpassung erforderlich.
   3. Auswahl der Bodenmenge: Die verwendete Bodenmenge kann je nach organischer Substanz variieren (je höher der organische Gehalt, desto weniger Boden wird für das Experiment benötigt)²¹. Allerdings wird 20 g als Referenzmenge vorgeschlagen.
   4. Proben in 100 ml Glasphiolen geben und destilliertes Wasser bis zu einem Feuchtigkeitsprozentsatz von 60 % Feldkapazität hinzufügen. Versiegeln Sie die Fläschchen mit einem Septaum und legen Sie sie in den Inkubator.

2. CO2-Konzentrationsmessungen

1. Messintervall:
   1. Führen Sie CO2-Messungen in ausgewählten Intervallen entsprechend der erwarteten Atmungsrate des Bodens durch, um eine übermäßige CO₂-Ansammlung im Fläschchenkopf zu vermeiden.
   2. Vermeiden Sie Konzentrationen über 10 % (100.000 ppm), um eine Hemmung der mikrobiellen Aktivität zu verhindern. Verkürze die Messintervalle, wenn die Konzentrationen diese Schwelle überschreiten. Führen Sie in der ersten Woche täglich Messungen durch und danach alle 3 oder 4 Tage im später gezeigten repräsentativen Beispiel.
2. Messungen der CO2-Konzentrationen (%) mit einem Infra-Red Headspace Gas Analyzer (IRGA)
   1. Kalibrieren Sie die IRGA vor jeder Messsitzung gemäß den Herstelleranweisungen oder mit einem Nullstandard (CO₂-freie Luft oder Stickstoff) und mindestens einem Spannstandard mit bekannter CO₂-Konzentration innerhalb des Messbereichs. Überprüfen Sie die Instrumentenstabilität und korrigieren Sie den Basisdrift gemäß den Anweisungen des Herstellers. Protokollieren Sie Kalibrierungsparameter vor Probenmessungen.
   2. Im in der Materialliste beschriebenen IRGA-Gerät wird eine Nadel mit einer Kapillare mit dem Instrument verbunden...
   3. Führe den Neddle durch das Septum in das Fläschchen, um einen Aliquot Gas zu extrahieren und die CO₂-Konzentration (%). zu notieren.
   4. Wiederholte Messungen pro Probe durchzuführen, bis sich das Signal stabilisiert.
3. Probenrekonditionierung
   1. Lassen Sie die Fläschchen nach jeder Messung eine halbe Stunde lang in einem sauberen, vor Staub und Luftströmung geschützten Bereich offen, um die Luft zu erneuern und anaeroben Bedingungen zu vermeiden. Rühren oder rühren Sie den Boden während dieses Belüftungsschritts nicht.
   2. Die Phiolen mit dem Septum wieder abschließen und zurück in die Brutkammer.
4. _{CO2-Korrektur}
   1. Fügen Sie ein Fläschchen ohne Erde, aber mit denselben Betriebsbedingungen hinzu, um eine Lücke zu berücksichtigen.
   2. Subtrahieren Sie die Werte des Blanks von den Proben, um die_{CO2-Bedingungen} in der Umgebung zu entfernen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, in der Nähe der geöffneten Phiolen auszuatmen. Das kann die Ergebnisse verzerren.

3. Berechnung der Bodenbasalatmung (SBR)

1. Bestimmen Sie das Kopfraumvolumen im Fläschchen (Vhs), indem Sie das vom Boden eingenommene Volumen (Volumendichte) und zugesetztes Wasser vom Gesamtvolumen des Fläschchens abziehen [Gleichung 2].
2. Schätzen Sie das Bodenvolumen anhand von Volumendichtemessungen und berechnen Sie das Wasservolumen aus der hinzugefügten Feuchtigkeit. Verwenden Sie dieses korrigierte Headspace-Volumen in allen nachfolgenden Berechnungen.
3. Bestimmung des Kopfraumvolumens im Fläschchen (Vhs): Es bezieht sich auf das Volumen des Fläschchens minus das Volumen des Bodens und Wassergehalts [Gleichung 2].
   [Gleichung 2]
4. Schätzung des CO₂-Volumens im Fläschchen
   1. Ermitteln Sie das CO₂-Volumen im Fläschchen aus den IRGA-Werten der_{CO-2-Konzentration} (%), wobei der effektive Kopfeffekt des Volumens des Fläschchens [Gleichung 3] berücksichtigt wird.
      
      [Gleichung 3]
5. Schätzung der CO₂-Mol, die aus den Bodenproben ausgeatmet wurden:
   1. Erhalten Sie CO₂-Mol, die aus den Bodenproben ausgeatmet werden, indem Sie n in der Gleichung des idealen Gasgesetzes lösen (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Gleichung 4], nachdem Sie das zuvor berechnete V in [Gleichung 3] ersetzen.
      [Gleichung 4]
6. Schätzung des CO₂-Flusses (mg C-CO₂ ^kg-1 trockener Boden Tag ¹)
   1. Einzelne Messungen von %_CO2 müssen hinzugefügt werden, und der endgültige_CO2-Fluss wird mit [Gleichung 5] geschätzt, wobei folgende Überlegungen folgen: i) korrektes Probengewicht unter Berücksichtigung der Bodenfeuchte; ii) bedenken, dass ein Mol_CO2 12 g C (12.000 mg C) ausmacht.
      
      [Gleichung 5]
      wobei:
      P = Gasdruck im Fläschchen. Das sollte dem atmosphärischen (momentan) entsprechen. Passen Sie Ihre Standortwerte an.
      Vhs = Gaskopfraumvolumen im Fläschchen (L)
      [% CO₂ ]=_{CO2-Konzentration} , gemessen mit der IRGA
      R = Gaskonstante = 0,082 L·atm· K⁻¹·mol⁻¹
      T = Inkubationstemperatur in Kelvin
      Trockener Boden = trockene Bodenmasse in kg
      t = Inkubationszeit in Tagen
      Ein zusammenfassender Arbeitsablauf des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Arbeitsablauf des IRGA-basierten Bodenbasalatmungsprotokolls, von der Bodenprobenahme und Vorkonditionierung bis hin zur Inkubation, IRGA-Messung und Berechnungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Die in diesem Artikel gezeigten Ergebnisse entsprechen einem Experiment, bei dem wenig fruchtbare Böden mit Kompost behandelt wurden, um die Fruchtbarkeit und die mikrobiologische Aktivität zu erhöhen. Die ursprünglichen Böden wurden in der "Tabernas-Wüste" (Südostspanien) vermessen, einer Region mit halbtrockenem Klima und schlecht entwickelten Böden²². Ungefähr 40 kg der oberen 30 cm eines landwirtschaftlichen Feldes wurden beprobt, ins Labor gebracht und 2 mm g...

Diskussion

Die Bodenatmung ist ein sensibler Indikator für mikrobielle Aktivität und Zersetzung organischer Substanz und liefert bemerkenswerte Informationen über die Auswirkungen des Bodenmanagements ^23,24. Der in diesem Artikel beschriebene experimentelle Ansatz bietet einen einfachen und leistungsstarken Rahmen zur Quantifizierung der mikrobiellen Aktivität im Boden durch CO₂-Emissionsmessungen unter kontrollierten Laborbedingungen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 mm Sieb
Luftdichte Kolben oder Fläschchen mit Septen (100 mL)
Analysenwaage
Bar-Druckplatten-Extraktor	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Zur Berechnung der Feldkapazität
Deionisiertes Wasser oder destilliertes Wasser sterilisiert
Inkubatorausrüstung	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Unverbesserlicher Marker
IRGA CO2-Konzentrationsmesser	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
Isotherme Beutel und Box			Zum Transport von Böden ins Labor
Laborofen			Es muss eine Einstellung von 105ºC ermöglichen
Laminar-Fluss-Kammer	CRUMA	HZ-1	Optional in Schritt 2.3
Septumstopfen zum festen Verschließen von Fläschchen
Bodenproben			Repräsentativ aus dem zu untersuchenden Bereich entnommen.
Sterilisierende Reagenzien			Es kann Bleichmittel (10%) oder Ethanol (70%) verwendet werden