Ein standardisiertes Protokoll zur Bewertung der Cadmium-Toxizität in menschlichen kolorektalen Organoiden mittels Luciferase-basiertem Viabilitätstest

Summary

Das Protokoll zielt darauf ab, menschliche kolorektale Organoide zu etablieren und einen luciferasebasierten ATP-Biolumineszenz-Test zur Erkennung von kadmiuminduzierter Toxizität zu evaluieren. Er bewertet die Machbarkeit und Empfindlichkeit des Tests, indem er dosis- und zeitabhängige Veränderungen der Organoid-Lebensfähigkeit quantifiziert.

Abstract

Cadmium (Cd) ist als Krebserreger der Gruppe 1 klassifiziert und stellt ein ernsthaftes globales Umweltproblem dar. Diese Studie zielte darauf ab, ein Modell des menschlichen kolorektalen Organoids zu entwickeln und die Machbarkeit und Empfindlichkeit eines luciferasebasierten ATP-Biolumineszenztests zur Erkennung toxischer Reaktionen kolorektaler Organoide (COs) auf CD-Exposition zu bewerten. Stammzellen wurden aus menschlichem kolorektalem Gewebe isoliert und in einer dreidimensionalen Basalmembranmatrix kultiviert, um COs zu erzeugen. Organoide wurden mit einer abgestuften Serie von CD-Konzentrationen für unterschiedliche Expositionsdauern behandelt. Ein lumineszierendes Viabilitätsreagenz wurde bei gleichem Volumenverhältnis hinzugefügt, sanft durch Schaukeln bei Raumtemperatur gemischt, um Lyse und Reagenzpenetration zu fördern, und anschließend inkubiert, um die biolumineszente Reaktion fortsetzen zu lassen. Die Lumineszenz wurde im Lumineszenzmodus auf einem Multimode-Mikroplattenleser aufgezeichnet. Die Dosis-Antwort-Kurven-Anpassung wurde verwendet, um die halbmaximale inhibitorische Konzentration zu berechnen und Veränderungen der Viabilität oder der relativen Viabilität zu bewerten. Primäre Stammzellen wurden erfolgreich aus menschlichem kolorektalem Gewebe isoliert und zur Erzeugung von COs verwendet. Die CD-Exposition führte zu dosisabhängigen und zeitabhängigen Absenkungen der organoiden Stoffwechselaktivität; Die Dosis-Response-Analyse ergab Überlebenskurven und IC50-Werte für die Organoide. Diese Studie bietet methodische Leitlinien und praktische Einblicke zur Nutzung menschlicher COs in Umwelt-Schwermetalltoxikologiestudien.

Introduction

Cd ist ein natürlich vorkommendes Schwermetall, das als Gruppe-1-Karzinogen eingestuft wird und zu einem globalen Umweltproblem^{geworden ist}. Die menschliche Exposition gegenüber CD erfolgt hauptsächlich durch Einatmen und Nahrungsaufnahme. Obwohl chronische Low-Dose-Exposition mit einer Reihe von gesundheitlichen Nebenwirkungen verbunden ist, bleibt eine erhebliche Reduzierung der Nutzung und der Umweltfreisetzung^{eine Herausforderung 2,3}. Traditionelle zweidimensionale Kulturen wachsen auf flachen Substraten und besitzen keine Gewebearchitektur, Zellpolarität und das Mikroumfeld des Tumors. Folglich besitzen sie eine begrenzte Fähigkeit, in vivo Heterogenität und authentische toxikologische Reaktionen auf Cadmiumexposition nachzubilden⁴. Solche Systeme können Zell-Zell-Interaktionen, matrixabhängiges Wachstum oder die biologischen Prozesse, die der Entwicklung der Arzneimittelresistenz zugrunde liegen,^nicht ausreichend modellieren. Dreidimensionale organoide Systeme, die aus Patientengeweben abgeleitet sind, bieten eine physiologisch relevantere Plattform im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Zelllinien⁶. Organoide behalten die genomischen Merkmale, die histologische Organisation und die funktionellen Zustände des Primärgewebes bei. Dies ermöglicht eine genauere Modellierung des Tumorwachstums, der Evolution und der Empfindlichkeit gegenüber Cadmium-Toxizität und bietet klare Vorteile für Krankheitsmodellierung und toxikologische Forschung⁷. COs besitzen eine komplexe dreidimensionale Architektur, zelluläre Heterogenität und intrinsische Fähigkeiten zur Selbsterneuerung und Selbstorganisation ^8,9. Die Transplantation von COs in Empfängermäuse kann die Selbsterneuerung der intestinalen Stammzellen fördern und die Immunmikroumgebung des Wirts modulieren, wodurch sie schützende Effekte erzeugt⁴. Im Jahr 2009 zeigten Sato et al. erstmals, dass eine einzelne Lgr5⁺-adulte Darmstammzelle sich spontan selbst organisieren und differenzieren kann, um Krypt-Villus-Strukturen zu bilden, die alle Intestinalzelllinien^{umfassen 10}.

Das Darmepithel bildet die erste Verteidigungslinie gegen CD-Toxizität nach der Aufnahme. Tatsächlich liegt die orale Bioverfügbarkeit von Cd typischerweise unter 5%. Cd-induzierte Darmtoxizität ist gekennzeichnet durch die Störung interzellulärer Übergänge, eine erhöhte parazelluläre Durchlässigkeit und die Induktion von Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus beeinträchtigt Cd die Immunfunktion des Darms und verändert die Zusammensetzung und Homöostase der Darmmikrobiota¹¹. Je nach Expositionsdosis und -dauer kann Cd eine Dysregulation des Zellzyklus verursachen, was in manchen Kontexten onkogene Phänotypen fördert und in anderen Apoptose auslöst. Cd kann indirekt die ROS-Produktion (reaktive Sauerstoffspezies) anregen, was oxidativen Stress und Redoxungleichgewicht auslöst. Die Funktion von Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, Proteasen, Adhäsionsmolekülen und Transkriptionsfaktoren kann durch Redox-Signalgebung moduliert werden. Cd stört außerdem Signalkaskaden und verändert den Aktivierungsstatus von ERK1/2, JNK (c-Jun N-terminale Kinase) und p38 MAPK (p38 mitogenaktiviertes Proteinkinase) über mehrere Zelltypen¹². Durch die Aktivierung von ERK1/2 innerhalb der MAPK-Kaskade kann Cd die Zellproliferation und das Überleben fördern, den programmierten Zelltod unterdrücken und zur aberranten Hyperproliferation¹³ beitragen. Cd kann die Expression und Aktivität wichtiger Effektorproteine direkt oder indirekt regulieren. So wird beispielsweise der Tumorsuppressor p53 herunterreguliert und anti-apoptotische Proteine wie Bcl-2 und Bcl-xL hochreguliert, wodurch letztlich die Apoptose und die Zellzyklus-Homöostase¹⁴ gestört werden.

In CO-Modellen, die zur Bewertung der zytotoxischen Effekte von Cd verwendet werden, wird die Messung des ATP-Gehalts häufig verwendet, um die Lebensfähigkeit organoider zu bewerten. ATP, das zentrale Molekül des Energiestoffwechsels, spiegelt direkt den allgemeinen Stoffwechselzustand und die Lebensfähigkeit der Organoiden wider. Bei der Cadmium-Exposition bei COs induziert Cd hauptsächlich mitochondriale Dysfunktion, verschärft oxidativen Stress und stört die Homöostase der organoiden Energie. Diese Ereignisse beeinträchtigen die ATP-Produktion kollektiv und verringern letztlich die Lebensfähigkeit der Organoiden. Daher dienen Veränderungen der ATP-Spiegel als robuste funktionelle Anzeige der durch Kadmium induzierten Zytotoxizität. Konventionelle Zytotoxizitätstests umfassen kolorimetrische MTT/CCK-8-Tests, Live/Dead-Färbungen und Flowzytometrie-basierte Analysen. Im Vergleich zu diesen Methoden bieten ATP-basierte Tests deutliche Vorteile in dreidimensionalen Organoidsystemen. Aufgrund der strukturellen Komplexität und ausgeprägten räumlichen Heterogenität der Organoide sind traditionelle Färbungs- und Bildgebungsmethoden oft durch unzureichende Gewebepenetration und geringere quantitative Genauigkeit eingeschränkt. Im Gegensatz dazu basieren ATP-Assays auf einer luciferase-vermittelten biolumineszenten Reaktion, die eine direkte Quantifizierung ermöglicht, ohne die Organoidstruktur zu stören. Die ATP-Messung zeigt eine hohe Empfindlichkeit und einen breiten Dynamikbereich. Dies ermöglicht den Nachweis kontinuierlicher biologischer Reaktionen, die von früher metabolischer Unterdrückung bis zum Organoid-Tod reichen, und ermöglicht genaue Dosis-Antwort-Analysen über unterschiedliche Cadmiumkonzentrationen. ATP-Werte spiegeln umfassend den allgemeinen Funktionszustand der Organoide wider und übertreffen Ansätze, die auf morphologischer Bewertung oder einzelnen molekularen Markern basieren. Daher eignet sich dieser Test besonders gut für Hochdurchsatz-Toxizitätsscreenings und bietet verbesserte Stabilität und Reproduzierbarkeit.

Das Kernprinzip, das der Verwendung von ATP-Biolumineszenz zugrunde liegt, um die Empfindlichkeit von COs gegenüber CD-Exposition zu bewerten, ist, dass die Glühwürmchenluciferase die Oxidation von D-Luciferin in Gegenwart von ATP, Mg²⁺ und O₂ katalysiert, um Oxyluciferin zu produzieren und Photonen auszustrahlen. Die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zum messbaren ATP-Gehalt in der Probe innerhalb eines definierten linearen Bereichs. Daher dient Lumineszenz als indirekter quantitativer Ersatz für zelluläre metabolische Aktivität oder Lebensfähigkeit. Organoide sind in eine extrazelluläre Matrix eingebettet und besitzen eine mehrschichtige, dreidimensionale Struktur. Um dies zu berücksichtigen, verfügen ATP-Assay-Reagenzien über optimierte Lysis-Puffer-Zusammensetzungen und -Verfahren. Diese Optimierungen verbessern die Störung innerer organoider Zellen, fördern die ATP-Freisetzung und stabilisieren das biolumineszente Signal¹⁵. Wichtig ist, dass ATP-Biolumineszenz eine metabolische Aktivität anzeigt und nicht eine exakte Zellzahl. So können mitochondriale Inhibitoren beispielsweise die zellulären ATP-Spiegel in kurzen Abständen deutlich senken, selbst wenn die Zellen lebensfähig bleiben. Umgekehrt können einige frühe Formen des Zelltodes relativ hohe ATP-Werte vorübergehend erhalten.

Trotz überlegener physiologischer Relevanz bei Cadmium (Cd)-Toxizitätsbewertungen weisen kolorektale organoide Modelle mehrere praktische Einschränkungen auf. Im Vergleich zu traditionellen zweidimensionalen (2D) Zelllinien ist die Kultivierung von Organoiden zeitaufwändiger und kostenintensiver. Darüber hinaus führt ihre Abhängigkeit von tierischen Matrizen zu Batch-zu-Charge-Variabilität, was ihren Nutzen bei groß angelegten, hochdurchsetzenden Toxizitätsscreenings einschränkt. Obwohl diese Modelle sehr geeignet sind, um die direkten toxikologischen Effekte von Schwermetallen auf das Darmepithel zu bewerten, können sie in-vivo-Modelle zur Bewertung systemischer Toxizität oder komplexer toxikokinetischer Prozesse noch nicht vollständig ersetzen.

In dieser Studie wurde menschliches kolorektales Gewebe als Ausgangsmaterial zur Isolierung kolorektaler Stammzellen und zur Etablierung von COs in vitro verwendet. Organoide wurden Cd in unterschiedlichen Konzentrationen und für unterschiedliche Expositionsdauern ausgesetzt. Die Lumineszenz wurde anschließend mit dem Multimode-Mikroplatten-Leser im Lumineszenzdetektionsmodus gemessen. Die Zellviabilität oder IC50-Werte wurden mit Betriebssoftware für einen bestimmten Mikroplattenleser berechnet und visualisiert.

Protocol

Das Experiment wurde vom Ethikausschuss des Suzhou Berufsgesundheitskollegs genehmigt (Genehmigungsnummer SWYXLL202516) und wurde gemäß medizinischen ethischen Standards durchgeführt. Alle Probanden dieser Studie haben schriftliche informierte Zustimmung eingeräumt.

1. Isolierung menschlichen Kolorektalgewebes und Etablierung von COs

1. Transport und Konservierung von Gewebeproben
   1. Vor dem Experiment wird die Basalmembranmatrix langsam bei 4 °C aufgetaut und das erforderliche Kulturmedium auf Raumtemperatur ausgeglichen.
   2. Geben Sie das menschliche Darmgewebe, das durch klinische Verfahren gewonnen wurde, sofort in eine vorgekühlte Gewebekonservierungslösung (2–8 °C) ein.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des Transports vollständig untergetaucht bleibt. Übertragen Sie die Proben ins Labor.
2. Unter einem Biosicherheitsschrank wird das Gewebe zur Begutachtung in eine 6 cm große Kulturschale gelegt. Entfernen Sie vorsichtig sichtbares Fettgewebe und Muskelschichten mit einem Skalpell und einer Pinzette, wobei die Epithelkomponenten erhalten bleiben.
3. Übertragen Sie das Gewebe in eine 6 cm große Schale mit 3 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 300 μL Antibiotika. Schneiden Sie das Gewebe in 2 mm × 5 mm große Fragmente.
4. Transferiere die Gewebefragmente in ein 50-mL-Zentrifugenrohr.
5. Gib 10 ml vorgekühltes PBS und 200 μL 0,5 M EDTA (Endkonzentration ~10 mM) in das Rohr.
6. Setze den Schlauch auf einen Shaker bei Zimmertemperatur und rühre ihn vorsichtig bei 0,072 g für 15 Minuten.
7. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe in die Kulturschale zu übertragen und unter dem Mikroskop zu untersuchen. Gehen Sie zum nächsten Schritt über, sobald die Gruftstrukturen sichtbar werden oder sich zu lösen beginnen.
   HINWEIS: Wenn Kryptstrukturen nach der EDTA-Behandlung unter mikroskopischer Beobachtung sichtbar werden, hat die Verdauung im Allgemeinen ein ausreichendes Niveau für Kryptisolierung erreicht, und Krypten beginnen, sich von gelockerten Epithelgewebefragmenten abzulösen. Intakte Krypten behalten typischerweise eine gut definierte Drüsen- oder Röhrenmorphologie mit einem erkennbaren zentralen Lumen, während eine übermäßige Verdauung große Mengen dissoziierter Einzelzellen und nekrotischer Ablagerungen erzeugt.
8. Die Verdauung wird beendet, sobald zahlreiche intakte Krypten sichtbar werden und Gewebefragmente lose und durchsichtig erscheinen, was sanftes Pipettern ermöglicht, um Krypten leicht freizugeben.
   HINWEIS: Eine verlängerte EDTA-Inkubation stört die Integrität der Krypt, erhöht die Ansammlung von Zellresten und verringert die Lebensfähigkeit von Darmstammzellen, wodurch die nachfolgende Effizienz der Organoidbildung verringert wird.
9. Fügen Sie 15 ml antibiotika-supplementiertes PBS hinzu, um die EDTA-Verdauung zu stoppen. Mische vorsichtig.
10. Zentrifugiere die Probe bei 300 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
11. Entferne das Überwasser.
12. Fügen Sie 1 ml vollständiges Zellmedium hinzu und übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
13. Zentrifugieren Sie die Federung bei 300 × g für 3 Minuten und entsorgen Sie den Überstandsmittel.
14. Fügen Sie 500 μL der Basalmembranmatrix in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr hinzu und mischen Sie gut.
15. Minimieren Sie die Exposition gegenüber Raumtemperatur beim Mischen und lassen Sie die Kellermembranmatrix auf Eis, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern.
16. Geben Sie 25 μL der Mischung tropfenweise in jede Mulde der 24-Bohrloch-Platte, um einen Tröpfchen zu bilden.
17. Invertiere die 24-Bohrloch-Platte und bebrüte sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 20 Minuten.
18. Fügen Sie jedem Brunnen 600 μL CO-Kulturmedium hinzu.
19. Beziehen Sie kolorektale organoide Kulturmedium und Dissoziationsreagenzien aus kommerziellen Quellen und verwenden Sie sie strikt gemäß den Anweisungen des Herstellers.
20. Zur Herstellung des vollständigen Zellkulturmediums werden 500 ml DMEM-Basalmedium mit 50 ml fetalem Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin ergänzt. Mische die Lösung gründlich durch sanfte Inversion.

2. Sensitivitätstest von COs, die Cd ausgesetzt sind

1. Beschichtung und Kultivierung von COs in 96-Well-Platten
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 500 μL organoide Dissoziationslösung hinzu. Pipette vorsichtig auf und ab, um die Basalmembranmatrix zu verteilen.
   2. Stellen Sie die behandelte Platte in einen 37 °C, 5 % CO₂-Inkubator zur Verdauung, mit einer anfänglichen Verdauungszeit von 10 Minuten.
   3. Nehmen Sie die Verdauungslösung aus jedem Bohrloch der 24-Loch-Platte in ein 15-mL-Zentrifugenrohr auf und fügen Sie 10 ml vollständiges Zellkulturmedium hinzu.
   4. Zentrifugiere bei 300 × g für 3 Minuten, um das Organoid aufzusammeln und den Überstand zu entsorgen.
   5. Fügen Sie 1 ml vollständiges Zellkulturmedium hinzu, mischen Sie gründlich durch Pipettieren und übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
   6. Zentrifugiere bei 300 × g für 3 Minuten und entsorge dann das Supernatant.
   7. Fügen Sie 100 μL der Kellermembranmatrix hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipetten.
   8. Dissoziieren Sie die Organoide und schätzen Sie die Anzahl der Einzelzellen unter dem Mikroskop, bevor Sie etwa 3.000–5.000 einzelne Zellen pro Bohrloch aussäen.
   9. Halten Sie eine relativ konstante Aussaatdichte in allen Versuchsgruppen aufrecht, um reproduzierbares Organoidwachstum und experimentelle Ergebnisse sicherzustellen.
   10. Anpassung des Saatbereichs basierend auf mikroskopischer Untersuchung nach der Organoid-Dissoziation und auf zuvor berichteten Bedingungen, die häufig in Organoidkulturstudien verwendet werden.
   11. Fügen Sie 6 μL des Gemisches in die Mitte jedes Bohrlochs einer 96-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie insgesamt 30 Brunnen, mit drei technischen Nachbildungen.
   12. Die Platte invertieren und bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Brutkasten 15 Minuten lang inkubieren.
   13. Fügen Sie 100 μL Organoid-Kulturmedium zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte hinzu.
   14. Beginnen Sie die Cadmiumbehandlung genau 7 Tage nach der Aussaat.
       HINWEIS: Diese 7-tägige Kulturzeit ermöglicht es einzelnen Zellen, sich vollständig zu strukturell intakten COs zu entwickeln.
2. CD-Konzentrationsverdünnung
   1. Lösen Sie 3,67 mg Cadmiumchloridpulver in 2 ml steriles ultrareines Wasser, um eine 10 mM große Lagerlösung mit einem Endvolumen von 2 ml herzustellen.
   2. Sterilisieren Sie die 2 mL 10 mM Cadmium-Lösung, indem Sie sie durch einen 0,22 μm-Filter leiten.
   3. Aliquot die sterilisierte Cadmium-Lösung in 1,5-mL-Zentrifugenröhren und diese bei 4 °C, geschützt vor Licht, lagern.
   4. Tragen Sie während des gesamten Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrillen.
   5. Führen Sie alle entsprechenden Operationen in einer chemischen Abzugshaube durch, um das Expositionsrisiko zu minimieren.
   6. Klassifizieren und verwalten Sie alle CD-haltigen Abfälle, einschließlich cadmiumhaltiger Kulturmedien, Pipettenspitzen, Zentrifugenröhren und Kulturschalen, als gefährliche chemische Abfälle.
   7. Entsorgen Sie diese Materialien in ausgewiesenen Behältern zur Sammlung von Schwermetallen, Flüssigkeiten oder festen Abfällen.
   8. Entsorgen Sie alle Abfälle strikt gemäß institutionellen Richtlinien und lokalen Umweltvorschriften.
   9. Behandle niemals CD-Abfälle als allgemeinen Labormüll oder schütte ihn in die Spüle.
   10. Beschrifte den Deckel einer 24-Well-Platte mit 4, 3, 2, 1 und 0.
       HINWEIS: Behandeln Sie die Organoide mit Cd bei Endkonzentrationen von 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM und 0 μM. Die Verdünnung der Cadmium-Lagerlösung wurde mit der Standardformel berechnet:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Um 4 mL der Arbeitskonzentration von 20 μM herzustellen, fügen Sie 8 μL der 10 mM großen Lagerlösung zu 3992 μL vollständigen Kulturmediums hinzu. Mischen Sie die Lösung gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
   1. Fügen Sie 1,4 ml Kulturmedium zu den gut gekennzeichneten 4 hinzu und fügen Sie jedem der verbleibenden Bohrungen 700 μL Kulturmedium hinzu.
   2. Entnehmen Sie 5,6 μL Kulturmedium aus dem mit der Beschriftung 4 gekennzeichneten Bohrloch und fügen Sie 5,6 μL Cadmiumlösung hinzu. Gründlich mischen.
   3. Übertragen Sie 700 μL der Lösung von der Well, die mit der Beschriftung '4' gekennzeichnet ist, auf die Well, die mit der Beschriftung '3' gekennzeichnet ist, und mischen Sie gründlich.
   4. Wiederholen Sie den Transfer- und Mischprozess von jedem Bohrloch zum nächsten niedriger nummerierten Brunnen (von '3' zu '2', '2' zu '1' und von '1' bis '0') und mischen Sie bei jedem Schritt gründlich.
      HINWEIS: Führen Sie keine Operation im mit 0 bezeichneten Brunnen aus.
   5. Entferne die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und entsorge das vorhandene Kulturmedium.
   6. Beschriften Sie den Deckel der 96-Well-Platte von links nach rechts mit 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM und 0 μM.
   7. Fügen Sie jedem entsprechenden markierten Bohrloch 100 μL cadmiumhaltiges Kulturmedium hinzu.
   8. Stelle den Teller in den Inkubator.

3. Hinzufügung des lumineszierenden Viabilitätsreagens

1. Entferne das lumineszente Viabilitätsreagenz aus dem −20 °C Gefrierfach und lasse es bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie das lumineszente Viabilitätsreagenz in einem 1:1-Volumenverhältnis hinzu.
2. Fügen Sie 2,5 ml lumineszente Viabilitätsreagenz in ein Einweg-Reagenzreservoir hinzu.
3. Fügen Sie 2,5 ml kolorektale organoide Kulturmedium hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipetten.
4. Verwenden Sie ein Abfall-Aspirationssystem, um das Organoid-Kulturmedium aus jedem Bohrloch der 96-Well-Platte zu entfernen. Vermeiden Sie es, die Basalmembranmatrix aus den Bohrlöchern zu aspirieren.
5. Übertragen Sie 200 μL der Lösung aus dem Einweg-Reagenz-Reservoir in jeden Brunnen der 96-Brunnen-Platte mit COs und mischen Sie gründlich durch kräftiges Pipetteren. Vermeiden Sie es, während des Pipetterens Luftblasen einzuführen.
6. Den Teller 25 Minuten bei Zimmertemperatur bebrüten. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur und geschützt vor Licht.

4. Messung der lumineszierenden Viabilitätsreagenz

1. Öffnen Sie die Betriebssoftware für den spezifischen Mikroplattenleser (ergänzende Abbildung 1A).
2. Klicken Sie auf Jetzt lesen (ergänzende Abbildung 1B).
3. Klicken Sie auf Neu (ergänzende Abbildung 1B).
4. Klicken Sie auf Lesen (ergänzende Abbildung 1C).
5. Wähle Lumineszenz (ergänzende Abbildung 1D).
6. Wählen Sie Lumineszenzfaser (ergänzende Abbildung 1D).
7. Klicken Sie OK (ergänzende Abbildung 1D).
8. Wählen Sie Vollplatte (ergänzende Abbildung 1E).
9. Klicken Sie auf Alle löschen (ergänzende Abbildung 1F).
10. Wählen Sie die entsprechenden Positionen auf der Ziel-96-Well-Platte aus, insgesamt 15 Wells (ergänzende Abbildung 1G).
11. Klicken Sie auf OK (ergänzende Abbildung 1G).
12. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Instrument ein (ergänzende Abbildung 1H).
13. Verwenden Sie Deckel (ergänzende Abbildung 1I).
14. Klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten (ergänzende Abbildung 1I).
15. Nach Abschluss der Messung klicken Sie auf Exportieren, um die Daten nach Excel zu exportieren (ergänzende Abbildung 1J).

5. Datenverarbeitung und -analyse

1. Offene Software zur statistischen Datenanalyse, die nichtlineare Regression ermöglicht. (Ergänzende Abbildung 2A).
2. Wählen Sie eine XY-Datentabelle aus (ergänzende Abbildung 2A).
3. Setze X auf Zahlen (ergänzende Abbildung 2A).
4. Stellen Sie Y ein, um Replikationswerte in nebeneinander angeordneten Unterspalten einzugeben und 3 Replikate einzugeben (ergänzende Abbildung 2A).
5. Hier kommen die Daten ein (ergänzende Abbildung 2B).
6. Klicken Sie auf Analysen (ergänzende Abbildung 2C).
7. Klicken Sie auf XY-Analysen (ergänzende Abbildung 2D).
8. Klicken Sie auf Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) (ergänzende Abbildung 2D).
9. Klicken Sie OK. (Ergänzende Abbildung 2D).
10. Select Dose–Response – Hemmung (ergänzende Abbildung 2E).
11. Log (Inhibitor) vs. normalisierte Reaktion auswählen – Variable Steigung (ergänzende Abbildung 2E).
12. Klicken Sie auf OK, um die Analyse durchzuführen (ergänzende Abbildung 2E).
13. Klicken Sie auf Datei (ergänzende Abbildung 2F).
14. Klicken Sie auf Exportieren (ergänzende Abbildung 2F).
15. Klicke OK (ergänzende Abbildung 2G).

Results

Einrichtung menschlicher COs
Wir isolierten erfolgreich kolorektale Kryptstrukturen aus Gewebeproben, und eine typische Kryptmorphologie wurde sowohl unter Niedrig- als auch Hochvergrößerungsmikroskopie deutlich beobachtet. Während der In-vitro-Kultur dehnten sich die isolierten Krypten allmählich aus und zeigten einen geordneten morphologischen Reifungsprozess (Abbildung 1A,B). Am Tag 3 und 6 der Kultur hatten sich strukturell intakte kolorektale Organoide gebildet, die überwiegend kugelförmige oder frühknospige Strukturen aufwiesen (Abbildung 1C,D).

Empfindlichkeit von COs gegenüber CD-Exposition
COs wurden in 96-Well-Platten ausgesät und weitere 5 Tage kultiviert, gefolgt von einer Behandlung mit Cadmium in Konzentrationen von 0, 5, 10, 20 und 40 μM. Nach 72 Stunden Belichtung wurde ein ATP-basierter Lumineszenztest durchgeführt, um relative Lumineszenzeinheiten (RLU) zu messen, und die Daten wurden analysiert und visualisiert. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten dosisabhängigen Rückgang der Organoid-Lebensfähigkeit bei steigenden Cadmiumkonzentrationen (Abbildung 2A). COs, die 10 μM, 20 μM und 40 μM Kadmium ausgesetzt waren, wiesen deutlich reduzierte RLU-Werte auf (Abbildung 2B). Wir beobachteten keine signifikante Toxizität bei kolorektalen Organoiden, die 5 μM Cd ausgesetzt waren. Im Einklang mit den Viabilitätsdaten zeigte die morphologische Analyse ausgeprägte strukturelle Veränderungen bei kadmiumbehandelten kolorektalen Organoiden, einschließlich verkleinerter Organoidgröße, schwerer Störung der epithelialen Architektur und fortschreitender struktureller Fragmentierung (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kolorektale Organoide hochsensibel gegenüber cadmiuminduzierter Zytotoxizität sind.

Abbildung 1: Isolierung menschlicher kolorektaler Krypten und Etablierung kolorektaler organoider Kulturen. (A) Repräsentatives Bild isolierter menschlicher kolorektaler Krypta. (10×). (B) Hochvergrößerungsansicht einer einzelnen Krypta (20×). (C) Repräsentatives Bild der COs nach 3 Tagen in der Kultur (4×). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Cd-induzierte zytotoxische und morphologische Veränderungen bei COs. (A) Relative Dosis-Antwort-Kurve der COs, die unterschiedlichen Konzentrationen von Cd ausgesetzt sind. Die X-Achse stellt die Cd-Konzentrationen dar, die y-Achse zeigt die relative Organoid-Viabilität an. (B) Relative RLU-Werte der COs nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cd. Die X-Achse stellt die Cd-Konzentrationen dar, und die Y-Achse gibt die relativen RLU-Werte an. Einweg-ANOVA *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Repräsentative Hellfeldbilder unbehandelter (0 μM) und CD-behandelter COs bei 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Ein detaillierter 16-Schritte-Workflow zur RLU-Detektion unter Verwendung der Betriebssoftware für einen bestimmten Mikroplattenleser. (A) Software-Symbol. (B) Softwarestart-Schnittstelle. (C) Einstellungsmenü. (D) Schnittstelle zur Auswahl des Tests. (E) Menü zur Konfiguration des Kennzeichenlayouts. (F) Standard-Kennzeichenlayout. (G) Stellen Sie die Bohrlochpositionen gemäß dem Layout der experimentellen Platten an. (H) Mikroplate wird geladen. (I) Das Instrument initiiert die RLU-Messung. (J) Datenexport. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Folgende Datenexport, Datenverarbeitung und statistische Analyse werden in der Software zur statistischen Datenanalyse durchgeführt. (A) Startbildschirm. (B) Dateneingabetabelle. (C) Analysedialog. (D) Menü für Analyseparameter. (E) Konfigurationsmenü für nichtlineare Regression. (F) Dateioptionen-Menü. (G) Datenexport-Dialog. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Diese Studie etabliert ein standardisiertes Protokoll für Cadmiumexposition und ATP-Viabilitätstests mit COs, um die Auswirkungen von Cadmium auf die Organoid-Viabilität zu bewerten. Dieses Protokoll optimiert speziell die Organoid-Dissoziation und die 96-Well-Beschichtungsschritte, um die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Stabilität nachfolgender ATP-Assay-Messungen zu verbessern. Obwohl das aktuelle experimentelle Protokoll sich hauptsächlich auf die Entwicklung eines 3D-Organoid-Organoid-Modells von Kolorektalkrebs zur Beurteilung der CD-Toxizität konzentriert, hat umfangreiche Forschung gezeigt, dass traditionelle 2D-Zellkulturen und 3D-Organoidmodelle sich signifikant in Arzneimittelreaktionen, Zell-Zell-Interaktionen, Gewebearchitektur und toxikologischen Profilen unterscheiden. Im Vergleich zu 2D-Monoschichten spiegeln Organoide die räumliche Architektur, zelluläre Heterogenität und das in vivo-ähnliche Mikromilieu der Tumore genauer wieder und bieten so eine überlegene physiologische Relevanz. Aufgrund des Fehlens komplexer Interaktionen zwischen Zelle und Zelle und Zell-Extrazellulärmatrix (ECM) kann die Reaktion von 2D-Kulturen auf Schwermetallexposition möglicherweise nicht ausreichen, echte in vivo toxikologische Prozesse genau zu erfassen¹⁶. Umgekehrt simuliert das in dieser Studie etablierte CO-Modell effektiv die dreidimensionale Wachstumsdynamik von Tumorgeweben und bietet eine physiologisch sehr relevante Plattform zur Bewertung der durch Cd induzierten Toxizität.

Während des Organoid-Passagings wurde die Dissoziationszeit strikt auf etwa 10 Minuten gehalten. Diese Optimierung verhindert unvollständige Dissoziation, die zu übergroßen Zellaggregaten führt, und vermeidet gleichzeitig Überdissoziation, die zu einer übermäßigen Anzahl einzelner Zellen führt. Durch präzise Kontrolle des Ausmaßes der Dissoziation erreichten wir relativ einheitliche organoide Strukturen, was die Konsistenz nachfolgender pharmakologischer Behandlungen und ATP-Viabilitätstests erhöhte.

Wir verwendeten ein Hochdurchsatz-96-Well-Kultursystem und standardisierten das Basalmembranmatrix-Matrixvolumen auf 6 μL pro Bohrloch. Diese Standardisierung minimiert die Variabilität zwischen den Brunnen, indem sie eine konstante Organoiddichte und Wachstumseigenschaften über alle Bohrungen hinweg sicherstellt, was letztlich die experimentelle Reproduzierbarkeit und Datenvergleichbarkeit verbessert. Durch die Kombination von ATP-Lumineszenztests mit Dosis-Reaktions-Kurvenanalysen mithilfe von Software für statistische Datenanalysen erreichten wir eine robuste quantitative Bewertung der Veränderungen der Organoidenlebensfähigkeit nach CD-Exposition. Zusammenfassend etabliert diese Studie ein hochgradig reproduzierbares experimentelles Protokoll für die Anwendung von Organoidmodellen in der Umwelttoxikologie und der Exposition von Schwermetallen.

Während der COs-Kultur ist das gründliche Mischen des Crypt-Pellets mit der Basalmembranmatrix ein entscheidender Schritt, um eine ordnungsgemäße COs-Bildung und stabiles Wachstum sicherzustellen. Der Anteil der Basalmembranmatrix sollte über 70 % gehalten werden (das Basalmembranvolumen > 70 %). Die empfohlenen Basalmembranmatrixvolumina betragen 6 μL pro Bohrloch für 96-Bohrlochplatten, 20 μL pro Bohrloch für 48-Bohrlochplatten und 25 μL pro Bohrloch für 24-Bohrlochplatten. Nach der Matrixpolymerisation werden folgende Volumina zu den Bohrlöchern hinzugefügt: 100 μL pro Bohrloch für 96-Bohrlochplatten, 300 μL pro Bohrloch für 48-Bohrlochplatten und 500 μL pro Bohrloch für 24-Bohrlochplatten. Es sollte darauf geachtet werden, das direkte Pipettieren des Mediums auf die Kellermembranmatrixkuppeln zu vermeiden, da dies die dreidimensionale Architektur stören könnte. Um phänotypische und genetische Stabilität zu erhalten, begrenzte diese Studie die Verwendung kolorektaler Organoide auf maximal 4 Durchgänge.

Wenn Krypten oder COs einen Durchmesser von etwa 600 μm erreichen oder Verdunkelung und Wachstumsstopp zeigen, sollte das Passaging umgehend durchgeführt werden, um nachfolgende Sensitivitätsanalysen zu ermöglichen. Während der enzymatischen Dissoziation von COs sollte die Verdauung unter dem Mikroskop überwacht werden. Wenn COs nicht ausreichend in Kleinzellcluster oder Einzelzellen dissoziiert sind, kann die Verdauungszeit je nach Größe des Organoids und Dissoziationsstatus schrittweise verlängert werden. Eine verlängerte Verdauung in einem einzigen Schritt sollte vermieden werden, um das Risiko einer Überverdauung und Verlust der Zelllebensfähigkeit zu minimieren.

Berechnen Sie die relative Viabilität jedes Bohrlochs mit folgender Gleichung und verwenden Sie den durchschnittlichen Prozentsatz aus replizierten Bohrlöchern als Antwortwert für jede Konzentration

 

Der ATP-Biolumineszenz-Test basiert auf der von Glühwürmchen Luciferase katalysierten Oxidation von D-Luziferin, was zu einer Photonenemission führt. Aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit, der Kompatibilität mit plattenbasierten Hochdurchsatzformaten und der Verfügbarkeit standardisierter kommerzieller Bausätze wurde diese Methode weit verbreitet für vorläufige Toxizitätstests in Organoid-Modellen¹⁷ eingesetzt.

Mehrere Störfaktoren müssen berücksichtigt werden. Bestimmte Chemikalien können die Luciferase-enzymatische Reaktion direkt durch chemische Interferenz oder enzymatische Unterdrückung hemmen, was zu einer Signalabschreckung führt. Hintergrundlumineszenz aus der dreidimensionalen extrazellulären Matrix, Heterogenität in der Größe und Dichte der Organoide sowie unvollständige Lyse können erhebliche Variabilität zwischen Wells und Batchs verursachen. ATP-basierte Lumineszenz allein kann Zelltodmodalitäten nicht genau unterscheiden oder zugrundeliegende toxikologische Mechanismen aufklären¹⁸.

Um die methodische Zuverlässigkeit zu erhöhen, werden systematische Qualitätskontrollmaßnahmen empfohlen. Einsatz von vom Hersteller empfohlenen oder zuvor validierten Lysispuffern sowie verlängerter Lysiszeit, mechanischer Dissoziation oder Einfrieren-Tau-Zyklen, wenn nötig, um die Zelllyseeffizienz innerhalb der Matrix zu verbessern. Zweitens: ATP-Spike-in-Recovery-Experimente während der Assay-Optimierung durchführen, um eine mögliche direkte Hemmung der lumineszenten Reaktion durch die Testverbindungen oder die Lyseumgebung zu bewerten. Drittens: Überprüfen Sie den linearen Detektionsbereich mit einer ATP-Standardkurve und steuern Sie das Timing zwischen der Zugabe von Reagenzen, der Inkubation und dem Plattenlesen streng, um die technische Variabilität zu minimieren. Schließlich sollten Rohstoff-, Vehikel- und Negativkontrollen in jeden Test aufgenommen werden und genügend technische Replikate integriert werden, um Kanteneffekte und batchbezogene Variationen zu bewerten und zu korrigieren. Kürzlich wurden mehrere organoidoptimierte Viabilitätstests mit verbesserter Lysechemie und verbesserter Signalstabilität entwickelt, und diese Formulierungen haben im Allgemeinen eine überlegene Leistung bei dreidimensionalen Toxizitätstests¹⁹ gezeigt. Zusammenfassend nutzte diese Studie menschliche COs als in-vitro-Modell der Umwelt-Schwermetalltoxikologie und etablierte einen hochdurchsetzten, empfindlichen ATP-Biolumineszenz-Test zur Bewertung der Anfälligkeit für CD-Exposition von Organoiden. Diese Arbeit bietet eine praktische experimentelle Referenz und methodische Orientierung für die Toxizitätsbewertung in organoidbasierten Forschungssystemen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Zellsieb	BIOLOGIX	15-1100
15 mL Zentrifugenröhrchen	BIOFIL	CFT011150
1mL Pipettenspitzen	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL Pipettenspitzen	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-Well-Platten	Corning Incorporated	3524
50 mL Zentrifugenröhrchen	CLUXCELL	321050
96-Well-Platten	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Das Betriebssoftware für spezifische Mikroplattenleser.
Cadmiumchlorid, 10 g	Sigma	202908-10G
Human Colonic organoid Kit Plus (Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Pinzette	Beyotime	FS019
Kühlbox	Beyotime	FBX078
Niedertemperatur-Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	Die Basalmembranmatrix
Organoid-Dissoziationslösung	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Organoid-Dissoziationslösung
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphat-gepufferter Saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipetten	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Das Betriebssoftware für spezifische Mikroplattenleser.
Schere	Beyotime	FS001
Gewebe-Verdauungslösung	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S