Methodenartikel

Isolierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel, die aus selbstassemblierten mesenchymalen Stammzellaggregaten abgeleitet sind

DOI:

10.3791/70534

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24. April 2026

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Isolierung großer extrazellulärer Vesikel (LEVs) aus selbstassemblierten Stammzellaggregaten und deren therapeutische Anwendung zur Regeneration des Unterkieferknochens.

Zusammenfassung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler der interzellulären Kommunikation und vielversprechende zellfreie Substanzen für die regenerative Medizin. Unter EV-Subpopulationen sind große extrazelluläre Vesikel (LEVs) besonders geeignet für Gewebereparatur, da sie eine angereicherte pro-regenerative Fracht haben. Standardisierte und reproduzierbare Methoden zur Erzeugung funktioneller dentalstämmiger Stammzell-abgeleiteter LEVs für die nachgelagerte Charakterisierung und therapeutische Bewertung bleiben jedoch begrenzt. Unter Nutzung des außergewöhnlichen osteogenen Potenzials von Stammzellen aus der apikalen Papille (SCAPs) entwickelten wir ein 3D-Kulturmodell unter Bedingungen mit niedriger Adhäsion, um selbstassemblierte SCAP-Aggregate zu induzieren. Dieses Modell ahnt die physiologische mesenchymale Kondensation nach, verbessert die Zell-Cell-Interaktionen signifikant und steigert die LEV-Sekretion. Wichtige Kulturparameter und Handhabungsnotizen werden bereitgestellt, um die Gesamtkonsistenz der Aggregate zu verbessern und den LEV-Output zu maximieren, während die Zelllebensfähigkeit erhalten bleibt. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur effizienten Produktion funktioneller, SCAP-abgeleiteter LEVs, das 3D-Aggregatgenerierung, Isolierung durch Differenzzentrifugation, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)-basierte Partikelgrößenverteilung und -konzentrationsanalyse sowie therapeutische Abgabe mit einem thermisch vernetzten Hydrogel zur Reparatur von Unterkieferknochendefekten umfasst. Dieser Ansatz optimiert die LEV-Produktion für nachgelagerte mechanistische Studien und präklinische Untersuchungen bei der kraniofazialen Regeneration. Dieser optimierte Arbeitsablauf gewährleistet die reproduzierbare Herstellung bioaktiver LEVs mit konstanten Erträgen und angereicherter pro-osteogener Ladung, was die Grundlagenforschung erleichtert und die klinische Translation der EV-vermittelten kraniofacialen Rekonstruktion beschleunigt. In repräsentativen Anwendungen bieten hydrogelbelastete LEVs ein lokales Depot an den Fehlerstellen und erleichtern die bequeme Handhabung während der Einpflanzung. Gemeinsam bietet diese Methode eine skalierbare Plattform zur Erstellung von SCAP-abgeleiteten LEVs und hebt wichtige Überlegungen für standardisierte Berichterstattung und translationale Studiengestaltung hervor. Dieser Ansatz unterstützt eine breitere Einführung in kraniofasalen EV-Laboren.

Einleitung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Nanopartikel, die von Zellen freigesetzt werden und die interzelluläre Kommunikation durch den Transfer bioaktiver Ladungen wie Proteine, miRNAs und Lipide 1,2,3 vermitteln. Unter EV-Subpopulationen zeichnen sich große extrazelluläre Vesikel (LEVs) durch ihre direkte Freisetzung von der Zellmembran und die anhärente Anreicherung pro-regenerativer Moleküle aus, was sie gut für den Bedarfan Gewebereparatur und -regeneration 4,5 geeignet macht. In der regenerativen Medizin werden EVs, die aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) gewonnen werden, zunehmend als eine lebensfähige zellfreie Alternative zur Ganzzelltherapieanerkannt 6,7,8. Sie wiederholen die parakrinen regenerativen Effekte der elterlichen MSCs und vermeiden dabei Einschränkungen der direkten Zelltransplantation, wie geringe Engraftment-Effizienz, Immunogenität und Chargenvariabilität 7,8,9,10. Unter den MSC-Quellen zeigen Stammzellen der apikalen Papillen (SCAPs) ein überlegenes osteogenes und odontogenes Differenzierungspotential11,12,13, was SCAP-abgeleitete EVs besonders attraktiv für die Reparatur von orofacialen Knochen und Zahngewebemacht 8.

Bemerkenswert ist, dass die Biogenese und Funktionalität von EVs stark von der zellulären Mikroumgebung beeinflusstwerden. Konventionelle zweidimensionale (2D) Monoschichtkulturen weichen signifikant vom nativen Gewebekontextab 16,17 und führen häufig zu EVs mit eingeschränkter regenerativer Kapazität18. Im Gegensatz dazu replizieren dreidimensionale (3D) selbstzusammengesetzte MSC-Aggregate zentrale Aspekte der physiologischen mesenchymalen Kondensation, einer Entwicklungsphase, die durch hohe Zelldichte, intensiven Zell-Zell-Kontakt und eine angereicherte extrazelluläre Matrix (ECM) gekennzeichnet ist, die strukturelle Unterstützung bietet und biochemische sowie mechanische Hinweise liefert, die Zelladhäsion, Migration und Schicksalsentscheidungen regulieren 19,20,21. Diese biomimetische 3D-Mikroumgebung verbessert nicht nur die interzelluläre Kommunikation und parakrine Signalübertragung22,23, sondern fördert auch die Sekretion von EVs mit höherer Ausbeute und verbesserten bioaktiven Frachtprofilen 24,25,26. Die Verwendung von 3D-selbstmontierten MSC-Aggregaten erweist sich daher als sehr vielversprechende Strategie, um funktional leistungsfähige Elektrofahrzeuge für regenerative Anwendungenzu erhalten.

Trotz der klaren Vorteile aggregatbasierter Elektrofahrzeuge sind standardisierte Protokolle zur Isolierung und Charakterisierung von 3D-Systemen weiterhin unterentwickelt. Aktuelle Methoden zur EV-Isolation, wie die differentielle Zentrifugation, sind gut etabliert und bieten einen skalierbaren Rahmen für die EV-Produktion27. Ebenso wurden Methoden zur Erzeugung von MSC-Aggregaten berichtet, die oft auf Vitamin-C-induziertem zellulärem Curling und Aggregation aus 2D-kultivierten Zellen28 basieren. Die ECM-Architektur innerhalb dieser Vitamin-C-induzierten Aggregate kann sich jedoch weiterhin von der räumlich organisierten, kondensationsähnlichen Mikroumgebung nativer mesenchymaler Gewebe unterscheiden. Im Gegensatz dazu erleichtert die gerüstfreie Selbstassemblage unter Bedingungen mit geringer Haftung die Bildung kompakter, kugelförmiger Aggregate, die zentrale Merkmale der mesenchymalen Kondensation approximieren19,29. Derzeit fehlt ein systematischer und reproduzierbarer Workflow zur Isolierung und Anwendung von Elektrofahrzeugen aus solchen klebungsarm-induzierten 3D-SCAP-Aggregaten. Aus praktischer Sicht liegt die LEV-Produktion aus herkömmlichen 2D-SCAP-Kulturen typischerweise im Bereich ~1011 Partikel/mL durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), und eine 3D-Aggregation mit niedriger Haftung wird erwartet, die LEV-Ausgabe um mehrere Male zu steigern, während die Reproduzierbarkeit für nachgelagerte Anwendungen erhalten bleibt. Um diese Lücke zu schließen, beschreiben wir hier ein umfassendes Protokoll, das die angeborene osteogene und odontogene Funktionalität von SCAPs nutzt und die MSC-Mikroumgebung durch 3D-Aggregation mit niedriger Haftung optimiert. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Herstellung hochwertiger LEVs und bietet ein standardisiertes Werkzeug zur Weiterentwicklung zellfreier regenerativer Therapien in der kraniogesichten Medizin.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Fourth Military Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die Entnahme und Verwendung menschlicher Proben wurde vom Ethikausschuss der Vierten Militärmedizinischen Universität genehmigt (Genehmigungsnummer IRB-REV-2022187). Vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt; Für Spender, die minderjährig waren oder anderweitig keine Zustimmung geben konnten, wurde eine schriftliche informierte Zustimmung von ihren gesetzlichen Vormündern eingeholt. Alle Reagenzien wurden steril gefiltert, und Zellkulturverfahren wurden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, um die Sterilität zu gewährleisten (siehe Materialtabelle). Behandeln Sie alle vom Menschen stammenden Materialien (Zähne, Gewebe, Primärzellen, konditionierte Medien und EV-Präparate) als potenziell infektiös. Führen Sie alle Verfahren mit menschlichen Proben in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durch, einschließlich Laborkittel, Handschuhen und Augenschutz. Für Biosicherheit und Abfallentsorgung befolgen Sie die institutionellen BSL-2-Richtlinien: Behandeln Sie alle menschlichen Materialien und kontaminierten Einwegstoffe als BSL-2-Biohazard-Abfälle; Dekontaminieren Sie Oberflächen oder Geräte nach Gebrauch mit einem institutionell zugelassenen Desinfektionsmittel. Sammeln Sie flüssige Biohazard-Abfälle in beschrifteten Behältern und deaktivieren Sie sie mit zugelassenen Methoden vor der Entsorgung. Entsorgen Sie die Spitzen sofort in zugelassenen Behältern (kein Decken). Behandeln Sie tierisches Gewebe/Kadaver sowie anästhetische/chemische Rückstände als regulierte Biohazard-/chemische Abfälle und entsorgen Sie sie über institutionelle Einrichtungen gemäß den geltenden Vorschriften.

1. Isolation und Kultur menschlicher SCAPs

HINWEIS: P/S ist eine bioaktive Antibiotikamischung und kann Haut- und Augenreizungen oder allergische Reaktionen verursachen. Griff in einem BSL-2 Biosicherheitsschrank beim Öffnen; Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz; Aerosolbildung vermeiden; und die Entsorgung von Abfällen gemäß den institutionellen Richtlinien für chemische Abfälle. Kollagenase Typ I (Lösung) ist ein bioaktives Enzym und kann Haut- und Augenreizungen oder allergische Reaktionen verursachen. Griff in einem BSL-2 Biosicherheitsschrank; Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz; Vermeide Spritzer und Aerosolbildung während des Pipetierens; und dekontaminiere Verschmutzungen umgehend gemäß den institutionellen Verfahren. Schütze Kollagennase Typ I vor Licht während der Lagerung und Nutzung (siehe Materialtabelle).

  1. Sammeln Sie dritte Molaren mit unreifen Spitzen von gesunden Spendern (16–21 Jahre) und spülen Sie gründlich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält (siehe Materialtabelle).
  2. Sezieren Sie das apikale Papillengewebe von der Wurzelspitze mit steriler Augenpinzette und Schere und zerkleinern Sie es dann in kleine Fragmente (<1 mm3).
  3. Übertragen Sie alle Gewebefragmente in ein 15-mL Zentrifugenrohr. Die Fragmente mit 2 mg/mL Kollagenase Typ I bei 37 °C für 1 Stunde verdauen, wobei alle 15 Minuten sanft geschüttelt wird.
  4. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen vollständigen α-minimalen essentiellen Mediums (α-MEM) hinzufügen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Verdauungszeit von Kollagenase Typ I ist nicht festgelegt und hängt vom Verdauungszustand des Gewebes ab. Überwachen Sie genau und beenden Sie die Verdauung, wenn Gewebe halb erodiert sind, indem Sie Medium hinzufügen. Überverdauung kann die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 × g für 5 Minuten bei 4 °C, entsorgen Sie das Überstandsmittel und suspendieren Sie das Pellet in 2 mL vollständiger α-MEM.
  6. Säen Sie die verdaute Gewebesuspension in eine 10 cm große Petrischale aus und fügen Sie 8 ml vollständiges α-MEM zu einem Endvolumen von 10 ml pro Schale hinzu.
  7. Kultivieren Sie SCAPs bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
    HINWEIS: Kulturen werden kontinuierlich überwacht, wandern die Zellen typischerweise aus Gewebefragmenten heraus und haften innerhalb von 3–7 Tagen radial an der Schale an. Wenn die Gewebelebensfähigkeit schlecht ist oder innerhalb von 5 Tagen keine Zellmigration festgestellt wird, wird auf komplettes α-MEM mit 20 % Serum ergänzt umgestellt.
  8. Für die Zellpassaging wurden die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen, um Restmittel zu entfernen, sobald sie 80–90 % Konfluenz erreicht hatten. Anschließend wurden sie mit 2 mL 0,25 % Trypsin-1 mM EDTA bei 37 °C für 2 Minuten inkubiert (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Trypsin–EDTA ist ein Reizstoff und kann Haut und Augen schädigen. Behandle sie mit Handschuhen und Augenschutz, vermeiden Sie Spritzer und Aerosolbildung und spülen Sie sofort mit viel Wasser, falls Kontakt auftritt. Entsorgen von trypsinhaltigen flüssigen Abfällen gemäß institutionellen Richtlinien.
  9. Wenn Zellen unter dem Mikroskop mit gestörten interzellulären Verbindungen abgerundet werden, lösen Sie die Zellen vorsichtig von der Schale ab, ohne übermäßige strukturelle Schäden. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml vollständiges α-MEM hinzufügen.
  10. Sammeln Sie die Zellen durch sanftes, wiederholtes Pipettern in ein frisches 15-mL-Zentrifugenrohr. Nach der Zentrifugation bei 100 × g für 5 Minuten entsorgt man den Supernatant und suspendiert das Zellpellet in vollständiger α-MEM. Säen Sie die resuspendierten Zellen in frische Kulturschalen oder Brunnenplatten. Wechsel das Medium alle zwei Tage.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass SCAPs, die für die Zuschlagkultur verwendet werden, innerhalb von Abschnitt 5 liegen. Die Stamm- und Aggregationskapazität nehmen mit erhöhten Durchgangszahlen30,31 ab, was die Gesamtformationseffizienz und die funktionale Leistung verringern kann.

2. Selbstassemblierung von SCAP-Aggregaten

  1. Harvest-Durchgang von 3–5 SCAPs durch Trypsinisierung, Zentrifugieren Sie bei 100 × g für 5 Minuten und setzen Sie es in α-MEM mit 10 % EV-depletiertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % P/S (siehe Materialtabelle) (siehe Materialtabelle) wieder auf.
    HINWEIS: Bereiten Sie das EV-entleerte FBS vor, indem Sie FBS über Nacht bei 150.000 × g bei 4 °C zentrifugieren, um EVs und andere Verunreinigungenzu entfernen.
  2. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer und Seed 1 × 105 Zellen pro Bohrloch in ultraniedrigen Anheftungsplatten mit 24 Wellen. Stellen Sie das mittlere Volumen auf 500 μL pro Bohrloch ein, um einen Aufhängungszustand aufrechtzuerhalten.
  3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 72 Stunden und ersetzen Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden.
  4. Überwachen Sie die Aggregatbildung täglich unter einem invertierten optischen Mikroskop. Sammeln Sie EVs, wenn Aggregate einen Durchmesser von 200–400 μm erreichen und eine kompakte, glattkantige Struktur zeigen.
    HINWEIS: Definieren Sie eine Produktions-"Charge" als LEVs, die aus dem zusammengefassten konditionierten Medium isoliert werden, das aus SCAP-Aggregaten gesammelt wird, die am selben Tag aus demselben Zellgang ausgesaat und unter identischen Kulturbedingungen innerhalb eines einzigen Sammelfensters (72 Stunden) erhalten werden. Verarbeiten Sie jede Charge unabhängig durch Zentrifugation. Das Kulturmedium nach 48 Stunden nach dem Aussäen ersetzen und mit dem gleichen Volumen frischen Mediums nachfüllen. Für die LEV-Produktion wird konditioniertes Medium nach 48 Stunden und erneut nach 72 Stunden nach der Aussaat gesammelt und das geerntete Medienmaterial (0–48 h und 48–72 h Fraktionen) als eine einzige Charge zusammengefasst. Halten Sie das gesammelte konditionierte Medium bei 4 °C und verarbeiten Sie es für die LEV-Isolierung.

3. Isolierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen aus SCAP-Aggregaten

  1. Differentielle Zentrifugation zur Isolierung großer LEVs
    1. Sammeln Sie das Kulturmedium mit SCAP-Aggregaten in 15-ml-Zentrifugenröhren.
    2. Zentrifugieren Sie bei 800 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um intakte Zuschlagstoffe und Großzellreste zu entfernen.
    3. Übertragen Sie das Supernatant in neue 15-mL-Röhren und zentrifugieren Sie bei 2.500 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um Restplättchen und Kleinzellfragmente zu eliminieren.
    4. Übertrage den Überstandsstoff vorsichtig in sterile 1,5 mL konische Röhren und zentrifugiere bei 16.800 × g für 30 Minuten bei 4 °C zu pellet-LEVs.
      HINWEIS: Verwenden Sie 1,5-mL konische Röhren, um die Sprengkraft der LEVs zu verbessern.
    5. Entsorgen Sie das Überlagermittel, lassen Sie das Pellet in 1 mL steriles PBS wieder aufhängen und zentrifugieren Sie erneut mit 16.800 × g für 30 Minuten bei 4 °C mit einem festen Winkelrotor (kompatibel zu einer Standard-Tischzentrifuge), um die LEVs zu pelletieren.
    6. Stellen Sie die Verzögerung/Bremse auf eine "langsame" oder "niedrige" Einstellung ein (typischerweise Bremsstufe 1 oder 2), um das Nachaufhängen des LEV-Pellets während der letzten Verzögerungsphase zu verhindern.
    7. Entsorge das Überstandsmittel und suspendiere das letzte LEV-Pellet in 50 μL sterilem PBS. Verwenden Sie die Suspension sofort (innerhalb von 24 Stunden) oder lagern Sie sie bei 4 °C. Vermeiden Sie Einfrieren, um den Verlust der Bioaktivität zu minimieren.
      HINWEIS: Bereiten Sie etwa 80 Brunnen mit Aggregaten vor, um ausreichende LEVs für typische nachgelagerte Experimente zu erhalten. LEV-Proben werden für die sofortige Charakterisierung oder therapeutische Anwendung empfohlen, nicht für die Langzeitlagerung. Wenn längere Lagerung erforderlich ist, aliquotieren Sie die LEV-Suspension (z. B. 5–10 μL pro Röhre), um wiederholte Temperaturschwankungen und Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Schnellgefrier-Aliquots auf Trockeneis lagern und bei −80 °C für eine kurzfristige, verlängerte Lagerung (z. B. bis zu 1–3 Monate) aufbewahren. Einmal auf Eis auftauen und sofort verwenden. Beachten Sie, dass das Einfrieren die Bioaktivität verringern und die Partikelrückgewinnung/Größenverteilung verändern kann; daher führen Sie, wann immer möglich, funktionelle Studien mit frisch vorbereiteten LEVs durch. Zur Qualitätskontrolle nach der Lagerung messen Sie die Partikelkonzentration und Größenverteilung mit NTA neu und fahren Sie nur dann fort, wenn die Werte im vordefinierten Akzeptanzbereich bleiben. Zusätzlich wird in diesem Protokoll die NTA-Partikelkonzentration als primäre Quantifizierungsmethode verwendet, um den Verlust von Vesikeln, die mit proteinbasierten Assays wie BCA verbunden sind, zu vermeiden und so den Ertrag für nachgelagerte Anwendungen zu maximieren.
  2. NTA für Partikelgröße und -konzentration
    HINWEIS: NTA wird mit einem kommerziell erhältlichen Nanopartikel-Tracking-Analyzer durchgeführt (siehe Materialtabelle), um die Größenverteilung und die Partikelkonzentration zu bewerten.
    1. Verdünnen Sie 1 μL der LEVs-Suspension (aus Abschnitt 3.1, Schritt 6) in 1.499 μL sterilem PBS in einem sterilen 1,5 mL konischen Rohr und vermischen Sie gründlich.
    2. Starten Sie die kompatible Software und füllen Sie die Probenzelle mit 10 ml ultrareinem Wasser. Bestätigen Sie, dass die Hintergrundpartikelanzahl pro Bild < 10 beträgt, um sicherzustellen, dass das System sauber ist (siehe Materialtabelle).
    3. Kalibrieren Sie das Instrument mit einer vorbereiteten Standardlösung. Stellen Sie die Softwareparameter ein: Empfindlichkeit 70, Verschluss 70, Min. Bereich 5 und Min. Helligkeit 20. Führen Sie "AutoAlignment" durch, um sicherzustellen, dass der Laser fokussiert ist. Stellen Sie die Standardverdünnung an, bis die in der Software angezeigte Partikelanzahl 50–400 (vorzugsweise ~200) beträgt, und führen Sie dann das Kalibrierungsprogramm aus.
      HINWEIS: Die Standardlösung wird hergestellt, indem man 1 μL Kalibrierungsperlen in 1 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, um eine Primärlösung herzustellen. Verdünnen Sie 100 μL der Hauptlösung in 25 ml destilliertem Wasser (1:250.000 Verdünnung) und lagern Sie bis zu einer Woche bei 4 °C.
    4. Spülen Sie die Probezelle vor der Analyse mit 5 ml destilliertem Wasser.
    5. Spülen Sie den Kanal mit 1 ml destilliertem Wasser und bestätigen Sie, dass die Partikelanzahl an der Detektionsschnittstelle <10 beträgt.
    6. Injizieren Sie 1 ml der verdünnten LEV-Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 mL/s mit einer sterilen 1-mL-Spritze.
      VORSICHT: Kontrollieren Sie die Spritze manuell, um eine konstante Einspritzgeschwindigkeit zu halten.
    7. Führe Partikelanalysen durch und erstelle Berichte. In der Software erstellen Sie eine neue Messung und wählen Sie den Modus Größe/Konzentration aus. Stellen Sie die Aufnahme auf 3 Aufnahmen ein, 60 s pro Aufnahme, bei 25 °C mit denselben Detektionsparametern wie in Schritt 3 (Empfindlichkeit 70, Verschluss 70, Min. Bereich 5, Min. Helligkeit 20).
    8. Beginnen Sie mit der Erfassung und überprüfen Sie, dass die Teilchenanzahl auf dem Bildschirm innerhalb von 50–400 Partikeln pro Bild bleibt (vorzugsweise ~200); wenn außerhalb dieses Bereichs liegt, stoppen und die Probenverdünnung anpassen, dann Schritt 6 wiederholen. Nach der Erfassung wird die Analyse durchgeführt, um die mittlere Größe, Modengröße, D10/D50/D90 und die Teilchenkonzentration (Partikel/mL) zu ermitteln. Dann exportieren Sie die Ergebnisse und Größenverteilungsdiagramme als .csv und .pdf (oder gleichwertige Berichtsformate) und speichern die Messdatei zur Aufzeichnung.

4. Therapeutische Anwendung von LEVs bei der Unterkieferknochenregeneration

  1. Herstellung von LEV-belastetem Hydrogel
    1. Bereite Pluronic F-127-Aktie vor (20 % W/V). Pluronisches F-127-Pulver zu sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 20 % (w/v) geben und über Nacht bei 4 °C rühren, bis es vollständig gelöst und homogen ist (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Lösung während der gesamten Vorbereitung bei 4 °C, um eine vorzeitige Gelierung zu vermeiden.
      HINWEIS: 20 % (w/v) Pluronisches F-127 ist flüssig bei 4 °C und wird bei ~20–25 °C (je nach Rohr/Raum) thermogeliert; es wird bei 37 °C zu einem stabilen Gel.
    2. Laden Sie LEVs unter kalten Bedingungen. Vorkühle Tuben, Pipettenspitzen und das Hydrogel auf 4 °C. Mischen Sie 50 μg LEVs (äquivalent zu LEVs aus zwei 24-Well-Platten von Aggregaten) mit 1 ml 20 % Pluronic F 127 durch sanftes Pipetieren und kurzes Wirbeln mit niedriger Geschwindigkeit, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen. Halten Sie die Mischung auf Eis oder bei 4 °C bis zur Einnistung.
    3. Handhabung/Nutzungsanleitung (zur Reproduzierbarkeit). Führen Sie das Laden und Spritzen-/Spitzenladen schnell auf Eis durch. Erwärmt sich das Gemisch über ~20–25 °C, steigt die Viskosität und die Gelierung kann beginnen; in diesem Fall wird auf 4 °C zurückgekehrt, bis das Material vor der Nutzung wieder vollständig fließbar ist. Nach der Platzierung des Defekts lassen Sie die Gelation in situ bei Körpertemperatur (37 °C) erfolgen.
  2. Etablierung des Maus-Mandibular-Knochendefekts
    1. Betäuben Sie 8 Wochen alte C57Bl/6 Mäuse (männlich oder weiblich) durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatrium (50 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
      VORSICHT: Pentobarbitalnatrium ist ein starkes Beruhigungsmittel/Anästhetikum und giftig für Menschen, wenn es versehentlich injiziert, eingenommen oder eingeatmet wird. Bereiten Sie sich auf und verabreichen Sie diese mit sicheren Methoden (Nadeln nicht aufdecken; sofort in einen Behälter werfen), Handschuhe und Augenschutz tragen, Hautkontakt vermeiden und den Gebrauch gemäß institutionellen Arzneimittelrichtlinien aufbewahren/dokumentieren. Überprüfen Sie die richtige Anästhesie bei den Mäusen, indem Sie prüfen, ob ein Hornhautreflex fehlt und kein Gliedmaßenentzug beim Kneifen der Fußpolster entweicht. Tragen Sie eine schützende Augensalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
    2. Rasieren Sie das Fell über dem linken Unterkieferbereich und desinfizieren Sie abwechselnd mit 10 % Povidon-Jod und 75 % Ethanol.
      VORSICHT: 75 % Ethanol sind hochentzündlich; Verwenden Sie es fernab von Zündquellen und sorgen Sie für eine gute Belüftung. Povidon-Jod kann Haut- und Augenreizungen oder allergische Reaktionen verursachen; Tragen Sie Handschuhe, vermeiden Sie den Kontakt mit Augen oder Schleimhaut und reinigen Sie Verschüttungen umgehend.
    3. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt entlang des Unterkieferrandes und schneiden Sie das Weichgewebe stumpf auf, um den Unterkieferwinkel freizulegen.
    4. Erzeugen Sie einen kreisförmigen Knochendefekt (2 mm im Durchmesser) mit einem Zahnbohrer mit kontinuierlicher Kochsalzbewässerung, um thermische Schäden zu verhindern (siehe Materialtabelle).
      VORSICHT: Überwachen Sie die intraoperativen Blutungen genau, kontrollieren Sie die Blutungen mit kleinen Wattebäuschen, um ein freies Operationsfeld zu erhalten, und verringern Sie das Infektionsrisiko. Vermeiden Sie es, mit dem Bohrer das umliegende Weichgewebe zu berühren, um eine Verschränkung zu verhindern.
  3. Einpflanzung von LEV-geladenem Hydrogel
    1. Füllen Sie die LEV-Hydrogel-Mischung in eine sterile Spritze und injizieren Sie sie in den Knochendefekt, um eine vollständige Befüllung sicherzustellen.
      HINWEIS: Verabreichen Sie ~10 μg LEVs pro Maus. Zwei 24-Well-Platten mit SCAP-Aggregaten sind erforderlich, um ausreichende LEVs für ein Experiment mit n = 5 Mäusen zu liefern.
    2. Für die Kontrollgruppe wird ein gleiches Volumen Pluronic F-127 Hydrogel ohne LEVs injiziert.
    3. Nähen Sie den Schnitt mit 4-0 absorbierbaren Nähten und verabreichen Sie subkutane Analgesie (Carprofen, 5 mg/kg) zur Linderung der postoperativen Schmerzen (siehe Materialtabelle).
      VORSICHT: Carprofen ist ein pharmakologisch aktives NSAID und kann schädlich sein, wenn es versehentlich injiziert wird oder Haut/Augen berührt. Tragen Sie Handschuhe, vermeiden Sie scharfe Verletzungen, entsorgen Sie Nadeln/Spritzen in einem scharfen Behälter und entsorgen Sie ungenutzte Medikamente sowie kontaminierte Materialien gemäß den institutionellen Verfahren für pharmazeutische Abfälle.
    4. Legen Sie die Mäuse bis zur Erholung von der Narkose auf eine Aufwärmdecke, dann in einzelne Käfige mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
      HINWEIS: Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein haben, um die sternale Liegeruhe aufrechtzuerhalten. Mäuse erst nach vollständiger Genesung in die Gruppenunterbringung zurückbringen.

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Ergebnisse

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Laut dem experimentellen Arbeitsablauf wurden wichtige Schritte wie SCAP-Isolierung, Aggregatbildung, LEV-Extraktion und therapeutische Implantation erfolgreich durchgeführt (Abbildung 1). Klinisch beeinflusste dritte Molaren von Spendern zeigten unreife Spitzen mit intaktem apikalem Papillagewebe, das um die offenen Wurzelkanalöffnungen angebracht war, was die geeignete Quelle des SCAP bestätigt (Abbildung 2A). Bei der Kultur <...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das wachsende Interesse an zellfreien regenerativen Therapien hat mesenchymale Stammzell-abgeleitete LEVs als vielversprechende Alternativen zur Ganzzelltransplantation positioniert, da sie bioaktive Moleküle ohne die mit zellbasierten Ansätzen verbundenen Risiken liefern können. Die klinische Umsetzung von LEV-basierten Therapien wurde jedoch durch das Fehlen physiologisch relevanter Kultursysteme behindert, die die Funktionalität von LEVs vollständig erhalten und verbessern können. Kon...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des Nationalen Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramms Chinas (2021YFA1100600), der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (82471011, 82401201), dem Projekt des Staatlichen Schlüssellabors für orale und maxillofaciale Rekonstruktion und Regeneration (2024MS04), der China Postdoctoral Science Foundation (BX20230485) sowie dem Partnerlabor-Kooperations- und Austauschprogramm der Vierten Militärmedizinischen Universität (2024HB014) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Spritze mit NadelBD300841Betäubung
10 cm ZellkulturschaleCorning353003Zellkultur
15 mL Polystyrol-ZentrifugenröhreCorning352095Zellkultur
75 % Ethanol-DesinfektionsmittelHai Shi Hai NuoHS-750Betrieb
Absorbierbare Naht 4-0Jinhuan MedicalR413Betrieb
TischzentrifugeWIGGENSCE187EV-Isolierung
CO2-Inkubator, 150 L, UniversaltypThermoFisher51032874Zellkultur
Kollagenase Typ IThermoFisher17100017Zellkultur
WattebäuscheDeroyal30-033Betrieb
Gebogene OperationsschereJZ Chirurgisches InstrumentJ21040Betrieb
Zahnmobile TurbineneinheitKaVoS609CBetrieb
Elektronische BilanzZhi KeZK-DSTZellkultur
Eppendorfer U-BahnEppendorf3810XEV-Isolierung
Pinzette, alles in OrdnungJZ Chirurgisches InstrumentJD1020Betrieb
HaarentfernungscremeVeet1.00097E+11Betrieb
Hochgeschwindigkeits-BallburDentsply SironaE0123Betrieb
Hochgeschwindigkeits-HandstückKaVoKV-1-008-1644Betrieb
Invertiertes MikroskopMshotMF53-NZellkultur
MEM & Alpha; (Minimales essentielles Medium α)ThermoFisher12561056Zellkultur
Nanopartikel-Tracking-Videomikroskop PMX-120TeilchenmetrixZetaView PMX120Nanopartikel-Tracking-Analyse
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher15140122Zellkultur
PentobarbitalnatriumSigma-Aldrich57-33-0Betäubung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)ThermoFisher10010023Zellkultur
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443EV-Implantation
PovidonjodlösungBaxter PROSL500Betrieb
Spezialisiertes fetales Rinderserum (FBS)ThermoFisher12664025Zellkultur
Steriler MullblockSieg10-000-681Betrieb
Tisch-Hochgeschwindigkeits-MikrozentrifugeHitachiCT15EEV-Isolierung
Trephine DrillBiomet-Mikrofixierung01-9182Betrieb
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072Zellkultur
Ultra-Low Attachment 24-Well-PlatteCorning3473Zellkultur
Vortex Mixer DschinnWissenschaftliche IndustrienSI0425EV-Implantation

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

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