Methodenartikel

Aufklärung der materiellen Grundlage der Yiqi-Qingjie-Formel gegen IgA-Nephropathie mit UHPLC-Q-Orbitrap HRMS integriert in Netzwerkpharmakologie

318 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

19. Mai 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz der ultraleistungsfähigen Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit hybrider Quadrupol-Orbitrap-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), kombiniert mit Netzwerkpharmakologie und molekularem Andocken, um die materielle Grundlage der Yiqi-Qingjie-Formel (YQQJ) zur Behandlung der IgA-Nephropathie (IgAN) vorherzusagen und zu validieren.

Zusammenfassung

Diese Studie verwendet UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, um die wasserabschließenden und blutabsorbierten Bestandteile von YQQJ zu charakterisieren. Netzwerkpharmakologie und molekulares Andocken werden weiter angewandt, um die materielle Grundlage der therapeutischen Wirkungen von YQQJ gegen IgAN vorherzusagen und zu verifizieren. Die wässrigen Extrakt- und Serumproben von YQQJ wurden mit UHPLC-Q-Orbitrap HRMS analysiert, um die chemischen Bestandteile zu charakterisieren und blutabsorbierte Verbindungen zu identifizieren. Die Verbindungsidentifikation erfolgte auf Basis von Referenzdatenbanken, veröffentlichter Literatur und einer umfassenden Bewertung der Retentionszeit, der Genauigkeit der Vorläuferionenmasse, MS/MS-Fragmentierungsmustern und der Isotopenverteilung. Potenzielle Ziele der blutabsorbierten Prototypen wurden mittels Zielvorhersagedatenbanken vorhergesagt, während IgAN-bezogene Ziele von integrierten bioinformatischen Plattformen gesammelt wurden. Die Kernziele wurden durch PPI-Netzwerkanalysen gescreent. Ein "Verbindung–Ziel-Weg–Krankheit"-Netzwerk wurde aufgebaut, um Schlüsselbestandteile zu identifizieren, und ein molekulares Andocken wurde durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen Kernverbindungen und Zielgruppen zu bewerten. Insgesamt wurden 185 Verbindungen im Wasserextrakt von YQQJ identifiziert. Darunter gelangten 28 Verbindungen in ihren Prototypformen in den Blutkreislauf. PPI identifizierte 42 Kernziele, die mit den therapeutischen Effekten von YQQJ in IgAN assoziiert sind. KEGG- und GO-Anreicherungsanalysen zeigten eine Beteiligung an Zellproliferation, Entzündung und Apoptose sowie Anreicherung in mehreren Schlüsselwegewegen wie PI3K-Akt, MAPK und JAK-STAT. Die molekulare Andockungsanalyse sagte günstige Bindungsinteraktionen zwischen sechs kritischen Zielen (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB und PIK3CA) und drei Hauptblutabsorptionsverbindungen – Deacetylasperulosidsäure, Geniposidsäure und Dioscin – mit konstant niedrigen Bindungsenergien voraus, was auf mögliche Interaktionen hindeutet. Diese integrierte Analyse zeigt, dass YQQJ therapeutische Wirkungen gegen IgAN durch mehrere Komponenten und verschiedene Ziele ausübt. Deacetylasperulosidsäure, Geniposidsäure und Dioscin werden als wichtige Wirkstoffe empfohlen, die zu diesen Effekten beitragen.

Einleitung

Die IgA-Nephropathie (IgAN) ist eine der weltweit häufigsten primären Glomerulonephritis. Ihre klinischen Erscheinungsformen sind hoch heterogen und äußern sich typischerweise als mikroskopische oder grobe Hämaturie, oft begleitet von unterschiedlichen Ausmaßen an Proteinurie, Bluthochdruck und Nierenschädigung. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass bis zu 40 % der Patienten innerhalb von 20 Jahren nach der Diagnosezu Nierenversagen überschreiten 1; Neuere Erkenntnisse deuten jedoch auf eine deutlich schlechtere Prognose hin, wobei die meisten Patienten innerhalb von 10–15 Jahren Nierenversagen entwickelten und nur ein kleiner Teil lebenslange Nierenfunktion ohne Fortschreitungbeibehielt 2,3,4. Obwohl gezielte Therapien in letzter Zeit klinische Fortschritte im IgAN-Management erzielt haben, bleiben ihre hohen Kosten und der relativ langsame Wirksamkeitsbeginn große Herausforderungen, und das klinische Nutzen-Risiko-Verhältnis bleibt umstritten 5,6.

Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) zeigt besondere Vorteile bei der Behandlung komplexer Krankheiten. Sie zeichnet sich durch stabile therapeutische Wirksamkeit, relativ geringe Inzidenz von Nebenwirkungen und multizielmäßige synergistische Effekteaus. Im Gegensatz zu pharmakologischen Wirkstoffen mit nur einem Ziel enthalten TCM-Formeln typischerweise mehrere bioaktive Bestandteile, die gleichzeitig verschiedene biologische Signalwege modulieren können. Diese multikomponentige und multi-zielbezogene Wirkungsweise bietet einen potenziellen therapeutischen Vorteil bei der Behandlung komplexer Krankheiten wie IgAN8. In der TCM-Theorie hat IgAN keinen spezifischen Krankheitsnamen, wird aber allgemein unter "Hämaturie", "Ödem", "Rückenschmerzen", "Nierenwind" und "Tuberkuloseerkrankung" klassifiziert. Die meisten Wissenschaftler betrachten die Kernpathogenese als Lungen-Milz-Qi-Mangel, was zu einem Kontrollverlust über das defensive Qi führt und wiederum zur Invasion von Wind, Feuchtigkeit, Hitze und Toxinen, was letztlich die Nieren schädigt. Obwohl die Niere das primäre beteiligte Organ ist, können auch Herz, Leber, Milz und Lungebetroffen sein. Auf Grundlage dieses Wissens konzentrierten sich zahlreiche Studien auf die Identifizierung pflanzlicher Medikamente und Formeln mit Qi-tonisierenden, äußeren konsolidierenden, wärmereinigenden, entgiftenden und feuchtigkeitslösenden Eigenschaften für die klinische Behandlung von IgAN 10,11.

Die Yiqi Qingjie-Formel (YQQJ) ist ein wirksames empirisches Rezept, das in der Abteilung für Nephrologie unseres Krankenhauses zur Behandlung von IgAN verwendet wird. Die Formel umfasst sieben Kräuter, darunter Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) und Plantago asiatica L. (Cheqiancao). YQQJ übt therapeutische Funktionen aus, indem es Qi stärkt, das äußere Gewebe konsolidiert, Wärme befreit, entgiftet, die Blutzirkulation aktiviert und Diuresefördert. Klinische Studien haben gezeigt, dass YQQJ Proteinurie und Hämaturie bei Patienten mit IgAN signifikant reduziert, die Nierenfunktion verbessert und schleimhaut-immunbezogene Symptome lindert, während es ein günstiges Sicherheitsprofil12,13 aufweist.

Obwohl diese Formel eine günstige klinische Wirksamkeit gezeigt hat, bleibt die pharmakologisch aktive Materialbasis schwer zu klären, da TCM-Formeln zahlreiche chemische Bestandteile enthalten. Chemische Profilierung, die ausschließlich auf chromatographischer oder massenspektrometrischer Analyse basiert, kann die gesamte chemische Zusammensetzung einer Formel aufzeigen; es kann jedoch nicht feststellen, welche Verbindungen in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden und direkt zu therapeutischen Effekten beitragen14. Darüber hinaus basieren konventionelle Netzwerkpharmakologiestudien weitgehend auf datenbankbasierten Vorhersagen und screenen Kandidatenverbindungen typischerweise anhand von Parametern wie oraler Bioverfügbarkeit und Arzneimittelähnlichkeit. Dieser Ansatz kann Verbindungen übersehen, die tatsächlich pharmakologische Aktivität in vivoausüben.

Um diese Einschränkungen zu beheben, verwenden neuere Studien zunehmend integrative analytische Strategien, die ultra-leistungsstarke Flüssigkeitschromatographie mit hybrider Quadrupol-Orbitrap-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), Serumpharmakochemie und Systempharmakologie in der TCM-Forschung16,17 kombinieren. Die Serumpharmakochemie identifiziert Verbindungen, die nach der Verabreichung in den systemischen Kreislauf gelangen, und liefert damit pharmakokinetisch relevante Belege für das Screening potenzieller bioaktiver Bestandteile18. Gleichzeitig ermöglicht UHPLC-Q-Orbitrap HRMS eine hochpräzise Detektion und strukturelle Charakterisierung chemischer Bestandteile in komplexen Kräutermatrizen19.

Im Vergleich zu Ansätzen, die ausschließlich auf chemisches Profiling oder theoretische Zielvorhersage basieren, bietet der in dieser Studie angewandte integrative Arbeitsablauf – bestehend aus UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-basierter Komponentenidentifikation, serumpharmakochemischer Screening, Netzwerkpharmakologieanalyse und molekularer Andockungsvalidierung – mehrere methodische Vorteile. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS ermöglicht eine umfassende und präzise Identifikation komplexer chemischer Bestandteile. Die Serumpharmakochemie beschränkt Kandidatenverbindungen auf solche, die tatsächlich in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden, wodurch die biologische Plausibilität nachfolgender Netzwerkanalysen verbessert wird. Netzwerkpharmakologische Analysen auf Basis experimentell bestätigter absorbierter Verbindungen ermöglichen eine systemweite Untersuchung von Multi-Ziel-Mechanismen und spiegeln die ganzheitlichen pharmakologischen Eigenschaften der TCM-Formeln besser wider. Das molekulare Andocken liefert zudem eine vorläufige computergestützte Validierung vorhergesagter Verbindung-Ziel-Interaktionen und unterstützt eine rationale Priorisierung von Kandidatenmolekülen für eine anschließende experimentelle Verifikation. Zusammen bietet dieser integrative Arbeitsablauf eine zuverlässige, effiziente und physiologisch relevante Strategie, um die materiellen Grundlagen und Mechanismen komplexer pflanzlicher Formeln wie YQQJ zu erläutern.

Dieser Workflow eignet sich besonders gut zur Untersuchung der pharmakologisch aktiven Materialbasis und der Mechanismen komplexer pflanzlicher Formeln, wenn in vivo Absorptionsdaten aus pharmakokinetischen Tier- oder Humanstudien gewonnen werden können. Sie ist besonders auf Formeln mit nachweislicher klinischer Wirksamkeit, aber unklaren Wirkstoffen anwendbar. Dennoch sollten einige Einschränkungen anerkannt werden. Erstens hängt die Genauigkeit der Zielvorhersage von der Qualität und Vollständigkeit öffentlicher Datenbanken ab. Zweitens konzentriert sich der Workflow auf im Umlauf nachgewiesene Prototypverbindungen und berücksichtigt nicht bioaktive Metaboliten, die in vivo gebildet werden. Drittens erfordern Vorhersagen, die aus Netzwerkpharmakologieanalysen abgeleitet werden, weitere experimentelle Validierung. Trotz dieser Einschränkungen bietet der Arbeitsablauf einen effizienten und zuverlässigen Ansatz zur Hypothesengenerierung und Zielpriorisierung in mechanistischen Studien von TCM-Formeln.

Daher verwendet diese Studie UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, um systematisch sowohl die wässrigen Extraktbestandteile als auch die zirkulierenden Verbindungen von YQQJ zu charakterisieren und so eine relativ umfassende Datenbank potenzieller aktiver Bestandteile zu etablieren. Basierend auf diesem Datensatz sagt die Netzwerkpharmakologieanalyse in Kombination mit molekularer Docking-Validierung die potenziell pharmakologisch aktiven Komponenten von YQQJ für die Behandlung von IgAN voraus und bildet eine Grundlage für nachfolgende mechanistische Untersuchungen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die vom China Animal Welfare Committee herausgegeben wurden. Alle Verfahren dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Animal Experimental Center des Guang'anmen-Krankenhauses genehmigt.

1. Tiere und Arzneimittelverabreichung

  1. Verwenden Sie zwölf 6 Wochen alte männliche Sprague–Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 200–230 g.
  2. Halten Sie alle Tiere im Experimental Animal Center unter.
    HINWEIS: Halten Sie die Gehäusetemperatur bei 20–26 °C und die relative Luftfeuchtigkeit bei 40–70 %. Verwenden Sie einen 12-Stunden/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, um natürliche zirkadiane Rhythmen zu simulieren.
  3. Gewöhne die Tiere 7 Tage lang unter Standardbedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser vor dem Experiment. Teilen Sie die Ratten zufällig in zwei Gruppen auf (n = 6 pro Gruppe): eine Kontrollgruppe und eine medikamentenbehandelte Gruppe.
  4. Beziehen Sie sich auf die äquivalente Dosis, die nach Körperoberfläche zwischen Mensch und Tier umgewandelt wird20. Verabreichen Sie YQQJ-konzentriertes Extrakt über orale Gavage mit 24,68 mL/(kg·Tag) an die medikamentenbehandelte Gruppe. Geben Sie der Kontrollgruppe gleichzeitig ein gleiches Volumen destilliertes Wasser, um eine synchrone Behandlung sicherzustellen.
  5. Setzen Sie die Verabreichung 1 Tag lang fort. Teilen Sie die Gesamtdosis täglich in drei gleich große Dosen auf (z. B. um 08:00, 13:00 und 18:00 Uhr), um die volle Dosis innerhalb eines Tages zu gewährleisten.
    HINWEIS: Schnelle Tiere 12 Stunden vor der letzten Promenade, mit freiem Zugang zu Wasser.
  6. Entnehmen Sie Blutproben 2 und 8 Stunden nach der letzten Verabreichung. Betäuben Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 1 % Natriumpentobarbital (50 mg/kg). Sammeln Sie Blut aus der Bauchaorta.
  7. Lassen Sie die Blutproben 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und zentrifugieren Sie dann bei 450 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Überprüfen Sie, ob das Supernatant (Serum) frei und frei von Hämolyse ist. Übertragen Sie das Supernatant-Serum und lagern Sie es bei –80 °C zur weiteren Analyse.

2. Vorbereitung von Lösungen

  1. Vorbereitung von Testlösungen
    1. Sammle alle rohen Kräuter von YQQJ gemäß der Formel. Gib 4 Bände gereinigtes Wasser in den Absuktopf und lasse sie 20 Minuten einweichen.
      HINWEIS: Gereinigtes Wasser wurde den Kräutern im Verhältnis 4:1 (v/w) zugesetzt.
    2. Bring die Mischung zum Kochen und lasse den Abzug dann 30 Minuten bei niedriger Hitze weitergeben. Filtern Sie durch Mull und sammeln Sie das Filtrat. Wiederhole den Absoch der Rückstände mit 4 Bänden Wasser für weitere 30 Minuten und filtere erneut.
    3. Kombiniere die beiden Filtrate. Konzentrieren Sie die Kombinationslösung mit einem Rotationsverdampfer, der auf eine Wasserbadtemperatur von 60 °C eingestellt ist, bis eine Konzentration von 3 g/mL (W/V, entspricht rohen Heilmitteln) erreicht wird.
    4. Überprüfen Sie, dass der konzentrierte Extrakt eine dunkle, zähflüssige Flüssigkeit ohne sichtbare Niederschlagung ist. Lagern Sie bei 4 °C für spätere Gebrauch.
  2. Vorbereitung von Referenzlösungen
    1. Wägen Sie die folgenden Referenzverbindungen genau: Deacetylasperulosidsäure, Geniposidsäure, Logansäure, Morronisid, Chlorogensäure, Swerosid, Plantagoguanidinsäure, Rhein-8-O-β-D-Glucopyranosid, Genistin, Apigenin-7-Glucosid, Diosmetin-7-O-β-D-Glucopyranosid, Calycosin, Protodioscin, Genistein, Diosmetin, Pseudoprotodioscin, Formononetin, 3-Hydroxy-9,10-Dimethoxyptercarpan, Aloeemodin, Rhein, Dioscin.
    2. Lösen Sie jede Verbindung in Methanol, lassen Sie die Mischung 1 Minute vortexen und sonizieren Sie dann 10 Minuten bei Raumtemperatur, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen.
    3. Verdünnen Sie jede Lösung mit Methanol, um eine Endkonzentration von 10 μg/mL für jeden Standard zu erreichen.

3. Probenvorbereitung

  1. Herstellung von YQQJ-Extraktproben
    1. Pipette 100 μL des YQQJ-Wasserextrakts in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr. Füge 300 μL Methanol hinzu und wirbel für 1 Minute vortex. Zentrifugiere bei 1800 × g, 4 °C für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass das entstehende Supernatant frei und frei von suspendierten Partikeln ist.
    2. Nehmen Sie 100 μL des Supernatanten und mischen Sie sie mit 100 μL ultrareinem Wasser, um eine 1:1-Verdünnung zu erzielen. Vortex vorziehen und zur Analyse in ein Autosampler-Fläschchen übertragen.
  2. Herstellung von serumhaltigen Proben mit Arzneimitteln
    1. Pipette 100 μL Serum in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr. Fügen Sie 300 μL Methanol hinzu und vortexen Sie 10 Minuten lang, um die Proteinausfällung sicherzustellen. Zentrifugiere bei 1800 × g, 4 °C für 10 Minuten.
    2. Sammeln Sie 270 μL des Supernatanten und übertragen Sie es in ein sauberes Rohr. Verdampfen Sie das Überlagerungsmittel mit einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator, der auf 120 × g, 37 °C für 4 Stunden, bis sich ein sichtbarer fester Rückstand bildet.
    3. Rekonstituieren Sie den Rest mit 90 μL wässriger Lösung aus 50 % Methanol. Wirbel 1 Minute lang, um den Rückstand vollständig aufzulösen, dann erneut bei 1800 × g, 4 °C für 10 Minuten.
    4. Sammeln Sie 80 μL des endgültigen klaren Supernatanten und übertragen Sie es zur Analyse in ein Autosampler-Fläschchen.

4. Analytische Bedingungen

  1. Chromatographische Bedingungen
    1. Führen Sie chromatographische Trennung mit einem UHPLC-System durch, das mit einer chromatografischen Säule ausgestattet ist.
    2. Verwenden Sie eine binäre mobile Phase (Phase A: Wasser mit 0,1 % Ameisensäure; Phase B: Acetonitril). Wenden Sie ein Gradienten-Elutionsprogramm an, wie in Tabelle 1 gezeigt, bei einer Durchflussrate von 0,3 mL/min. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C und das Einspritzvolumen auf 6,0 μL ein.
      HINWEIS: Die Säulenspezifikationen betragen 2,1 mm × 100 mm Partikelmaß von 1,8 μm.
  2. MS-Bedingungen
    1. Proben werden mit einem Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer analysiert, das mit einer beheizten Elektrosprüh-Ionisationssonde (HESI) ausgestattet ist.
    2. Parameter wie folgt setzen: Ionisationsspannung: 3,7 kV (positiver Modus) / 3,5 kV (negativer Modus); Kapillartemperatur: 320 °C; Gasdruck in der Hülle: 30 psi; Hilfsgasdruck: 10 psi; Desolvationstemperatur: 300 °C; Mantelgas und das Hilfsgas: Stickstoff; Kollisionsgas: Stickstoff, 1,5 mTorr.
    3. Daten im Full Scan/dd-MS2-Modus erfassen. Setzen Sie die vollständigen Scanparameter wie folgt: Auflösung 70000, Auto Gain Control Ziel 1×106, maximale Isolationszeit 50 ms und m/z-Scanbereich 100 – 1500.
    4. Sammeln Sie die dd-MS2-Daten mit den Parametern Auflösung 17500, Auto-Gain-Steuerungsziel 1×105, maximale Isolationszeit 50 ms, wählen Sie die oberen n (n≤10) intensivsten Elternionen für Fragmentierung aus, gekoppelt mit einem dynamischen Ausschlussmechanismus, Isolationsfenster m/z 2, Kollisionsenergie 10 V, 30 V, 60 V und Intensitätsschwelle 1×105.

5. Verarbeitung von MS-Daten

  1. Verarbeiten Sie die erfassten MS-Daten mit spezieller Datenverarbeitungssoftware. Navigiere zum Modul Daten importieren und lade die Rohdaten hoch.
  2. Führe das Peak Picking-Modul aus und führe eine Peak-Dekonvolution durch, um Adduktionionen zu gruppieren und Verbindungsmerkmale zu generieren.
  3. Durchsuchen Sie Referenzdatenbanken, Zielvorhersagedatenbanken und relevante veröffentlichte Literatur zur Identifizierung von Kandidaten.
  4. Identifizieren Sie Verbindungen mit zwei komplementären Identifikationsstrategien basierend auf hochauflösenden MS-Daten.
    1. Identifikation basiert auf Referenzstandard-Matching. Bestätigen Sie Verbindungen im Vergleich mit authentischen Referenzstandards. Identifizieren werden nur akzeptiert, wenn alle folgenden Kriterien erfüllt sind:
      1. Massengenauigkeit: Der Massenfehler sowohl von Vorläuferionen als auch von Fragmentionen muss innerhalb von ±5 ppm liegen.
      2. Spektrale Ähnlichkeit: Der Cosinus-Ähnlichkeitswert zwischen dem experimentellen MS/MS-Spektrum und dem MS/MS-Spektrum des Referenzstandards muss ≥ 0,85 betragen.
      3. Isotopenverteilung: Der Isotopenmuster-Matching-Wert muss ≥ 90 % betragen.
      4. Chromatographisches Verhalten: Die Abweichung der Retentionszeit zwischen der detektierten Verbindung und dem Referenzstandard muss < 0,2 Minuten betragen.
        HINWEIS: Verbindungen, die alle oben genannten Kriterien erfüllen, sind als MSI Level 1 annotiert, was eine bestätigte strukturelle Identifikation darstellt.
    2. Identifikation basierend auf hochauflösenden MS-Daten und in-silico-spektraler Vorhersage. Für Verbindungen ohne verfügbare Referenzstandards führen Sie eine vermutete Identifikation auf Basis genauer Massenmessungen und rechnergestützter spektraler Vorhersage durch. Anmerkungen werden nur akzeptiert, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind:
      1. Massengenauigkeit: Der Massenfehler von Vorläuferionen muss innerhalb von ±5 ppm liegen, und der Massenfehler von Fragmentionen muss innerhalb von ±10 ppm liegen.
      2. Spektrale Ähnlichkeit: Vergleichen Sie das experimentelle MS/MS-Spektrum mit dem theoretischen MS/MS-Spektrum, das aus der zusammengesetzten SMILES-Struktur mit dem Progenesis-QI-Algorithmus erzeugt wird. Akzeptiere Übereinstimmungen mit einem Kosinus-Ähnlichkeitswert ≥ 0,60.
      3. Isotopenverteilung: Der Isotopenmuster-Matching-Wert muss ≥ 90 % betragen.
      4. Chromatographisches Verhaltensvorhersagen: Die Abweichung zwischen der experimentellen Retentionszeit und der maschinellen Lernzeit muss < 1,0 Minuten betragen.
        HINWEIS: Das Vorhersagemodell der Retentionszeit wurde mit experimentellen chromatografischen Daten von mehr als 2000 Referenzverbindungen trainiert, die unter denselben chromatografischen Bedingungen analysiert wurden. Verbindungen, die diese Kriterien erfüllen, werden als MSI-Stufe 2 annotiert und repräsentieren angeblich identifizierte Verbindungen mit hoher struktureller Zuverlässigkeit.

6. Netzwerkpharmakologie

  1. Identifikation von blutabsorbierten Komponenten und IgAN-bezogenen Zielen
    1. Importieren Sie die identifizierten blutabsorbierten Prototypbestandteile von YQQJ in die Zielvorhersagedatenbanken. Wählen Sie "Homo sapiens" als Zielart aus und ermitteln Sie deren potenzielle Ziele. Zeichnen Sie diese als Zielgruppe der blutabsorbierten Verbindungen in YQQJ auf.
    2. Verwenden Sie das Schlüsselwort "IgA-Nephropathie", um IgAN-bezogene Krankheitsziele von den integrierten Bioinformatikplattformen abzurufen. Konsolidiere Ergebnisse aus mehreren Quellen, um Verzerrungen zu minimieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Proteindatenbank, um alle abgerufenen Ziele für Konsistenz in das Gen-Symbol-Format umzuwandeln.
  2. Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) und Identifikation von Kernzielen
    1. Kombinieren Sie die Zielmenge der blutabsorbierten YQQJ-Verbindungen mit dem IgAN-Krankheitszielsatz und extrahieren Sie deren Schnittpunkt.
    2. Laden Sie die sich schneidenden Ziele auf die PPI-Plattform21 hoch. Konfigurieren Sie die Einstellungen: Setzen Sie den Organismus als Homo sapiens, den Konfidenzwert auf 0,90 und verwerfen Sie alle losgelösten Knoten.
    3. Importiere die PPI-Daten in die Visualisierungssoftware22. Starte das topologische Analyse-Plugin. Berechnen Sie Gradzentralität (DC)23, Zwischenzentralität (BC)24 und Nähezentralität (CC)25.
    4. Screenen Sie auf die Kernziele von YQQJ gegen IgAN, indem Sie Knoten mit topologischen Parameterwerten (DC, BC und CC) filtern, die den Median überschreiten.
  3. Aufbau und Analyse des integrierten Netzwerks "YQQJ–blutabsorbierte Komponenten–Ziele–Wege–Krankheit"
    1. Bereite die Node-Attributdatei vor: Erstelle eine Tabelle mit zwei Spalten. Beschriften Sie die erste Spalte Knotenname und den zweiten Knotentyp. Jedem Knoten werden eine der fünf Kategorien (Formel, Blutabsorbierte Komponente, Schnittziel, Pfad oder Krankheit) zugewiesen.
    2. Bereite die Netzwerkinteraktions-(Edge)-Datei vor: Erstelle eine Tabelle, die die Verbindungen zwischen den Knoten definiert (z. B. Blood-Absorbed Component to Intersection Target). Stellen Sie sicher, dass alle Knotennamen mit denen in der Knotenattributdatei übereinstimmen, um Abbildungsfehler zu vermeiden.
    3. Netzwerk importieren und aufbauen: Starten Sie die Netzwerkvisualisierungssoftware. Navigiere zu Datei > Import > Netzwerk , um die Randdatei zu laden. Im Vorschaufenster werden die Spalten als Quellknoten und Zielknoten zugeordnet und auf OK geklickt, um den Anfangsgraphen zu generieren.
    4. Knotenattribute zuordnen und visuelle Stile festlegen: Importiere die Knotenattributdatei über Datei > Importiere > Tabelle. Öffnen Sie das Style-Panel und weisen Sie die Spalte Knotentyp bestimmten visuellen Eigenschaften zu, einschließlich Knotenform, Füllfarbe und Größe.
    5. Topologische Analyse durchführen: Navigieren Sie zu Tools > Analyze Network , um topologische Berechnungen durchzuführen. Filtern und identifizieren Sie Kernwirkstoffe sowie wichtige therapeutische Ziele basierend auf Gradwerten.
      HINWEIS: Verwenden Sie dieselben topologischen Parameter wie in Schritt 6.2 beschrieben, um eine Konsistenz bei der Kern-Knotenidentifikation sicherzustellen.
    6. Exportiere das Netzwerk-Image: Finalisiere das Netzwerklayout. Navigiere zur Datei > exportiere > Netzwerk zu Bild, um die optimierte Visualisierung zu speichern.
  4. GO-Anreicherung und KEGG-Signalweganalysen
    1. Die Genliste einreichen: Öffnen Sie die webbasierte funktionale Annotationsplattform. Navigieren Sie zum Bereich Schritt 1: Genliste absenden und die zuvor gefilterte Zielgenliste26 hochladen.
    2. Arten auswählen: In den Dropdown-Menüs für Schritt 2: Eingabe als Art und Schritt 3: Analyse als Art wählen Sie H. sapiens. (Mensch) aus, um sicherzustellen, dass die Analyse im korrekten biologischen Kontext durchgeführt wird.
    3. Benutzerdefinierte Analyse konfigurieren: Wähle den benutzerdefinierten Analyse-Modus . In der Kategorie Anreicherung prüfen Sie folgende Datenbanken: Gene Ontology (GO) Molecular Function (MF), GO Biological Process (BP), GO Cellular Component (CC) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG Pathway).
    4. Signifikanzschwellen setzen: Setzen Sie die P-Wert-Grenze auf < 0,01, die Mindestanreicherung auf ≥ 1,5 und die Mindestüberlappung auf ≥ 3. Behalten Sie alle anderen Parameter auf ihren Standardeinstellungen.
    5. Führen Sie die Analyse aus: Klicken Sie auf die Schaltfläche Anreicherungsanalyse , um die Aufgabe einzureichen, und warten Sie, bis die Berechnung abgeschlossen ist.
    6. Ergebnisse abrufen und exportieren: Zugriff auf die Seite des generierten Analyseberichts. Klicken Sie auf den Download-Button, um die detaillierten Anreicherungsdaten in einer Tabellenkalkulation sowie den entsprechenden Balkendiagrammen und Heatmaps zu exportieren.

7. Molekulare Andockverifikation

  1. Laden Sie die hochauflösenden (< 2,50 Å) 3D-Proteinstrukturen der Kernziele und 2D-chemische Strukturen der blutabsorbierten Kernbestandteile aus den strukturellen biologischen Datenbankenherunter 27.
  2. Starte die Molekular-Andocksoftware und importiere die heruntergeladenen Strukturen.
  3. Führen Sie die folgenden Vorverarbeitungsschritte nacheinander aus: Navigieren Sie zu Bearbeiten > Wasser entfernen, um Wassermoleküle zu eliminieren; Wählen Sie Bearbeiten > Entfernen von Heteroatomen , um nicht-standardisierte Reste zu verwerfen.
  4. Gehe zu Bearbeiten > Wasserstoffe> füge > nur polare Wasserstoffatome hinzu, um polare Wasserstoffatome hinzuzufügen. Speichere die verarbeiteten Strukturen im PDBQT-Format über File > Save > Write PDBQT.
  5. Definieren Sie den Andockplatz mit dem Werkzeug Grid > Grid Box . Die Gitterboxmaße wurden adaptiv angepasst (20–100 Å), um eine vollständige Abdeckung der vorhergesagten Bindungsbereiche sicherzustellen.
  6. Initialisieren Sie die Andockparameter: Wählen Sie den Rezeptor über Andocken > Makromolekül > Stellen Sie den Dateinamen fest und öffnen Sie den Ligand über Docking > Ligand > Open. Die Andockparameter wurden wie folgt festgelegt: Exhaustivität = 32, Energiebereich = 3 kcal/mol, und bis zu 10 Bindungsmodi wurden beibehalten. Bei Proteinen mit kokristallisierten Liganden war die Andockgitterbox auf das Ligandenzentroid mit einer 8,0-Å-Erweiterung zentriert, während bei Proteinen ohne kokristallisierte Liganden Bindungstaschen mit DoGSiteScorer mit etwa 90 % Abdeckung vorhergesagt wurden.
  7. Wählen Sie den Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) als Suchstrategie. Führe die Simulation über Andocken aus > führe AutoDock aus.
  8. Bewerten Sie die Bindungsaffinität anhand der berechneten Bindungsenergie (Andockwert)28.
    HINWEIS: Eine niedrigere Bindungsenergie weist auf eine stärkere vorhergesagte Bioaktivität und eine höhere strukturelle Stabilität des Protein-Ligand-Komplexes hin. Ein Schwellenwert von ≤ -5,0 kcal/mol wird typischerweise verwendet, um eine günstige Bindungsstabilität zu bestimmen.

Ergebnisse

Analyse der Bestandteile im YQQJ-Wasserextrakt
Die Komponentenanalyse des YQQJ-Wasserextrakts wurde unter den im PROTOKOLL 4 festgelegten Bedingungen durchgeführt. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS wurde sowohl im positiven als auch im negativen Ionen-Fullscan-Modus eingesetzt, um den wässrigen Extrakt von YQQJ zu profilieren, und das erhaltene Base Peak Ion Chromatogramm (BPI) ist in Abbildung 1 dargestellt. Auf dieser Grundlage ermöglichte eine selbst etablierte chemische Bestandteilsdatenbank in Kombination mit MS/MS-Spektralcharakterisierung die erfolgreiche Identifikation von 185 Verbindungen aus dem wässrigen Extrakt, wobei detaillierte Informationen in ergänzender Tabelle 1 zusammengefasst sind. Repräsentative MS/MS-Spektralabstimmungs- und Fragmentierungsmuster, die zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, sind in ergänzender Abbildung 1 dargestellt. Statistische Analysen der Verbindungskategorien zeigten, dass Flavonoide und Terpenoide die vorherrschenden Bestandteile in YQQJ waren und 94 Verbindungen ausmachten, den häufigsten Anteil.

Blutabsorbierte Komponenten von YQQJ
Um die direkten bioaktiven Substanzen in vivo zu klären, wurden nach der Verabreichung von YQQJ entnommene Serumproben analysiert. Das BPI-Chromatogramm des Blankserums (Abbildung 2) wurde zum Vergleich beigefügt, um wirkstoffabgeleitete Verbindungen von endogenen Serumkomponenten zu unterscheiden. Basierend auf dem BPI des medikamentenhaltigen Serums (Abbildung 3) wurden insgesamt 28 Prototypkomponenten identifiziert, die in den Blutkreislauf aufgenommen wurden, hauptsächlich darunter Flavonoide, Terpenoide und Steroide. Extrahierte Ionenchromatogramme (EICs) repräsentativer Verbindungen über den YQQJ-Extrakt, das Blankserum und das medikamentenhaltige Serum bestätigten das Vorhandensein von wirkstoffabgeleiteten Komponenten im Umlauf weiter (ergänzende Abbildung 2). Davon stammen 10 Verbindungen von Spatholobus suberectus Dunn, 7 von Dioscorea nipponica Makino, 7 von Astragalus membranaceus, 6 von Hedyotis diffusa Willd., 6 von Lonicera japonica Thunb., 4 von Plantago asiatica L. und 4 von Rheum palmatum.L., zusammengefasst in der ergänzenden Tabelle 1.

Zielvorhersage der blutabsorbierten Komponenten von YQQJ in Zusammenhang mit IgAN
Insgesamt wurden 28 identifizierte Prototypbestandteile, die in den Blutkreislauf gelangen, in Zielvorhersagedatenbanken eingetragen, was 459 potenzielle Ziele ergab. Unterdessen wurden 2779 IgAN-bezogene Ziele von integrierten Bioinformatikplattformen abgerufen. Die Schnittanalyse identifizierte 247 sich überlappende Ziele zwischen YQQJ und IgAN (Abbildung 4).

Aufbau und Analyse des PPI-Netzwerks
Die 247 sich schneidenden Ziele wurden in die PPI-Plattform hochgeladen, und die Visualisierungssoftware wurde verwendet, um Kernziele anhand von drei topologischen Parametern zu screenen: DC, BC und CC. Insgesamt wurden schließlich 42 Ziele als Kernknoten identifiziert. Der Workflow zur Auswahl dieser Kernziele ist in ergänzender Abbildung 3 zusammengefasst. Im PPI-Netzwerk variierten Knotengröße und -farbe je nach Parameterwert (Abbildung 5), darunter TP53, SRC, AKT1, ESR1 und STAT3 unter den fünf wichtigsten Kernzielen.

"Formel–blutabsorbierte Komponenten–Kernziele–Pfade–Krankheit"-Netzwerk von YQQJ
Um systematisch die Multikomponenten- und Multi-Zielmechanismen von YQQJ im Vergleich zu IgAN aufzudecken, wurde ein Interaktionsnetzwerk "Formel–Blutabsorbierte Komponenten–Kernziele–Pfade–Krankheit" mit Visualisierungssoftware erstellt. Das Netzwerk bestand aus 96 Knoten und 459 Kanten, wobei jede Kante eine Beziehung oder Interaktion zwischen zwei Knoten darstellte (Abbildung 6).

GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen
Die GO-Anreicherungsanalyse der 42 Kernziele ergab 1162 BP-Terme, 52 CC-Terms und 92 MF-Terms. Abbildung 7 zeigt die zehn am stärksten angereicherten GO-Begriffe in BP-, CC- und MF-Kategorien. Die KEGG-Anreicherungsanalyse identifizierte außerdem 182 Signalwege, die mit diesen Kernzielen assoziiert sind. Abbildung 8 zeigt die 20 wichtigsten signifikant angereicherten Signalwege, die eng mit der Pathogenese von IgAN verwandt sind. In diesen Diagrammen zeigen tiefere rote Farben eine stärkere statistische Signifikanz, während größere Blasengrößen oder längere Balkenlängen eine größere Anzahl bereicherter Ziele innerhalb jedes Weges darstellen.

Molekulare Andockungsbewertung
In dieser Studie, basierend auf der vorherigen Analyse der Schlüsselziele und verwandten Signalwege von YQQJ bei der Behandlung von IgAN 29,30,31,32, wurden sechs Kernziele, darunter CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) UND PIK3CA (PDB ID: 5FI4), ALS REZEPTORPROTEINE FÜR MOLEKULARE DOCKING AUSGEWÄHLT. Entsprechend der Kern-TCM-Pathogenese von IgAN, definiert als "pathogener Wind, Feuchtigkeitshitze und Toxine, die die Niere befallen", wurden repräsentative Wirkstoffe mit wärmereinigenden, feuchtigkeitsentfernenden und entgiftenden Eigenschaften als Liganden ausgewählt, nämlich Deacetylasperulosidsäure und Geniposidsäure aus Hedyotis diffusa Willd. sowie Dioscin aus Dioscorea nipponica. Makino. Die Andockergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Unter allen Liganden-Rezeptor-Kombinationen zeigte Dioscin bei allen ausgewählten Zielen deutlich niedrigere Bindungsenergie, was auf eine höhere vorhergesagte Bindungsaffinität hindeutet. Abgesehen von den Wechselwirkungen zwischen JUN und Deacetylasperulosidsäure/Geniposidsäure zeigten die anderen Andockpaare ebenfalls günstige Bindungsaktivitäten. Repräsentative 3D-Andockkonformierungen sind in Abbildung 10 dargestellt.

figure-results-1
Abbildung 1: Base-Peak-Ionenchromatogramme des YQQJ-wässrigen Extrakts. (A) BPI-Chromatogramm mit positivem Ionenmodus. (B) BPI-Chromatogramm im negativen Ionenmodus. Die Chromatogramme zeigen das gesamte chemische Profil des YQQJ-wässrigen Extrakts unter den etablierten UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Basis-Peak-Ionenchromatogramme des Blankserums. (A) BPI-Chromatogramm mit positivem Ionenmodus. (B) BPI-Chromatogramm im negativen Ionenmodus. Die Chromatogramme stellen das endogene Serum-Hintergrundprofil dar, das als Kontrolle zum Vergleich mit medikamentenhaltigem Serum verwendet wird, um wirkstoffabgeleitete Komponenten von endogenen Bestandteilen zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Base-Peak-Ionenchromatogramme des YQQJ-enthaltenden Serums. (A) BPI-Chromatogramm mit positivem Ionenmodus. (B) BPI-Chromatogramm im negativen Ionenmodus. Die Chromatogramme zeigen das Profil der blutabsorbierten Bestandteile, die nach der Verabreichung von YQQJ im Serum nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-4
Abbildung 4: Venn-Diagramm überlappender Ziele zwischen YQQJ und IgAN. Das Diagramm zeigt die Anzahl der vorhergesagten YQQJ-Ziele, IgAN-bezogene Ziele und deren Überschneidungen und hebt die gemeinsamen Ziele hervor, die potenziell an therapeutischen Wirkungen beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-5
Abbildung 5: Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) von Kernzielen. Knoten repräsentieren Proteinziele, und Kanten stehen für Interaktionen zwischen Zielen. Knotengröße und Farbintensität entsprechen Gradwerten, wobei größere und dunklere Knoten eine höhere Konnektivität innerhalb des Netzwerks anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-6
Abbildung 6: Integriertes Netzwerk von YQQJ-Komponenten, Zielen, Signalwegen und Krankheiten. Das Netzwerk veranschaulicht Beziehungen zwischen der Formel, blutabsorbierten Komponenten, Kernzielen, Signalwegen und IgAN. Dreieck steht für Krankheit; Kreis steht für Bahnen; Der V-förmige Knoten stellt die YQQJ-Formel dar; Diamant steht für Kräuter; Hexagon stellt Komponenten dar; Octagon stellt Prototypen der blutabsorbierten Komponenten dar; Das Rechteck stellt Ziele dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-7
Abbildung 7: GO-Anreicherungsanalyse der Kernziele. Das Balkendiagramm zeigt die zehn wichtigsten bereicherten Genontologie-Begriffe in den BP-, CC- und MF-Kategorien. Die x-Achse stellt GO-Terme dar, und die y-Achse zeigt −log10(p-Wert), was die Bedeutung der Anreicherung anzeigt. Abkürzungen: BP = Biologischer Prozess; CC = zelluläre Komponente; MF = Molekulare Funktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-8
Abbildung 8: KEGG-Anreicherungsanalyse der Kernziele. Das Blasendiagramm zeigt die 20 wichtigsten angereicherten KEGG-Pfade. Die Punktgröße zeigt die Anzahl der angereicherten Gene an, und der Farbgradient zeigt −log10 (p-Wert) an, wobei rötwere Farben eine höhere statistische Signifikanz anzeigen. Die x-Achse zeigt das Genverhältnis, und die y-Achse listet Wegterme auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-9
Abbildung 9: Molekulare Andockungs-Bindungsenergie-Heatmap. Die Heatmap zeigt Bindungsenergien (kcal/mol) zwischen Kernzielen und wichtigen blutabsorbierten Verbindungen. Niedrigere Bindungsenergiewerte deuten auf eine stärkere vorhergesagte Bindungsaffinität hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-10
Abbildung 10: Repräsentative molekulare Andockungskonformationen. (A) Bindungskonformation von Deacetylasperulosidsäure mit CASP3. (B) Bindende Konformation von Dioscin mit STAT3. (C) Bindungskonformation von Geniposidsäure mit PIK3CA. Die Bilder zeigen die vorhergesagten Liganden-Protein-Interaktionen und Bindungsorientierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Strukturelle Identifikation repräsentativer Verbindungen durch hochauflösende MS/MS. (A) Kopf-zu-Ende-Spektralvergleich der Deacetylasperulosidsäure zwischen dem experimentellen Spektrum (oben, rot) und dem Referenzdatenbankspektrum (unten, blau). (B) Hochauflösendes MS/MS-Fragmentationsspektrum der Deacetylasperulosidsäure. (C) Kopf-zu-Schwanz-Spektralvergleich von Geniposidsäure mit der Referenzdatenbank. (D) Experimentelles MS/MS-Fragmentierungsspektrum von Geniposidsäure. (E) Kopf-zu-Schwanz-Spektralvergleich von Dioscin mit der Referenzdatenbank. (F) Hochauflösendes MS/MS-Fragmentierungsspektrum von Dioscin. Diese Panels veranschaulichen das spektrale Matching zur Identifizierung von Verbindungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Extrahierte Ionenchromatogramme (EICs) repräsentativer Verbindungen über Proben hinweg. (A) EIC für Deacetylasperulosidsäure. (B) EIC Geniposidinsäure. (C) Der Chefarzt von Dioscin. Für jedes Panel stellt die obere Spur das YQQJ-Wasserextrakt (ZY) dar, die mittlere Spur das leere Kontrollserum (KBX) und die untere Spur Serumproben mit blutabsorbierten Komponenten nach YQQJ-Verabreichung (GYX). Der Vergleich hebt das Vorhandensein von wirkstoffabgeleiteten Verbindungen im Serum hervor. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Arbeitsablauf zum Screening von Kernzielen. Das Flussdiagramm veranschaulicht den schrittweisen Prozess der Zielidentifizierung, einschließlich der Vorhersage von zusammengesetzten Zielen, der IgAN-bezogenen Zielerfassung, der Analyse der Schnittpunkte, dem Aufbau von PPI-Netzwerken und der Überprüfung von Kernzielen basierend auf topologischen Parametern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zeit (min)Mobilphase
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabelle 1: UHPLC-Gradienten-Elutionsprogramm. Die Tabelle zeigt die Zusammensetzung der mobilen Phase und die Gradientenbedingungen, die für die chromatographische Trennung verwendet werden, einschließlich Zeitpunkten und der entsprechenden Anteile von wässrigen (Phase A) und organischen (Phase B) Lösungsmitteln.

Ergänzende Tabelle 1: Identifizierte chemische Bestandteile des wässrigen YQQJ-Extrakts. Die Tabelle listet Verbindungen auf, die durch UHPLC-Q-Orbitrap HRMS identifiziert wurden, einschließlich der blutabsorbierten Prototypkomponenten (A1–A28), sowie deren Klassifikation und pflanzlichen Ursprungs. Abkürzungen: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Rheum palmatum L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiatica L.; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Zusammengesetzte Klassen umfassen A = Alkaloide; Ald = Aldehyde; F = Flavonoide; N = Nukleoside; O = Andere; OA = Organische Säuren; P = Phenole; PA = Phenolsäuren; Phe = Phenylpropanoide; Q = Chinonen; S = Saccharide; Ste = Steroide; T = Terpenoide; Tan = Tannine. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In der vorliegenden Studie wurde eine integrierte Strategie verwendet, die "UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-Identifikation – Serumpharmakochemie-Analyse – Netzwerkpharmakologie-Vorhersage – molekulare Andockungsvalidierung" kombiniert, um systematisch die potenziellen materiellen Grundlagen und Mechanismen von YQQJ bei der Behandlung von IgAN zu erläutern. Im Gegensatz zu früheren Forschungen, die hauptsächlich auf MS zur Analyse der chemischen Bestandteile pflanzlicher Formeln setzten und anschließend Mechanismen ausschließlich mit Netzwerkpharmakologievorhersagten 16, folgt die Serumpharmakochemie einem Arbeitsablauf mit "komplexen pflanzlichen Bestandteilen – blutabsorbierte Komponenten – direkte in vivo aktive Substanzen – pharmakodynamische Materialbasis". Durch die Identifizierung der nach der Verabreichung in den systemischen Kreislauf gelangenden Komponenten gilt dieser Ansatz weithin als effektive Strategie zur Bestimmung der pharmakodynamischen Materialbasis von TCM-Formeln.

In dieser Studie identifizierte die UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS-Analyse zunächst 185 Bestandteile in YQQJ, von denen 28 als blutabsorbierte Prototypen bestätigt wurden, was eine verlässliche chemische Grundlage für spätere mechanistische Studien lieferte. Die Genauigkeit dieser Identifikation hing von der umfassenden Abgleichung von Retentionszeit, exakter Masse und MS/MS-Fragmentierungsinformationen14. Basierend auf der serumpharmakochemischen Strategie wurden diese blutabsorbierten Prototypverbindungen als Ausgangspunkt für den Netzwerkaufbau verwendet, was die Relevanz zwischen pflanzlichen Komponenten und tatsächlicher in vivo Wirksamkeiterhöhte. Durch die Integration von Verbindungs-Krankheits-Überschneidungszielen mit PPI-basiertem Screening von Kernknoten, gefolgt von GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen, wurden15 wichtige Signalwege identifiziert, die mit IgAN assoziiert sind. Molekulare Andockungsergebnisse deuteten darauf hin, dass die wichtigsten blutabsorbierten Komponenten von Hedyotis diffusa Willd. und Dioscorea nipponica makino stammten.kann mit Kernzielen aufgrund vorhergesagter Bindungsaffinitäten interagieren, anstatt experimentell bestätigter funktioneller Aktivität. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Deacetylasperulosidsäure, Geniposidsäure und Dioscin als potenzielle wichtige pharmakodynamische Bestandteile von YQQJ dienen könnten, bis weitere experimentelle Validierung erfolgt.

Aus technischer Sicht war die Probenvorbehandlung entscheidend. Aufgrund der Komplexität des Serums und des Vorhandenseins endogener Proteine (z. B. Hormone und Enzyme) ist eine Beeinträchtigung des Nachweises blutabsorbierter Komponenten unvermeidlich. In dieser Studie wurde Methanol-Präzipitation angewendet, um Analyten zu bereichern und Hintergrundinterferenzen zu reduzieren, wodurch sowohl die Empfindlichkeit als auch die Genauigkeit der MS-Analyse34 gewährleistet wurde. Bezüglich der Blutprobenzeitpunkte können verschiedene Inhaltsstoffe in pflanzlichen Formeln unterschiedliche Absorptions- und In-vivo-Transformationsmuster aufweisen, was ihre Nachweisbarkeit im Serum beeinflussen kann. Daher wurden auf Grundlage der Vorstudien Serumproben 2 Stunden und 8 Stunden nach der letzten Verabreichung entnommen, um die Abdeckung der zirkulierenden Bestandteile zu maximieren.

Mehrere prozedurale Schritte erwiesen sich als besonders entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung dieses Workflows. Eine genaue Verbindungsidentifikation beruht stark auf der kombinierten Bewertung von Retentionszeit, hochauflösender Massengenauigkeit und diagnostischen MS/MS-Fragmentionen. Darüber hinaus sind geeignete Serumprobenzeiten unerlässlich, um blutabsorbierte Bestandteile zu erfassen, die in verschiedenen Phasen nach der Verabreichung im Kreislauf erscheinen können. Eine sorgfältige Optimierung der Vorbehandlungs- und chromatographischen Trennbedingungen ist daher notwendig, um eine zuverlässige Detektion von Prototypverbindungen in komplexen biologischen Matrizen sicherzustellen.

Potenzielle analytische Herausforderungen können während der Probenvorbereitung und der MS-Analyse auftreten. Beispielsweise kann unvollständige Proteinausfällung zu Matrixeffekten führen, die die Ionisationseffizienz unterdrücken, während übermäßiges Hintergrundrauschen die Nachweisempfindlichkeit verringern kann. Diese Probleme können durch Optimierung der Lösungsmittelverhältnisse während der Proteinausfällung, Verbesserung der chromatografischen Trennbedingungen und Anpassung der MS-Aufnahmeparameter behoben werden. Während der Datenverarbeitung können falsch-positive zusammengesetzte Annotationen auftreten, wenn ausschließlich auf Datenbankabgleich angewiesen wird; daher wird eine manuelle Überprüfung der MS/MS-Fragmentierungsmuster und des Aufbewahrungsverhaltens empfohlen, um die Zuverlässigkeit der Identifikation zu verbessern.

Mehrere methodische Überlegungen wurden in dieses Werk aufgenommen. Erstens wurden anstelle konventioneller Kriterien wie orale Bioverfügbarkeit und Arzneimittelähnlichkeit nur experimentell verifizierte blutabsorbierte Komponenten zur Zielvorhersage verwendet. Dieser Ansatz vermied das mögliche Auslassen aktiver Verbindungen aufgrund voreingestellter Filterschwellenwerte und eliminierte irrelevante Bestandteile, die in vivo nicht bioverfügbar sind, wodurch die physiologische Relevanz der Netzwerkvorhersage16 gestärkt wurde. Zweitens konzentrierte sich die Auswahl aktiver Liganden für das Andocken speziell auf Hauptbestandteile, die aus Kräutern stammen und die Funktion "Windfeuchtigkeit und Entfernung von Wärmetoxin" (Hedyotis diffusa Willd. und Dioscorea nipponica Makino.) haben, wodurch eine mechanistische Brücke zwischen dem pathologischen TCM-Konzept des "windfeuchten-Wärmetoxins, das in die Niere eindringt" und den modernen pathologischen Merkmalen von IgAN hergestellt wurde. Dies liefert vorläufige Beweise zur Unterstützung der TCM-Theorie der Formel-Muster-Korrelation. Drittens wurden unter Berücksichtigung möglicher Unterschiede in Datengröße und -qualität zwischen Datenbanken mehrere Plattformen integriert, um die Zielabdeckung zu erweitern und Verzerrungen, die durch eine einzelne Datenbank35 entstehen, zu verringern.

Im Vergleich zu herkömmlichen Strategien, die die Netzwerkpharmakologie direkt auf alle nachgewiesenen chemischen Bestandteile anwenden, legt der aktuelle Arbeitsablauf den Schwerpunkt auf evidenzbasierter Priorisierung von Verbindungen auf Basis experimentell nachgewiesener, blutabsorbierter Bestandteile. Dieser schrittweise Filterprozess reduziert die Anzahl der Kandidatenverbindungen, die in die rechnergestützte Analyse eingehen, und verbessert die Interpretierbarkeit von Verbindungen und Ziel-Interaktionsnetzwerken. Darüber hinaus konzentriert sich die derzeitige Strategie im Gegensatz zu metabolomikorientierten Studien, die hauptsächlich endogene Stoffwechselstörungen erfassen, auf exogene Prototypverbindungen, die aus pflanzlichen Arzneimitteln abgeleitet sind, wodurch eine direktere Zuordnung der pharmakologischen Aktivität auf spezifische pflanzliche Bestandteile ermöglicht wird.

Aus praktischer methodischer Sicht bietet dieser Arbeitsablauf mehrere Vorteile bei der Untersuchung komplexer pflanzlicher Formulierungen. Die Integration von HRMS mit der Serumpharmakochemie ermöglicht die zuverlässige Identifikation bioverfügbarer Bestandteile, während die anschließende Kombination aus Netzwerkpharmakologie und molekularem Andocken einen hierarchischen analytischen Rahmen schafft, der chemische Beweise mit mechanistischer Vorhersage verbindet. Darüber hinaus reduziert die Beschränkung des Netzwerkaufbaus auf experimentell verifizierte Verbindungen die Netzwerkkomplexität und erleichtert eine klarere Identifikation der Kernverbindungs-Ziel-Interaktionen.

Auch diese Studie hat Einschränkungen. Erstens sind Netzwerkpharmakologie und molekulares Andocken prädiktive computergestützte Ansätze. Eine starke Bindungsaffinität führt nicht zwangsläufig zu biologischer Regulation in vivo, da molekulares Andocken weder die Proteindynamik, den zellulären Kontext noch die nachgelagerte Signalübertragung berücksichtigt. Darüber hinaus beinhaltete das derzeitige Andockprotokoll keine Neuandockungsvalidierung mit kokristallisierten Liganden oder Benchmarking mit bekannten Inhibitoren, was die Bewertung der Andockgenauigkeit einschränken könnte. Zukünftige Studien mit RMSD-basierter Validierung, molekulardynamischen Simulationen und experimentellen Assays werden die Zuverlässigkeit dieser Vorhersagen weiter stärken. Derzeit hat unsere Gruppe mechanistische Validierung abgeschlossen, die zeigt, dass Dioscin über den JAK2/STAT3-Weg wirkt, was die Glaubwürdigkeit der Vorhersage teilweise stärkt und teilweise experimentelle Unterstützung für die in dieser Studie identifizierten Schlüsselziele liefert, obwohl andere Komponenten-Ziel-Interaktionen noch Bestätigung36 benötigen. Zweitens wurden die Einflüsse von proportionaler Kompatibilität und Dosierungsbeziehungen zwischen Kräutern in die aktuelle Analyse nicht einbezogen. Zukünftige Arbeiten könnten Dosis-Effekt-gewichtete Netzwerkmodelle einführen, um klinische Verschreibungspraktiken besser widerzuspiegeln37.

Zusammenfassend ermöglicht der derzeitige Workflow – hochauflösende MS-basierte Identifikation blutabsorbierter Bestandteile, netzwerkpharmakologiebasierte Ziel- und Weg-fokussierte Analyse sowie molekulare Docking-Validierung – eine effiziente Eingrenzung der Wirkstoffbasis und der Aktionsziele aus einer komplexen Kräuterformel. Dies bietet eine klare experimentelle Richtung für die Nachverfolgung biologischer Verifikation und beschleunigt mechanistische Untersuchungen der TCM-Formeln. In Zukunft könnte die Integration räumlicher Metabolomik, Organoid-Modelle und Multi-Omics-Technologien eine dynamische und dreidimensionale Validierung und Erweiterung der aktuellen Ergebnisse in Systemen ermöglichen, die physiologische und pathologische Bedingungen genauer nachbilden und so robustere Belege für die wissenschaftliche Grundlage der TCM-Formeln liefern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Fördernr. 81973675) und dem High-Level Chinese Medical Hospital Promotion Project (Grant Nr. HLCMHPP2023039) und der Beijing Natural Science Foundation (Zuschuss Nr. 7252259).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AutoDock 4.2.6Das Skriptforschungsinstitut-
Chromatographische SäuleWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Hochgeschwindigkeits-KühlzentrifugeHettich LabortechnologieMikro 220R
Integrierte BioinformatikplattformenWeizmann  Institute  of  Wissenschaft-GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/)
Integrierte BioinformatikplattformenThe  Johns  Hopkins  Universität  Schule  of  Medizin-OMIM-Datenbank (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitrilThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MethanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L WasserThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL AmeisensäureThermo Fisher ScientificA117-50
Software zur Datenverarbeitung für MassenspektrometrieWaters Corp.-Progenesis QI 3.0 Software
Molekulare AndocksoftwareOlson-LaborAutoDock 4.2.6
PPI-PlattformSTRING-Datenbankfirma-Die Online-Plattform STRING (https://string-db.org)
ProteindatenbankEuropäisches Institut für Bioinformatik; das Schweizer Institut für Bioinformatik; Proteininformationsressource-UniProt-Plattform (https://www.uniprot.org/)
Quadrupol-Orbitrap-MassenspektrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Referenz-ZusammensetzungsdatenbankenTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
RotationsverdampferShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Datenbanken zur Strukturbiologie.Brookhaven Nationallabor-Die RCSB PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/)
Datenbanken zur Strukturbiologie.Nationales Zentrum für Biotechnologie-Information-Die PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
ZielvorhersagedatenbankenSIB Schweizer Institut für Bioinformatik-SwissTargetPrediction-Datenbank (https://www.swisstargetprediction.ch)
ZielvorhersagedatenbankenShanghai  Institute  of  Materia  Medica-TCMSP-Datenbank (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Topologische Analyse-Plugin--Centiscape 2.2 Plugin; Netzwerkanalysator
UHPLC-SystemVanquish Flex-
Ultra-Hochleistungs-FlüssigkeitschromatographThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Ultraschall-AuszieherKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Vakuum-ZentrifugalkonzentratorNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Visualisierungssoftware--Zytoscape 3.10.4
Webbasierte funktionale Annotationsplattform.Broad  Institut-Die Online-Plattform Metascape (https://metascape.org)

Referenzen

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Molekulares Dockingim Blut absorbierte VerbindungenIdentifizierung von VerbindungenProtein InteraktionsnetzwerkKEGG PathwayTraditionelle Chinesische Medizin
Aufklärung der materiellen Grundlage der Yiqi-Qingjie-Formel gegen IgA-Nephropathie mit UHPLC-Q-Orbitrap HRMS integriert in Netzwerkpharmakologie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.