Method Article

Entschlüsselung des Epitranskriptoms: In Silico Einblicke in das m6A-Regulationsnetzwerk bei Brustkrebs

DOI:

10.3791/70545

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June 9th, 2026

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1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet einen Ansatz zur Durchführung von in silico genetischen, molekularen und prognostischen Analysen von m6A-Modifikationsregulatoren, indem Mutationsprofile, Kopienzahl-Veränderungen, Genexpression und klinische Ergebnisse unter Verwendung öffentlich zugänglicher Datensätze aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA), dem Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Projekt und Mikroarray-Plattformen integriert werden.

Abstract

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N6-Methyladenosin (m6A) ist die am häufigsten vorkommende interne RNA-Modifikation in eukaryotischen Transkripten und spielt eine entscheidende Rolle im RNA-Stoffwechsel, der Genexpression und der zellulären Homöostase. Die Dysregulation der m6A-Regulierungsbehörden, darunter "Autoren", "Radiergummis" und "Leser", wird zunehmend in die Krebsbiologie verwickelt; Ihre umfassende Rolle bei Brustkrebs bleibt jedoch noch zu verstehen. Das Hauptziel dieses Methodenartikels ist es, Bioinformatik-Anfängern einen Schritt-für-Schritt-Rahmen zu bieten, um öffentlich zugängliche Krebsdatensätze zu nutzen, um Mutationsanalysen durchzuführen, Genexpressionsänderungen zu bewerten und deren Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten zu untersuchen. Als Fallstudie wurden m6A-Regulatoren bei Brustkrebs mit Datensätzen aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA), dem Genotype-Tissue Expression (GTEx) Projekt und Mikroarray-Plattformen analysiert. Transkriptomische Profile wurden systematisch analysiert, um Arbeitsabläufe zur Bewertung der prognostischen Relevanz von m6A-regulatorischen Komponenten bei Brustkrebs zu demonstrieren. Mit diesem analytischen Rahmen wurden unterschiedliche Muster genetischer Veränderungen und differenzierter Expression unter wichtigen m6A-Regulatoren identifiziert. Mehrere Regulatoren, darunter METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 und RBMX, waren mit einer besseren Patientenüberlebensrate assoziiert, während YWHAG mit einer schlechten Gesamtüberlebensrate assoziiert war. Diese Studie bietet einen umfassenden Überblick über die Systemgenomik der m6A-regulatorischen Gene bei Brustkrebs und demonstriert gleichzeitig einen praktischen und reproduzierbaren webbasierten Bioinformatik-Workflow. Diese Erkenntnisse fördern das Verständnis der epitranskriptomischen Regulation bei Brustkrebs und bilden die Grundlage für die Entwicklung neuartiger m6A-basierter diagnostischer und therapeutischer Strategien.

Introduction

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Epitranskriptomische Modifikationen stellen eine wichtige Schicht der posttranskriptionellen Genregulation dar und tragen zu vielfältigen zellulären Prozessen und Krankheitszuständen bei. Unter mehr als 170 bis heute identifizierten RNA-Modifikationen ist N6-Methyladenosin (m6A) die am weitesten verbreitete und am besten charakterisierte in eukaryotischen mRNAs1. Installiert von "Schreiber"-Komplexen wie METTL3/METTL14, entfernt durch "Radiergummis" wie FTO und ALKBH5 und interpretiert von "Leser"-Proteinen einschließlich YTH- und IGF2BP-Familienmitgliedern, orchestriert m6A RNA-Spleißen, Stabilität, Transport und Translation und beeinflusst so wichtige biologische Prozesse wie Entwicklung, Differenzierung und Spannungsantwort 2,3.

Veränderungen der regulatorischen Komponenten von m6A wurden über ein breites Spektrum von Malignitäten berichtet4. Bei vielen Krebsarten führt abweichende m6A-Aktivität zu bösartigen Phänotypen; z. B. fördert erhöhte Expression von METTL3 den Beginn und das Fortschreiten von Prostatakrebs, indem sie den Hedgehog-Weg und die Methylierung von MYCRNA 5,6 moduliert. Zunächst wurde festgestellt, dass FTO mit onkogenen Effekten bei akuter myeloischer Leukämie in Verbindung gebracht wird, und es wurde gezeigt, dass es das Tumorprogression bei Leber-, Lungen- und Darmkrebsvorantreiben 7,8,9,10. Es wurden jedoch kontextabhängige Rollen von FTO und ALKBH5 identifiziert, die die doppelte Natur der m6A-vermittelten Regulation veranschaulichen, die sowohl die onkogene als auch die tumorsuppressive Signalierung 11,12,13,14 fördern kann. M6A-Leser, darunter YTHDF1/2/3, heterogene nukleare Ribonukleoproteine (hnRNPs) und insulinähnliche Wachstumsfaktor-2-mRNA-bindende Proteine (IGF2BP1-3), wurden ebenfalls mit Karzinogenese 15,16,17 in Verbindung gebracht.

Bei Brustkrebs deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass m6A-Regulatoren häufig dysreguliert sind und mit Tumorsubtypen, immunbezogenen Merkmalen und klinischen Ergebnissen assoziiert seinkönnen 18,19. Mehrere mechanistische Studien positionieren METTL3 als häufig hochregulierten pro-onkogenen Faktor bei Brustkrebs. Die METTL3-vermittelte m6A-Installation kann die Translation von Transkripten stabilisieren oder verbessern, was die Proliferation, den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT), Metastasen und Chemoresistenz20 fördert. METTL3 hat außerdem gezeigt, dass es das Fortschreiten von Brustkrebs fördert, indem es Bcl-221 gezielt anvisiert. ALKBH5 wurde an der Regulierung von Krebs-Stammprogrammen über NANOG und andere stamm-bezogene Moleküle beteiligt, aber sein Einfluss kann je nach Tumorkontext22 variieren.

Da die Liste der m6A-Regulierungsbehörden in den letzten Jahren weiter wächst, ist ein Update darüber erforderlich, wie die neu identifizierten Regulierungsbehörden bei Brustkrebs dysreguliert sein könnten. Tabelle 1 bietet eine Liste der m6A-Regulatoren, zu denen auch Schreiber, Leser und Radiergummis der m6A-Modifikation gehören. Zusätzlich wurden neuartige m6A-Regulatoren, darunter LRPPRC und YWHAG, mit Auswirkungen auf das Krebsfortschreitenidentifiziert 23,24,25. Daher wurde eine umfassende genetische und molekulare Charakterisierung aller bekannten m6A-Regulatoren bei Brustkrebs durchgeführt, mit Werkzeugen, die von Forschern mit begrenztem bioinformatischem Hintergrund eingesetzt werden können.

Ziel dieses Methods-Artikels ist es, ein schrittweises, plattformbasiertes Bioinformatik-Protokoll zur Analyse von m6A-Regulatoren bei Brustkrebs unter Verwendung öffentlich zugänglicher Krebsgenomik-Ressourcen vorzustellen. Anhand von Datensätzen aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), dem Genotype Tissue Expression (GTEx) Projekt26 und webbasierten Analyseplattformen wie cBioPortal und UCSC Xena demonstriert dieses Protokoll reproduzierbare Arbeitsabläufe zur Bewertung von Mutationsprofilen, Genexpressionsänderungen und der Verbindung zum Patientenüberleben. Dieser visualisierte und zugängliche Ansatz soll die Einführung epitranskriptomischer Datenanalyse durch Forscher im Bereich Krebsbioinformatik erleichtern.

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Protocol

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HINWEIS: Die Liste der Gene, die für m6A-Methylierungsregulatoren codieren, kategorisiert als Autoren, Leser und Radiergummis, ist in Tabelle 1 dargestellt. Alle aufgeführten Gene wurden in die anschließenden Analysen von Mutationen, Expressionsmustern und dem Gesamtüberleben einbezogen. Alle in dieser Studie verwendeten Software und Werkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Identifikation genetischer Veränderungen in m6A-Regulatoren

  1. Greifen Sie auf das cBioPortal für Krebsgenomik zu. Besuchen Sie die cBioportal-Website (www.cbioportal.org)27,28. Auf der Startseite wählen Sie den Reiter "Abfrage", um eine neue Analyse zu beginnen.
  2. Wählen Sie die passende Krebsstudie und Kohorte aus.
  3. In der Suchleiste "Select Studies for Visualization and Analysis" geben Sie "Brustinvasives Karzinom" ein und wählen Sie "Brustinvasives Karzinom (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Unten wählen Sie "Abfrage nach Gen".
    KRITISCH: Stellen Sie sicher, dass die ausgewählte Kohorte (996 Proben) sowohl Mutations- als auch Kopienzahl-Alterationsdaten (CNA) enthält.
  5. Definiere die genetische Abfrage. In "Gene eingeben" geben Sie die HUGO-Gensymbole für die vollständige Liste der untersuchten m6A-Regulatoren ein.
    HINWEIS: Gene können als Liste eingegeben werden, die durch Leerzeichen getrennt ist. Unter "Genomische Profile auswählen" sollten folgende zwei Datentypen überprüft werden: Mutationen und Kopiennummern-Änderungen.
  6. Wählen Sie unter "Select Patient/Case Set" den Standard-Stichprobensatz, der der Kohorte mit allen Profilfällen entspricht.
  7. Klicken Sie auf den blauen Button "Anfrage absenden".
  8. Holen Sie die Daten zur genetischen Veränderung ab und interpretieren Sie sie. Nach der Abgabe wird das Ergebnis im Tab "Zusammenfassung" geladen. Die zentrale "OncoPrint"-Visualisierung bietet einen sofortigen Überblick über genetische Veränderungen aller abgefragten Gene in der Kohorte, die heruntergeladen werden können.
  9. Neben dem OncoPrint finden Sie das Diagramm "Cancer Type Summary". Dies liefert eine quantitative Aufschlüsselung der Veränderungen zwischen Brustkrebs-Subtypen.
  10. Führen Sie eine Pankrebsanalyse durch. Kehren Sie zur cBioPortal-Startseite zurück und wählen Sie unter dem Reiter "Abfrage" "TCGA PanCancer Atlas Studies".
  11. Im Geneingabefeld geben Sie dieselbe Liste der m6A-Regulatorgene ein.
  12. Klicken Sie auf "Anfrage absenden" und auf der Ergebnisseite navigieren Sie zum Tab "Krebstypen-Zusammenfassung". Dies bietet eine Pankrebs-Sichtweise.

2. Vergleichende transkriptomische Analyse von m6A-Regulatoren unter Verwendung von UCSC Xena.

  1. Greifen Sie auf die UCSC Xena-Plattform zu. Besuchen Sie die UCSC Xena-Website (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Von der Startseite aus klicken Sie auf die Schaltfläche "Xena starten", um den Haupt-Analysebrowser zu öffnen.
  3. Im Xena-Browser klicken Sie auf "DATENSÄTZE".
  4. Wählen Sie unter den Datensätzen "TCGA TARGET GTEx" aus. Dieser enthält einheitlich verarbeitete RNA-Seq-Daten aus den normalen Geweben der TCGA- und GTEx-Projekte.
  5. Auf der nächsten Seite klicken Sie auf "VISUALISIEREN".
  6. Definiere die Phänotyp-(Stichprobengruppe-)Variable. Im "Auswählen Sie Ihre erste Variable" wählen Sie im phänotypischen Datentyp "Hauptkategorie".
  7. Klicken Sie auf "ZUR ZWEITEN VARIABLE". Dann kreuzen Sie im Genomik-Datentyp im Datensatz "Genexpression" an. Füge die Genliste im Feld "Gen oder Position hinzufügen" hinzu. Klicke auf "Fertig".
  8. Visualisiere Ausdrucksmuster mit einer Heatmap.
  9. Um die Brustproben (TCGA+GTEx) vom TCGA TARGET GTEx zu trennen, tippen Sie "Brust" und verwenden Sie die Filteroption, um die Proben zu behalten.
  10. Die Heatmap ist jetzt sichtbar und kann als PDF heruntergeladen werden.
  11. Erstellen Sie vergleichende Boxplots für einzelne Gene. Um Expressionsunterschiede für ein bestimmtes Gen zu quantifizieren und zu visualisieren, verwenden Sie das "Als Diagramm anzeigen". Mit dieser Option können die Daten als Box-Plot, Punktdiagramm und Geigendiagramm betrachtet werden, wobei die Ausdrucksverteilung zwischen den beiden Stichprobengruppen verglichen wird.
  12. Verwenden Sie die Option "Als PDF herunterladen", um die Diagramme herunterzuladen.
  13. Die statistische Signifikanz (p-Wert) kann durch Klicken auf "STATISTICS" erhalten werden.

3. Bewertung der prognostischen Bedeutung von m6A-Regulatoren mit dem Kaplan-Meier-Plotter.

  1. Greifen Sie auf das Kaplan-Meier Plotter-Tool zu. Besuchen Sie die Kaplan-Meier Plotter-Website (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Auf der Startseite wählen Sie den Reiter "Brustkrebs", um eine Analyse speziell für Brustkrebsdatensätze zu starten.
  3. Konfigurieren Sie die Gen-Abfrage für ein einzelnes Gen.
  4. Im Haupteingabebereich finden Sie das Feld "Gen-Symbol".
  5. Hier kommt das offizielle Symbol des zu analysierenden m6A-Regulator-Gens (z. B. METTL3).
    KRITISCH: Direkt unter dem Gen-Eingabefeld finden und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Only JetSet Best Probe Set". Dies stellt sicher, dass die zuverlässigste und spezifischste Microarray-Probe automatisch für Ihr Gen ausgewählt wird, wodurch die Datenqualität und Reproduzierbarkeit optimiert werden.
  6. Definieren Sie die Überlebensanalyseparameter. Im Abschnitt "Überleben" wählen Sie "Gesamtüberleben (OS)" als primären Endpunkt für diese Analyse aus. Das Tool nutzt automatisch Daten von 1880 Brustkrebspatientinnen, wenn diese Einstellung ausgewählt wird.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Option "Patienten aufteilen" auf "Median" gesetzt ist. Dadurch wird die Patienten in zwei gleichberechtigte Gruppen eingeteilt; hohe und niedrige Expression, basierend auf dem medianen Expressionswert des abgefragten Gens über alle Proben.
  8. "Nachbeobachtungsschwelle" kann verwendet werden, um den Nachbeobachtungszeitraum auszuwählen. Für diese Studie wurden 180 Monate ausgewählt.
  9. Generiere und interpretiere die Kaplan-Meier-Handlung.
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Kaplan-Meier Plot zeichnen".
  11. Ein neues Fenster wird geladen und zeigt die Überlebenskurve an.
  12. Die wichtigsten Handlungselemente interpretieren; Die X-Achse zeigt die Zeit in Monaten an, die Y-Achse zeigt die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit, die beiden farbigen Linien stellen die Überlebenskurven für die Patientengruppen mit hoher Expression (rot) und niedriger Expression (schwarz) dar. Der Log-Rang-P-Wert wird angezeigt und zeigt die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den beiden Überlebenskurven an.

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Results

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Mutationale Landschaft von M6a-Methylierungsregulatoren bei Brustkrebs

In einer früheren Studie zur genomischen Analyse von TCGA-Datensätzen wurden wiederkehrende Mutationen in mehreren Genen, die für Regulatoren der DNA-Methylierung codieren,31 berichtet. In der vorliegenden Studie wurde cBioPortal verwendet, um den Datensatz "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" zu analysieren, um Mutationsprofile von Genen zu untersuchen, die die Autore...

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Discussion

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Der Artikel dieser Methode bietet einen umfassenden, zugänglichen und integrierten Workflow für die systematische Multi-Omics-Profilierung und klinische Übersetzung jeder Gensignatur in der Krebsforschung, hier durch die Analyse von m6A-RNA-Methylierungsregulatoren bei Brustkrebs demonstriert. Durch die Kombination dieser großen öffentlichen Bioinformatikplattformen ermöglicht dieser Ansatz Forschern, effizient von der Genomentdeckung zu klinisch relevanten Hypothesen voranzukommen, ohne...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teile dieses Manuskripts wurden mit Hilfe KI-basierter Sprachwerkzeuge überarbeitet, um Klarheit und Lesbarkeit zu verbessern. Alle inhaltlichen Inhalte, Interpretationen, Analysen und Schlussfolgerungen sind die Autoren selbst. Wir erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Acknowledgements

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Ein Zuschuss der Alfaisal University (IRG 25450) an RM wird dankbar anerkannt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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