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Forschungsartikel
Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Integration von PIVKA-II, AFP und routinemäßigen klinischen Variablen in ein logistisch-regressives diagnostisches Modell für das hepatozelluläre Karzinom, mit Validierung im Frühstadium und bei AFP-negativer Erkrankung.
Die Früherkennung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) wird weiterhin durch die unvollständige Sensitivität des Alpha-Fetoproteins (AFP) begrenzt, insbesondere bei tumorös frühstadiigen und AFP-negativen Tumoren. Diese Studie untersuchte, ob das abnorme Prothrombin / Protein induced by vitamin K absence-II (PIVKA-II), AFP und routinemäßige klinische Variablen in ein reproduzierbares diagnostisches Modell für HCC integriert werden können. Für die Modellentwicklung wurde eine retrospektive Trainingskohorte von 205 Teilnehmern verwendet, darunter 112 bildgebungsgesicherte HCC-Fälle und 93 Nicht-HCC-Kontrollen. Zur externen Validierung diente eine unabhängige prospektive Kohorte mit 184 Teilnehmern, darunter 58 HCC-Fälle und 126 Nicht-HCC-Kontrollen, wobei keine Nachjustierung des Modells erfolgte. Vor der Bildgebung entnommene Blutproben wurden zur Bestimmung von AFP und PIVKA-II verwendet, und klinische Variablen wurden aus dem gleichen diagnostischen Zeitfenster extrahiert. Das finale multivariable logistische Regressionsmodell kombinierte ln(AFP), ln(PIVKA-II), Alter, Geschlecht, Albumin, international normalisiertes Verhältnis und Thrombozytenzahl. Das kombinierte Modell erreichte im Trainingskollektiv eine AUC von 0,93 und im Validierungskollektiv von 0,89. In der Validierung betrug die Sensitivität 84,5 % und die Spezifität 90,5 %. Die Sensitivität lag bei frühstadiigem HCC weiterhin bei 72,7 % und bei AFP-negativem HCC bei 73,1 %, was jeweils über der alleinigen Verwendung von AFP lag. Kalibrierung und Bootstrap-Validierung sprachen für eine akzeptable Modellstabilität. Diese Ergebnisse zeigen, wie PIVKA-II, AFP und routinemäßig verfügbare klinische Variablen zu einem praktischen diagnostischen Triage-Instrument für Hochrisikopopulationen mit Lebererkrankungen kombiniert werden können.
Das hepatocelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten Ursachen krebsbedingter Todesfälle und entsteht gewöhnlich bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung, einschließlich Hepatitis-B-Virus-Infektion, Hepatitis-C-Virus-Infektion, alkoholbedingter Lebererkrankung und metabolischer dysfunktionsassoziiierter fettiger Lebererkrankung1. Die Früherkennung ist klinisch von großer Bedeutung, da eine kurative Behandlung am wirksamsten ist, wenn Tumore erkannt werden, bevor eine vaskuläre Invasion, eine extrahepatische Ausbreitung oder eine erhebliche Verschlechterung der Leberfunktion aufgetreten sind. Derzeitige Überwachungsstrategien basieren im Allgemeinen auf Leberultraschall, mit oder ohne Bestimmung des serumgebundenen Alpha-Fetoproteins (AFP)2. In der routinemäßigen klinischen Praxis wird die Effektivität der Überwachung jedoch durch abhängige Faktoren wie die Untersuchungserfahrung des Anwenders, kleine Tumorgröße, heterogene zirrhotische Knoten, bildgebende Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Adipositas sowie Tumore, die wenig oder kein AFP produzieren, beeinträchtigt3,4.
AFP wird weiterhin häufig verwendet, da es kostengünstig, leicht verfügbar und für Kliniker vertraut ist. Sein diagnostischer Wert ist jedoch durch eine unvollständige Sensitivität und eine ungenügende Spezifität eingeschränkt. Bei der konventionellen Schwelle von 20 ng/mL kann ein erheblicher Anteil an HCC-Fällen im Frühstadium oder an AFP-negativen HCC übersehen werden. Niedrigere Schwellenwerte könnten die Sensitivität verbessern, führen jedoch zu mehr falsch-positiven Ergebnissen bei Patienten mit aktiver Hepatitis, Zirrhose oder anderen entzündlichen Lebererkrankungen5,6. Diese Einschränkungen machen die Interpretation eines einzelnen Markers für die diagnostische Einstufung bei Patienten mit hohem Risiko für Lebererkrankungen unzureichend.
Abnormales Prothrombin, auch bekannt als durch Vitamin K-Mangel induziertes Protein-II (PIVKA-II) oder des-γ-carboxy-Prothrombin, wird freigesetzt, wenn maligne Hepatozyten unvollständig carboxyliertes Prothrombin produzieren. PIVKA-II spiegelt die koagulationsbezogene Tumorbiologie wider und nicht die Sekretion von AFP, und kann weiterhin aussagekräftig sein, wenn AFP niedrig ist7. Frühere Studien und Metaanalysen haben gezeigt, dass PIVKA-II die Detektion von hepatozellulärem Karzinom (HCC) verbessert, insbesondere in Kombination mit AFP, und zusätzlichen Nutzen bei frühen Stadien oder AFP-negativer Erkrankung bieten kann8,9. Allein auf Marker basierende Strategien berücksichtigen jedoch nicht vollständig den Wirtsstatus, die Leberfunktion, die Thrombozytenzahl, den Gerinnungszustand oder die zugrundeliegende Lebererkrankung.
Zusammengesetzte diagnostische Modelle bieten eine praktische Methode, Tumormarkerergebnisse gemeinsam mit dem klinischen Kontext zu interpretieren. GALAD, GAAD und verwandte Modelle haben gezeigt, dass demografische Variablen und Biomarker kombiniert werden können, um die Detektion von HCC bei unterschiedlichen Ätiologien und Populationen zu verbessern10,11. Ihre Leistung spricht für die Anwendung einer multivariablen Risikoeinschätzung statt isolierter Biomarker-Schwellenwerte. Gleichzeitig enthalten einige Modelle Analysen, die nicht in allen Labors verfügbar sind, und das Verhalten der Cutoff-Werte kann je nach Region, ätiologischem Profil, Krankheitsstadium und beabsichtigter klinischer Anwendung variieren12. Ein Modell, das auf weit verbreiteten Biomarkern und routinemäßigen Laborvariablen basiert, könnte leichter in den alltäglichen diagnostischen Ablauf integriert werden. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Modellen, die möglicherweise auf spezialisierten Biomarkern oder populationsabhängigen Cutoff-Strategien beruhen, evaluierte die vorliegende Studie ein multivariablen diagnostisches Modell, das auf weit verfügbaren Biomarkern und routinemäßigen klinischen Variablen basiert, und validierte dessen Leistung in einer unabhängigen prospektiven Kohorte.
PIVKA-II eignet sich für diesen Ansatz, da es AFP ergänzt und auf automatisierten Immunanalysesystemen gemessen werden kann, die bereits in klinischen Laboren verwendet werden. Routinemäßige Variablen wie Alter, Geschlecht, Albumin, Bilirubin, Thrombozytenzahl, internationaler normalisierter Quotient und die zugrundeliegende Lebererkrankung stehen beim gleichen klinischen Untersuchungszeitpunkt zur Verfügung und können Informationen über die Leberreserve oder gerinnungsrelevante Parameter erfassen, die für das HCC-Risiko von Bedeutung sind13. Die Kombination dieser Variablen mit AFP und PIVKA-II könnte die Diskriminierung verbessern und gleichzeitig die Abhängigkeit von einer einzelnen Cut-off-Grenze vermeiden.
PIVKA-II, AFP und routinemäßige klinische Variablen wurden daher anhand eines zweistufigen diagnostischen Designs bewertet. Ein multivariates logistisches Regressionsmodell wurde in einem retrospektiven Trainingskollektiv entwickelt und in einem unabhängigen prospektiven Validierungskollektiv ohne Nachjustierung getestet. Die diagnostische Leistung wurde mit der von AFP, PIVKA-II und den klinischen Variablen allein verglichen, wobei bewusst auf frühe HCC-Stadien, AFP-negative HCC, die Interpretation von Cutoff-Werten, Kalibrierung und interne Bootstrap-Validierung geachtet wurde.
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Diese Studie wurde vom Ethikkomitee des Angegliederten Ersten Volkskrankenhauses Hangzhou, Medizinische Fakultät der Westlake University, geprüft und genehmigt. Die Genehmigungsnummer lautete IIT-20230528-0108-01. Schriftliche informierte Einwilligung wurde von prospektiv eingeschriebenen Teilnehmern vor der Blutentnahme eingeholt. Für retrospektiv eingeschlossene klinische Daten und archivierte Überrestproben, die im Rahmen der routinemäßigen Versorgung gesammelt wurden, wurde die informierte Einwilligung vom Ethikkomitee aufgehoben, da anonymisierte Daten verwendet wurden und keine zusätzlichen Interventionen durchgeführt wurden.
Reproduzierbarkeit, Bias-Kontrolle und Datenintegrität
Einschlusskriterien, Zeitpunkte der Blutentnahme, Regeln zur Beurteilung der Bildgebung, Definitionen von Untergruppen, prüfbare Prädiktoren, Cutoff-Definitionen, Regeln für fehlende Daten und Validierungsverfahren wurden vor der statistischen Analyse festgelegt. Blutproben wurden vor der kontrastmittelverstärkten bildgebenden Bestätigung und vor jeder antitumoralen Therapie entnommen. Für die Laboruntersuchungen wurden anonymisierte Studienkennungen verwendet, und Proben aus den Trainings- und Validierungskohorten wurden in zufälliger Reihenfolge analysiert. Das Laborpersonal war hinsichtlich der endgültigen Diagnose, der Zuteilung zur Kohorte, des Barcelona-Clinic-Liver-Cancer-(BCLC-)Stadiums und des AFP-negativen Status geblendet. Die bildgebende Diagnose und Stadieneinteilung erfolgte unabhängig von den Laboruntersuchungen. Dateneingabe, Umrechnung von Einheiten, Kohortenzuordnung, Codierung von Ausschlüssen, Codierung fehlender Werte und statistische Datensätze wurden von zwei Untersuchern vor der Modellanpassung überprüft. Die Trainings- und Validierungskohorten wurden während der gesamten Variablenauswahl, Modellanpassung, Cutoff-Ableitung und Validierung getrennt gehalten.
Studienpopulation und -design
Diese diagnostische Studie mit zwei Kohorten entwickelte und validierte ein multivariables Modell zur Erkennung von HCC unter Verwendung von abnormaler Prothrombin/Protein-induziertem PIVKA-II, AFP und routinemäßigen klinischen Variablen. Die retrospektiv zusammengestellte Trainingskohorte umfasste Teilnehmer, die zwischen dem 1. Januar 2021 und dem 31. Dezember 2023 untersucht wurden. Diese Kohorte diente der Variablenauswahl, Modellanpassung, Ableitung von Cutoff-Werten und internen Bootstrap-Validierung. Die prospektiv rekrutierte Validierungskohorte umfasste Teilnehmer, die zwischen dem 1. Januar 2024 und dem 31. Dezember 2025 untersucht wurden. Diese Kohorte wurde ausschließlich für Out-of-Sample-Tests verwendet. In der Validierungskohorte erfolgten keine erneute Variablenauswahl, Modellnachjustierung, Aktualisierung der Koeffizienten, Neuauswahl der Cutoffs oder subgruppenbasierte Rekalibrierung. Der Teilnehmerfluss, die Zuordnung zu Kohorten, die Blutentnahme, die Plasmapräparation, die Biomarkerbestimmung, die Bildgebungsauswertung und der statistische Arbeitsablauf sind in Abbildung 1 dargestellt.
Die Teilnehmer wurden über einen Überwachungs- oder Diagnosepfad für Lebererkrankungen mit hohem Risiko am Affiliated Hangzhou First People's Hospital, School of Medicine, Westlake University, rekrutiert. Ein hohes Risiko wurde definiert als chronische Hepatitis-B-Infektion, chronische Hepatitis-C-Infektion, Zirrhose unabhängig von der Ätiologie oder Fettlebererkrankung mit dokumentierter Fibrose, basierend auf klinischer Beurteilung, Laborbefunden oder früheren bildgebenden Verfahren. Teilnahmeberechtigt waren Erwachsene im Alter von ≥18 Jahren, die eine Blutentnahme vor der Bildgebung sowie eine kontrastmittelverstärkte multiphasische Computertomographie (CT) und/oder eine dynamische kontrastmittelverstärkte Magnetresonanztomographie (MRT) innerhalb von 14 Tagen nach der Blutentnahme abgeschlossen hatten. Ausschlusskriterien waren vorherige HCC-Behandlung, einschließlich Resektion, Ablation, transarterieller Therapie oder systemischer Therapie; Gabe von Vitamin K innerhalb von 7 Tagen vor der Probenentnahme; Therapie mit Vitamin-K-Antagonisten oder anderen Antikoagulanzien, die die Beurteilung der Gerinnung beeinflussen könnten; akute Cholangitis oder biliäre Obstruktion zum Zeitpunkt der Probenentnahme; Schwangerschaft; fehlende Werte für AFP, PIVKA-II oder eine endgültige bildgebende Diagnose; sowie inakzeptable Probengüte ohne gültige Wiederholungsprobe.
Die endgültige Studienpopulation umfasste 389 Teilnehmer. Die Trainingskohorte umfasste 205 Teilnehmer, darunter 112 bildgebungsbestätigte HCC-Fälle und 93 Nicht-HCC-Kontrollen. Die Validierungskohorte umfasste 184 Teilnehmer, darunter 58 bildgebungsbestätigte HCC-Fälle und 126 Nicht-HCC-Kontrollen. In der Trainingskohorte bestanden die 93 Nicht-HCC-Kontrollen aus 30 gesunden Kontrollen und 63 Kontrollen mit chronischer Lebererkrankung. In der Validierungskohorte bestanden die 126 Nicht-HCC-Kontrollen aus 0 gesunden Kontrollen und 126 Kontrollen mit chronischer Lebererkrankung.
Der symptomatische Status wurde nicht allein anhand der Hepatitis-Anamnese oder einer kompensierten Zirrhose festgelegt. Ein Teilnehmer wurde nur dann als symptomatisch klassifiziert, wenn in der vor der Bildgebung liegenden Dokumentation ein neu aufgetretenes oder verschlechtertes Schmerzsyndrom im rechten Oberbauch, unerklärlicher Gewichtsverlust, Bauchdehnung, Gelbsucht, dunkler Urin oder eine klinisch dokumentierte Dekompensation festgestellt wurde, die nicht durch eine andere bestätigte Ursache erklärbar war. Teilnehmer ohne diese Befunde wurden als asymptomatisch oder als durch Überwachung erfasst klassifiziert.
Diagnostische Beurteilung und Stadieneinteilung
Der endgültige HCC-Status wurde anhand kontrastverstärkter, mehrphasiger CT und/oder dynamischer, kontrastverstärkter MRT, die im Rahmen der Routineversorgung durchgeführt wurden, festgelegt. Die Bildgebung musste mindestens eine arterielle Phase und eine portale venöse Phase umfassen; verzögerte Phasenbefunde wurden, falls verfügbar, ebenfalls berücksichtigt. Eine Läsion wurde als HCC klassifiziert, wenn bei Leberbildgebung im Risikokontext eine Hyperenhancement in der arteriellen Phase mit Washout in der portalen venösen und/oder verzögerten Phase, mit oder ohne eine kontrastmittelaufnehmende Kapsel, nachgewiesen wurde. Teilnehmer ohne bildgebende Merkmale eines HCC und ohne andere maligne Diagnose wurden als nicht-HCC klassifiziert.
Bildgebungsdaten wurden mit einem vorgegebenen Formular erfasst, das die Bildgebungsmethode, die durchgeführten Phasen, eine arterielle Hyperenhancement, Washout, Kapselaussehen, die Anzahl der Läsionen, den maximalen Läsionendurchmesser, eine makrovaskuläre Invasion und eine extrahepatische Streuung dokumentierte. Zwei geschulte Auswerter erfassten die bildgebenden Merkmale unabhängig voneinander aus den endgültigen radiologischen Befunden. Unstimmigkeiten wurden durch Konsensentschluss anhand derselben vorab festgelegten Kriterien behoben. Falls sowohl CT als auch MRT verfügbar waren, wurde die Methode mit der vollständigsten multiphasischen Charakterisierung verwendet. Falls beide Methoden vollständig waren, wurde diejenige Methode gewählt, die als Grundlage für die endgültige klinische Entscheidung dokumentiert war.
Der BCLC-Stadium wurde zugewiesen, nachdem der HCC-Status endgültig festgelegt worden war. Frühstadiäres HCC wurde als BCLC-Stadium 0–A definiert. AFP-negatives HCC wurde definiert als AFP <20 ng/mL bei der Blutentnahme vor der Bildgebung. Diese Untergruppenbezeichnungen dienten der Bewertung der Leistung in Untergruppen, nicht dem Modelltraining oder der Teilnahmeberechtigung der Probanden.
Probenentnahme und Plasmaprozessierung
Periphere venöse Blutproben wurden morgens nach einer mindestens 8 h dauernden nächtlichen Fastenphase, vor der kontrastmittelverstärkten CT/MRT-Untersuchung und vor der Antitumor-Therapie, entnommen. Insgesamt 10 mL venöses Blut wurden in Blutentnahmeröhrchen mit K2-EDTA als Antikoagulans gezogen. Die Röhrchen wurden unmittelbar nach der Entnahme 8–10 Mal vorsichtig umgestülpt und bei 4 °C zum Labor transportiert. Der Zeitraum von der Venenpunktion bis zur Zentrifugation wurde stets unter 2 h gehalten und im Probenprotokoll dokumentiert.
Plasma wurde durch Zentrifugation bei 1.600 × g für 10 min bei 4 °C unter Verwendung einer gekühlten Zentrifuge abgetrennt. Das Plasmasupernatant wurde in 1,5 mL nukleasefreie Mikrozentrifugenröhrchen überführt und in Portionen von 0,5–1,0 mL aliquotiert. Die Aliquots wurden bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Vor der Biomarkerbestimmung wurde ein Aliquot einmal bei Raumtemperatur, 20–25 °C, für 20–30 min aufgetaut, vorsichtig durch Inversion gemischt und innerhalb von 2 h nach vollständigem Auftauen analysiert. Proben mit sichtbarer Gerinnung, mittelschwerer bis schwerer Hämolyse oder ausgeprägter Lipämie wurden gemäß vorab festgelegter laborinterner Akzeptanzkriterien ausgeschlossen. Für die prospektive Validierungsgruppe wurde eine erneute Blutentnahme vor der bildgebenden Bestätigung durchgeführt, wenn klinisch machbar.
Bestimmung von AFP und PIVKA-II
AFP und PIVKA-II wurden mittels elektrochemilumineszenzbasierter Immunoassays auf einem automatisierten Immunoanalysator gemessen. AFP wurde in ng/mL erfasst und PIVKA-II in mAU/mL. Die Ergebnisse wurden direkt aus dem Laborinformationssystem exportiert.
Jede analytische Charge umfasste assayspezifische Kalibratoren und mindestens zwei interne Qualitätskontrollstufen. Für die Akzeptanz einer Charge mussten alle Ergebnisse der Qualitätskontrolle innerhalb des vorab definierten laborinternen Kontrollbereichs liegen. Die Zielwerte für die analytische Präzision lagen bei einem Variationskoeffizienten innerhalb eines Durchlaufs von ≤10 % und zwischen Durchläufen von ≤15 % sowohl für AFP als auch für PIVKA-II. Falls die Qualitätskontrolle fehlschlug oder ein systematischer Messdrift erkannt wurde, wurde die Charge verworfen, das Analysengerät neu kalibriert und die Charge wiederholt, sofern ausreichend Probenmenge vorhanden war. Bei einem unplausiblen oder außerhalb des Messbereichs liegenden Einzelergebnis wurden, wenn möglich, zwei Wiederholungsmessungen aus derselben aufgetauten Aliquotte durchgeführt, und der Mittelwert der beiden akzeptierten Wiederholungswerte wurde verwendet. Falls die Wiederholungsanalyse fehlschlug oder die Probenmenge unzureichend war, wurde das Ergebnis als ungültig gekennzeichnet und gemäß der Regel für fehlende Daten behandelt.
Routine-Extraktion klinischer Variablen
Routinemäßige klinische Variablen wurden aus dem gleichen klinischen Erhebungszeitpunkt wie die Blutentnahme von AFP/PIVKA-II vor der Bildgebung extrahiert. Zu den untersuchten Variablen gehörten Alter, Geschlecht, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase, Albumin, Gesamtbilirubin, international normalisiertes Verhältnis (INR), Prothrombinzeit und Thrombozytenzahl. Falls innerhalb des Zeitfensters vor der Bildgebung mehrere Werte verfügbar waren, wurde derjenige gewählt, der dem Zeitpunkt der AFP/PIVKA-II-Probenentnahme am nächsten lag. Die Einheiten wurden vor der Analyse standardisiert. Das Alter wurde in Jahren erfasst; das Geschlecht wurde kodiert als weiblich = 0 und männlich = 1; die Thrombozytenzahl wurde als ×10⁹/L angegeben; Albumin wurde in g/L erfasst; Gesamtbilirubin in μmol/L; AFP in ng/mL; und PIVKA-II in mAU/mL.
Bereichsprüfungen, Einheitenprüfungen und Plausibilitätsprüfungen wurden nach der Extraktion durchgeführt. Markierte Werte wurden anhand der Quelldaten überprüft. Ein Wert wurde nur dann ausgeschlossen, wenn die Quelle einen Mangel an Probenqualität, einen Fehler bei der Einheitenumrechnung oder eine Abweichung im Verfahren bestätigte. Bestätigte Extremwerte blieben erhalten. Das Variablendictionary definierte die Datensatzstruktur, Variablennamen, Einheiten, Kodierregeln, Transformationsregeln und Codes für fehlende Werte.
Prädiktordefinition und Variablenselektion
Kandidaten-Prädiktoren wurden vor der Modellentwicklung festgelegt. Zu den Kernbiomarkern gehörten AFP und PIVKA-II. Zu den routinemäßigen klinischen Kandidaten zählten Alter, Geschlecht, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, Albumin, Gesamtbilirubin, INR oder Prothrombinzeit sowie Thrombozytenanzahl. AFP und PIVKA-II wurden mittels natürlicher Logarithmus-Transformation umgerechnet. Werte unterhalb der Nachweisgrenze des Assays wurden vor der Transformation durch die Hälfte der unteren Nachweisgrenze ersetzt.
Univariate Vergleiche zwischen HCC- und Nicht-HCC-Teilnehmern im Trainingskollektiv erfolgten mittels t-Tests für unabhängige Stichproben bei annähernd normalverteilten Variablen, Mann-Whitney-U-Tests für schief verteilte stetige Variablen sowie χ²- oder exakten Fisher-Tests für kategoriale Variablen. Variablen mit einem P < 0,10 im univariaten Screening wurden für die multivariable Modellierung berücksichtigt. Multikollinearität wurde anhand des Varianzinflationsfaktors (VIF) geprüft; ein VIF >5 galt als Hinweis auf bedenkliche Kollinearität. Wenn zwei Variablen stark miteinander korrelierten, wurde die Variable mit der klareren klinischen Interpretierbarkeit und der besseren inkrementellen Modellleistung beibehalten.
Das endgültige multivariable logistische Regressionsmodell wurde ausschließlich in der Trainingskohorte erstellt. ln(AFP) und ln(PIVKA-II) wurden zwingend in das Modell aufgenommen. Weitere Prädiktoren wurden mittels rückwärtsgerichteter Eliminierung basierend auf dem Akaike-Informationskriterium ausgewählt. Nach der rückwärtsgerichteten Auswahl verblieben die Variablen ln(AFP), ln(PIVKA-II), Alter, Geschlecht, Albumin, INR und Thrombozytenzahl.
Entwicklung des Modells und Berechnung des Risikoscores
Das diagnostische Modell wurde mithilfe einer multivariablen logistischen Regression mit dem HCC-Status als binärem Endpunkt erstellt. Die vorhergesagte Wahrscheinlichkeit für HCC wurde aus dem linearen Prädiktor η anhand der folgenden Gleichung berechnet:
p(HCC)=1/[1+exp(-η)]
η = -4.862+0.247×ln(AFP)+0.712×ln(PIVKA-II)+0.018×Alter+0.331×Geschlecht-0.062×Albumin+0.554×INR-0.004×Thrombozytenzahl
AFP wurde in ng/mL gemessen, PIVKA-II in mAU/mL, das Alter in Jahren; das Geschlecht wurde als weiblich = 0 und männlich = 1 codiert, Albumin wurde in g/L gemessen, INR war dimensionslos, und die Thrombozytenzahl wurde als ×109/L angegeben. Für AFP und PIVKA-II wurden natürliche Logarithmen verwendet. Ein Nomogramm wurde aus denselben geschätzten Koeffizienten erstellt. Für die Analyse der Receiver-Operating-Characteristic (ROC), die Kalibrationsanalyse, die Entscheidungskurvenanalyse und die Validierung wurde die vorhergesagte Wahrscheinlichkeit und nicht die Punkteskala des Nomogramms verwendet.
Schwellenwertdefinitionen und Schwellenwertbehandlung
PIVKA-II-Schwellenwerte wurden gemäß dem analytischen Zweck bezeichnet. Der etablierte klinische Schwellenwert für PIVKA-II betrug 40,0 mAU/mL. Der Youden-Schwellenwert für PIVKA-II in der Trainingskohorte lag bei 45,0 mAU/mL. Der festgelegte Spezifitätsschwellenwert wurde ermittelt, indem der Schwellenwert ausgewählt wurde, der in der Trainingskohorte einer Spezifität von 90 % am nächsten kam; dies ergab einen Wert von 38,0 mAU/mL für PIVKA-II. Ein ausschließlich für die Validierung bestimmter, scheinbarer Schwellenwert von 37,5 mAU/mL wurde als explorativ behandelt und nicht als primärer Validierungsschwellenwert verwendet.
Für das kombinierte Modell wurde die primäre binäre Cutoff-Grenze anhand der Trainingskohorte unter Verwendung des Youden-Index ermittelt und unverändert auf die Validierungskohorte angewandt. Für AFP wurde die etablierte klinische Cutoff-Grenze von 20,0 ng/mL zur Definition der AFP-negativen Untergruppe und zum Vergleich mit der routinemäßigen Praxis verwendet. Die für die ROC-Analyse optimierten AFP-Cutoffs wurden separat von der klinischen Schwelle gekennzeichnet. Die Cutoffs wurden daher je nach analytischem Zweck angegeben und nicht als austauschbare Schwellenwerte behandelt.
Modellleistung, Kalibrierung und Validierung
Die Diskriminierung wurde mithilfe von Receiver-Operating-Characteristic-Kurven und der Fläche unter der Kurve beurteilt. Die AUCs wurden mit 95 % Konfidenzintervallen angegeben. Zum Vergleich der AUCs wurde der DeLong-Test verwendet. Die Klassifikationsleistung wurde als Sensitivität, Spezifität, positiver Vorhersagewert, negativer Vorhersagewert und Genauigkeit bei vorgegebenen Cutoffs berichtet.
Die Kalibrierung wurde anhand des Kalibrierungsachsenabschnitts, der Kalibrierungssteigung, der Brier-Score und des Hosmer-Lemeshow-Anpassungstests beurteilt. Kalibrierungsdiagramme verglichen die vorhergesagten und beobachteten HCC-Wahrscheinlichkeiten über Risikogruppen hinweg. Zur internen Validierung wurden im Trainingskollektiv 1.000 Bootstrap-Stichproben verwendet, um die optimistisch-korrigierte AUC und die optimistisch-korrigierte Kalibrierungssteigung zu schätzen. Das Validierungskollektiv diente ausschließlich der externen Leistungsbewertung. Im Validierungskollektiv wurde keine Koeffizientenaktualisierung, Modellnachoptimierung, Schwellenwertneuoptimierung oder subgruppenbasierte Rekalibrierung durchgeführt.
Die klinische Anwendbarkeit wurde mittels Entscheidungskurvenanalyse über Schwellenwahrscheinlichkeiten von 0,05 bis 0,50 bewertet. Der Nettovorteil wurde für AFP allein, PIVKA-II allein, das Modell mit klinischen Variablen und das kombinierte Modell verglichen.
Umgang mit fehlenden Daten und Sensitivitätsanalyse
Die primäre Analyse verwendete eine Modellierung mit vollständigen Fällen für Teilnehmer, bei denen alle Variablen im endgültigen Modell beibehalten wurden. Fehlende Werte wurden für jeden potenziellen Prädiktor zusammengefasst. Wenn der Anteil fehlender Werte für irgendeinen beibehaltenen Prädiktor 5 % überstieg, wurde als Sensitivitätsanalyse eine multiple Imputation mittels verketteter Gleichungen durchgeführt, wobei das Ergebnis, alle beibehaltenen Prädiktoren und der Kohortenindikator im Imputationsmodell berücksichtigt wurden. Variablen mit einem Anteil fehlender Werte von mehr als 20 % kamen nicht für die multivariable Modellierung in Frage. Die Modellkoeffizienten, die AUC, die Kalibrierungssteigung sowie Klassifizierungsmetriken aus der Imputationsanalyse wurden mit den Ergebnissen aus der Analyse der vollständigen Fälle verglichen.
Software und reproduzierbare Berichterstattung
Alle Analysen wurden mit R-Version 4.3.2 und RStudio-Version 2023.12.1 durchgeführt. Die logistische Regression wurde mit dem Basis-Paket stats durchgeführt. ROC-Analysen und DeLong-Vergleiche wurden mit pROC-Version 1.18.5 durchgeführt. Die Kalibrationsanalyse erfolgte mit rms-Version 6.7-1 und ResourceSelection-Version 0.3-6. Zur Bootstrap-Validierung wurden 1.000 Resamples mit einem festen Zufallsstartwert von 70558 verwendet. Die Entscheidungskurvenanalyse wurde mit rmda-Version 1.6 durchgeführt. Gegebenenfalls wurde die multiple Imputation mit mice-Version 3.16.0 durchgeführt. Das Analyseskript reproduzierte den Teilnehmerfluss, die Modellkoeffizienten, ROC-Kurven, Kalibrierungsmetriken, Bootstrap-Validierung, Entscheidungskurvenanalyse, Analysen basierend auf Schwellenwerten sowie statistische Tabellen.
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Grundlegende Merkmale
Die endgültige Analyse umfasste 389 Teilnehmer. Der Trainingskohorte gehörten 205 Teilnehmer an, darunter 112 bildgebungsbestätigte HCC-Fälle und 93 Nicht-HCC-Kontrollen. Die Validierungskohorte umfasste 184 Teilnehmer, darunter 58 bildgebungsbestätigte HCC-Fälle und 126 Nicht-HCC-Kontrollen. Die Basischarakteristika sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
In der Trainingskohorte umfassten die 93 Nicht-HCC-Kontrolle...
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Diese Studie evaluierte eine integrierte diagnostische Strategie für HCC unter Verwendung von PIVKA-II, AFP und routinemäßigen klinischen Variablen, wobei besonderes Augenmerk auf frühen Stadien und AFP-negativen Erkrankungen lag14. In den Trainings- und Validierungskohorten übertraf das kombinierte Modell die Einzelmarkertestung. In der Trainingskohorte erreichte das kombinierte Modell eine AUC von 0,93 im Vergleich zu 0,78 für AFP und 0,85 für PIVKA-II. In der unabhängigen Validierungskohorte be...
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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen bestehen. Kein kommerzieller Geldgeber, Reagenzhersteller, Softwareanbieter oder Diagnoseplattformunternehmen hatte Einfluss auf das Studiendesign, die Datensammlung, die statistische Analyse, die Interpretation der Ergebnisse, die Manuskripterstellung oder die Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.
Die Autoren danken den Studienteilnehmern und dem klinischen Personal, das die Blutentnahme, die klinische Koordination, die Bildüberprüfung und die Datenverifikation für diese Studie unterstützt hat.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5-mL nukleasefreie Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 30123328 | Plasma-Aliquotierung und -lagerung |
| AFP-Kalibrator | Roche Diagnostics | AFP CalSet II, 09227261190 | AFP-Kalibrierung |
| AFP-Qualitätskontrollmaterial | Roche Diagnostics | PreciControl Tumor Marker, 11776452160 | AFP-Qualitätskontrolle |
| AFP-Qualitätskontrollmaterial | Roche Diagnostics | PreciControl Universal, 11731416160 | AFP-Qualitätskontrolle |
| AFP-Reagenzkit | Roche Diagnostics | Elecsys AFP, 09015124190 | AFP-Messung |
| Automatisierter elektrochemilumineszenzbasierter Immunoassay-Analysator | Roche Diagnostics | cobas e 801 | AFP- und PIVKA-II-Messung |
| Kalibrierungspaket | R-Paket | rms 6.7–1 | Kalibrierungsanalyse |
| Paket für die Entscheidungskurvenanalyse | R-Paket | rmda 1.6 | Entscheidungskurvenanalyse |
| Hosmer–Lemeshow-Testpaket | R-Paket | ResourceSelection 0.3–6 | Hosmer–Lemeshow-Test |
| K2-EDTA-Blutentnahmeröhrchen, 10 mL | BD | 367525 | Entnahme von peripherem venösem Blut |
| Paket für multiple Imputation | R-Paket | mice 3.16.0 | Multiple Imputation |
| PIVKA-II-Reagenzkit | Roche Diagnostics | Elecsys PIVKA-II, 08333629190/08333629500 | PIVKA-II-Messung |
| Kühlzentrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5425 R | Plasmatrennung |
| Paket für ROC-Analyse | R-Paket | pROC 1.18.5 | ROC-Analyse und DeLong-Test |
| Statistische Software | R Foundation | R 4.3.2 | Statistische Analyse |
| Benutzeroberfläche für statistische Software | Posit Software | RStudio 2023.12.1 | Statistische Analyse |
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