Untersuchung des Mechanismus des Guben-Pingchuan-Granulats bei der Behandlung von Bronchialasthma

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht den Wirkmechanismus der Guben-Pingchuan-Granulate bei Bronchialasthma mittels Netzwerkpharmakologie, molekularer Docking und in vivo. Validierung.

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht den Wirkmechanismus von Guben-Pingchuan-Granulen bei der Behandlung von Bronchialasthma mittels Netzwerkpharmakologie, molekularem Docking und experimenteller Validierung. Wirkstoffe und entsprechende Ziele wurden mithilfe von TCMSP-, HERB- und SymMap-Datenbanken identifiziert. Asthmabezogene Ziele wurden von GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank und PharmGKB gesammelt. Überlappende Ziele wurden identifiziert, und Komponenten-Ziel- sowie Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) wurden konstruiert. Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen wurden mit Korrektur der falschen Entdeckungsrate (FDR) durchgeführt. Molekulares Andocken wurde durchgeführt, um die Bindungsaffinität zu bewerten, gefolgt von einer In-vivo-Validierung . Insgesamt wurden 121 aktive Komponenten und 234 arzneimittelbezogene Ziele identifiziert, was 155 überlappende Ziele ergibt. Zu den Kernzielen gehörten TP53, AKT1, TNF und IL6. Die KEGG-Analyse zeigte eine signifikante Anreicherung des PI3K–Akt-Signalwegs, der für die experimentelle Validierung ausgewählt wurde. Das molekulare Andocken zeigte eine starke Bindungsaffinität zwischen den Kernkomponenten und AKT1. Bei ovalbumininduzierten asthmatischen Ratten senkte das Guben-Pingchuan-Granulat die Serumspiegel von IL-4 und IL-10 , erhöhte die FoxP3-Expression im Lungengewebe und erhöhte die PI3K - und AKT-mRNA-Spiegel . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Guben-Pingchuan-Granulat Bronchialasthma lindert, indem es den PI3K–Akt.-Signalweg moduliert, entzündliche Zytokine reguliert und die Regulation der T-Zellfunktion verbessert.

Einleitung

Bronchialasthma ist eine heterogene chronische Atemwegserkrankung, die durch Atemwegsentzündungen, Hyperreaktion der Atemwege, Schleimübersekretion^und Atemwegsanbau gekennzeichnet ist. Seine Pathogenese umfasst komplexe Wechselwirkungen zwischen Aktivierung von Immunzellen, entzündlichen Mediatoren und mehreren Signalwegen. Klinisch zeigt sich Asthma mit wiederkehrendem Keuchen, Atemnot, Engegefühl in der Brust und Husten. Die Entzündung der Atemwege ist ein zentraler Mechanismus für den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit, gekennzeichnet durch eine erhöhte Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-6, IL-4, IL-17 und TNF-α., die Infiltration von Entzündungszellen einschließlich Eosinophilen und Neutrophilen sowie strukturelle Veränderungen wie die Proliferation glatter Atemwegsmuskulatur, Verdickung der Basalmembran und Schleimdrüsenhyperplasie^2˒3. Diese pathologischen Prozesse führen letztlich zu Atemwegsverstopfungen und beeinträchtigtem Luftstrom.

Die Asthmapathophysiologie wird durch mehrere wechselwirkende Signalwege und nicht durch einen einzigen Mechanismus reguliert. Der PI3K–Akt-Signalweg spielt eine Schlüsselrolle bei der Modulation des Immunsystems, insbesondere der Treg/Th17-Achse, indem er die Expression von FoxP3 reguliert. Dieser Signalweg interagiert auch mit IL-17- und TNF-Signalwege, um entzündliche Reaktionen und Atemwegsanordnung zu verstärken, was zur Heterogenität der Krankheit und zur Behandlungsresistenz ^3,4 beiträgt. Epidemiologische Daten zeigen einen kontinuierlichen weltweiten Anstieg der Asthmaprävalenz, mit über 358 Millionen Betroffenen weltweit und etwa 45,7 Millionen erwachsenen Patienten in China ^5,6. Aktuelle Behandlungsstrategien basieren hauptsächlich auf inhalierten β₂-Agonisten und Glukokortikoide; Diese Therapien richten sich jedoch gegen begrenzte pathologische Mechanismen und können bei bestimmten Patienten zu Nebenwirkungen und Glukokortikoidresistenz führen. Die Dysregulation von Signalwegen wie PI3K–Akt. wurde mit einer verminderten therapeutischen Responsivität in Verbindung gebracht, was den Bedarf an multizielreichen therapeutischen Ansätzen^{unterstreicht 7,4}.

Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) klassifiziert Asthma als "Xiao-Syndrom", das mit Mängeln in Lungen-, Milz- und Nierenfunktion verbunden ist, kombiniert mit externen pathogenen Faktoren. TCM-Formulierungen werden aufgrund ihrer multikomponentigen, multi-zielspezifischen Eigenschaften ^8,9 weit verbreitet in der Asthmabehandlung eingesetzt. Im Gegensatz zu Single-Target-Pharmakologien bewirken TCM-Verbindungen therapeutische Wirkungen, indem sie die Regulation mehrerer biologischer Signalwege koordinieren und damit der komplexen Pathophysiologie von Asthma¹⁰ entsprechen. Die Netzwerkpharmakologie bietet einen systemweiten Ansatz zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffkomponenten, Zielgruppen und Krankheitswegen, wodurch die Identifikation wichtiger bioaktiver Verbindungen und molekularer Mechanismen ermöglicht¹¹. Das molekulare Andocken ergänzt diesen Ansatz weiter, indem es die Bindungsaffinität zwischen kleinen Molekülen und Zielproteinen bewertet.

Guben Pingchuan-Granulat ist eine traditionelle chinesische medizinische Formulierung, die aus acht pflanzlichen Bestandteilen besteht, darunter Ephedra sinica (Ephedra-Kraut), Psoralea corylifolia-Frucht , Prunus armeniaca-Samen (Aprikosensamen), Pseudostellaria heterophylla-Wurzel , Perilla frutescens-Frucht , Eriobotrya japonica-Blatt (Loquat-Blatt), Lilium brownii-Zwiebel und Epimedium brevicornum. Diese Formulierung wird traditionell verwendet, um lebenswichtige Energie zu stärken, Schleim zu lösen und Keuchen zu lindern. Frühere klinische Studien haben ihre therapeutische Wirksamkeit bei Asthma mit höheren Ansprechraten im Vergleich zu herkömmlichen Behandlungen^{nachgewiesen 12}.

Um den zugrunde liegenden Wirkmechanismus zu erläutern, wird ein integrierter Ansatz angewandt, der Netzwerkpharmakologie, molekulares Andocken und in vivo experimentelle Validierung kombiniert. Netzwerkpharmakologie wird verwendet, um aktive Bestandteile und potenzielle Ziele im Zusammenhang mit Bronchialasthma zu identifizieren. Molekulares Andocken wird eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen Schlüsselverbindungen und Zielproteinen zu bewerten. Anschließend wird eine experimentelle Validierung in einem Tiermodell durchgeführt, um die regulatorischen Auswirkungen auf kritische Signalwege, insbesondere auf den PI3K–Akt.-Signalweg , zu bewerten. Dieser Ansatz zielt darauf ab, mechanistische Einblicke in die multi-zielorientierten therapeutischen Effekte des Guben-Pingchuan-Granulats zu liefern und dessen Anwendung bei der Behandlung von Bronchialasthma zu unterstützen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Tierethikausschuss der Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Zulassungsnummer: 21000042023058) genehmigt und gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Datenbanken und Software

1. Zugriff auf folgende Datenbanken und Software: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt und Cytoscape (Version 3.9.1).

2. Erwerb von Komponentenzielen

1. Beziehen Sie chemische Bestandteile von Ephedra-Kraut, Aprikosensamen, Pseudostellaria-Wurzel, Perilla-Frucht, Loquat-Blatt, Lilium-Arten und Epimedium aus der TCMSP-Datenbank¹³. Beziehen Sie Verbindungen von Psoralea aus den Datenbanken HERB und SymMap.
2. Wirkstoffe werden mit oraler Bioverfügbarkeit (OB ≥ 30 %) und Arzneimittelähnlichkeit (DL ≥ 0,18^{) getestet}.
3. Vorhersagen Sie Zielgene mit TCMSP. Standardisieren Sie alle Ziele mithilfe der UniProt-Datenbank, indem Sie Homo sapiens auswählen. Entfernen Sie doppelte und ungültige Ziele, einschließlich nicht-menschlicher Einträge, nicht annotierte Proteine und veraltete Identifikatoren.

3. Erfassung von Zielen für Bronchialasthma

1. Suchen Sie bei GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank und PharmGKB mit dem Schlüsselwort "Bronchialasthma". Setze den Relevanzwert von GeneCards auf >4. Führe alle gesicherten Ziele zusammen und entferne Duplikate.

4. Identifikation von Schnittzielen

1. Importiere Arzneimittelziele und Krankheitsziele in ein Online-Venn-Analysetool. Identifizieren Sie sich überlappende Ziele und notieren Sie die Gesamtzahl für die spätere Analyse.

5. Aufbau des Komponenten-Ziel-Netzwerks

1. Importiere Schnittziele in Cytoscape 3.9.1. Konstruiere das Komponenten-Ziel-Netzwerk. Passen Sie die Knotengröße und -farbe basierend auf den Gradwerten an.

6. Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI)

1. Lade Intersection-Ziele in die STRING-Datenbank hoch. Wählen Sie Homo sapiens aus und stellen Sie den Vertrauenswert auf ≥0,900 ein. Exportiere das Netzwerk und importiere es in Cytoscape.
2. Berechnen Sie topologische Parameter (Gradzentralität, Zwischenzentralität und Nähezentralität). Identifizieren Sie Kernziele anhand der mittleren Schwellenwerte und des Grades >20.

7. GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse

1. Laden Sie überlappende Ziele in die DAVID-Datenbank hoch oder analysieren Sie sie mit dem R-Paket clusterProfiler.
2. Führen Sie Genontologie-(GO)-Anreicherungsanalysen für biologische Prozess-, zelluläre Komponenten und molekulare Funktionen durch.
3. Führen Sie eine KEGG-Anreicherungsanalyse des Signalwegs durch. Falsche Entdeckungsrate (FDR) Korrektur anwenden und die Signifikanzschwelle auf FDR < 0,05 setzen.
4. Visualisieren Sie die obersten angereicherten Begriffe mit Balkendiagrammen oder Blasendiagrammen.

8. Molekulare Andockung

1. Laden Sie 2D-Strukturen von Kernverbindungen von PubChem herunter. Generiere 3D-Strukturen mit ChemOffice und speichere sie als mol2-Dateien.
2. Laden Sie Proteinstrukturen aus der RCSB PDB-Datenbank herunter. Entfernen Sie Wassermoleküle und Liganden mit PyMOL.
3. Führen Sie molekuläres Andocken mit AutoDock Vina durch. Definiere Gridbox-Parameter und führe Andocksimulationen durch.
4. Erfassen Bindungsenergien (kcal/mol) und wichtige wechselwirkende Reste. Visualisieren Sie Andockergebnisse mithilfe von molekularen Modellierungen, Visualisierungs- und Simulationsplattformen.

9. Experimentelle Validierung

1. Tiere
   1. Erhalten Sie 48 männliche Sprague–Dawley-Ratten (9 Wochen alt, 220–240 g). Haustiere bei 20–25 °C und 55%–60% Luftfeuchtigkeit unter Standardbedingungen.
2. Medikamente und Reagenzien
   1. Bereiten Sie Guben-Pingchuan-Granulate vor, bestehend aus Ephedra-Kraut, Psoralea, Aprikosensamen, Pseudostellaria-Wurzel, Perilla-Frucht, Loquat-Blatt, Lilium und Epimedium.
   2. Bereiten Sie Dexamethason, Ovalbumin (OVA), Aluminiumhydroxid, ELISA-Kits, RNA-Extraktionskits und Antikörper wie in der Materialtabelle aufgeführt vor.
3. Instrumente
   1. Bereite Standardlaborausrüstung vor, darunter ein Mikroplattenleser, ein Elektrophoresesystem, ein Paraffinmikrotom und ein Bildgebungssystem.
4. Tiergruppierung und Behandlung
   1. Ratten werden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 8): Kontrollgruppe für Blanke, Modellgruppe, Dexamethasongruppe (0,3 mg/kg), Gruppe für niedrig dosierte chinesische Medizin, mitteldosierte chinesische Medizingruppe und für hochdosierte chinesische Medizingruppe.
   2. An den Tagen 1, 7 und 14 verabreichen Sie 1 ml intraperitoneale Injektion von 10 % OVA + 10 % Al(OH)₃ an Ratten in der Modellgruppe, der Gruppe mit niedriger Dosis chinesischer Medizin, der mitteldosierten chinesischen Medizingruppe, der hochdosierten chinesischen Medizingruppe und der Dexamethasongruppe zur Sensibilisierung.
   3. Verabreichen Sie 1 ml intraperitoneale Injektion von 0,9 % physiologischer Kochsalzlösung an Ratten in der Blindkontrollgruppe an den Tagen 1, 7 und 14.
   4. Von Tag 15 bis 21 wird eine verneblte Inhalationsstimulation einmal täglich für 20 Minuten durchgeführt. Geben Sie Ratten in der Modellgruppe, der Gruppe mit niedriger Dosis chinesischer Medizin, mitteldosierter chinesischer Medizingruppe, hochdosierter chinesischer Medizingruppe und Dexamethasongruppe eine 5%ige OVA-nebulisierte Inhalation.
   5. Verabreichen Sie 0,9 % physiologische, salzhaltige verneblte Inhalation an Ratten in der blanken Kontrollgruppe von Tag 15 bis 21.
   6. Behandeln Sie je nach zugewiesener Behandlungsgruppe einmal täglich von Tag 22 bis 36 durch orale Gavage.
   7. Überwachen Sie während des gesamten Experiments täglich das Körpergewicht und den allgemeinen Zustand. Die experimentelle Zeitleiste ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
5. Histopathologie
   1. Sammle Lungengewebe. Korrektur, Einbettung und Schnittproben. Führen Sie eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung durch.
   2. Führen Sie eine Masson-Färbung durch, um die Kollagenablagerung zu bewerten.
6. RT-PCR-Analyse
   1. Vollständige RNA aus dem Lungengewebe extrahieren.
   2. Homogenisieren Sie gefrorenes Lungengewebe unter ultraniedrigen Temperaturbedingungen. Nach dem Wiegen der Probe wird sie schnell in einen vorgekühlten Mörtel mit flüssigem Stickstoff gegeben und zu Pulver gemahlen.
   3. Transferiere die pulverisierte Probe in ein Zentrifugenrohr. Fügen Sie 1 ml TransZol UP und 0,2 ml RNA-Extraktionsreagenz zu jedem 50–100 mg Gewebe hinzu. Schüttle das Rohr bei Zimmertemperatur 5 Minuten lang.
   4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g und 2–8 °C für 15 Minuten. Übertragen Sie die farblose wässrige Phase in ein neues Zentrifugenrohr.
   5. Fügen Sie 1 ml TransZol UP auf 0,5 mL Isopropanol hinzu. Die Mischung 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen.
   6. Zentrifugiere die Probe bei 1000 × g für 10 Minuten. Gib 1 ml 75 % Ethanol hinzu und zentrifugiere erneut für 5 Minuten.
   7. Entsorge das Überlagerungsmittel und lasse den Niederschlag 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen. Lösen Sie das Präzipitat in 50–100 μL RNA-Lösung auf und inkubieren Sie dann 10 Minuten.
   8. Lagern Sie die Probe bei −70 °C zur langfristigen Konservierung.
   9. cDNA synthetisieren und quantitative PCR durchführen, um die Expression von PI3K und AKT zu messen.
7. ELISA
   1. Tau-Serumproben bei 4 °C ab. Missen Sie IL-4- und IL-10-Werte mit ELISA-Bausätzen gemäß den Herstelleranweisungen.
8. Immunhistochemie
   1. Fixiertes Lungengewebe mit 4 % Paraformaldehyd, eingebettet in Paraffin, geschnitten, entwachst und mit Feuchtigkeit versorgt.
   2. Führen Sie Antigenentnahme durch, Blockierung und Antikörperinkubation. Die Färbung laut dem FoxP3-Immunhistochemie-Kit, der DAB-Färbungslösung und der positiven Ausdruck erscheinen als bräunlich-gelb oder dunkelbraune Färbung.
   3. Beobachten und fotografieren Sie unter dem Mikroskop und verwenden Sie die Image J-Software zur quantitativen statistischen Analyse der FoxP3-Expression.
9. Statistische Analyse
   1. Testdatennormalität mit dem Shapiro–Wilk-Test und Varianzhomogenität mit dem Levene-Test.
   2. Analysieren Sie die Daten mit Einweg-ANOVA- oder nicht parametrischen Tests, je nach Anwendung. Drücken Sie Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus.
   3. Definiere p < 0,05 als statistisch signifikant. ★★p < 0,01 und ★p < 0,05 vs. Kontrollgruppe; ◆◆p < 0,01 und ◆p < 0,05 vs. Modellgruppe; ##p < 0,01 und #p < 0,05 vs. Dexamethason-Gruppe.

Tabelle 1: Experimentelle Zeitleiste. Zeitplan für Sensibilisierung, Herausforderung und Behandlungsverfahren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergebnisse

Screening der Wirkstoffe
Insgesamt wurden 121 aktive Komponenten nach Filterung auf Zielaktivität aus der TCMSP-Datenbank identifiziert. Dazu gehörten 23 Komponenten aus Ephedra-Kraut , 7 aus Psoralea, 19 aus Aprikosensamen, 8 aus Pseudostellaria-Wurzel , 16 aus Perilla-Frucht, 18 aus Loquat-Blatt, 7 aus Lilium und 23 aus Epimedium. (Tabelle 2). Sechzehn häufige Bestandteile wurden identifiziert, darunter L...

Diskussion

Bronchialasthma ist eine häufige Erkrankung in der Atemwegsabteilung¹⁶. Es handelt sich um eine obstruktive Atemwegserkrankung, die durch Allergene und Atemwegsüberempfindlichkeit^verursacht wird. Es hat eine hohe klinische Inzidenz, ist anfällig für Rückfälle und schwer zu heilen, was die Gesundheit und Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigt. Die Global Initiative for Asthma 2025 (GINA) berichtet, dass die inhalierte Glukokor...

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Erkennung der relativen mRNA-Expression von Zielgenen
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Immunologisches Adjuvans zur Verstärkung der Antigen-Immunantwort
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 Stück pro Box	Quantifizierung des Gesamtproteins zur Standardisierung der Probenbeladung
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	WB-Band-Imaging, Sammlung und Analyse von Gel- und Blot-Bildern
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Protein-Molekülgewichtsreferenz für Elektrophorese-Experimente
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 Stück pro Box	Extraktion und Reinigung von totaler RNA aus Geweben und Zellen
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Quantitative Detektion von Zytokinen und Proteingehalten in Proben
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/Stück	Gezielte Bindung an FOXP3-Protein für Immunoassays
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 Sets	Schnelle Herstellung von Trenn- und Stapelgel für Elektrophorese
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 Tabletten	Spezifische Färbung für Gewebe-Kollagenfasern und Fibrose-Beobachtung
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Klassisches Allergen zur Etablierung allergischer Tiermodelle
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Verdünnung des Primärantikörpers, Aufrechterhaltung der Aktivität und Reduzierung unspezifischer Bindungen
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Quantitative Detektion des entzündungshemmenden Ratten IL-10
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Quantitative Detektion des Ratten Th2-Entzündungsfaktors IL-4
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Reverse Transkription von RNA in cDNA für nachfolgende Genanalyse
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 Flasche	Spezifische Färbung und Detektion von Lipidtröpfchen in Geweben
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Bindung an Kaninchen-Primärantikörper für WB-Farbreaktion
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / Flasche	Puffer für Membranwäsche und Antikörperverdünnung in Western Blot
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Verwendet für Proteinelektrophorese und Western Blot Membrantransfer
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	Tiefgefrieren von Reagenzien, Proteinproben und Geweben bei niedrigen Temperaturen
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	Vertikale elektrophoretische Trennung von Protein- und Nukleinsäureproben

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