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Methodenartikel
* These authors contributed equally
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung unmarkierter Gendeletionen und zur Konstruktion genomweiter Tn5-Insertions-Mutantenbibliotheken in Pectobacterium brasiliense, einem Phytopathogenen, der für Kartoffel-Schwarzbein und Weichfäule verantwortlich ist. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente umgekehrte genetische Analyse und erleichtert die funktionelle Charakterisierung virulenzassozoziierter Gene in diesem Organismus.
Pectobacterium brasiliense ist ein hochpathogenes Bakterium, das für Kartoffelknollen-Weichfäule, Schwarzbein und Luftstängelfäule verantwortlich ist. Die Aufklärung seiner pathogenen Mechanismen ist für die Krankheitskontrolle unerlässlich; genetische Werkzeuge für diesen Organismus bleiben jedoch begrenzt. Ein toxinbasiertes Gegenselektionssystem wurde entwickelt, um markerlose Gen-Deletion und hochdichte Tn5-Transposon-Mutagenese zu ermöglichen. Das aus dem pLP12-Plasmid gewonnene vmi480-Toxin wurde als Gegenselektionsmarker verwendet, um den Suizidvektor pKV2 zu konstruieren. Mit diesem System wurde das recA-Gen im P. brasiliense SM-Stamm erfolgreich gelöscht. Der daraus resultierende recA-Mutant diente als elterlicher Stamm für den Aufbau einer Tn5-Insertionsbibliothek, die über 12.000 Mutanten durch Konjugation mit dem RHO3-Hilfsstamm umfasst, der pKV2-LLtnp trägt. In diesem derivativen Plasmid wurde das vmi480-Toxin unter Kontrolle eines nach außen gerichteten Lac-Promotors durch eine hyperaktive Tn5-Transposase ersetzt, um polare Effekte zu reduzieren. Hochdurchsatz-Knolleninokulationstests ermöglichten die Identifizierung pathogenitätsdefizienter Mutanten, einschließlich Einsätzen im Typ-II-Sekretionssystem, einem wichtigen Virulenzfaktor, der die Sekretion von pflanzenwandabbauenden Enzymen vermittelt. Diese Plattform unterstützt die funktionelle Genomik und erleichtert die Untersuchung von Virulenzmechanismen bei diesem wirtschaftlich wichtigen Erreger.
P. brasiliense ist eine der aggressivsten Arten innerhalb der Gattung Pectobacterium und der Ursache von Kartoffelweichfäule, Schwarzbein und Luftstängelfäule1. Diese Krankheiten führen zu einem geschätzten Ertragsverlust von 30 % bei Kartoffeln, einer Kulturpflanze, die als drittwichtigste Nahrungsquelle der Welt und ein zentraler Bestandteil des chinesischen landwirtschaftlichen Produktionssystems2 gilt. Trotz ihrer wirtschaftlichen Auswirkungen sind die molekularen Mechanismen, die die Pathogenität von P. brasiliense steuern, weiterhin unzureichend verstande....
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1. Erzeugung eines markerlosen recA-Deletionsmutanten in P. brasiliense
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Um die durch die sucB-Mutation verursachte Instabilität in P. brasiliense zu überwinden, wurde das vmi480-Toxin aus dem Plasmid pLP12 als Gegenselektionsmarker verwendet, und der modifizierte Suizidvektor pKV2 (Abbildung 1A) wurde durch Ersatz der Antibiotikaresistenzkassette und Anpassung der Klonierungsstelle konstruiert. Um einen markerlosen recA-Deletionsmutanten zu erzeugen, wurden ~800 bp linke und rechte homologe Arme des recA-Gens zu pKV2 geklont, .......
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Die in dieser Studie entwickelte genetische Manipulationsstrategie bietet eine Option für funktionelle Genomik bei P. brasiliense, einem primären Weichfäulnis-Erreger der Kartoffel 9,10. Durch die Integration eines toxinbasierten Gegenselektionssystems in ein Suizidplasmid-Rückgrat entstand ein markerloser ΔrecA-Mutant. Dieser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber traditionellen SACB-basierten Sys.......
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32472504 und 32561143029 an X.Z. und 32201914 an J.W.), der Guangdong Foundation für Grundlagen- und Angewandte Grundlagenforschung (2024A1515012708 bis X.Z.), der Nature Science Foundation of Inner Mongolia (2024QN03044 an U.H.) sowie vom Pearl River Talent Program (2021QN02N151 bis X.Z.) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bacterial genomic DNA extraction kit | Extract bacterial genomic DNA | Tiangen | DP302-02 |
| Diaminopimelic acid | 0,3 mM in 1 L Medium | Macklin | D836611-5g |
| DNA assembly kit | DNA-Assembly | Vazyme | C116-02 |
| DNA purification kit | DNA-Reinigung | Tiangen | DP214-02 |
| Kanamycin | 50 mg/mL | Aladdin | K103025-25g |
| Glucose | 0,2% (w/v) | Aladdin | G116305-250mg |
| Tryptone | 10% in 1 L Medium | OXOID | LP0042B |
| Yeast Extract | 5% in 1 L Medium | OXOID | LP0021B |
| NaCl | 10% in 1 L Medium | Biofroxx | 1249KG001 |
| Agar | 15% in 1 L Medium | Biofroxx | 8211GR500 |
| L-arabinose | 0,3% (w/v) | Aladdin | A106196-25g |
| Plasmid Miniprep kit | Extract Plasmid | Tiangen | DP103-02 |
| EcoRI | Restriktionsendonuklease | Yugong Biotech | EG15536 |
| NheI | Restriktionsendonuklease | Yugong Biotech | EG15552 |
| HindIII | Restriktionsendonuklease | Yugong Biotech | EG15539 |
| T4 DNA Ligase | Lineare DNA-Selbstzirzularisierung | Yugong Biotech | EG15205 |
| Zentrifuge | RWD | M1324R | |
| PCR Thermocycler | BIO-GENER | GET3XG | |
| Digitalkamera | SONY | ILCE-7M4 | |
| Elektrophoresesystem | LY | DYY-6C | |
| Wasserbad | JOANLAB | WB100-1F | |
| Geldokumentationssystem | Thermo Fisher Scientific | iBright CL750 | |
| Autoklav | Yamato | SQ510C | |
| Schüttelinkubator | ZHICHU | ZQZY-AR8 | |
| Inkubator mit konstanter Temperatur | ZQ | DHP-9272 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | Lite Plus | |
| UV-Vis-Spektrophotometer | HITACHI | U-3900 | |
| Elektroporator | BIO-RAD | MicroPulser | |
| Stämme und Plasmide | |||
| P. brasiliense SM | Kartoffelpathogene Bakterien | Laborstammsammlung | |
| E. coli S17-1 λpir | E. coli kompetente Zellen | WEIDI | DL2010S |
| E. coli WM3064 | E. coli kompetente Zellen | BIO SCI BIO | C1039 |
| E. coli RHO3 | E. coli kompetente Zellen | Laborstammsammlung | |
| pKV2 | Das modifizierte Suizidplasmid | Konstruiert in dieser Studie | |
| pLP12 | Suizidplasmid | Laborstammsammlung | |
| pMCS2-LLtnp | Stellen Sie das Tn5 tragende Fragment bereit | Laborstammsammlung | |
| pKV2-LLtnp | Das modifizierte Plasmid, das das Tn5-Fragment trägt. | Konstruiert in dieser Studie | |
| Pimers | |||
| LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc) | Kundenspezifisch | ||
| LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt) | Kundenspezifisch | ||
| RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac) | Kundenspezifisch | ||
| RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc) | Kundenspezifisch | ||
| checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc) | Kundenspezifisch | ||
| checkR (gctcttgctcataattgtcctgg) | Kundenspezifisch | ||
| TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg) | Kundenspezifisch | ||
| TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag) | Kundenspezifisch | ||
| ori-F (taatcgccttgcagcacatc) | Kundenspezifisch | ||
| ori-R (ggtatgagtcagcaacacct) | Kundenspezifisch | ||
| 5’ME (attcattaatgcagctggcacg) | Kundenspezifisch |
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