Ein toxinbasiertes Gegenselektionssystem für markerlose Gen-Deletion und hochdichte Tn5-Transposon-Mutagenese in Pectobacterium brasiliense

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung unmarkierter Gendeletionen und zur Konstruktion genomweiter Tn5-Insertions-Mutantenbibliotheken in Pectobacterium brasiliense, einem Phytopathogenen, der für Kartoffel-Schwarzbein und Weichfäule verantwortlich ist. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente umgekehrte genetische Analyse und erleichtert die funktionelle Charakterisierung virulenzassozoziierter Gene in diesem Organismus.

Zusammenfassung

Pectobacterium brasiliense ist ein hochpathogenes Bakterium, das für Kartoffelknollen-Weichfäule, Schwarzbein und Luftstängelfäule verantwortlich ist. Die Aufklärung seiner pathogenen Mechanismen ist für die Krankheitskontrolle unerlässlich; genetische Werkzeuge für diesen Organismus bleiben jedoch begrenzt. Ein toxinbasiertes Gegenselektionssystem wurde entwickelt, um markerlose Gen-Deletion und hochdichte Tn5-Transposon-Mutagenese zu ermöglichen. Das aus dem pLP12-Plasmid gewonnene vmi480-Toxin wurde als Gegenselektionsmarker verwendet, um den Suizidvektor pKV2 zu konstruieren. Mit diesem System wurde das recA-Gen im P. brasiliense SM-Stamm erfolgreich gelöscht. Der daraus resultierende recA-Mutant diente als elterlicher Stamm für den Aufbau einer Tn5-Insertionsbibliothek, die über 12.000 Mutanten durch Konjugation mit dem RHO3-Hilfsstamm umfasst, der pKV2-LLtnp trägt. In diesem derivativen Plasmid wurde das vmi480-Toxin unter Kontrolle eines nach außen gerichteten Lac-Promotors durch eine hyperaktive Tn5-Transposase ersetzt, um polare Effekte zu reduzieren. Hochdurchsatz-Knolleninokulationstests ermöglichten die Identifizierung pathogenitätsdefizienter Mutanten, einschließlich Einsätzen im Typ-II-Sekretionssystem, einem wichtigen Virulenzfaktor, der die Sekretion von pflanzenwandabbauenden Enzymen vermittelt. Diese Plattform unterstützt die funktionelle Genomik und erleichtert die Untersuchung von Virulenzmechanismen bei diesem wirtschaftlich wichtigen Erreger.

Einleitung

P. brasiliense ist eine der aggressivsten Arten innerhalb der Gattung Pectobacterium und der Ursache von Kartoffelweichfäule, Schwarzbein und Luftstängelfäule¹. Diese Krankheiten führen zu einem geschätzten Ertragsverlust von 30 % bei Kartoffeln, einer Kulturpflanze, die als drittwichtigste Nahrungsquelle der Welt und ein zentraler Bestandteil des chinesischen landwirtschaftlichen Produktionssystems² gilt. Trotz ihrer wirtschaftlichen Auswirkungen sind die molekularen Mechanismen, die die Pathogenität von P. brasiliense steuern, weiterhin unzureichend verstanden, was vor allem auf das Fehlen effizienter und reproduzierbarer genetischer Manipulationswerkzeuge für diese Art^{zurückzuführen ist.}

Funktionelle genomische Studien bei vielen phytopathogenen Bakterien basieren auf robusten Allelaustausch- und Transposonmutagenesesystemen; vergleichbare genetische Werkzeuge für P. brasiliense bleiben jedoch begrenzt oder ineffizient. Insbesondere sind effektive Gegenselektionsmarker, die mit dieser Art kompatibel sind, rar. Während das sacB-Gen in verschiedenen Bakterien weit verbreitet als Gegenselektionsmarker für Gendeletion verwendet wird, könnte P. brasiliense während des Selektionsprozesses eine hohe Toleranz von bis zu 50 % Saccharose zeigen⁵. Diese Toleranz spiegelt wahrscheinlich eine mangelnde Empfindlichkeit gegenüber Toxinen wider, möglicherweise aufgrund der enzymatischen Umwandlung von Saccharose in Zuckerpolymere. Darüber hinaus können hohe Saccharosekonzentrationen schädlichen osmotischen Schock⁶ auslösen. Darüber hinaus sind effiziente groß angelegte Mutagenese-Methoden, wie die Konstruktion der Tn5-Transposon-Einführungsbibliothek, für diesen Organismus noch nicht gut etabliert.

Um diese technischen Einschränkungen zu beheben, wurde ein toxinbasiertes Gegenselektionssystem entwickelt und ein robuster Tn5-Mutagenese-Screening-Workflow für P. brasiliense eingerichtet. Im Vergleich zu traditionellen saccharosebasierten Methoden bietet dieser toxinbasierte Ansatz deutliche Vorteile, darunter eine erhöhte Selektionsstrenge, eine erhöhte Spezifität bei der Erkennung von Doppel-Crossover-Ereignissen und die Beseitigung von störender osmotischer Belastung. Ähnliche vmi480-Toxin-Antitoxin-basierte Systeme wurden erfolgreich implementiert, um Selektionsbarrieren in Vibrio-Spezies ⁷ zu überwinden. Die etablierte Methodik ist sehr anwendbar für die hochdurchsatzfähige funktionelle Charakterisierung unbekannter Gene und bietet eine vielseitige Plattform, die an andere verwandte Weichfäule (Pectobacteriaceae) angepasst werden kann.

Protokoll

1. Erzeugung eines markerlosen recA-Deletionsmutanten in P. brasiliense

1. Genomische DNA aus P. brasiliense SM und pKV2-Plasmid (pLP12 gewonnen durch Modifikation des Antibiotika-Selektionsmarkers und der Mehrfachklonstelle) aus dem E.-coli-Spenderstamm mit Standard-DNA-Vorbereitungsverfahren extrahieren.
2. Verifizieren Sie die Qualität und Konzentration der extrahierten genomischen DNA und Plasmid-DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese und NanoDrop-Spektrophotometrie.
3. Linearisieren Sie das Plasmid pKV2 durch doppelte Verdauung mit EcoRI und NheI bei 37 °C für 5 Stunden. Überprüfen Sie die vollständige Verdauung durch Agarosegel-Elektrophorese und reinigen Sie das linearisierte Plasmid.
4. Identifizieren Sie etwa 800 bp-Regionen stromaufwärts und stromabwärts des recA-Gens mit Genomanalyse-Software und entwerfen Sie die entsprechenden Primerpaare LBF/LBR und RBF/RBR (siehe Materialtabelle für alle in dieser Studie verwendeten Primer).
5. Beide homologen Arme unter Standard-PCR-Zyklusbedingungen verstärken und die PCR-Produkte reinigen. Eine 50-μL-PCR liefert typischerweise 2,5 μg Produkt.
   HINWEIS: Die Tm-Werte und der GC-Gehalt der Primer können durch Änderung der Grenzen der homologen Regionen angepasst werden.
6. Setze das rekombinante Suizidplasmid pKV2-recA mit einem DNA-Assemblierungskit zusammen, indem die gereinigten homologen Arme mit dem linearisierten Plasmid-Rückgrat ligiert werden.
7. Die Montagemischung wird durch Hitzeschock in chemisch kompetente E. coli S17-1 λpir-Zellen umgewandelt, die Zellen im LB-Medium zurückgewonnen und auf LB-Agar mit Kanamycin (LB + kan) verplattet.
   HINWEIS: Die endgültig verwendeten Konzentrationen sind 50 mg/mL Kanamycin, 0,2 % (w/v) Glukose, 0,3 % (w/v) Arabinose und 0,3 mM 2,6-Diaminopimelsäure (DAP).
8. Validiere positive Klone durch Restriktionsverdauung oder Kolonie-PCR. (Siehe Materialtabelle für alle in dieser Studie verwendeten Medium-Rezepte).
9. Extrahiere das bestätigte pKV2-recA-Plasmid und transformiere es mittels Wärmeschocktransformation in E. coli WM3064 (erwartete Transformationsrate > 10⁶ cfu/μg).
10. Wählen Sie Transformanten auf LB-Agar aus, der Kanamycin und Diaminopimelsäure (DAP) enthält.
11. Durchführung der biparental Konjugation durch das Mischen von Übernachtkulturen des Spenderstamms (WM3064 pKV2-recA) und des Empfängers P. brasiliense SM im Verhältnis 1:1 (v/v), was typischerweise 10⁴ bis 10⁶ Transkonjuganten pro Milliliter Spender- und Empfängerzellen ergibt.
12. Waschen Sie die Mischkultur einmal mit sterilem Wasser, legen Sie die Mischung auf LB-Agar, das mit Kanamycin und DAP ergänzt wird, und inkubieren Sie bei 28 °C 48–72 Stunden.
    HINWEIS: Wenn keine Transkonjuganten beobachtet werden, kann das Verhältnis von Spender zu Empfänger auf 2:1 (v/v) erhöht werden, um die Konjugationseffizienz zu verbessern. Wenn ein starkes Hintergrundwachstum beobachtet wird, kann das verbleibende DAP durch zweimaliges Waschen der Mischkultur mit sterilem Wasser entfernt werden.
13. Die Konjugationsmischung wird wiederhergestellt und auf LB-Agar mit Kanamycin und Glukose (ohne DAP) zur Gegenselektion geplatiert.
14. Wähle 6–8 Kolonien aus und vergestalte sie auf LB + kan und LB + kan + Arabinose.
15. Wähle Kolonien aus, die auf LB + kan wachsen, aber auf LB + kan + Arabinose nicht wachsen; Das sind Kandidaten für das erste Crossover.
16. Inokulierte bestätigte Erst-Crossover-Stämme in das LB-Medium und inkubierte über Nacht. Plattieren Sie die Kulturen auf LB-Agar, der L-Arabinose enthält, um die zweite homologe Rekombination zu induzieren.
17. Wähle mehrere Kolonien aus und repliziere sie auf LB + Arabinose und LB + kan. Wählen Sie Kolonien aus, die auf LB + Arabinose wachsen, aber nicht auf LB + kan; dies sind mutative RecA-Deletionsmutanten.
    HINWEIS: Wenn nach dem zweiten Crossover keine Kolonien mehr beobachtet werden, sollte die potenzielle Essenzialität des Zielgens für das Bakterienwachstum bewertet werden. Alternativ können die upstream- und downstream-homologen Regionen auf 1.200 bp erweitert werden, um die Effizienz der homologen Rekombination zu verbessern.
18. Bestätigen Sie die recA-Mutanten mittels Kolonie-PCR mit Primerpaar-CheckF/CheckR, das darauf ausgelegt ist, über die recA-Promotor - und Terminatorregionen zu amplifizieren, um die In-Frame-Deletion des Zielgens zu überprüfen. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt, um die präzise In-Frame-Löschung von recA zu bestätigen.
19. Eine erfolgreiche Deletion wird durch eine Verkleinerung der PCR-Produktgröße angezeigt, die der Wildtyp-Fragmentlänge minus der spezifischen Länge des gelöschten Gensegments entsprechen sollte.

2. Konstruktion von pKV2-LLtnp für die Tn5-Mutagenese in P. brasiliense

1. Verstärkt die Tnp-Transposase-Kassette von pMCS2-LLtnp⁸ mit dem Primerpaar Tnp-F/Tnp-R und verstärkt das oriγR6K Tn5-Backbone aus pKV2 mit dem Primerpaar ori-F/ori-R. Reinigen Sie alle PCR-Produkte mit einem DNA-Reinigungskit.
2. Bauen Sie die gereinigte Tnp-Kassette und das oriγR6K Tn5-Backbone mit einem DNA-Montagekit zusammen. Die Montagemischung wird durch Hitzeschock in chemisch kompetente E. coli S17-1 λpir-Zellen umgewandelt, im LB-Medium zurückgewonnen und auf LB-Agar mit Kanamycin (LB + kan) aufgelagert.
3. Validiere positive Klone mittels Kolonie-PCR mit den Primerpaaren ori-F/ori-R und Tnp-F/Tnp-R.
4. Bereiten Sie E.-coli-RHO3-fähige Zellen vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in ein LB-Medium impfen und über Nacht inkubieren. Verdünne die Kultur mit 1:100 in frisches LB-Medium und lasse es auf einen OD₆₀₀ von 0,6 wachsen.
5. Kühlen Sie die Kultur auf Eis und waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühltem 0,1 M CaCl₂. Das endgültige Pellet in 500 μL vorgekühltem 20%-Glycerols wieder suspendieren und bei −80 °C lagern.
6. Transformieren Sie 10 μL des validierten rekombinanten Plasmids (pKV2-LLtnp) durch Wärmeschock in 100 μL RHO3-fähige Zellen (erwartete Transformationsrate > 10⁶ cfu/μg). 30 Minuten auf Eis ausbrüten, 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 °C, dann 2 Minuten auf Eis abkühlen.
7. Fügen Sie 500 μL LB Medium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C 1 Stunde lang mit Rührung. Platte auf LB-Agar mit Kanamycin und DAP (LB + kan + DAP) und inkubiere über Nacht bei 37 °C.
8. Validiere positive RHO3-Transformanten mittels Kolonie-PCR mit Tnp-F/Tnp-R.

3. Bau der Tn5-Transposon-Mutantenbibliothek in P. brasiliense

1. Anbau von P. brasiliense ΔrecA in LB-Medium bei 28 °C und RHO3/pKV2-LLtnp im LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin und DAP (LB + kan + DAP) bei 37 °C. Beide Stämme erreichen ein OD₆₀₀ von 1.
2. Mischen Sie 100 μL P. brasiliense ΔrecA mit 100 μL RHO3/pKV2-LLtnp, zentrifugieren Sie das Gemisch, entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das gewaschene Pellet in 10 μL LB-Medium.
3. Lege die neu suspendierte Mischung auf eine mit DAP ergänzte LB-Agarplatte und inkubiere sie 8 Stunden bei 28 °C, um die Konjugation zu ermöglichen.
4. Die Konjugationsmischung wird durch Abspülen der Plattenoberfläche mit 1 ml sterilem LB-Medium wiederhergestellt. Zentrifugieren Sie kurz, entsorgen Sie das Überlagerungsmittel und waschen Sie das Pellet zweimal mit LB-Medium, um DAP zu entfernen.
5. Das gewaschene Pellet in 300 μL LB-Medium wieder suspendieren und 10-fache Serienverdünnungen auf LB-Agar anbringen, ergänzt mit Kanamycin und Glukose (LB + kan + Glukose; ohne DAP), um für Transkonjuganten auszuwählen.
6. Inkubieren Sie die Platten bei 28 °C für 48 Stunden. Wählen Sie fünf Kolonien aus und validieren Sie jede per Kolonie-PCR mit den Primerpaaren ori-F/ori-R und Tnp-F/Tnp-R, um die erfolgreiche Einführung des Tn5-Transposons zu bestätigen. Sequenzieren Sie alle fünf Kolonien, um die Tn5-Einfügung im Genom zu überprüfen.
   HINWEIS: Vor dem formellen Bau der Mutantenbibliothek wurden sechs einzelne Kolonien zufällig aus der Konjugationsplatte ausgewählt. Plasmid-Rettungstests wurden durchgeführt, um die Einsatzstellen zu bestimmen, wobei zwei verschiedene Restriktionsenzyme separat als zwei parallele Kontrollgruppen verwendet wurden. Insgesamt wurden 36 Sequencing-Reads erzielt. Ein einziges Tn5-Einfügungsereignis wurde nur validiert, wenn die sechs Einfügungsstellen jeder einzelnen Kolonie identisch waren.
7. Schätzen Sie die Kapazität der Mutantenbibliothek, indem Sie den Konjugationsschritt wiederholen und die Kolonienzahlen zählen. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtgröße der Bibliothek 12.000 Kolonien übersteigt, um eine ausreichende genomische Abdeckung für das nachgelagerte Screening zu erreichen.
   HINWEIS: Wenn eine niedrige Mutagenese-Frequenz beobachtet wird, sollte die Verwendung einer hyperaktiven Tn5-Transposase-Variante, wie der E54K/M56A/L372P-Mutanten, in Betracht gezogen werden, um die Transpositionseffizienz zu erhöhen.
8. Übertragen einzelne mutierte Kolonien, die in Schritt 6 gewonnen wurden, in 96-Brunnenplatten mit 200 μL LB + kan pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 28 °C und schütteln Sie bei 200 U/min.
9. Fügen Sie jedem Brunnen 133 μL steriles 50%iges Glycerol hinzu, um eine Endkonzentration von etwa 20% zu erreichen. Versiegeln und lagern Sie die 96-Well-Platten bei −80 °C zur langfristigen Konservierung.

4. Hochdurchsatz-Pathogenitätstests mittels Kartoffelknollen- und Topfinokulation

1. Bereiten Sie Kartoffelknollen (siehe Favorita) vor, indem Sie sie mit sterilem Wasser abspülen, sie kurz in 75 % Ethanol eintauchen und sie auf einer sauberen Werkbank an der Luft trocknen. Schneiden Sie die Knollen in ~8 mm dicke Stücke und legen Sie die Scheiben in sterile 90-mm-Petrischalen. Bereiten Sie mindestens drei Scheiben für biologische Replikationen vor.
2. Inokulieren Sie 1 μL jeder mutierten Sortung mit einer Mehrkanalpipette auf Kartoffelscheiben, entsprechend dem Plattenlayout der 96-Well-Mutantenbibliothek. Beziehen Sie P. brasiliense ΔrecA als positive Kontrolle und LB + kan als negative Kontrolle ein.
3. Die geimpften Kartoffelscheiben bei 28 °C 7–8 Stunden inkubieren. Mutanten zeigen sichtbar reduzierte Maceration oder kleinere Läsionsbereiche im Vergleich zur ΔrecA-Kontrolle . Quantifizieren Sie die Läsionsfläche durch Messung ihrer Länge und Breite. Bestimmen Sie diese als Kandidaten für das Primary Screening.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die_OD-600-Werte von mutierten Kulturen und Kontrollen vor der Impfung auf 0,8 normalisiert sind.
4. Für das sekundäre Screening werden 5 μL jeder Kandidatsorte auf frische Kartoffelscheiben geimpft (6 Stämme pro Scheibe, gleicher Abstand). Bereite für jeden Stamm drei biologische Replikate vor. Inkubieren Sie bei 28 °C für 7–8 Stunden und zeichnen Sie die Läsionengrößen auf, um die Abschwächung zu bestätigen.
5. Isolieren Sie Stämme mit einer konsistenten Virulenzreduktion, indem Sie sie auf LB+Kan-Platten streifen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 28 °C und lagern validierte Mutanten mit reduzierter Virulenz bei 4 °C für die spätere Analyse.
6. Für die Validierung ganzer Pflanze inokulieren Sie Kartoffelstängel mit 150 μL bakterieller Suspensionen, die auf 1 x 10⁸ CFU/ml normalisiert sind. Injektion von Suspensionen in den Basalstammbereich mit einer sterilen Spritze. Beobachte die Entwicklung der Krankheit nach 48 Stunden. Führen Sie biologische Replikationen an drei einzelnen Pflanzen durch.
7. Bewerten Sie die Schwere der Krankheit mit der Blackleg-Disease-Skala ("eine 6-Punkte-Ordinalskala: 0, 1, 3, 5, 7, 9") und berechnen Sie den Krankheitsindex als:
   1. Stufe 0: Keine Krankheitssymptome an der gesamten Pflanze.
   2. Grad 1: Stängelläsionen bedecken nicht mehr als ein Drittel des Stängelumfangs, und/oder einzelne Blätter sind verwelkt.
   3. Grad 3: Stängelläsionen bedecken nicht mehr als die Hälfte des Stängelumfangs, und/oder weniger als die Hälfte der Blätter zeigen eine leichte Welkung, und/oder einige untere Blätter weisen Läsionen auf.
   4. Grad 5: Stängelläsionen bedecken mehr als die Hälfte des Stängelumfangs, und/oder mehr als die Hälfte der Blätter zeigen eine leichte Welkung.
   5. Stufe 7: Stängelläsionen umschließen den gesamten Stängelumfang, und/oder mehr als zwei Drittel der Blätter sind verwelkt.
   6. Klasse 9: Alle Blätter der Pflanze sind verwelkt oder tot.
      
8. Bereiten Sie Langzeitlagerbestände bestätigter abgeschwächter Mutanten vor, indem Sie Kulturen mit einem gleichen Volumen sterilen 50%-Glycerols bis zu einer Endkonzentration von 25% mischen und bei -80 °C lagern.

5. Identifizierung der Tn5-Einsetzstellen durch Plasmidrettung

1. Züchten Sie den interessierten Tn5-Mutanten und extrahieren Sie genomische DNA mit einem bakteriellen DNA-Extraktionskit. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration, um ausreichende Eingabe für die nachgelagerte Verdauung sicherzustellen.
2. Verdauen Sie 1–2 μg genomische DNA mit EcoRI in einer 100-μL-Reaktion mit 10× Reaktionspuffer und 5 μL Enzym und inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für mindestens 3 Stunden. Überprüfen Sie den Abschluss der Verdauung mit einem Agarosegel.
3. Fällen Sie die verdaute DNA aus, indem Sie 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 3 Bände absolutes Ethanol hinzufügen. Gründlich mischen und 1 Stunde bei -20 °C inkubieren.
4. Zentrifugiere bei 13.500 x g für 5 Minuten und wasche das Pellet nacheinander mit 75 % Ethanol und absolutem Ethanol. Lufttrocknen Sie das Pellet und lassen Sie es in 17 μL sterilem Wasser wieder suspendieren.
5. Selbst ligatieren Sie die verdauten DNA-Fragmente, indem Sie 2 μL 10× T4-DNA-Ligasepuffer und 1 μL T4-DNA-Ligase hinzufügen. Fügen Sie eine negative Kontrolle (ohne Ligase) hinzu, um die Hintergrundtransformation zu überprüfen. Inkubieren Sie die Ligationsreaktion über Nacht bei 4 °C, um die Zirkularisierung der Restriktionsfragmente zu fördern.
6. Transformieren Sie 10 μL des Ligationsgemisch in chemisch kompetente E. coli S17-1 λpir mittels zuvor beschriebener Wärmeschocktransformation. Zellen in LB für 1 Stunde zurückgewinnen und auf LB-Agar mit Kanamycin (LB + kan) verplatten, um Plasmide mit der Tn5-Kassette auszuwählen.
7. Wähle fünf zufällig kanamycinresistente Kolonien aus und extrahiere Plasmid-DNA mit einem Standard-Plasmid-Miniprep-Kit. Validiere die Plasmidstruktur, indem du 500 ng jedes Plasmids mit HindIII verdaust und bei 37 °C für 5 Stunden inkubierst. Analysieren Sie Verdauungsmuster mittels Agarosegel-Elektrophorese.
8. Wenn die Plasmidbandgrößen mit den erwarteten Fragmentmustern übereinstimmen, wird eine Sanger-Sequenzierung mit dem 5' ME-Primer innerhalb der Tn5-Enden durchgeführt.
9. Identifizieren Sie die genaue Tn5-Einsatzstelle, indem Sie die 50-100 bp Flankensequenz stromabwärts der Tn5 5'-ME-Region mit dem P. brasiliense SM-Genom mittels BLAST- oder Genomanalyse-Software ausrichten.
10. Bestätigen Sie, dass alle fünf unabhängigen Sequenzierungsreaktionen für jede Mutante auf dieselbe genomische Koordinate abgebildet werden (> 98%-Sequenzidentität).
11. Wenn eine der fünf Sequenzierungsreaktionen auf eine andere genomische Koordinate abgebildet ist, deutet dies auf das Vorhandensein mehrerer Tn5-Insertionsstellen in diesem Mutanten hin. In solchen Fällen analysieren Sie weitere Kolonien, um alle Einsatzpositionen zu bestimmen. Alternativ führen Sie Southern Blotting oder Whole-Genom-Sequencing durch, um eine endgültigere Insertion-Site-Kartierung zu erhalten.
12. Benennen Sie Mutanten mit einem einzigen, konsistenten Einsetzpunkt über alle Sequenzierungsreaktionen hinweg als echte Tn5-Single-Insertion-Mutanten, die für nachgelagerte phänotypische oder genetische Analysen geeignet sind.

Ergebnisse

Um die durch die sucB-Mutation verursachte Instabilität in P. brasiliense zu überwinden, wurde das vmi480-Toxin aus dem Plasmid pLP12 als Gegenselektionsmarker verwendet, und der modifizierte Suizidvektor pKV2 (Abbildung 1A) wurde durch Ersatz der Antibiotikaresistenzkassette und Anpassung der Klonierungsstelle konstruiert. Um einen markerlosen recA-Deletionsmutanten zu erzeugen, wurden ~800 bp linke und rechte homologe Arme des recA-Gens zu pKV2 geklont, ...

Diskussion

Die in dieser Studie entwickelte genetische Manipulationsstrategie bietet eine Option für funktionelle Genomik bei P. brasiliense, einem primären Weichfäulnis-Erreger der Kartoffel ^9,10. Durch die Integration eines toxinbasierten Gegenselektionssystems in ein Suizidplasmid-Rückgrat entstand ein markerloser ΔrecA-Mutant. Dieser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber traditionellen SACB-basierten Sys...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bacterial genomic DNA extraction kit	Extract bacterial genomic DNA	Tiangen	DP302-02
Diaminopimelic acid	0,3 mM in 1 L Medium	Macklin	D836611-5g
DNA assembly kit	DNA-Assembly	Vazyme	C116-02
DNA purification kit	DNA-Reinigung	Tiangen	DP214-02
Kanamycin	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucose	0,2% (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	10% in 1 L Medium	OXOID	LP0042B
Yeast Extract	5% in 1 L Medium	OXOID	LP0021B
NaCl	10% in 1 L Medium	Biofroxx	1249KG001
Agar	15% in 1 L Medium	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	0,3% (w/v)	Aladdin	A106196-25g
Plasmid Miniprep kit	Extract Plasmid	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Restriktionsendonuklease	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Restriktionsendonuklease	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Restriktionsendonuklease	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA Ligase	Lineare DNA-Selbstzirzularisierung	Yugong Biotech	EG15205
Zentrifuge	RWD	M1324R
PCR Thermocycler	BIO-GENER	GET3XG
Digitalkamera	SONY	ILCE-7M4
Elektrophoresesystem	LY	DYY-6C
Wasserbad	JOANLAB	WB100-1F
Geldokumentationssystem	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoklav	Yamato	SQ510C
Schüttelinkubator	ZHICHU	ZQZY-AR8
Inkubator mit konstanter Temperatur	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis-Spektrophotometer	HITACHI	U-3900
Elektroporator	BIO-RAD	MicroPulser
Stämme und Plasmide
P. brasiliense SM	Kartoffelpathogene Bakterien	Laborstammsammlung
E. coli S17-1 λpir	E. coli kompetente Zellen	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli kompetente Zellen	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli kompetente Zellen	Laborstammsammlung
pKV2	Das modifizierte Suizidplasmid	Konstruiert in dieser Studie
pLP12	Suizidplasmid	Laborstammsammlung
pMCS2-LLtnp	Stellen Sie das Tn5 tragende Fragment bereit	Laborstammsammlung
pKV2-LLtnp	Das modifizierte Plasmid, das das Tn5-Fragment trägt.	Konstruiert in dieser Studie
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Kundenspezifisch
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Kundenspezifisch
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Kundenspezifisch
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Kundenspezifisch
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Kundenspezifisch
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Kundenspezifisch
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Kundenspezifisch
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Kundenspezifisch
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Kundenspezifisch
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Kundenspezifisch
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Kundenspezifisch