Methodenartikel

Ein in-vitro-System zur Anwendung von Zugkraft auf skelettale Stammzellen mittels eines zyklischen Zellstressspannungssystems

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DOI:

10.3791/70570

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12. Juni 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Maus-periostale skelettale Stammzellen (SSCs) wurden mittels FACS isoliert und in vitro kultiviert. Ein kontrollierbares experimentelles System wurde eingerichtet, um zyklische zugmechanische Stimulation auf SSCs anzuwenden, was zu einer verminderten Expression der zellulären Senezenz-assoziierten Genen, insbesondere p16 und p21, führte.

Zusammenfassung

Knochen ist ein wichtiges mechanosensitives Organ, das kontinuierlich auf körperliche Signale im Körper reagiert. Obwohl mechanische Stimulation eine wichtige Rolle bei der Skelettentwicklung, Homöostase und Verletzungsreparatur spielt, sind die spezifischen Reaktionen der skelettalen Stammzellen (SSCs) auf mechanischen Stress weiterhin unvollständig verstanden. Um diese Frage zu beantworten, haben wir ein In-vitro-Modell entwickelt, um mausperiostale SSCs zu isolieren und mechanische Stimulation anzuwenden. Mausperiostale Zellen wurden zunächst durch enzymatische Verdauung gewonnen, und SSCs wurden anschließend durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) basierend auf etablierten Oberflächenmarkern isoliert. Nach der Befestigung an die Kultur wurden SSCs einer zugmechanischen Stimulation mittels eines zyklischen Zellstress-Spannungs-Systems unterzogen. Dieses System ermöglicht die reproduzierbare Anwendung von Zugkraft auf kultivierte Zellen und bietet eine Plattform zur Analyse von SSC-Reaktionen auf mechanische Eingaben. Mit diesem Ansatz stellten wir fest, dass die Expression der zellulären Senezenz-assoziierten Gene p16 und p21 in SSCs nach mechanischer Stimulation deutlich reduziert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zugstimulation die seneszenzbedingte Veränderungen bei SSCs unter in-vitro-Bedingungen beeinflussen kann. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine nützliche und geeignete Plattform, um das Verhalten von SSCs unter mechanischer Stimulation zu untersuchen und zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die SSC-Funktion beeinflussen.

Einleitung

Als das größte und wichtigste Stützorgan im menschlichen Körper bietet das Skelettsystem nicht nur Anheftungsstellen und Schutz für andere Organe, sondern dient auch als Grundlage für die motorische Funktion. Daher ist das Skelettsystem ständig verschiedenen mechanischen Reizen sowohl aus inneren als auch äußeren Umgebungen ausgesetzt. Mechanische Stimulationssignale sind ebenso wichtig für die Knochenentwicklung und die funktionelle Erhaltung. Bereits 1893 wurde vorgeschlagen, dass es eine gewisse positive Korrelation zwischen Knochendichte und der mechanischen Kraft gibt, die Knochen tragen, was das Wolffsche Gesetz1 ist. In den letzten Jahren haben einige Studien die Bedeutung gezeigt, dass das Skelettsystem mechanische Kräfte für die normale Entwicklung der Knochenträgt 2,3,4,5. Die Reaktion des Skelettsystems auf mechanische Kräfte hängt teilweise von den zellulären Komponenten im Knochen6 ab. Osteozyten machen 85 % bis 90 % der zellulären Komponenten im Skelettsystem aus. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung und einzigartigen dendritischen Zellmorphologie sind Osteozyten derzeit der am gründlichsten untersuchte Typ von Skelettzellen hinsichtlich der mechanischenAntwort 7,8. Neben der weithin anerkannten Fähigkeit von Osteozyten, auf mechanische Kräfte zu reagieren, spielen auch skelettale Vorläuferzellen eine unverzichtbare Rolle dabei. Es wurde festgestellt, dass die Reaktion der periostalen Vorläuferzellen auf mechanische Signale ihre Schicksalstransformation regulierte und so die Reparatur von Gewebeschädenbeeinflusste.

Skelettstammzellen (SSCs) sind eine Art gewebespezifischer Stammzellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit, die sich in reife Knochenzellen differenzieren können, die für Knochenwachstum, -pflege und -reparatur erforderlich sind. Im Jahr 2015 wurden10 Oberflächenmarker-Gene für Maus-SSCs identifiziert. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass SSCs eine sehr wichtige Rolle in verschiedenen Bereichen spielen, wie Knochenentwicklung, Erhaltung der Homöostase und Reparatur von Knochenverletzungen11,12. Aufgrund der Eigenschaften des Skelettsystems, das auf mechanische Kräfte reagiert, können wir mechanische Kraftsignale als unverzichtbaren Faktor bei der Regulierung der Funktion skelettaler Stammzellen betrachten. Um die Verhaltensänderungen von SSCs unter mechanischer Stimulation zu untersuchen, müssen wir ein geeignetes experimentelles System zur Anwendung mechanischer Kraft in vitro etablieren.

Die Hauptmethoden der in-vitro-mechanischen Stimulation für Zellen umfassen Strömungsscherspannung, Druckspannung, Zugkraft, hydrostatischen Druck, Matrizensteifigkeit und Matrizentopologie 6,13. Basierend auf den Oberflächenmarker-Genen von Maus-SSCs erhielten wir mausperiostale SSCs durch Flowzytometrie-Sortierung, da die an der Frakturreparatur beteiligten SSCs hauptsächlich aus demPeriost-14 stammen. Anschließend wurde eine angemessene Zugkraft über ein zyklisches Zellspannungssystem auf die periostealen SSCs ausgeübt. Nach der Zugkraftstimulation können Zellproben gewonnen und Multi-Omics-Analysen durchgeführt werden, darunter Transkriptomsequenzierung, Proteomsequenzierung und ATAC-seq. Daher bietet die Etablierung dieses Protokolls eine solide Grundlage für die Untersuchung von SSC-Reaktionen auf mechanische Stimulation.

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Protokoll

Die Mausexperimente in diesem Protokoll wurden alle vom Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (SIBCB-S350-2312-41), genehmigt.

1. Isolierung von Periostzellen bei Mäusen

  1. Setze 4- bis 6 Wochen alte Mäuse in eine CO₂-Euthanasiebox und setze sie 3 Minuten lang kontinuierlich CO₂ aus, bis das Atmen aufhört.
  2. Desinfizieren Sie die Oberfläche der Körper der Mäuse mit 75 % Alkohol. Verwenden Sie eine Augenschere, um die Hintergliedmaßen zu trennen. Anschließend werden spitze Zangen und Augenschere verwendet, um die Skelettmuskulatur der Hintergliedmaßen zu entfernen und sicherzustellen, dass die Gelenkbereiche von Oberschenkelknochen und Tibia intakt bleiben.
  3. Konservieren Sie die isolierten Knochen in gekühltem PBS und beschichten Sie dann beide Enden der Knochen mit niedrigschmelzender Agarose (5–10 % im TAE-Puffer).
  4. Zweimal Verdauen Sie die Oberschenkelknochen und Tibias in einem minimalen essentiellen Medium Alpha (α-MEM), das 1 mg/mL Kollagenase, 2 mg/mL Dispase II und 0,1 mg/ml DNase I bei 37°C und 0,3 × g enthält, zweimal 30 Minuten. Sammeln Sie die verdauten Zellen in das Kulturmedium (α-MEM + 10 % fetales Rinderserum (FBS)).
  5. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm großes Sieb und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten bei 500 × g , um das Überstandsmittel zu entfernen.
  6. Das Zellpräzipitat mit einem roten Blutkörper-Lysepuffer für 2 Minuten neu suspendieren und die Reaktion mit dem Durchflusszytometriepuffer (PBS + 2 % FBS) beenden.
  7. Zentrifugiere die Zellen bei 500 × g für 5 Minuten und entsorge das Supernatantum. Setzen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriepuffer bei 1 × 107 Zellen /ml für die Zellsortierung wieder auf.

2. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

  1. Färbe die Zellsuspension mit folgenden Antikörpern wie folgt: PerCP/Cy5.5-konjugierte Anti-Maus CD45, PerCP/Cy5.5-konjugierte Anti-Maus CD31, PerCP/Cy5.5-konjugierte Anti-Maus Ter119, FITC-konjugierte Anti-Maus 6C3/Ly-51, Brilliant Violet 605-konjugierte Anti-Maus CD90.2, PE/Cy7-konjugierte Anti-Maus CD105, APC-konjugierte Anti-Maus CD200.
  2. Verdünnen Sie die oben genannten Antikörper im Verhältnis 1:500 und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht.
  3. Waschen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriepuffer und führen Sie die Zellsortierung mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer durch, um CD45-CD31- Ter119- CD90.2- 6C3-CD105-CD200+ SSCs zu erhalten. Sammeln Sie die sortierten SSCs mit dem Kulturmedium. Analysieren Sie die gesammelten Daten mit der Software FlowJo v10.8.1.
  4. Erweitern Sie die sortierten SSCs in Kulturschalen mit Ausdehnungsmedium in einem 5%igen CO2-Zellen-Inkubator. Ein Abschnitt konnte vor der mechanischen Stimulation ausgeführt werden.
    HINWEIS: Von jedem Paar von sechs Wochen alten Mäusen können etwa 1 ×5 periostale SSCs gewonnen werden.

3. Mechanische Stimulation von SSCs

  1. Verdünnen Sie das Kollagen des Rattenschwanzes Typ I in sterilisierter 0,02 M Essigsäure auf eine Endkonzentration von 0,15 mg/mL. Diese Lösung kann dreimal wiederverwendet werden und sollte bei 4 °C aufbewahrt werden.
  2. Gib 1,5 ml verdünntes Rattenschwanz-Typ-I-Kollagen zu jedem Brunnen der 6-Wellen-Kulturplatte mit flexiblem Boden hinzu. Nachdem Sie die Platten 1 Stunde bei Zimmertemperatur beschichtet haben, saugen Sie das überschüssige Kollagen ab und waschen Sie die Platten einmal mit PBS für spätere Anwendung.
  3. HINWEIS: Für die sofortige Verwendung sollte die Platte mit PBS abgespült werden, um eventuelle Säurereste zu entfernen. Vor der Lagerung bei 4 °C sollte der Teller vollständig getrocknet und der Deckel abgenommen werden.
  4. Man verdauen die kultivierten periostealen SSCs der Maus, zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 Minuten, setzen Sie das Zellniederschlag im Kulturmedium neu auf, um eine Zelldichte von 1 × 105 Zellen/ml zu erreichen, geben Sie jedem Brunnen der 6-Bohrloch-Kulturplatte 2 ml Zellsuspension hinzu und legen Sie sie in den Zellinkubator.
  5. 24 Stunden nach dem Aussäen der Zellen wird die flexibel bodenartige Kulturplatte in die gedehnte Grundplatte gelegt und eine weitere flexible Zellkulturplatte als Kontrollgruppe ohne mechanische Kraftstimulation erhalten.
  6. Stellen Sie die Parameter in der FX-6000 Version 1.0 Software wie folgt ein: Dehnungsstärke 8 %, Frequenz 0,1 Hz, Wellenform als Rechteckwelle, Wellenform-Duty Cycle 80 % und Dehndauer für 12 Stunden.
    HINWEIS: Auf der gespannten Grundplatte gibt es vier Positionen zum Einsetzen einer 6-Wellen-Kulturplatte mit flexiblem Boden. Wenn die für das Experiment benötigten Zellen weniger als 4 sind, sollten die leeren Positionen mit neuen 6-Wellen-Kulturplatten mit flexiblem Boden gefüllt werden. Nach geeigneter mechanischer Stimulation können SSCs funktionelle Tests wie Zelldifferenzierung oder -proliferation durchlaufen oder Proben für Multi-Omics-Sequenzierung extrahiert werden.

4. Echtzeit-quantitative PCR (RT-qPCR)

  1. Nach Abschluss der mechanischen Stimulation der Zellen wird das Kulturmedium entsorgt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen, die gesamte RNA mit Trizol-Reagenz extrahiert und die RNA-Reverse-Transkription durchgeführt.
    HINWEIS: Nach Abschluss der RNA-Extraktion kann sie bei -80 °C gelagert werden. Die cDNA, die durch die Reverse-Transkription gewonnen wird, kann ebenfalls bei -20 °C für nachfolgende Tests gespeichert werden.
  2. Führen Sie die RT-qPCR mit einem Echtzeit-PCR-System durch. Die verwendeten Zündhüttensätze waren wie folgt:
    Hprt: vorwärts 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAAA-3',
    Hprt: Rückwärts 5'-AGGGCATATCCAACAACAAACTT-3',
    p16: vorwärts 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
    P16: Rückwärts 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAGAAGAG-3',
    p21: vorwärts 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
    P21: Rückwärts 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Die Auswirkungen der kurzfristigen Behandlung mechanischer Belastung

  1. Stellen Sie die Parameter in der FX-6000 Version 1.0 Software wie folgt ein: Dehnfestigkeit 8 %, Frequenz 0,1 Hz, Wellenform als Rechteckwelle, Wellenform-Duty Cycle 80 %. Die Zellen werden mit RIPA-Lysepuffer I (mit Phosphataseinhibitor-Cocktail und Proteaseinhibitor-Cocktail) 10 und 60 Minuten nach mechanischer Spannungsstimulation lysiert.
  2. Führe den Western Blot mit Erk und p-Erk Antikörper durch.

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Ergebnisse

Nach der Umsetzung dieses Protokolls wurde erfolgreich Zugkraft auf periostale SSCs von Mäusen angewendet. Erstens wurden SSCs aus dem Periost von Mäusen mittels Durchflusszytometrie gewonnen. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass der Anteil der SSCs am Periost fast 30 % von Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2-6C3- (Abbildung 1) ausmachte, was deutlich höher war als im Knochenmark. Angesichts der bed...

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Diskussion

In den letzten Jahren wurden skelettale Stammzellmarker-Gene aus verschiedenen Knochenteilen kontinuierlich entdeckt 11,12,17. Die Forschung zur direkten Regulation der SSC-Funktion muss jedoch noch vertieft werden, insbesondere im Bereich der mechanischen Kraftstimulationsregulation. Bisher basiert die Forschung zu den mechanischen regulatorischen Effekten von skelettalen Stammzellen/Vorläuferz...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken der Kernanlage für die Durchflusszytometrie und der Tierkernanlage des Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinesische Akademie der Wissenschaften. Die Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32471190, 82502903) und dem Hainan Provincial Foreign Experts Program (506068033010) unterstützt.

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Materialien

```html
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
α-MEMCorning10-022-CVperiostale Zellen Isolierung
APC anti-mouse CD200BioLegend123809SSCs Sortierung
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001AZellkultur
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317SSCs Sortierung
CollagenaseSigmaC0130periostale Zellen Isolierung
Dispase IISigmaD4693periostale Zellen Isolierung
DNase ISigmaDN25periostale Zellen Isolierung
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701SSCs Sortierung
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305SSCs Sortierung
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 Zellspannung
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria FusionSSCs Sortierung
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513Zellkultur
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409SSCs Sortierung
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522SSCs Sortierung
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132SSCs Sortierung
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228SSCs Sortierung
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236Zellkultur
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702periostale Zellen Isolierung
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesternBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesternBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesternBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesternBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesternBlot
```

Referenzen

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

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Schlagwörter

Mechanische StimulationIn vitro ModellPeriostzellenZellsortierungfluoreszenzaktivierte Zellsortierungzellul re SeneszenzOberfl chenmarker

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