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Ethische Aussage
Alle Tierverfahren wurden vom Fujian Ambry Biotechnology Laboratory Animal Ethics Committee geprüft und genehmigt, Genehmigungsnummer IACUC FJABR2024031202). Führen Sie alle Tierversuche gemäß dem genehmigten institutionellen Pflege- und Nutzungsprotokoll für Tiere durch.
SDD und Ibuprofen-Vorbereitung
SDD besteht aus Shixiao San (9 g), Xiangfu (9 g), Moyao (6 g), Guizhi (9 g), Weilingxian (12 g), Shijianchuan (20 g), Yanhusuo (12 g), Danggui (9 g), Liujinu (15 g) und Xiaohuixiang (5 g). Shixiao San besteht aus Puhuang (4,5 g) und Wulingzhi (4,5 g). Alle pflanzlichen Komponenten wurden als konzentrierte Granulate verwendet und sind in der Materialtabelle aufgeführt. SDD wird hergestellt, indem 106 g konzentrierte Granulate in 200 mL kochendem Wasser gelöst werden, um eine Endkonzentration von 0,53 g/mL Roharzneimitteläquivalent zu erhalten. Gründlich mischen, bis die Granulate vollständig gelöst sind, lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie sie durch intragastrische Gabe mit 2,5 mL/kg pro Verabreichung. Bereiten Sie die Ibuprofen-Suspension entsprechend der erforderlichen Konzentration für die intragastrische Gabe vor. Geben Sie Ibuprofen mit 0,02 g/kg als positive Kontrollbehandlung.
Tiere und Gruppierungen
Verwenden Sie 36 gesunde, erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten spezifischer pathogenfreier Qualität, im Alter von 2–3 Monaten und mit einem Gewicht von 200 ± 20 g, ohne Vorgeschichte von Schwangerschaft oder Paarung. Halten Sie die Ratten unter einem 12 Stunden/12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus bei 22 ± 2 °C und 50–70 % relativer Luftfeuchtigkeit, mit freiem Zugang zu Standardfutter und Trinkwasser. Nach einer Woche der Akklimatisierung werden die Ratten zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): Blank, Model, SDD, TEAP, SDD + TEAP und Ibuprofen-Gruppen.
Erstellung und Durchführung des QSBSPD-Modells
In diesem Experiment wurde das weithin akzeptierte Modell der OT-induzierten Dysmenorrhoe verwendet. Kurz gesagt, wurden die Östruszyklen von Ratten mittels vaginalen Abstrichen beurteilt. Die Ratten galten als aufnahmeberechtigt, wenn ihre Östruszyklusdauer auf 4–5 Tage festgelegt wurde.
Mit Ausnahme der Blankgruppe erhielten die Ratten in den Versuchsgruppen täglich eine subkutane Injektion von Estradiolbenzoat und Adrenalinhydrochlorid für 10 Tage täglich. Nach der Injektion von Epinephrin-Hydrochlorid in einer Dosierung von 0,9 mg/kg täglich wurden die Ratten verschiedenen kombinierten Stimulationen ausgesetzt (A: Akustische Stimulation: Ratten wurden akustischen Reizen (90 dB, 1 kHz) für 5 Minuten pro Zeit, 3–4 Mal täglich, mit jeweils 2 Stunden Abstand ausgesetzt. B: Lichtstimulation: Ratten wurden 5 Minuten pro Tag, 3–4 Mal täglich, mit jeweils 2 Stunden Abstand ausgesetzt. C: Elektrische Stimulation: Ratten wurden elektrischer Stimulation (biphasische quadratwellige Impulse) bei 30–35 V ausgesetzt, wobei Wechselstrom alle 2 Sekunden 0,3 Sekunden angelegt wurde. Diese Stimulation wurde alle 2 Stunden 5 Minuten verabreicht, 2–4 Mal täglich. D: Fesselung: Die Ratten wurden in einen aus Stacheldraht gefertigten Fesselkäfig gehalten, der etwa 25 cm lang und 5 cm im Durchmesser maß. Im Käfig wurden die Enden geklemmt, um die Ratten zu immobilisieren und ihre Bewegung für 2 Stunden, einmal täglich, einzuschränken. Außerdem wurden die Ratten an den Tagen 1 und 10 subkutan mit 5,0 mg/kg/Tag Estradiolbenzoat injiziert, und an den Tagen 2–9 erhielten sie 2,5 mg/kg/Tag.
Ab dem 5. Tag der Estradiolbenzoat-Injektion erhielten die Ratten sieben Tage lang verschiedene Medikamente intragastrisch verabreicht, zweimal täglich um 10:00 Uhr und 16:00 Uhr, mit Ausnahme der Ibuprofen-Gruppe, die einmal täglich um 10:00 Uhr erhielt. In den Blank-, Modell- und TEAP-Gruppen erhielten die Ratten 2,5 ml/kg Normalsalzlösung. In SDD- und TEAP+SDD-Gruppen erhielten die Ratten 2,5 mL/kg SDD (hergestellt als 106 g Rohöl, gelöst in 200 mL Wasser, 0,53 g/mL); Diese Dosis wurde von der klinischen Tagesdosis von 106 g bei Erwachsenen basierend auf der Körperoberflächenäquivalenz umgerechnet, was zu einer rattenäquivalenten Dosis führte. In der Ibuprofen-Gruppe erhielten die Ratten 0,02 g/kg Ibuprofen-Suspension. In den TEAP- und TEAP+SDD-Gruppen erhielten die Ratten ab dem 5. Tag nach der Estradiolbenzoat-Injektion eine TEAP-Stimulation. Die Elektroden werden an den beidseitigen Ohrpunkten von Jiaogan, Shenmen, Neishengzhiqi und Neifenmi befestigt, wie sie gemäß einem zuvor berichteten Standard für die Ratsakupunkt-Lokalisierung12 definiert sind. Diese Punkte befinden sich in der beidseitigen Ohrkonschalenhöhle, die vom Vagusnerv innerviert wird. Die Elektroden waren an ein elektronisches Nadeltherapieinstrument angeschlossen, das einmal täglich eine kontinuierliche Welle für 20 Minuten (Frequenz: 20 Hz; Intensität: 1 mA) lieferte. Die TEAP+SDD-Gruppenratten unterzogen sich täglich nach der ersten SDD-Kurve einer TEAP-Untersuchung. Die abschließende TEAP-Stimulation wurde vor der intraperitonealen Injektion der OT durchgeführt.
24 Stunden nach der letzten Estradiolbenzoat-Injektion, also am 11. Tag, 1 Stunde nach der letzten intragastrischen Verabreichung, außer in den Blank- und TEAP-Gruppen, erhielten die Ratten in anderen Gruppen 2 U OT pro Ratte mit intraperitonealer Injektion. Die Ratten in der TEAP-Gruppe erhielten nach der abschließenden TEAP-Stimulation eine intraperitoneale Injektion von OT in einer Dosierung von 2 U pro Ratte. Die Ratten in der Blank-Gruppe erhielten keine OT-Injektion. Dieses Protokoll etablierte erfolgreich ein Rattenmodell von QSBSPD. Die gesamte Tierauswahl, die Modellvorbereitung, der Medikamentenverabreichungsplan, die TEAP-Stimulationsparameter und die Orte der Ohrpunkte sind in Abbildung 1 zusammengefasst.
Wright-Giemsa-Flecken
Der östruse Zyklus wurde durch die Wright-Giemsa-Färbung der vaginalen Abstriche bestimmt. Ein steriler Wattestäbchen wurde mit 0,9 % Natriumchloridlösung befeuchtet und vorsichtig 0,5–1,0 cm in den Vaginalkanal eingeführt. Der Abstrich wurde 1–2 Mal gedreht, um vaginale exfoliierte Zellen zu sammeln, und die Probe wurde gleichmäßig in eine Richtung auf einen sauberen Glasträger verteilt. Der Abstrich wurde bei Zimmertemperatur an der Luft getrocknet. Eine Wright-Giemsa-Färbelösung wurde hinzugefügt, um den Fleck zu bedecken, und 5 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde eine gleiche Menge phosphatgepufferte Kochsalzlösung zur Färbungslösung gegeben, und die Färbung wurde weitere 5 Minuten fortgesetzt. Der Objektträger wurde dreimal vorsichtig mit ultrareinem Wasser abgespült, an der Luft getrocknet und unter einem Lichtmikroskop untersucht. Das Stadium des Östruszyklus wurde anhand der dominanten Zelltypen bestimmt, darunter nukleierte Epithelzellen, kornifizierte Epithelzellen und Leukozyten.
Probenentnahme
Die Ratten wurden in eine Anästhesie-Induktionsbox gelegt, wobei die Isoflurankonzentration von 3 % bis 5 % eingestellt war. Nachdem die Ratten das Bewusstsein verloren hatten, wurden sie auf den Operationstisch verlegt und unter Narkose mit Maske gehalten. Die Konzentration wurde auf 1,5 % bis 2,5 % reduziert. Das Bauchfell der Ratte wurde mit einer Schere geschnitten und anschließend mit einer topischen Anwendung von Alkohol desinfiziert. Ein Schnitt von 2–3 cm wurde entlang der mittleren Bauchlinie gemacht. Eine Seite der Gebärmutter sowie die Bänder wurden nach außen entfernt, und das Fettgewebe, das an der Gebärmutteroberfläche haftet, wurde entfernt. Das Gebärmuttergewebe wurde dann sorgfältig isoliert. Wenn die Ratte nach der Probenahme noch lebt, wird sie mit CO₂-Erstickung eingeschläfert.
Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung
Gebärmuttergewebe wurde fixiert, in Paraffin eingebettet und mit einer Dicke von 5 μm durchschnitten. Die Abschnitte wurden zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol entwachst. Die Abschnitte wurden dann nacheinander zweimal für jeweils 5 Minuten in absolutem Ethanol rehydriert, gefolgt von jeweils 95 %, 90 %, 80 % und jeweils 5 Minuten 70 % Ethanol. Die Abschnitte wurden in ultrareinem Wasser abgespült. Die Hämatoxylin-Färbung wurde 5 Minuten lang durchgeführt, und die Abschnitte wurden mit Wasser ausgespült, bis kein überschüssiger Farbstoff mehr übrig war. Die Abschnitte wurden für 5 Minuten in phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingetaucht, um sie zu bläuen. Die Abschnitte wurden dann eine Minute lang mit Eosin gefärbt und mit Wasser abgespült. Anschließend wurden die Abschnitte 10 Minuten in 95 % Ethanol und 10 Minuten in absolutem Ethanol dehydriert, 10 Minuten in Xylol gereinigt und mit neutralem Harz montiert. Repräsentative Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop oder einem digitalen Dia-Scanner aufgenommen.
Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)
Frisches Gebärmuttergewebe wurde mit vorgekühltem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung ausgespült, um Restblut zu entfernen. Jede Gewebeprobe wurde gewogen, in kleine Stücke geschnitten und in vorgekühlter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Gewebe-zu-Puffer-Verhältnis von 1:9 homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 5000 × g für 5–10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und das Supernatant wurde für die spätere Analyse gesammelt. Die Werte von IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α und PGE2 wurden mit Ratten-ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Alle Reagenzien und Mikroplattenstreifen wurden vor der Verwendung auf Raumtemperatur ausgeglichen. Standards oder Proben (50 μL) wurden den vorgesehenen Brunnen hinzugefügt. Ein Meerrettichperoxidase-konjugierter Detektionsantikörper (100 μL) wurde jedem Bohrloch außer den Blankbrunnen hinzugefügt, und die Platte wurde versiegelt und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. Die Flüssigkeit wurde entsorgt und jedes Bohrloch fünfmal mit verdünntem Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden 50 μL Substrat A und 50 μL Substrat B zu jedem Brunnen hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C im Dunkeln für 15 Minuten. Anschließend wurde jedem Bohrloch eine Stopplösung (50 μL) zugegeben, und die optische Dichte wurde innerhalb von 15 Minuten mit 450 nm gemessen. Die Probenkonzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.
Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
Die Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz aus dem Gebärmuttergewebe extrahiert. Kurzzeitig wurde das Gewebe in flüssigem Stickstoff gemahlen und 1 ml RNA-Extraktionsreagenz hinzugefügt. Das Lysat wurde 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wurde Chloroform (200 μL) hinzugefügt, und die Mischung wurde 15 Sekunden kräftig geschüttelt, bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert und 12 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Rohr übertragen, sanft mit gleichem Volumen Isopropanol vermischt und bei −20 °C für 15 Minuten inkubiert. Die Proben wurden bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, das Supernatant entsorgt und das RNA-Pellet mit 75 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und in RNase-freiem Wasser aufgelöst. RNA-Konzentration und Reinheit wurden mit einem Mikrovolumenspektrophotometer bestimmt. Genomische DNA wurde entfernt, und cDNA wurde gemäß den Anweisungen des Reverse-Transkriptionsreagens synthetisiert. Für die genomische DNA-Entfernung wurde die Gesamt-RNA mit dem genomischen DNA-Entfernungsreagenz bei 42 °C für 5 Minuten inkubiert und anschließend auf Eis gelegt. Die Reverse-Transkription erfolgte bei 50 °C für 15 Minuten, gefolgt von 75 °C für 5 Minuten, um die Reaktion zu beenden.
Echtzeit-PCR wurde mit einem SYBR Green-basierten qPCR-Mix durchgeführt. Jede 20-μL-Reaktion enthielt 2 μL cDNA, 0,4 μL Forward Primer, 0,4 μL Reverse Primer, 10 μL 2× SYBR qPCR-Mischung und 7,2 μL nukleasefreies Wasser. Der qPCR wurde mit folgendem Fahrradprogramm durchgeführt: 95 °C für 1 Minute; 40 Zyklen mit 95 °C für 20 Sekunden, 56 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 38 Sekunden; gefolgt von der Analyse der Schmelzkurve. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet, und die relative mRNA-Expression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Jede biologische Probe wurde in technischem Dreifach vermessen. Der mittlere CT-Wert der technischen Dreifacharten wurde verwendet, um ΔCt und die relative mRNA-Expression für jede biologische Replikation zu berechnen. Die Primer-Sequenzen sind wie folgt: PPAR-γ2, vorwärts 5′-CGGAAGCCCTTTGGTGACTT-3′ und rückwärts 5′-CTCGATGGGCTTCACGTTCA-3′; COX-2, vorwärts 5′-AACCAGGTGAACTTCGTCTATTAG-3′ und Rückwärts 5′-GGTCGGTTTGATGTCACTGTA-3′; GAPDH, vorwärts 5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′ und rückwärts 5′-GGTGGTCCAGGGTTTTTCTTACTC-3′.
Statistische Analyse
Die Daten wurden mit statistischer Software ausgewertet. Alle quantitativen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Für die qRT-PCR-Analyse wurden zunächst technische Dreifacharten für jede biologische Replikation gemittelt, und eine statistische Analyse erfolgte unter Verwendung der biologischen Replikationswerte. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests, wenn die Daten die Annahmen von Normalität und Homogenität der Varianz erfüllten. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert.