Metabolische Markierung des entstehenden Transkriptoms in der frühen Embryogenese von Xenopus

Zusammenfassung

Wir bieten detaillierte Methoden zur metabolischen Markierung und Reinigung von entstehenden Transkriptomen für die Transkriptomanalyse in frühen Xenopus-Embryonen mit 5-Ethynyl-Uridin (5-EU).

Zusammenfassung

Die frühe Embryogenese erfordert eine neue Transkription zygotischer Gene aus dem zunächst ruhenden zygotischen Genom nach der Befruchtung. Eine große Herausforderung bestand darin, die neuen Transkripte genau zu erkennen und ihren Zeitpunkt der Expression während der zygotischen Genomaktivierung (ZGA) zu bestimmen. Hier bieten wir detaillierte Verfahren zur metabolischen Markierung der entstehenden Transkripte mit 5-Ethynyl-Uridin (5-EU) in frühen Xenopus laevis-Embryonen . Nach der Befruchtung wird 5-EU mikroinjiziert in die Embryonen der 1-Zell-Phase, um die neu transkribierten RNAs während ZGA metabolisch zu markieren. Die entstehenden EU-RNAs werden nach der Biotinylierung durch klickchemie-vermittelte Reaktionen gereinigt, und das entstehende Transkriptom wird mittels Next-Generation-Sequenzierung bestimmt. Wichtig ist, dass diese Methode eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist, die die Charakterisierung schwach aktivierter Gene ermöglicht. Dieser Ansatz bietet somit ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der Gentranskription während der frühen Entwicklung und kann auf andere embryonale Systeme oder Gewebe verallgemeinert werden.

Einleitung

Nach der Befruchtung steht der Embryo unter der Kontrolle mütterlicher Faktoren, die in der Eizelle abgelagert werden, während das zygotische Genom für eine gewisse Zeit transkriptionell still bleibt; Es wird aktiviert, um Hunderte bis Tausende von Genen zu transkribieren, die für die weitere Entwicklung unerlässlich sind, einschließlich der Zellschicksalsspezifikation und Keimschichtbildung 1,2,3,4,5,6. Dieses Phänomen der zygotischen Genomaktivierung (ZGA) während des Übergangs von der Mütter zur Zygotik (MZT) ist bei allen Metazoenarten hoch konserviert, obwohl der Zeitpunkt von ZGA zwischen den Arten 1,2,3,4,5,6 variiert. Das Verständnis, wie ZGA reguliert wird, ist nicht nur wichtig für unser Verständnis der grundlegenden Prinzipien der frühen Entwicklung, sondern bietet auch Potenzial zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Diagnose und Behandlung von Entwicklungsstörungen sowie zur Förderung der reproduktiven Gesundheit.

Eine große Herausforderung bei der Untersuchung von ZGA bestand darin, neue Transkripte genau zu erkennen und deren Anfangszeit während der zygotischen Genomaktivierung (ZGA) zu bestimmen. Aufgrund der Überwiegung mütterlicher Transkripte in frühen Embryonen⁷ können die hohen Konzentrationen dieser Transkripte den Nachweis neuer Transkripte während ZGA überdecken, insbesondere bei schwach aktivierten Genen, unter Verwendung konventioneller Bulk-RNA-Seq. Um diese Herausforderung zu meistern, entwickelten wir eine Methode zur Messung des entstehenden Transkriptoms durch metabolische Markierung der entstehenden Transkripte mit 5-Ethynyl-Uridin (5-EU), gefolgt von der Biotinylierung der entstehenden EU-RNAs mittels Klickchemie und deren Reinigung für die Sequenzierung (EU-RNA-seq)^8,9,10. Im Vergleich zu anderen Methoden der entstehenden Transkriptprofilierung, wie etwa denen mit 4-Thiouridin (4sU)^11,12, ist die 5-EU-Kennzeichnung hochspezifisch mittels Klickchemie, kann sowohl für Bildgebung als auch Sequenzierung verwendet werden und erfordert keine chemische Umwandlung. Darüber hinaus ist das entstehende EU-RNA-seq hochsensitiv und detektiert Hunderte von Genen, deren Aktivierung durch das konventionelle Bulk-RNA-seq⁸ nicht nachgewiesen werden kann. Dieser Ansatz ermöglichte es uns auch, den Beginn der individuellen zygotischen Genaktivierung genau zu bestimmen und die unterschiedlichen raumzeitlichen Muster von ZGA während der frühen Embryogenese⁸ zu profilieren.

Hier beschreiben wir die detaillierten Verfahren zur Vorbereitung von Proben für die EU-RNA-seq, um das entstehende Transkriptom unter Verwendung von frühen Embryonen von Xenopus laevis als Modell zu profilieren. Dieses Protokoll basiert auf einer früheren Methode^10,13 mit geringfügigen Optimierungen in den Verfahren, darunter die Mikroinjektion von 5-EU in die Embryonen der 1-Zell-Phase, die Biotinylierung entstehender EU-RNAs durch Klickreaktion und deren Reinigung für die Sequenzierung (Abbildung 1). Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, sollten je nach Stadien früher Embryonen mit unterschiedlicher Häufigkeit entstehender Transkripte 1–10 μg Gesamt-RNA als Eingabe verwendet werden, wobei dennoch eine geringere Menge verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann auch in anderen embryonalen Systemen angewandt werden, wie Drosophila¹⁴ und Zebrafish¹⁵ sowie in anderen Geweben¹³. Diese Methode ist ein kraftvolles Werkzeug für unser Verständnis von Gentranskription und regulatorischen Mechanismen in verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich der Aufdeckung neuer Prinzipien der frühen Embryogenese.

Protokoll

Die in dieser Studie beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Carolina genehmigt. Laborsicherheit und Abfallentsorgung sollten den institutionellen Vorschriften entsprechen.

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern

1. 20x MMR (Marc's Modified Ringer) Lösung: Mischen Sie 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl₂ und 40 mM CaCl₂. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
2. 3 % Ficoll (mit Spannung) / 0,5x MMR: Langsam 1,5 g Ficoll 400 in 50 ml 0,5x MMR geben, während Sie vorsichtig mit einer magnetischen Rührstange rühren, bis das Ficoll vollständig gelöst ist. Autoklaven halten und bis zur Nutzung bei 4 °C halten.
3. 5-Ethynyl-Uridin (5-EU) Serienlösung: Um die 50-mM-Lagerlösung herzustellen, fügen Sie 372,8 μL Puffer (beachten Sie, dass jeder mit Mikroinjektion kompatible Puffer verwendet werden kann, z. B. 1x Esse, pH 7,6) in das 5-mg-Fläschchen. Gut mischen und 2 μL-Aliquoten herstellen. Bei -80 °C lagern.

2. Mikroinjektion von 5-EU in 1-Zell-Embryonen

1. Um Xenopus-Embryonen zu erhalten, folgen Sie Standardprotokollen für die Durchführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) (siehe z. B. Sive et al., 2007)¹⁶). Der Embryo sollte im 0,1x MMR sein und einsatzbereit sein.
2. Fügen Sie 1 ml 3 % Ficoll/0,5x MMR in eine Mikroinjektionskammer aus einem Standardglas-Schlitten (25 mm x 75 mm) hinzu. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 20 (oder mehr Embryonen bei Bedarf) in die Mitte der Mikroinjektionskammer zu bringen.
3. Schneide mit einer feinen Pinzette vorsichtig die sehr dünne Spitze der Glasnadel ab und stecke die Nadel vertikal (mit der Spitze nach unten) gegen die Modellierplatte an der Werkbankwand. Verwenden Sie die P2-Pipette mit der Spitze des Microloaders, um 0,5 μL 50 mM 5-EU von der Glasnadel zu geben.
4. Setze die Nadel auf einen Mikromanipulator zusammen. Verwenden Sie die P10-Pipette, um 10 μL Halokarbonöl auf ein Stufenmikrometer zu geben und unter ein Stereomikroskop zu legen.
5. Um das Injektionsvolumen zu kalibrieren, drücken Sie zuerst mit dem Fuß das Polster auf den mit dem Mikroinjektoren verbundenen Boden und injizieren Sie einen Tropfen in das Halokarbonöl des Mikrometers. Je nach Tröpfchengröße wird der Druck und die Einspritzzeit des Mikroinjektors angepasst, um das Einspritzvolumen von 10 nL, also 0,27 mm im Durchmesser des Mikrometers, zu bestimmen.
6. Verwenden Sie in einer Hand eine Pinzette, um den Embryo zu halten, mit der anderen Hand den Mikromanipulator und injizieren Sie 10 nL 50 mM EU in Embryonen im 1-Zell-Stadium. Die Endkonzentration von 5-EU im Embryo beträgt ~0,5 mM.
7. Nach der Mikroinjektion verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Embryonen aus der Injektionskammer in eine neue Glasschale mit 3 % Ficoll/0,5x MMR zu übertragen. Bewahren Sie die injizierten Embryonen für ~1 Stunde in Ficoll auf.
8. Entferne vorsichtig die Ficoll-Lösung und ersetze das Medium durch 0,1x MMR. Embryonen in 0,1x MMR bis zur weiteren Anwendung aufbewahren. Überwachen Sie ständig die Entwicklung der Embryonen und entfernen Sie bei Bedarf alle abnormalen Embryonen.
9. Wenn die Embryonen die gewünschten Entwicklungsstadien erreicht haben, verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 10 Embryonen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr zu transferieren. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um vorsichtig eventuelle Restmedien im Schlauch zu entfernen, und frieren Sie die Embryonen mit flüssigem Stickstoff ein.
   Hinweis: Um die Strenge und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, entnehmen Sie nur die Embryonen, die aufgrund ihres Aussehens im Vergleich zur Kontrolle normal sind. Entfernen und schließen Sie alle abnormalen Embryonen aus der weiteren Analyse aus. Falls nötig, entnehmen Sie auch die gleiche Anzahl von Embryonen ohne Mikroinjektion wie bei negativen Kontrollen.
10. Bewahren Sie die Embryonen bis zur weiteren Verwendung in einem -80 °C Gefrierfach auf.

3. Totale RNA-Extraktion und Konzentrationsmessung

HINWEIS: Verwenden Sie ein auf Siliziummembran basierendes Total-RNA-Extraktions-Kit zur Isolierung der Gesamt-RNAs aus frühen Embryonen sowie ein fluoreszenzbasiertes RNA-Quantifizierungskit mit hoher Sensitivität zur Bestimmung der RNA-Konzentrationen. Folgen Sie den Anweisungen des Bausatzes, und die folgenden Schritte sind leicht gegenüber dem Handbuch angepasst. Alle Lösungen und Reagenzien, die in den folgenden Schritten verwendet werden, sollten frei von RNase sein.

1. Stellen Sie die Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank auf Eis.
2. Fügen Sie 700 μL des Puffer-RLT aus dem RNA-Extraktionskit in jedes Rohr hinzu. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um mindestens 15 Mal auf und ab zu pipetten, bis alle Embryonen aufgelöst sind.
3. Lass die Proben 20 Minuten auf Eis. Rühren Sie vorsichtig erneut, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipetten, um die Embryonen vollständig zu homogenisieren.
4. Fügen Sie 700 μL 70 % Ethanol zu den homogenisierten Embryonen hinzu. Pipette hoch und runter, um gut zu mischen, und übertrage die 700 μL des Gemisch in eine Spin-Säule.
5. Zentrifugiere die Säule bei 10.000 x g für 1 Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie die Zentrifuge, bis der Rest der Mischung vollständig ist.
6. Fügen Sie 350 μL des Puffers RW1 hinzu und zentrifugieren Sie die Säule mit 10.000 x g für 1 Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss.
7. Fügen Sie vorsichtig 80 μL DNase I in die Mitte der Membran in der Säule hinzu. Inkubiere 15 Minuten bei Zimmertemperatur.
8. Fügen Sie 350 μL Buffer RW1 hinzu und zentrifugieren Sie die Säule bei 10.000 x g für 1 Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss.
9. Fügen Sie 500 μL Puffer-RPE hinzu und zentrifugieren Sie die Säule bei 10.000 x g für 1 Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss. Wiederhole die Wäsche noch einmal.
10. Trockne die Säule, indem du sie erneut bei 10.000 x g für 2 Minuten zentrifugierst.
11. Übertragen Sie die Säule in ein neues, RNase-freies Rohr. Fügen Sie vorsichtig 35 μL RNase-freies H₂O in die Mitte der Membran in der Säule hinzu.
12. Zentrifugiere die Säule bei 10.000 x g für 1 Minute. Sammle die eluierte RNA und lasse sie auf Eis.
13. Um die RNA-Konzentration zu messen, bereitet man zunächst die Arbeitslösung mit dem RNA-Quantifizierungskit vor, indem das RNA-Reagenz (Farbstoff) bei 1:200 im RNA-Puffer verdünnt wird. Berechnen Sie das Gesamtvolumen der Arbeitslösung abhängig von der Gesamtzahl der Standards und bereiten Sie für jeden Standard oder jede Probe 200 μL vor.
14. Richte einen 0,2-mL 8-Rohr-Streifen ein. Um jeden Standard zu verdünnen, fügen Sie 10 μL zu 190 μL der Arbeitslösung hinzu. Um jede Probe zu verdünnen, fügen Sie 1 μL zu 199 μL der Arbeitslösung hinzu. Gut mischen.
15. Setze den 8-Röhrenstreifen in ein Fluorometer. Wählen Sie den RNA-Assay aus, kalibrieren Sie mit den Standards und lesen Sie die Konzentrationen der Proben ab.

4. Entstehende EU-RNA-Biotinylierung und -Reinigung

HINWEIS: Ein auf Klick-Chemie basierendes naszentes RNA-Capture-Kit wird verwendet, um die entstehenden EU-RNAs zu biotinylieren und herunterzuziehen. Befolgen Sie die Anweisungen des Kits, und die folgenden Schritte werden leicht angepasst. RNAs aus nicht injizierten Embryonen sowie EU-RNAs ohne Biotinylierung können als Hintergrundkontrollen für die Pulldown-Spezifität dienen.

1. RNA-Biotinylierung und -reinigung
   1. Für jede Probe werden folgende Komponenten in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gemischt, um eine 50-μL-Klickreaktion zu erzeugen: Gesamt-RNA (1–10 μg), 1x EU-Puffer, 2 mM CuSO₄, 0,25 mM Biotinazid, 10 mM Additiv 1 und 12 mM Additiv 2.
   2. Inkubiere die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 30 Minuten auf einem Nutator.
   3. Bei jeder oben genannten Reaktion werden 1 μL Glykogen, 50 μL 7,5 M Ammoniumacetat und 700 μL gekühltes 100 % Ethanol hinzugefügt. Pipette fünfmal hoch und runter, um sie gut zu mischen.
   4. Stelle die Tube in einen Gefrierfach bei -80 °C und bewahre sie über Nacht auf.
   5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 13.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Überdachungsmittel, ohne das Pellet zu stören.
   6. Fügen Sie 700 μL 75%-Ethanol hinzu und mischen Sie das Pellet vorsichtig wieder. Zentrifugiere das Rohr bei 13.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Überdachungsmittel, ohne das Pellet zu stören. Wiederhole die Wäsche noch einmal.
   7. Lassen Sie das Pellet 5–10 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen. Das Pellet wird in 10 μL RNase-freiem H2_{O wieder}suspendiert.
2. EU-RNA-Reinigung
   1. Um die entstehenden EU-RNAs herunterzuziehen, geben Sie für jede Probe 5 μL streptavidinbeschichtete magnetische Perlen in einer neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhre ab.
   2. Gib 9 μL Wash Buffer 2 dazu. Gut mischen und das Rohr auf ein magnetisches Rack setzen. Lass es 2 Minuten stehen. Entferne das Überwasser. Wiederhole das Waschen noch zweimal. Die Perlen in 5 μL Wash Buffer 2 wieder suspendieren.
   3. Bereiten Sie folgende Mastermischung in einem neuen 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr (15 μL pro Probe) vor: 12,5 μL RNA-Bindungspuffer (Komponente G), 0,2 μL 1:10 verdünntes RNase-OUT und 2,3 μL RNase-freies H2-O_.Fügen Sie 15 μL der Mischung zu jedem Rohr mit der RNA-Probe hinzu.
   4. Inkubiere 5 Minuten auf einem Heizblock bei 69 °C. Leg das Rohr auf Eis.
   5. Fügen Sie 5 μL der oben genannten vorgewaschenen Perlen zu jedem Röhrchen mit der RNA-Probe hinzu. Brüte 30 Minuten auf einem Nutator bei Zimmertemperatur.
   6. Füge 50 μL Wash Buffer 1 hinzu. Gut mischen und das Rohr auf ein magnetisches Rack setzen. Lass es 2 Minuten stehen. Entferne das Überwasser. Wiederhole das Waschen noch einmal viermal.
      Hinweis: Der Supernatant nach der ersten Wasch, der vermutlich nur die mütterlichen Transkripte enthält, kann zur Messung des mütterlichen Transkriptoms gesammelt werden.
   7. Füge 50 μL Wash Buffer 2 hinzu. Gut mischen und das Rohr auf ein magnetisches Rack setzen. Lass es 2 Minuten stehen. Entferne das Überwasser. Wiederhole das Waschen noch einmal viermal.
   8. Die Perlen in 5 μL Wash Buffer 2 wieder suspendieren. Die Perlen, die die entstehenden EU-RNAs enthalten, sind bereit für die direkte cDNA-Synthese und Bibliotheksvorbereitung.
      Hinweis: Bevor mit der Bibliotheksvorbereitung begonnen wird, kann die Anreicherung junger Transkripte durch Messung der Expression bekannter einzelner Gene mittels Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bewertet werden.

5. RNA-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung

1. Verwenden Sie kommerziell erhältliche Kits, um die cDNA-Bibliotheken vorzubereiten, und folgen Sie den Anweisungen des Kits. Nutze das NEBNext Library Quant Kit für Illumina, um die Bibliotheken zu quantifizieren und zusammenzufassen.
2. Sammeln Sie die Bibliotheken nach den Anweisungen der häufig verwendeten Next-Gen-Sequenzierungskits. Verdünnen Sie die Bibliotheken auf ~1,8 pM, bevor Sie sie in den Benchtop-Sequencer laden, um während der Sequenzierung eine optimale Clusterdichte von ~200 k/mm² zu erreichen. Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit der häufig verwendeten Next-Generation-Sequenzierung. Verwendete gepaarte 75-bp-Sequenzierung für ~20 Millionen Lesevorgänge pro Probe.
3. Quantifizieren Sie die transkriptomischen Lesungen, indem Sie die Sequenzen mit dem Xenopus laevis-Genom ausrichten, Build 9.2 mit Lachs¹⁷ , und führen Sie eine differenzielle Genexpressionsanalyse mit DESeq2¹⁸ durch. Um die Peaks im Genombrowser zu visualisieren, werden die Sequenzen mit STAR¹⁹ auf das Genom abgebildet und im Integrative Genomics Viewer (IGV)¹⁹ angezeigt.

Ergebnisse

Xenopus laevis-Embryonen (vier biologische Replikate) in den Stadien 5 bis 9 Stunden nach der Befruchtung (HPF) bei 22 °C, was die Stadien von Stadium 5 (mit wenig groß angelegtem ZGA) bis Stadium 9 (mit hohem ZGA) umfasst, wurden nach dem oben^{genannten Protokoll 8} verarbeitet. Die Gesamt-RNAs, die gereinigten entstehenden EU-RNAs und die Durchfluss-RNAs wurden zur Vorbereitung der Bibliotheken verwendet und sequenziert. Wie in Abbild...

Diskussion

Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur metabolischen Markierung des entstehenden Transkriptoms in der frühen Embryogenese bereitgestellt, einschließlich der Mikroinjektion des 5-EU in 1-Zell-Embryonen, der Extraktion von Gesamt-RNAs und der Messung ihrer Konzentrationen sowie der Biotinylierung und Reinigung der entstehenden EU-RNAs zur Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung (EU-RNA-Seq) (Abbildung 1). Aufgrund der hohen Sensitivität und Spezifit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
&Mikro; PUPM Mikroinjektor	Weltpräzisionsinstrumente	UPUMP	Für Mikroinjektion (Mikroinjektion mit Druck)
5-Ehtynyl Uridin	Thermo Fisher Scientific	E10345	Für Mikroinjektion (Kennzeichnung junger Traqnskripte)
ACCU-SCOPE 3075 Zoom-Stereomikroskope	VWR	470351-130	Für Mikroinjektion (Embryonenvisualisierung)
Ammoniumacetat	Sigma-Aldrich	A2706	Für RNA-Präzipitation
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A7506	Für Klickreaktion
Kapillaren aus Borosilikatglas	Weltpräzisionsinstrumente	TW100-4	Für Mikroinjektion (Herstellung von Glasnadeln)
Zentrifuge	Eppendorf	5425R	Für Zentrifugen
Click-iT Nascent RNA Capture Kit	Thermo Fisher Scientific	C10365	Zur Biotinylierung und Reinigung junger RNA
CuSO4	Sigma-Aldrich	61230	Für Klickreaktion
DNase I	Roche Diagnostics	4716728001	Für RNA-Extraktion
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	GE17-0300-10	Für Mikroinjektionen (Embryonenbrüte)
Glas-Petrischale (60 mm)	VWR	75845-542	Zur Befruchtung
Glykogen	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Für RNA-Präzipitation
Halocarbonöl 27	Sigma-Aldrich	H8773	Für Mikroinjektion (Kalibrierung des Einspritzvolumens)
L-Cystein	Sigma-Aldrich	168149	Für das Ent-Jellyen von Embryonen
Microloader-Spitzen	Kaliber wissenschaftlich	EPE-5242956003	Für Mikroinjektion (Laden von 5-EU in die Glasnadel)
NEBNext Library Quant Kit für Illumina	NEB	E7630	Zur Quantifizierung von Bibliotheken
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)	Illumina	20024906	Für die Sequenzierung
Qubi Flex Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33327	Zur Messung der RNA-Konzentration
Qubit-RNA-HS-Bindungskit	Thermo Fisher Scientific	Q32852	Zur Messung der RNA-Konzentration
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Für RNA-Extraktion
Stufenmikrometer	Wards Wissenschaft	470175-914	Für Mikroinjektion (Kalibrierung des Einspritzvolumens)
Universal RNA-Seq mit NuQuant	NuGEN	0364	Zur Bibliotheksvorbereitung