Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Zusammenfassung

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung vorzeitiger Alterung bei HNM mittels tBHP, standardisierte Protokolle zur Analyse wichtiger Senezenzmarker, einschließlich Wachstumsstillstand, SA-β-Galaktosidase-Aktivität und SASP-Faktoren.

Zusammenfassung

Umweltbelastungen wie UV-Strahlung, Luftverschmutzung oder Zigarettenrauch, treiben die Hautalterung der äußeren Haut voran. Die Exposition gegenüber diesen extrinsischen Alterungsfaktoren fördert die Ansammlung von seneszenten Zellen, was zur Bildung von Falten und Pigmentstörungen beiträgt. Melanozyten, die primären UV-Schutz bieten, zeigen mit zunehmendem Alter eine verminderte Aktivität. Seneszente Melanozyten sammeln sich in gealterter Haut an und tragen zu ihrem alternden Erscheinungsbild bei; Es gibt jedoch nur wenige Modelle zur Untersuchung der Melanozyten-Senezzenz, und diese Arbeit zielt darauf ab, ein reproduzierbares Modell für weitere Forschung zu entwickeln. In dieser Studie präsentieren wir ein Altersmodell menschlicher neonataler Melanozyten (HNM) unter Verwendung von tert-butylhydroperoxid (tBHP), einem gut charakterisierten oxidativen Stressauslöser. tBHP stört die Redoxhomöostase, indem es zelluläre Antioxidanzabwehr abbaut und eine radikale Überproduktion fördert, was zu DNA- und Proteinschäden führt. Wir charakterisieren den Altersphänotyp von mit tBHP behandelten Melanozyten durch die Analyse etablierter Altersmarker, einschließlich eingeschränktem Wachstumspotenzial, morphologischen Veränderungen und SA-β-Galactosidase-Aktivität. Dieses Modell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung stressbedingter vorzeitiger Alterung in Melanozyten und gibt Einblicke in ihre Rolle bei extrinsischer Hautalterung und Pigmentstörungen.

Einleitung

Hautalterung besteht aus zwei unterschiedlichen Faktoren: intrinsischer und extrinsischer Alterung ^1,2. Intrinsisches Altern wird durch natürliche chronologische Prozesse und genetische Faktoren verursacht, während extrinsisches Altern durch kumulative Exposition gegenüber Umweltstressoren, hauptsächlich ultravioletter Strahlung, aber auch Luftverschmutzung, Zigarettenrauch und chemischen Stoffen verursacht wird, die den Alterungsprozess über normale chronologische Raten hinaus beschleunigen ^3,4. Umweltbelastungen erzeugen oxidativen Stress, der die zellulären Antioxidativabwehrmechanismen überfordert, was zu DNA-Schäden, Proteinoxidation und Lipidperoxidation führt. Diese molekularen Veränderungen lösen anhaltende DNA-Schadensreaktionen und Zelldysfunktion aus, was letztlich eine vorzeitige Alterung^begünstigt. Diese stressinduzierte Alterung trägt zu den klinischen Merkmalen gealterter Haut bei, darunter Falten, ungleichmäßige Pigmentierung, verminderte Elastizität und beeinträchtigte Barrierefunktion⁷.

Melanozyten befinden sich in der basalen Epidermis und dienen als primäre Abwehr der Haut gegen UV-induzierte Schäden, indem sie Melanin synthetisieren und es an umliegende Keratinozyten übertragen. Paradoxerweise macht diese schützende Rolle sie besonders anfällig für oxidativen Stress und vorzeitige Alterung während des extrinsischen Alterns ^8,9. Der Melanogeneseprozess selbst erzeugt erhebliche reaktive Sauerstoffspezies als Nebenprodukte von tyrosinase-katalisierten Reaktionen, was eine inhärente oxidative Belastung erzeugt, die durch Umweltbelastungen wie UV-Strahlung und Verschmutzung^weiter verstärkt ^wird. Infolgedessen kann chronischer Umweltstress oxidative Schäden, mitochondriale Dysfunktion und letztlich die zelluläre Seneszenz¹² verursachen. Trotz ihrer Bedeutung bleiben zentrale Fragen zu den molekularen Wegen, die die Melanozyten-Seneszenz steuern, und wie oxidativer Stress diesen Prozess auslöst. Darüber hinaus ist der Einfluss von seneszenten Melanozyten auf die umgebende Hautmikroumgebung als Treiber altersbedingter Hautveränderungen, insbesondere durch die Freisetzung von SASP-Faktoren, weiterhin unzureichend verstanden^13,14.

Obwohl Melanozyten besonders anfällig für durch oxidativen Stress induzierte Seneszenz sind, bleiben experimentelle Modelle zur Untersuchung dieses Prozesses^{begrenzt: 15,16}. Die meisten Senezenzforschungen basieren weiterhin auf replikativen oder stressinduzierten Senezenzmodellen in Fibroblasten, aber diese Ansätze erfassen weder die eigenständige Biologie der Melanozyten noch ihr Potenzial, die Hautalterung durch Kreuzgespräche mit benachbarten Zellen und ihr eigenes SASP-Profil¹⁷ zu beeinflussen. Diese Lücke unterstreicht den Bedarf an melanozytenspezifischen Altersmodellen, die ihre physiologischen Reaktionen auf Umweltstressoren genauer widerspiegeln^18,19 und ihren Beitrag zur Hautalterung der Menschheit.

Trotz der Verfügbarkeit stressinduzierter Altersansätze bleibt deren Umsetzung in primären menschlichen Melanozyten technisch anspruchsvoll und oft mit erheblicher Variabilität verbunden. Melanozyten sind besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress, was zu einem engen experimentellen Zeitfenster zwischen effektiver Senezenzinduktion und übermäßiger Zytotoxizität führt. Darüber hinaus tragen donorabhängige Unterschiede in primären Zellpräparaten zusätzlich zu inkonsistenten Ergebnissen zwischen den Studien bei. Diese Herausforderungen werden häufig unterberichtet, und Protokolle sind oft unzureichend standardisiert, was die Reproduzierbarkeit einschränkt. Das vorliegende Protokoll schließt diese Lücke, indem es ein optimiertes und reproduzierbares Behandlungsregime, einen definierten Dosierungsplan und standardisierte Anzeigen für eine zuverlässige Einleitung und Beurteilung der Alterung in primären menschlichen Melanozyten bereitstellt.

Tert-Butylhydroperoxid (tBHP) ist ein gut charakterisierter Auslöser von oxidativem Stress, der die Alterung fördert, indem er reaktive Sauerstoffspezies erzeugt und die zelluläre Antioxidativabwehr schwächt. Es wurde häufig eingesetzt, um die Alterung bei dermalen Fibroblasten zu induzieren, wobei es charakteristische Altersmarker auslöst und gleichzeitig die Zelllebensfähigkeit^{aufrechterhält.} Da tBHP durch definierte biochemische Wege anhaltenden oxidativen Stress erzeugt, bietet es ein reproduzierbares und zugängliches System zur Untersuchung der durch oxidativen Stress induzierten Seneszenz und zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die oxidative Schäden mit Alterungsprozessen verknüpfen^22,23. Im Gegensatz zu UV-basierten Modellen ist tBHP besonders vorteilhaft, wenn eine kontrollierte, reproduzierbare Induktion von oxidativem Stress unabhängig von Bestrahlungsparametern und ohne Spezialausrüstung erforderlich ist.

HNM bietet ein relevantes Modell zur Untersuchung extrinsischer Alterungsmechanismen²⁴. Als primäre Zellen, die von der Vorhaut abstammen, behalten sie intakte Stress-Reaktionswege und vermeiden Artefakte, die mit genetischer Modifikation oder Unsterblichkeit verbunden sind²⁵. Neonatale Melanozyten bieten ein optimales experimentelles Modell, da sie minimale Basisschäden aufweisen, was eine klare Bewertung der durch Umweltstressoren induzierten Alterswege ermöglicht^26,27.

Diese Studie verwendet tBHP-induzierten oxidativen Stress in primären menschlichen neonatalen Melanozyten und überwindet damit die Einschränkungen nicht-melanozytischer und unsterblicher Zellmodelle, die häufig in der Altersforschung verwendet werden. Es bietet eine standardisierte Plattform zur Untersuchung melanozytenspezifischer Altersmechanismen und zur Charakterisierung des seneszenten Phänotyps anhand etablierter Marker. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein reproduzierbares, physiologisch relevantes Modell zur Untersuchung der durch oxidativen Stress induzierten Seneszenz in Melanozyten.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde für die Forschung an primären menschlichen neonatalen Melanozyten (HNM) optimiert, um die Mechanismen der stressinduzierten vorzeitigen Alterung durch tBHP zu untersuchen (Abbildung 1). Die Melanozyten stammen aus der neonatalen kaukasischen Vorhaut (Lichtpigmentierung, Phototyp) und wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen. Laut der Dokumentation des Lieferanten werden menschliches Gewebe von Spendern gesammelt, die vollständig informiert sind und ihre Zustimmung erteilt haben, im Einklang mit festgelegten ethischen und rechtlichen Rahmenbedingungen, einschließlich der Erklärung von Helsinki und den geltenden Datenschutzbestimmungen. Die Zellen wurden in einer de-identifizierten Form bereitgestellt. Für ihre Verwendung in dieser Studie war keine zusätzliche ethische Genehmigung erforderlich. Alle Experimente wurden mit derselben Melanozytenlinie durchgeführt, um eine Konsistenz sicherzustellen. Beachten Sie, dass bei Verwendung verschiedener Primärzelllinien die Kulturbedingungen sowie Konzentrationen und Handhabungsverfahren möglicherweise weiter angepasst werden müssen.

1. Vorbereitungen

HINWEIS: Um die tBHP-Behandlung einzuleiten, müssen Melanozyten mindestens drei Tage im Voraus aufgetaut werden, um eine ausreichende Erholung und Konfluenz zu ermöglichen. Die Behandlungsphase dauert 4 Tage, wobei der Aussaattag als Tag 0 bezeichnet wird. Details aller in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Um das Kulturmedium vorzubereiten, kombinieren Sie das Melanozyten-Basalmedium mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren. Zünden Sie den Deckel jedes Fläschchens an, bevor Sie den Inhalt ins Medium geben, um die Verunreinigung zu minimieren. Gib 1 % (v/v) PenStrep zum vorbereiteten Medium und lagere es bis zur Anwendung bei 4 °C.
2. Vor der Aussaat bereiten Sie die Trypsininhibitorlösung vor, indem Sie den Sojabohnen-Trypsininhibitor in DPBS verdünnen. Filtern Sie die Lösung durch eine 0,22 μm Membran, aliquot, und lagern Sie bei −20 °C. Nach dem Auftauen kann es bis zu 10 Tage verwendet werden.

2. Zellauftauen (Tag -3)

VORSICHT: Alle Materialien, die mit menschlichen Zellen in Kontakt stehen, sollten als biologisch kontaminiert gelten und gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien entsorgt werden. Zur Beurteilung der Seneszenz verwenden wir komplementäre Assays, die den Wachstumsstopp, die SA-β-gal-Aktivität und zusätzliche molekulare Marker bewerten. Hier stellen wir die Protokolle für diese Tests und die erwarteten Ergebnisse bei der Arbeit mit diesen Altersindikatoren vor.

1. Pipette 20 ml Dulbeccos Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (Zellkulturqualität) in ein 50 mL konisches Rohr bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Zellen mit dem Fläschchen bis zum Auftauen auf Eis.
2. Zünden Sie den Deckel vor dem Öffnen des Fläschchens mit den Zellen, schrauben Sie die Seiten ab und zünden Sie erneut an, um eine mögliche Kontamination zu verhindern.
3. Übertragen Sie 500 μL DPBS in das Fläschchen mit den Zellen. Lassen Sie die Zellen vorsichtig auftauen, indem Sie sie auf und ab pipetten, und übertragen Sie dann den gesamten Inhalt in das Rohr.
4. Zentrifugiere bei 100 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Das resultierende Pellet sollte beige bis bräunlich erscheinen (oder je nach ethnischer Herkunft des Spenders).
5. Bereiten Sie eine T75-Flasche mit 14 ml Melanozytenmedium vor.
6. Zünden Sie eine Glas-Pasteur-Pipette (jedes Mal bei der Handhabung von Melanozyten), saugen Sie vorsichtig die DPBS ab und suspendieren Sie die Kugel in 1 ml Medium.
7. Auf die zuvor vorbereitete Flasche übertragen.
8. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂, und beobachten Sie täglich unter dem Mikroskop. Wechsle das Medium mindestens alle 48 Stunden.
   HINWEIS: Jedes kryokonservierte Fläschchen enthält etwa 1 × 10^{6 primäre} menschliche Melanozyten. Alle Experimente wurden mit Zellen an Passage 9 durchgeführt.

3. Zell-Seeding (Tag 0)

1. Achten Sie auf eine Zusammenführung von 80–90 % der Zellen am Aussaattag.
2. Sauge das Medium aus der Flasche und wasche zweimal mit DPBS.
3. Abkoppeln Sie die Zellen, indem Sie 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und 5 Minuten bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
4. Klopfen Sie vorsichtig auf die Flasche und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop, um die vollständige Zellablösung zu bestätigen (inkubieren Sie bei Bedarf länger).
5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das 1,5-fache des Volumens des Trypsininhibitors hinzufügen.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und verdünnen Sie mit DPBS auf ein Endvolumen von 10 mL.
7. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 × g für 5 Minuten.
8. Aspirieren Sie das Überlagerungsmittel und suspendieren Sie es auf das gewünschte Volumen im Medium.
9. Für mit tBHP behandelte Platten sollten 6 × 10^{5 Zellen pro} 10 cm Schüssel gesät werden. Für Kontrollplatten solltest du 4 × 10 bis⁵ Zellen pro Platte aussäen.
   HINWEIS: Für mit tBHP behandelte Platten sollte eine höhere Zelldichte ausgesät werden, um sicherzustellen, dass genügend Zellen für die Experimente verfügbar sind, da ihre Wachstumsrate während der Behandlung schrittweise abnimmt. Beim Aussäen von Zellen auf Deckblättern für Mikroskopieexperimente müssen diese mit 0,1 mg/mL Poly-D-lysin beschichtet und vor der Zellaussaat vollständig getrocknet werden.
10. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren. Wechsle das Medium alle 48 Stunden für die Steuerplatten.

4. tBHP-Behandlung (Tag 1–4)

1. Bereiten Sie eine 10 mM Arbeitslösung aus tBHP-Material vor (verdünnt in DPBS oder Medium).
   HINWEIS: tBHP ist lichtempfindlich: Decke den Behälter beim Arbeiten ab. Die Arbeitslösung kann bis zu einer Woche verwendet werden, wenn sie richtig bei 4 °C gelagert wird. Behandlungsplan: Tag 1 (der Tag nach der Aussaat) markiert den Beginn der tBHP-Exposition. Melanozyten werden zweimal täglich behandelt, mit mindestens 4 Stunden Abstand zwischen den Anwendungen. Dieses Regime wird von Tag 1 bis Tag 4 wiederholt, insgesamt 4 Tage Behandlung. Die ausgewählte tBHP-Konzentration und der Behandlungsplan wurden aus früheren Arbeiten an dermalen Fibroblasten angepasst, bei denen niedrigere Konzentrationen ausreichten, um die Seneszenz zu induzieren. In primären Melanozyten waren jedoch höhere Konzentrationen erforderlich, um eine robuste Senezenzinduktion zu erreichen, und 100 μM tBHP wurden aufgrund von Titrationsexperimenten, die die Senezenzinduktion und die Zelllebensfähigkeit ausbalancierten, als optimal identifiziert
2. Fügen Sie 100 μM tBHP pro Behandlung 1 Stunde pro Behandlung zu den Zellen hinzu (Zum Einleitung fügen Sie das passende Volumen der Arbeitslösung hinzu und passen Sie darauf, in das flüssige Medium zu pipetten).
3. Bewegt den Teller hin und her und von einer Seite zur anderen, um die TP gleichmäßig über das Medium zu verteilen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie kreisförmige Bewegungen, da dies zu einer ungleichmäßigen Verteilung von tBHP im Medium führen kann.
4. Inkubieren Sie genau 1 Stunde bei 37 °C mit 5 % CO₂.
5. Um die tBHP-Behandlung zu beenden, aspirieren Sie das Medium.
6. Waschen Sie die Teller zweimal mit vorgeheiztem DPBS (37 °C).
7. Fügen Sie den Tellern das passende Volumen frisches Medium hinzu.
8. Lassen Sie die Zellen mindestens 4 Stunden im Inkubator erholen, bevor die nächste Behandlung beginnt.
9. Wiederholen Sie dieses Verfahren am selben Tag für die zweite Behandlung und setzen Sie das für die restlichen Tage fort. Die Zellen werden nach Abschluss der Behandlung bis Tag 9 in Kultur gelassen, um die Altersmarker zu beurteilen.
10. Kontrollplatten und Passage überwachen, falls sie zusammenfließen.

5. Wachstumskurvenanalyse

1. Zählen Sie tBHP-behandelte Zellen und Kontrollgruppen nach dem Aussaatprotokoll.
2. Säe die gleiche Anfangsdichte oder alle Zellen neu aus, falls du weniger als die 6 × 10⁵ Zellen für tBHP-Platten zählst.
3. Führe Zellzählungen an den Tagen 4, 9 und 15 der Kultur durch.
4. Berechnen Sie die Wachstumskurve mit folgender Formel:
   lg (Zählung) - Log (Seed) / 0,301 + cPDL
   Anzahl: Anzahl der am Ende des Durchgangs erhaltenen Zellen.
   Samen: Anzahl der Zellen, die zu Beginn des Durchgangs zunächst plattiert wurden.
   cPDL: kumulative Populationsverdoppelung, übernommen aus früheren Durchgängen.

6. SA-β-Galaktosidase-Aktivität

1. Am 9. Tag Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, bevor Sie mit 2 % Formaldehyd und 0,4 % Glutaraldehyd fixieren.
2. Wasche die Zellen zweimal mit PBS.
3. Inkubieren Sie fixierte Zellen mit einer Färbelösung mit einem pH-Wert von 6,0 (150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 40 mM Zitronensäure, 12 mM Natriumphosphat und 1 mg/mL 5-Brom-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktosid (X-gal).
4. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C ohne CO₂ werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen.
5. Bild mit Lichtmikroskopie.
6. Quantifizieren Sie die Anzahl der blau gefärbten Zellen unter dem Mikroskop, indem Sie die Anzahl der blauen Zellen zählen und durch die Gesamtzahl der Zellen in einem Feld teilen. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz positiver Zellen aus.

7. Immunfluoreszenzfärbung

VORSICHT: Formaldehyd, Glutaraldehyd und paraformaldehydhaltige Abfälle müssen als gefährlicher chemischer Abfall behandelt und gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften entsorgt werden.

1. Verwenden Sie Zellen, die auf Deckblättern kultiviert und mit 0,1 mg/mL Poly-D-Lysin vorbeschichtet sind.
2. Am 9. Tag die Zellen zweimal waschen und dann 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixieren.
3. Wasche die Zellen zweimal mit PBS.
4. Permeabilisieren mit 0,3 % Triton-X und 0,1 % Natriumcitrat in PBS.
5. Blocke mit 1 % BSA in PBS-T für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Inkubieren Sie Zellen mit dem primären Antikörper γH2AX, um über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer eine dauerhafte DNA-Schadensreaktion zu erkennen.
7. Am folgenden Tag zweimal mit PBS waschen.
8. Trage einen sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf.
9. Färben Sie die Kerne bei Bedarf mit DAPI.
10. Zweimal mit PBS-T waschen, gefolgt von zwei Waschen mit PBS und zweimal mit ddH₂O.
11. Befestige Deckfolien und lasse sie vor der Bildnahme vollständig trocknen.
12. Analysieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität und/oder γH2AX-Brennpunkte mit der ImageJ-Software.

8. RNA-Isolierung und RT-qPCR

VORSICHT: β-Mercapptoethanol ist hochgiftig und muss in einer Abzugshaube behandelt werden. Abfälle, die β-Mercaptoethanol enthalten, sollten als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.

1. Am 9. Tag Trypsinisieren Sie die Zellen mit 2 ml Trypsin-EDTA.
2. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 1,5-fache so viel Trypsininhibitor auftragen.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 100 x g für 5 Minuten.
4. Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab.
5. Lyse-Zell-Pellets werden durch Resuspendierung in einem 350 μL RLT-Puffer mit 1 % β-Mercaptoethanol verwendet.
6. RNA mit einem säulenbasierten RNA-Reinigungskit isolieren.
7. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer (260 nm).
8. Für die cDNA-Synthese verwenden Sie 1 μg RNA für die Reverse-Transkription in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μL unter Verwendung einer Standard-Reverse-Transkriptionsmischung (einschließlich RT-Puffer, dNTPs, zufällige Primer, Reverse-Transkriptase und RNase-Inhibitor), gefolgt von thermischen Zyklen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9. RT-qPCR für SASP-Faktoren durchführen
   HINWEIS: Die ausgewählten SASP-Faktoren (IL-8, IL-6 und MMP-1) stellen gut etablierte Komponenten des senezenzassoziierten sekretorischen Phänotyps dar und wurden aufgrund ihrer Relevanz für die Hautbiologie ausgewählt, einschließlich entzündlicher Signalübertragung und Umstrukturierung der extrazellulären Matrix
   IL-6 (Vordertrieb: 5' AAGCCAGAGGTGTGCAGATGAGTA 3' Drehzahl: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
   IL-8 (Vortrieb: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACACACAGAG 3')
   MMP-1 (Vordertrieb: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Drehzahl: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTTG 3')
   GAPDH (Vordertrieb: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Drehzahl: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
10. Analysieren Sie die relative mRNA-Expression mit der ΔΔCt-Methode und Normalisierung auf das Haushaltungsgen GAPDH.

9. Proteinisolation und Westlicher Blot

1. Am 9. Tag sammeln Sie Proteinlysate.
2. Medium aspirieren und Teller zweimal mit kaltem DPBS waschen.
3. Lysezellen mechanisch mit einem Zellschaber nach der Zugabe von 150 μL RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS und 2 mM EDTA) ergänzt mit Proteaseinhibitoren und Transfer in ein 1,5 mL Röhrchen.
4. Führen Sie drei Einfrier- und Auftauzyklen durch, gefolgt von einer 30-minütigen Brützeit auf Eis.
5. Zentrifugiere bei 9600 x g bei 4 °C für 10 Minuten.
6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Supernatanten mit dem BCA-Test.
7. Gleiche Mengen (20 μg) Protein werden auf Polyacrylamid-Gelen getrennt und auf aktivierte PVDF-Membranen übertragen.
8. Blockmembranen in 5% Magermilch in TBS-T.
9. Inkubieren Sie über Nacht mit primären Antikörpern pRB und LaminB1 bei 4 °C.
10. Am nächsten Tag die Membranen dreimal in TBS-T waschen.
11. Inkubieren Sie in HRP-konjugierten geeigneten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
12. Proteine durch Chemilumineszenz nachweisen und densitometrische Analysen durchführen.

Ergebnisse

Die tBHP-Behandlung induziert einen Wachstumsstillstand in menschlichen neonatalen Melanozyten.
Die tBHP-Behandlung hemmt die Melanozytenproliferation im Vergleich zu unbehandelten Kontrollgruppen (n = 3) (Abbildung 2A). Bis Tag 9 erreichen die behandelten Zellen nur noch 1,4 cPDL, während die Kontrolle 3,1 cPDL erreicht. Diese Divergenz nimmt im Laufe der Zeit zu, wobei behandelte Melanozyten bis zum 15. Tag ein Plateau von 1,9 cPDL erre...

Diskussion

Dieses Protokoll etabliert einen standardisierten Ansatz zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz (SIPS) in menschlichen neonatalen Melanozyten mittels tBHP und bietet ein robustes Modell zur Untersuchung der Seneszenz speziell bei diesem Zelltyp. Konsistente Veränderungen in Proliferation, Morphologie, SA-β-gal-Aktivität, DNA-Schadensmarkern und SASP-Komponenten unterstützen den induzierten Phänotyp. Durch den Fokus auf Melanozyten, Zellen, die trotz ihrer Schlüsselrollen i...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 µm-Membranfilter	Merck	SLGVR33RS
1 M Zitronensäure	Merck	K91567844	in dest. H2O vorbereiten
1 M MgCl2	Merck	A649033	in dest. H2O vorbereiten
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	in dest. H2O vorbereiten
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	in dest. H2O vorbereiten
37% Formaldehyd	Sigma	252549
4% Paraformaldehyd	CarlRoth	0335.3
5 M Natriumchlorid	Sigma	S3014	in dest. H2O vorbereiten
50% Glutaraldehyd	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-konjugierter sekundärer Antikörper 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovines Serumalbumin)	Sigma	A7030
Chemoluminiszenz-Substrat	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Deckgläser für Zellkultur/Mikroskopie	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline	Sigma	D8537
Humane neonatale Melanozyten	CellSystems	FC-0023
LaminB1 Antikörper (Kaninchen)	Abcam	AB16048	Verdünnung 1:1000 in 5% BSA
Montiermedium mit DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Sigma	P4333
Polyacrylamid-Gradientengele	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysin, 0,1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Kaliumferricyanid	Sigma	P8131
Kaliumferrocyanid	Sigma	P-9387
pRB Antikörper (Kaninchen)	CellSignalling	93085	Verdünnung 1:1000 in 5% BSA
Proteasehemmer-Cocktail	selbst hergestellt	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM aktiviertes Na-Orthovanadat
RIPA-Puffer	selbst hergestellt	N/A	enthaltend: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT-Puffer	Qiagen	1015762	enthalten im RNeasy Mini Kit
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Magermilchpulver (für 5% Milch in TBS-T)	Sigma	70166
Natriumcitrat (für 0,1% Lösung)	Sigma	S4641
Sojabohnen-Trypsininhibitor, 0,5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butylhydroperoxid (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (für 0,3% Lösung)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma	T3924
β-Mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX Antikörper (Kaninchen)	CellSignalling	2577S	Verdünnung 1:200