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Methodenartikel

Etablierung eines Mausmodells der Nierenfibrose durch einseitige Ischämie-Reperfusionsverletzung und verzögerte kontralaterale Nephrektomie

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DOI:

10.3791/70598

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22. Mai 2026

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Guangzhou Chest Hospital, Institute of Tuberculosis, Guangzhou Medical University, 2Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 3Department of Transplantation, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um ein Mausmodell der Nierenfibrose unter Verwendung einer einseitigen Ischämie-Reperfusionsverletzung und einer verzögerten kontralateralen Nephrektomie zu etablieren. Diese Strategie ermöglicht longitudinale Studien des AKI-zu-CKD-Übergangs sowie eine präzise Beurteilung der Restnierenfunktion am Endpunkt.

Zusammenfassung

Die Nierenischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) trägt zur akuten Nierenschädigung (AKI) bei und ist ein wesentlicher Treiber für das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung (CKD). Ein reproduzierbares Tiermodell ist notwendig, um die Bewertung maladaptiver Reparatur- und Fibrosemechanismen zu erleichtern. Hier wird ein Standardmodell der Nierenfibrose berichtet, das durch eine einseitige Ischämie-Reperfusionsverletzung (uIRI) und anschließend eine kontralaterale Nephrektomie (CNx) etabliert wurde. Diese Strategie gewährleistet das langfristige Überleben des Tieres während des Krankheitsverlaufs und ermöglicht gleichzeitig eine präzise Beurteilung der verbleibenden Nierenfunktion der verletzten Niere zum Zeitpunkt der Ernte. Männliche C57BL/6-Mäuse wurden 28 Minuten lang einer warmen Ischämie bei 37 °C ausgesetzt, und ein CNx wurde 24 Stunden vor jedem Endpunkt der Studie durchgeführt. Mäuse wurden für histologische und immunhistochemische Untersuchungen zu folgenden Zeitpunkten geopfert: 2 Tage, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen nach der IRI. An den postoperativen Tagen 2 und 5 zeigten die Nieren hauptsächlich eine tubuläre Nekrose, insbesondere am kortikomedullären Übergang, ohne Hinweise auf interstitielle Fibrose. Ab einer Woche nach der Operation wurden diese pathologischen Merkmale durch eine entzündliche Zellinfiltration und frühe tubuläre Atrophie ersetzt; Die interstitielle Fibrose trat ebenfalls auf und erreichte ihren Höhepunkt in der zweiten Woche. In der dritten und vierten Woche nach der Operation zeigten die Nieren eine ausgedehnte röhrenförmige Atrophie, die mit Nichtnutzungsatrophie übereinstimmt. Bemerkenswert ist, dass die interstitielle Fibrose im Vergleich zur zweiten Woche verringert war, was auf ein Fortschreiten in die ruhende, hypozelluläre Narbenphase hinweist. Dieses Modell reproduziert effektiv die klinischen Szenarien des AKI-zu-CKD-Übergangs und bietet eine verlässliche Plattform, um fibrotische Mechanismen zu erforschen und therapeutische Interventionen zu screenen.

Einleitung

Die Nierenischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist einer der entscheidenden Faktoren, die im klinischenUmfeld zu einer akuten Nierenschädigung (AKI) führen. Häufige Ätiologien sind Nierentransplantationen (mit kalter und warmer Ischämie gefolgt von Reperfusion der Spenderniere), kardiovaskuläre oder Nierenoperationen, die eine vorübergehende vaskuläre Verschluss erfordern, sowie systemische Hypoperfusionszustände, die durch schwere Traumata, schwere Blutungen oder Sepsis2 verursacht werden.

Die Pathophysiologie der IRI umfasst einen komplexen biphasischen Prozess. Anfangs führt die Unterbrechung der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung während der ischämischen Phase zu metabolischen Störungen, ATP-Depletion und zytoskelettalen Störungen in den nierenröhrigen epibularen Zellen (TECs)3. Anschließend löst die Wiederherstellung des Blutflusses während der Reperfusion, obwohl sie zur Rettung des ischämischen Gewebes notwendig ist, eine komplexere "sekundäre Beleidigung" aus. 4 Diese Phase der Verletzung wird durch eine Kaskade von Ereignissen angetrieben, darunter oxidativen Stress durch den Burst reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), endotheliale Dysfunktion, massive Infiltration von Entzündungszellen (wie Neutrophilen und Makrophagen) und die Aktivierung des Komplementsystems3. Diese komplexen Kaskaden verstärken gemeinsam die Apoptose und Nekrose der TECs und bilden die primäre pathologische Darstellung von AKI.

Bemerkenswert ist, dass IRI nicht auf akute, reversible Schäden beschränkt ist. Erhebliche Belege deuten darauf hin, dass eine unvollständige oder maladaptive Reparatur nach der nierenalen IRI ein Kernmechanismus ist, der den Übergang zur langfristigen chronischen Pathologie vorantreibt. Unter physiologischen Bedingungen startet die Niere nach dem AKI ein Reparaturprogramm, das beschädigte Zellen effektiv beseitigt und die Vermehrung und Differenzierung überlebender TECs fördert, um die Struktur und Funktion der beschädigten Tubuli wiederherzustellen. Nach einer schweren oder wiederholten IRI-Verletzung kann dieser Reparaturprozess jedoch dysregulieren, was letztlich zu Tubuläratrophie, niereninterstitieller Fibrose und einer Beschleunigung der Entwicklung und dem Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung (CKD) führt5,6.

Daher sind die Aufklärung der Mechanismen des Übergangs von AKI zu CKD und die Entwicklung therapeutischer Interventionen dringend erforderlich. Nagetiermodelle, insbesondere Mausmodelle, sind in vivo unerlässlich und unverzichtbar geworden . Werkzeuge zur Untersuchung der post-IRI-Fibrose aufgrund ihrer klar definierten genetischen Hintergründe und der Ähnlichkeit zum menschlichen Krankheitsverlauf. Allerdings existiert in den aktuellen IRI-Methodologien eine signifikante Heterogenität (z. B. Dauer der Ischämie, Temperaturkontrolle, einseitige vs. bilaterale Verletzung), was zu schlechter Reproduzierbarkeit und begrenzter Vergleichbarkeit zwischen Studienführt 7.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, beschreibt die vorliegende Studie ein standardisiertes Protokoll für ein modifiziertes unilaterales Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell (uIRI). Außerdem beinhaltet dieses Protokoll eine kontralaterale Nephrektomie (CNx), die 24 Stunden vor dem Endpunkt der Studie durchgeführt wird. Diese Strategie überwindet die hohe Sterblichkeit, die mit einer beidseitigen Ischämie verbunden ist, und ermöglicht gleichzeitig eine genaue Beurteilung der Restnierenfunktion und des fibrotischen Fortschreitens der verletzten Niere. Dieses Modell stellt den dynamischen Übergang von AKI zu CKD genau dar und bietet eine robuste In-vivo-Plattform für mechanistische Erkundung und therapeutisches Screening.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Vorschriften zur Verwaltung von Angelegenheiten für Versuchstiere durchgeführt. Das experimentelle Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. genehmigt (Genehmigungsnummer JENNIO-IACUC-2025-A053). Alle Verfahren wurden strikt gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren und den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vollständig den 3R-Prinzipien eingehalten. Der Zeitplan der Studie, einschließlich der Opferpunkte und der Probenentnahme, ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

1. Vorbereitung von Tieren und Instrumenten

  1. Für die Studie werden männliche C57BL/6-Mäuse (8 Wochen alt, 20–25 g schwer) in speziellen pathogenfreien (SPF) Einrichtungen untergebracht.
  2. Teile die Mäuse zufällig in die uIRI-Gruppe und die Sham-Gruppe ein. Für jeden der sechs festgelegten Zeitpunkte (2 Tage, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen) werden n = 4 Mäuse pro Gruppe zugewiesen.
    HINWEIS: Die Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Sie wurden mindestens eine Woche vor den Experimenten an die Laborumgebung gewöhnt.
  3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mittel.Hochdruck-Dampfautoklavierung vor der Nutzung.
  4. Halten Sie die Körperkerntemperatur streng bei 37,0 °C ± 0,5 °C mit einem homöothermischen Überwachungssystem, das mit einer rektalen Sonde zur kontinuierlichen Temperaturüberwachung ausgestattet ist. Führen Sie die geschmierte Sonde unmittelbar nach Einleitung der Anästhesie in den Enddarm ein und halten Sie sie während des gesamten Eingriffs an Ort und Stelle.
  5. Betäuben Mäuse mit einem Gasanästhesiesystem für kleine Tiere und Isofluran (5 % zur Einleitung, 1,5 % zur Erhaltung, mit einer Sauerstoffdurchflussrate von 1,0 L/min über einen kalibrierten Verdampfer).
    HINWEIS: Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie durch das Fehlen eines Pedalrückzugsreflexes. Alle chirurgischen Eingriffe dürfen erst durchgeführt werden, nachdem die Maus einen Zustand der tiefen Anästhesie erreicht hat.
  6. Rasieren Sie das Fell auf der linken Rückenseite.

2. Chirurgischer Eingriff

  1. uIRI-Modell (Tag 0)
    1. Positionieren Sie die Maus im rechten lateralen Dekubitus, um die linke Flanke freizulegen.
    2. Machen Sie einen 1 cm bis 1,5 cm langen längsliegenden Hautschnitt am linken Rücken, gefolgt von einem Muskelschnitt zum Eintritt in den retroperitonealen Raum.
    3. Drücken Sie vorsichtig die linke Niere mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit Kochsalzlösung befeuchtet wird.
      HINWEIS: Die Niere sollte nur durch Manipulation des perirenalen Fettpolsters oder sterile Wattestäbchen bewegt werden. Die Pinzette sollte niemals die Nierenoberfläche berühren.
    4. Schneiden Sie den Nierenpedikel vorsichtig mit einer feinen Zange auf, um die Nierenarterie und Vene vom umliegenden Bindegewebe zu isolieren.
    5. Klemmen Sie den linken Nierenpedikel mit einem nicht-traumatischen Gefäß-Mikroclip an, um Ischämie zu induzieren.
      HINWEIS: Die Dissektion des Nierenpedikels muss sauber und vollständig durchgeführt werden. Das Verfahren sollte den Harnleiter ausdrücklich von der Anwendung der Klemme ausschließen. Eine unbeabsichtigte Harnleiterklemmung würde eine hybride IRI/Unilaterale Ureterobstruktion (UUO)-Verletzung induzieren und möglicherweise eine dauerhafte obstruktive Komponente einführen.
    6. Starte sofort nach dem Klemmen einen Timer. Die Dauer der Ischämie ist streng auf 28 Minuten festgelegt.
    7. Überprüfen Sie die Ischämie visuell: Die Nierenfarbe sollte innerhalb von Sekunden von leuchtendem Rot zu dunklem Lila wechseln.
    8. Bedecken Sie die Niere mit steriler Mullbinde, die in warmer Kochsalzlösung getränkt ist.
    9. Nach 28 Minuten wird die Klemme entfernt, um die Reperfusion einzuleiten.
    10. Bestätigen Sie die Reperfusion visuell: Die Nierenfarbe sollte innerhalb weniger Minuten wieder rosa/rot werden.
    11. Führen Sie die Niere vorsichtig zurück in die Bauchhöhle.
    12. Schließe die Muskelschicht mit 5-0 absorbierbaren Nähten und den Hautschnitt mit 5-0 Nylonnähten.
  2. Sham-Betrieb (Tag 0)
    1. Führen Sie die gleichen Schritte für Anästhesie, Schnitt und Nierenexteriorisation wie in Schritt 2.1 beschrieben durch.
    2. Schneiden Sie den Nierenpedikel auf, aber klemmen Sie die Gefäße nicht ab.
    3. Halten Sie die Niere für die gleiche Dauer (28 Minuten) nach außen, bevor Sie sie in die Bauchhöhle zurückführen und den Schnitt schließen.
  3. CNx-Chirurgie
    HINWEIS: Führen Sie CNx 24 Stunden vor dem geplanten Endpunkt der Probenentnahme für jede Gruppe durch, um die Restfunktion der verletzten Niere zu beurteilen.
    Für die 2-Tage-Gruppe: Führe CNx am ersten Tag nach dem IRI durch.
    Für die 5-Tage-Gruppe: Führe CNx am Tag 4 nach dem IRI durch.
    Für die 1-Wochen-Gruppe: Führe CNx am Tag 6 nach dem IRI durch.
    Für die 2-Wochen-Gruppe: Führe CNx am Tag 13 nach dem IRI durch.
    Für die 3-Wochen-Gruppe: CNx am Tag 20 nach dem IRI durchführen.
    Für die 4-Wochen-Gruppe: Führe CNx am Tag 27 nach dem IRI durch.
    1. Betäuben Sie die Maus, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Dann rasieren und desinfizieren Sie die rechte dorsale Flanke.
    2. Mach einen kleinen Flankenschnitt auf der rechten Seite, um die rechte Niere freizulegen.
    3. Fasse die rechte Niere nach außen und schneide vorsichtig den Nierenpedikel auf.
    4. Ligaiere den Nierenpedikel (Arterie, Vene und Harnleiter) fest mit einer 4-0 nicht absorbierbaren Seidennaht.
    5. Entfernen Sie die rechte Niere distal zur Ligatur.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine aktive Blutung vom Stumpf vorhanden ist.
    6. Führen Sie den Pedikelstumpf zurück in die Bauchhöhle und schließen Sie den Schnitt wie in Schritt 2.1.12 beschrieben.
    7. Lass die Maus sich auf einem Heizkissen erholen.

3. Postoperative Versorgung und Überwachung

  1. Lass die Mäuse auf dem Heizkissen, bis sie vollständig bei Bewusstsein und Mobilität sind.
  2. Bringen Sie die Mäuse zurück in saubere Käfige mit leicht zugänglichem Futter und Wasser.
  3. Überwachen Sie täglich den Gesundheitszustand der Mäuse.
    1. Überprüfe täglich die Sterblichkeit.
    2. Achten Sie auf Veränderungen in der Pflege, Anzeichen von Belastung oder Schmerzen sowie auf die Haltung.
    3. Untersuchen Sie die Schnitte auf Anzeichen einer Infektion, Entzündung oder Dehiszenz.

4. Postoperative Beurteilungen

  1. Probenentnahme
    HINWEIS: Mäuse wurden zu festgelegten Zeitpunkten geopfert: 2 Tage, 5 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen nach der IRI, um den Verlauf von Verletzung und Fibrose zu bewerten.
    1. Betäuben Sie die Mäuse mit 3 % Isofluran.
    2. Sammeln Sie Blutproben für eine serumbiochemische Analyse (falls erforderlich).
    3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch eine zervikale Verrenkung.
    4. Nehmen Sie die linke (verletzte) Niere schnell ab.
    5. Schneiden Sie das Nierengewebe: Fixieren Sie eine Portion in kommerziellen 4%-Paraformaldehyd für die histologische Analyse und frieren Sie das restliche Gewebe in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C für die molekulare Analyse.
  2. Gewebeverarbeitung und Schnitte
    1. Dehydrieren, reinigen und die fixierten Gewebe in Paraffinwachs einbetten, strikt nach dem von Feldman und Wolfe8 beschriebenen Gewebeaufbereitungsprotokoll.
    2. Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einer Dicke von 4 μm mit einem rotierenden Mikrotom.
    3. Montiere die Gewebeabschnitte auf Glasobjektträger und backe sie bei 60 °C für 2 Stunden, um eine Gewebehaftung zu gewährleisten.
  3. Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung
    1. Deparaffiniere die Gewebeslides in Xylol und rehydriere sie durch eine absteigende graduierte Ethanolserie zu destilliertem Wasser.
    2. Führen Sie eine H&E-Färbung durch, um morphologische Schäden zu bewerten. Führen Sie die Färbe- und Waschschritte genau wie im standardisierten Protokoll von Feldman und Wolfe8 beschrieben aus.
    3. Dehydrieren, klarieren und die befleckten Objektträger mit einem harzhaltigen Befestigungsmedium abdecken.
  4. Massons Trichrom-Flecken
    1. Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Gewebeabschnitte zu destilliertem Wasser.
    2. Tragen Sie die Mordanten-, Nuklear-, zytoplasmatischen und Kollagenfarbstoffe nacheinander auf, um die Kollagenablagerung und Nierenfibrose zu beurteilen. Folgen Sie den genauen Inkubationszeiten und Waschschritten, die von Islam und Kumar9 beschrieben sind.
    3. Spülen, dehydrieren, reinigen und die Objektträger für eine mikroskopische Untersuchung abdecken.
  5. Immunhistochemie (IHC)
    1. Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Gewebebereiche.
    2. Führen Sie hitzinduzierte Epitopenentnahme mit einem 10 mM natriumcitrat-Puffer durch, der 0,05 % Tween-20 (pH 6,0) enthält, wie von Magaki et al.10 beschrieben.
    3. Blockieren Sie die endogene Peroxidase-Aktivität, indem Sie die Abschnitte in 3%igen Wasserstoffperoxid inkubieren.
    4. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5 % Rinderserumalbumin in PBS für 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
    5. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht mit dem anti-alpha-glatten Muskelaktin (α-SMA) Primärantikörper (1:400-Verdünnung) bei 4 °C.
    6. Wasche die Objektträger und inkubiere sie 1 Stunde lang mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur.
    7. Visualisieren Sie das Zielantigen mit DAB und kontern Sie mit Hämatoxylin, wobei Sie die von Magaki et al.10 bereitgestellten Verfahrensschritte einhalten.
    8. Trocknen, reinigen und die Objektträger für die endgültige Bildgebung abdecken.

5. Statistische Analyse

  1. Präsentieren Sie alle quantitativen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).
    HINWEIS: Statistische Analysen und Graphengenerierung wurden mit der GraphPad Prism Software Version 10.0 durchgeführt. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen im Vergleich zu einer einzelnen Kontrollgruppe (Sham) wurden mit einer Ordinary One-Way Analysis of Variance (ANOVA) analysiert, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. Ein P-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P. < 0,0001). NS zeigt keinen signifikanten Unterschied.

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Ergebnisse

Während des gesamten experimentellen Zeitraums lag die Gesamtüberlebensrate sowohl für die Sham-Gruppe als auch für die uIRI-Gruppe bei 100 % (n = 4 pro Zeitpunkt). Weder bei der anfänglichen uIRI-Operation noch beim anschließenden verzögerten CNx-Verfahren wurde eine Sterblichkeit festgestellt. Dieses Ergebnis bestätigt das hohe Sicherheitsprofil und die Zuverlässigkeit dieses zweistufigen Protokolls im Vergleich zu bilateralen Ischämiemodellen, die typischerweise an einer erheblichen u...

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Diskussion

Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells der renalen interstitiellen Fibrose mittels uIRI, gefolgt von CNx, das 24 Stunden vor dem Studienendpunkt durchgeführt wird. Das dynamische histopathologische Screening zeigte unterschiedliche pathologische Phasen: akute tubuläre Nekrose, gekennzeichnet durch eine Spitzeninzidenz innerhalb der Tage 2–5, gefolgt von aktiver Fibrogenese und Myofibroblast-Aktivierung, die nach 1–2 Wochen ihren...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82373042), dem Joint Innovation Team for Clinical & Basic Research (202409) und der Natural Science Foundation der Provinz Shandong (ZR2022QH291, ZR2025MS1199) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-α-SMA-AntikörperProteintech14395-1-APPrimärer Antikörper, der in IHC verwendet wird, um die α-SMA-Expression nachzuweisen und die Myofibroblastaktivierung zu bewerten
Blut-Harnstoff-Stickstoff-(BUN) TestkitNanjing Jiancheng Biotechnologie Forschungsinstitut Co., Ltd.C013-2-1Verwendet zur Quantifizierung der Serum-BUN-Werte zur Beurteilung der Restnierenfunktion
Kreatinin (CRE) TestkitNanjing Jiancheng Biotechnologie Forschungsinstitut Co., Ltd.C011-2-1Verwendet zur Quantifizierung der Serumkreatininspiegel zur Beurteilung der verbleibenden Nierenfunktion
GasanästhesiesystemNanjing Calvin Biotechnology Co., Ltd.KW-MZJ-4Ausgestattet mit Isofluran für die Vollnarkose
GraphPad-Prisma-SoftwareGraphPad Software, Inc.N/AVerwendet für statistische Analyse und grafische Darstellung von Daten (https://www.graphpad.com)
Homöothermes ÜberwachungssystemFührungswissenschaftCS-HS-0001Ausgestattet mit einer rektalen Sonde für eine geschlossene, kontinuierliche Überwachung und Regulierung der Körperkerntemperatur im geschlossenen Kreislauf
ImageJ SoftwareNationale GesundheitsinstituteN/AOpen-Source-Software zur morphometrischen Quantifizierung fibrotischer Bereiche und IHC-Signale
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd R510-22Inhalierendes Anästhetikum, das bei chirurgischen Eingriffen verwendet wird
Masson' s Trichrome FleckensetBeyotimeC0189MZur Quantifizierung der Kollagenablagerung
Nicht-traumatischer Gefäß-MikroclipROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TFrüher habe ich den Nierenpedikel 28 Minuten lang abgeklemmt
Paraformaldehyd (4 %)Beyotime Biotech Inc.P0099-100mlVerwendet zur schnellen Fixierung entnommener Nierengewebeproben
Natriumcitratpuffer (10 mM, pH 6,0)Thermo Fisher Scientific Inc. 005000Verwendet zur hitzinduzierten Epitopengewinnung vor der immunhistochemischen Färbung
Stereotaxisches chirurgisches MikroskopBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKVerwendet zur Durchführung von IRI-Operationen

Referenzen

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