Methodenartikel

Physische Manipulation zur Erzeugung von Xenopus-Mini-Embryonen

DOI:

10.3791/70602

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10. April 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine physikalische Verengungsmethode, um Mini-Embryonen aus Xenopus laevis-1-Zell-Embryonen herzustellen.

Zusammenfassung

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Ein prägendes Merkmal der frühen Embryogenese ist die schnelle, exponentielle Verringerung der individuellen Zellgröße, während das Gesamtvolumen des Embryos konstant bleibt. Das nukleozytoplasmatische (N:C)-Verhältnis spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zellulärer und molekularer Aktivitäten, die für die frühe Embryogenese unerlässlich sind. Die physische Manipulation der Embryogröße stellt daher eine wichtige Methode dar, um diese Entwicklungsmechanismen zu untersuchen. Die große Größe (~ 1,2 mm im Durchmesser) und die hohe Entwicklungsplastizität der frühen Embryonen von Xenopus laevis machen sie zu einem idealen Modell für physikalische Dissektionen und Manipulationen, um die regulatorischen Entwicklungsmechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Erzeugung von Mini-Embryonen mit verändertem zytoplasmatischem Volumen und N:C-Verhältnis, indem 1-Zell-Xenopus-laevis-Embryonen mit Haarknoten verengt werden. Die resultierenden Mini-Embryonen haben gezeigt, dass sie eine frühzeitige zygotische Genomaktivierung (ZGA) initiieren, die direkt durch Zellgrößenreduktion und Wachstum des N:C-Verhältnisses induziert wird. Diese Mini-Embryonen, die auf andere embryonale Systeme verallgemeinert werden können, bieten daher ein einzigartiges, kraftvolles Werkzeug zur Analyse größenvermittelter Mechanismen der frühen Embryonalentwicklung.

Einleitung

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Eines der auffälligsten Merkmale der frühen Embryogenese ist die exponentielle Verringerung der individuellen Zellgröße innerhalb eines Embryos, die ein konstantes Volumen aufrechterhält. Schnelle DNA-Synthese und Zellgrößenreduktion führen zu einer Erhöhung des nukleozytoplasmatischen Verhältnisses (N:C-Verhältnis), das eine wichtige Rolle bei der Regulierung mehrerer charakteristischer Aktivitäten des mittleren Blastula-Übergangs (MBT) in Modellembryonalsystemen spielt, darunter zygotische Gen-Transkription, Zellzyklusverlängerung und Zellmotilität 1,2,3,4 . Manipulationen des N:C-Verhältnisses durch veränderte DNA-Ploidie unterstützen seine funktionelle Bedeutung in der frühen Embryogenese in mehreren Modellsystemen 3,4,5,6.

Die physikalische Manipulation der Embryogröße stellt eine wichtige Technik zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen in der frühen embryonalen Entwicklungdar 7. Die zytoplasmatische Entfernung durch Aspiration, die das N:C-Verhältnis in frühen Mausembryonen verändert, induziert eine vorzeitige Verdichtung8. Außerdem zeigte die Verkleinerung der Zebrafisch-Embryogröße durch Hacken einen neuen, gradientenbasierten Mechanismus der Somit-Skalierung9. Darüber hinaus zeigte die Verringerung des zytoplasmatischen Volumens in Xenopus-Embryonen die N:C-Verhältnis abhängige Zellzyklusdynamik10. Wichtig ist, dass wir durch die Erzeugung von Xenopus-Mini-Embryonen durch Zellgrößenreduktion und Markierung entstehender Transkripte mit 5-Ethynyl-Uridin (5-EU) in Einzelzellen gezeigt haben, dass eine Verringerung der Zellgröße zygotische Genomaktivierung (ZGA) dosisabhängig induziert11. Diese Ergebnisse untermauern die entscheidende Rolle der Zellgröße in der frühen Embryogenese.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung von Xenopus laevis-Mini-Embryonen durch physische Manipulation mit Haarknoten (Abbildung 1)10,11. Dieser Ansatz baut auf Newport und Kirschners (1982) grundlegender Verwendung der Haarschleifenverengung bei frühen Xenopus-Embryonen 1 auf und bietet ein klares, zuverlässiges Protokoll zur Erzeugung von Mini-Embryonen als experimentelle Werkzeuge. Zusätzlich ist diese Methode auf andere embryonale Systeme7 anwendbar, was die Aufdeckung neuer Mechanismen der frühen Embryogenese erleichtern würde.

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Protokoll

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Die hier beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Carolina genehmigt.

1. Vorbereitung von Materialien

  1. Lösungen vorbereiten
    1. Bereiten Sie 20× MMR vor, indem Sie 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 und 40 mM CaCl2 mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
    2. Bereiten Sie eine 3%-Dichtegradienten-Lösung (Wt/vol) her, indem Sie 1,5 g Dichtegradientenmedium in 50 mL 0,5× MMR mischen. Rühren Sie vorsichtig mit einer magnetischen Rührstange, bis das Polymer gelöst ist. Bis zur Anwendung bei 4 °C halten.
    3. Bereiten Sie 1 % Agarosegel in einer 60-mm-Petrischale vor, indem Sie 0,5 g Agarose in 50 mL mit 0,1× MMR mischen. Erhitze mit einer Mikrowelle, um Agarose aufzulösen, und gib dann 5 ml Agarose dazu, um den Boden einer 60-mm-Petrischale in einer dünnen Schicht zu überziehen.
  2. Vorbereitung von Haarknoten für das Verengen der Embryonen
    1. Nimm ein paar dünne Haare und schneide sie in ~5 cm lange Stücke.
    2. Mit einer Pinzette steckt ein Ende des Haares in eine P10-Spitze von etwa ~1 cm Tiefe.
    3. Wachs auf einen Löffel geben und es erhitzen, um das Wachs zu schmelzen. Tauchen Sie die mit Haaren befestigte P10-Spitze schnell in das Wachs und lassen Sie sie 1 Minute trocknen. Stellen Sie sicher, dass das Haar am Ende der P10-Spitze fixiert ist.
    4. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig einen Überhandknoten aus dem Haar zu machen. Passen Sie die Größe der Schlaufe auf ~1,5 mm an. Schneiden Sie den Überhang bei Bedarf ab. Legen Sie den Knoten für die Zukunft beiseite.
    5. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte, um bei Bedarf weitere Haarknoten zu machen.

2. Herstellung von Xenopus-Mini-Embryonen

  1. Um Xenopus-Embryonen zu erhalten, folgen Sie einem Standardprotokoll zur Durchführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) (siehe zum Beispiel Sive et al., 2007)12). Der Embryo sollte im MMR von 0,1 × und einsatzbereit sein.
  2. Um ZGA in Einzelzellen früher Embryonen zu visualisieren und deren regulatorische Mechanismen zu untersuchen, mikroinjizieren Sie die 1-Zell-Embryonen mit 5-Ethynyl-Uridin (5-EU), um die entstehenden Transkriptemetabolisch 11,13 zu markieren, bevor die folgenden Verfahren durchgeführt werden.
  3. Wenn die Embryonen ~1 Stunde nach der Befruchtung (HPF) sind, verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um ~20 Embryonen in eine 60-mm-Petrischale (mit 1 % Agarose-Gel bedeckt) mit ~15 ml 3 % Dichtegradientenmedium/0,5 × MMR zu transferieren.
  4. Verwenden Sie eine Pinzette in einer Hand, um einen Embryo unter einem Stereomikroskop etwa ~45–60 Grad zu drehen, um den pflanzlichen Pol (die blasse Hemisphäre) zu erreichen. Halte den geneigten Embryo mit der Pinzette und benutze mit einer 30-G-Nadel in der anderen Hand, um vorsichtig den pflanzlichen Stab zu durchstoßen. Setzen Sie etwas Zytoplasma frei, indem Sie den Embryo sanft drücken.
  5. Decken Sie vorsichtig einen Haarknoten ab, der mit einer P10-Spitze an einem Embryo montiert ist, sodass der Tierstangen (die dunkle Hemisphäre) im Haarknoten liegt. Passen Sie die Position des Knotens entsprechend der gewünschten Größe des Mini-Embryos an.
  6. Halten Sie die P10-Pipette mit einer Hand und verwenden Sie in der anderen Hand eine Pinzette, um die beiden oberen Enden des Knotens in entgegengesetzte Richtungen zu ziehen. Der Haarknoten zieht sich um den Embryo zusammen, zwischen dem Tierpol (intakt) und dem pflanzlichen Pol (wobei das Zytoplasma freigesetzt wird). Schneide den Haarknoten an der Stelle ab, an der er an der P10-Spitze befestigt ist.
  7. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte 2.4–2.6, um die gewünschte Anzahl an Mini-Embryonen herzustellen.
  8. Lassen Sie die Embryonen für ~1–2 Stunden im 3%-Dichtegradienten-Medium/0,5× MMR bleiben. Anschließend wird das Medium mit einer P1000-Pipette entfernt, ohne die Embryonen zu stören, und mit 15 mL 0,1× MMR nachgefüllt.
  9. Lassen Sie die Embryonen sich in die gewünschten Stadien entwickeln und verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Knoten vorsichtig aus den Mini-Embryonen zu entfernen.
  10. Sammeln Sie die Embryonen für die gewünschte Analyse, zum Beispiel die Visualisierung des ZGA inEinzelzellen.

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Ergebnisse

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Xenopus laevis-Embryonen im 1-Zell-Stadium wurden mit den Haarknoten, wie oben beschrieben, verengt. Die Kontroll- und Mini-Embryonen in ~Stadium 9 (8,5 hpf bei 23 °C) wurden unter einem Stereomikroskop abgebildet. Wie in Abbildung 2 gezeigt, beträgt das Volumen einiger Mini-Embryonen ~1/3 des der Kontrollembryonen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die frühen Xenopus-Embryonen manipuliert werden können, um Mini-Embryonen zu erzeugen, was ein...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung von Mini-Embryonen in Xenopus , indem 1-Zell-Embryonen mit Haarknoten physisch zusammengezogen werden. Dieser Ansatz liefert direkte Belege dafür, dass die Verringerung der Zellgröße ZGA in einem Modellembryo11 induziert.

Mehrere Aspekte dieses Protokolls sind entscheidend, um Mini-Embryonen erfolgreich zu erzeugen. Um Haarknoten zu bilden, ist es wichtig, dünnes, langlebiges Haar...

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Offenlegungen

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Der Autor erklärt keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Wir danken dem Matthew Good Labor an der University of Pennsylvania für die Ausbildung. Diese Arbeit wurde teilweise vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30-G-NadelBD Medical305128Für das Eindringen von Embryonen
60 mm Einweg-PetrischalenVWR25384-092Für die Inkubation von Embryonen
ACCU-SCOPE 3075 Zoom-StereomikroskopeVWR470351-130Zur Visualisierung von Embryonen
AgaroseSigma-AldrichA-9414Zum Überziehen von Petrischalen
Dumont-Pinzette, Stil 5Elektronenmikroskopiewissenschaften72701-DZum Anpassen und Halten von Embryonen
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Für die Inkubation von Embryonen
TipOne Pipettenspitze, 10 & Micro; LUSA Scientific1111-3700Zum Anbringen der Haarknoten
Wachsblock, SchwarzCarolina Biological Supply Co.974228Zum Anbringen der Haarknoten

Referenzen

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  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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Schlagwörter

Manipulation der Embryogr eNukleozytoplasmatisches Verh ltnisfr he EmbryogeneseGenomaktivierungphysikalische Einschn rungZytoplasmavolumenIn vitro FertilisationStereomikroskopieZellgr enregulation

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