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Methodenartikel

Kostengünstige Alternative zur Untersuchung der sozialen Präferenz bei Zebrafischen (Danio rerio) mit der 3-Kammer-Freischwimm-Aufgabe im offenen Becken

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DOI:

10.3791/70610

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7. August 2026

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1Christopher Newport University, 2Virginia Governor's School for Science and Technology, 3Bay Path University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mehrkammer-Sozialpräferenzaufgaben wurden von Nagetieren auf Zebrafische angepasst, was die Untersuchung des sozialen Verhaltens bei Modellorganismen erleichtert. Dieses Protokoll validiert eine kostengünstige 3-Kammer-Open-Tank-Aufgabe mithilfe von Webcams und Open-Source-Software zur Messung der sozialen Präferenz von Zebrafischen, wodurch sie für die Forschung und Lehre von Studierenden zugänglich ist.

Zusammenfassung

Das Verständnis von sozialem Verhalten ist ein zentrales Anliegen der neurobehavioralen Forschung, das oft mit sozialen Präferenzaufgaben untersucht wird. Diese Aufgaben, ursprünglich für Nagetiere entwickelt und später für Zebrafische angepasst, werden häufig verwendet, um soziale Dynamiken und Reaktionen zu untersuchen. Die 3-Kammer-Freischwimmaufgabe (OTFST) besteht aus einem zentralen Becken, flankiert von zwei Stimulustanks, mit einer Kamera, die das Verhalten des Subjekts im zentralen Becken aufzeichnet, sowie polarisierendem Film und Hintergrundbeleuchtung, um die Videoqualität und Validität zu verbessern. Dieses Protokoll verwendet eine kostengünstige Einrichtung mit USB-Webcams und leicht verfügbaren Materialien. Wir nutzen DeepLabCut, ein Open-Source-Tool zur markierungslosen Posenschätzung, das eine genaue Videoerfassung der Tierbewegungen ermöglicht und positionsbezogene Zeitreihendaten zur Analyse verschiedener Kennzahlen bereitstellt. Pilotsitzungen bestätigen die Fähigkeit des Systems, robustes soziales Präferenzverhalten zu erfassen. Dieser preisgünstige Ansatz bietet eine zugängliche und skalierbare Plattform für Labore, die soziale Interaktion bei Zebrafischen untersuchen, und die Vielseitigkeit sowie relative Einfachheit des 3-Kammer-OTFST machen es geeignet für Lehrlabore und Forschungsprojekte für Bachelorstudierende.

Einleitung

Soziale Präferenz ist die Tendenz eines Individuums, soziale Reize zu engagieren, zu suchen oder zu vermeiden, und ist ein grundlegender Aspekt des sozialen Verhaltens, der eine entscheidende Rolle bei der Etablierung von Bindungen und Hierarchien innerhalb von Tiergruppen, einschließlich Menschen, spielt. Das Verständnis sozialer Präferenz ist entscheidend, um die neuronalen und Verhaltensmechanismen zu charakterisieren, die sozialen Interaktionen zugrunde liegen. Frühere Forschungen zeigen, dass Defizite in sozialen Präferenzen mit neuroentwicklungsbedingten und psychiatrischen Störungen in Verbindung stehenkönnen 5,6,7,8. Tiermodelle können Einblicke in die biologische Grundlage sozialer Verhaltensweisen liefern und bei der Entwicklung translationaler Werkzeuge zur Diagnose und Behandlung sozialer Beeinträchtigungen helfen. Diese Tiermodelle, die von Nagetieren 9,10 bis zu aquatischenArten 11,12 reichen, bieten nützliche Fundrahmen.

Nagetiere wurden erstmals im frühen 19. Jahrhundert für Verhaltensforschungeingesetzt, aufgrund ihrer physiologischen Ähnlichkeiten mit Menschen14,15. Während Verhaltensweisen wie Aggression ursprünglich untersucht wurden, blieben systematische Maße der sozialen Präferenz minimal. Die Forscher schlossen diese Lücke durch die Entwicklung der von Nadler et al. 16 eingeführten Dreikammer-Sozialpräferenzaufgabe. Das Gerät besteht aus drei miteinander verbundenen Kammern. Typischerweise enthält eine Seitenkammer eine neuartige Art, während die andere Kammer leer bleibt. Der Versuchsperson darf alle Kammern frei erkunden, wobei die Zeit in jeder Kammer aufgezeichnet und als Präferenzindikator bewertet wird. Dieses Instrument und dieses Verfahren sowie verschiedene Varianten erlangten große Popularität und wurden verwendet, um verschiedene Aspekte der sozialen Leistungsfähigkeit 17,18,19 und soziale Defizitte in Nagetiermodellen für Autismus-Spektrum-Störung 5,20,21 zu untersuchen. Untersuchungen mit Nagetieren sind jedoch kostspieliger und benötigen erheblichen Platz. Daher wenden sich viele Forscher stattdessen der Nutzung aquatischer Arten für neurobehaviorale Forschung zu.

Wasserarten, insbesondere Zebrafische (Danio rerio), besitzen ein ausgeklügeltes Verhaltensrepertoire, einschließlich komplexer sozialer Interaktionen22. Aufgrund ihres Nutzens als biomedizinisches Forschungsmodell und der Bedeutung sozialer Interaktion in ihrer Verhaltensökologie bieten Zebrafische einen sinnvollen Rahmen für soziale Reaktionen, der im Vergleich zum Menschen verwendet werden kann23. Zebrafische sind für die Verhaltensneurowissenschaften immer beliebter geworden, da sie kostengünstig in der Pflege sind und einen relativ kleinen Halteraum benötigen, was diese Art zu einem kosteneffizienten und praktischen Modell für groß angelegte Studien zu sozialem Verhalten und Präferenzenmacht. In einigen Studien wurde eine benachbarte Beckenkonfiguration verwendet, um soziale Interaktionen bei aquatischen Artenzu untersuchen 25,26; Dieses System bot jedoch einen etwas begrenzten Durchsatz zur Bewertung sozialer Präferenz, da nur ein Reiz präsentiert wurde. Diese Einschränkung wurde durch die Einführung der Dreikammer-Aufgabe der Maus für Zebrafische im Jahr 2018 behoben. Die modifizierte Ausrüstung für die 3-Kammer-Freischwimmaufgabe (OTFST) bestand aus einem einzelnen Acrylamidbecken, das mit festen Acrylamidbarrieren unterteilt war, um eine neutrale Startzone zu schaffen, sowie zwei Seitenkammern, wobei jede Seitenkammer entweder einen bekannten oder neuartigen Artgenossen enthielt. Zur Messung der sozialen Präferenz wurde die kumulierte Zeit in der Nähe jeder Seitenkammer aufgezeichnet, was zeigte, dass Ethanolexposition und Sam2-Knockout die Neuheitspräferenz bei Zebrafischenreduzierten. Während der Nagetier-3-Kammer-Sozialinteraktionstest komplexe multimodale Interaktionen zwischen der Testperson und den Test-Konspezifischen(n) durch visuelle, chemische, taktile und akustische Modalitäten ermöglicht, reduziert die Verwendung separater Kammern für das aquatische 3-Kammer-OTFST die Interaktion zwischen Subjekt und Reiztieren auf die visuelle Modalität. Obwohl diese Interaktion mit einer einzelnen Modalität möglicherweise weniger ökologisch validiert ist, bietet sie dennoch mehr experimentelle Kontrolle und erhöht die Einfachheit für Projekte von Bachelor-Forschern. In der Literatur haben verschiedene Forscher seitdem Anpassungen des 3-Kammer-OTFST untersucht, um genetische und Umweltfaktoren zu untersuchen, die das soziale Verhalten bei Zebrafischenbeeinflussen 28,29,30,31,32.

Die derzeitige Adaption des 3-Kammer-OTFST soll als vielseitiges und für Bachelor-Studierende geeignetes Modellgerät dienen. Das FishLab, ein vollständig grundständiges Labor, entwickelte und nutzte dieses System und hat seine Wirksamkeit als Hochdurchsatzwerkzeug zur Untersuchung der sozialen Präferenz bei Zebrafischen nachgewiesen. Studien mit diesem Aufbau haben mehrere Facetten der sozialen Präferenz von Zebrafischen als Reaktion auf Manipulationen verschiedener unabhängiger Variablen untersucht. Die erste Studie zeigte, dass Zebrafische lebende versus simulierte soziale Reize33 erkennen können, während die zweite die Präferenz für etablierte Schwärme gegenüber neu entstandenen Schwärmen34 untersuchte. Die jüngste Studie untersuchte die Fähigkeit von Zebrafischen, zwischen chemisch alarmierten und unalarmierten Schwärmen35 zu unterscheiden. Gemeinsam behandeln diese Studien verschiedene Aspekte des sozialen Verhaltens, darunter Realismus, Vertrautheit und Bedrohungserkennung, während sie Gemeinsamkeiten bei Schwärmpräferenzen und Bewertung von Reaktionen auf das Prädationsrisiko aufzeigen. Das für diese vorherige Studien verwendete Setup verwendete jedoch digitale IP-Kameras, die auf professioneller Kameraausrüstung montiert waren, ein dediziertes Aquatic-Rack-Gehäusesystem und proprietäre Software für Videoaufnahme und -analysen, mit einem Gesamtkosten, der für Ermittler und Ausbilder mit kleinen Betriebsbudgets unerschwinglich sein könnte. Mit dem Aufkommen von Open-Source-Software und hochwertigen USB-basierten Webcams ist nun eine kostengünstige Version für Forscher möglich, die diese Technik bei Bachelor-Forschern anwenden möchten, mit einem Gesamtpreis (ca. 2.000 US-Dollar ohne Computer), der deutlich niedriger ist als die Kosten des teuren Systems (ca. 20.000+ US-Dollar+, ohne den Computer).

Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Anwendung einer kostengünstigen Version des 3-Kammer-OTFST für Zebrafische. Seine Erschwinglichkeit, Einfachheit und Vielseitigkeit machen es zu einem nützlichen Werkzeug für kleine Labore oder Bildungseinrichtungen mit begrenzter Finanzierung. In Kombination mit kostengünstigen Unterkünften, wie häufig verfügbaren 10-Gallonen-Aquarien, kostet die aktuelle Einrichtung deutlich weniger in Einrichtung und Instandhaltung. Zusätzlich bietet der Einsatz von Open-Access-Software wie dem Open Broadcasting System (OBS) zur Aufzeichnung experimenteller Sitzungen und verschiedenen Tracking-Anwendungen (z. B. DeepLabCut, SLEAP usw.) einen kostengünstigen, zugänglichen Rahmen zur Erfassung von Videos und zur Generierung von Zeitreihendaten sozialer Interaktionen von Zebrafischen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Christopher Newport University genehmigt (Protokoll #2025-23).

1. Tiere

  1. Erhalte erwachsene Kurzflossen-Wildtyp-Zebrafische 23,36,37, obwohl auch andere Stämme verwendet werden können. Alternativ können Sie Embryonen erwerben und sie im eigenen Haus aufziehen.
  2. Halten Sie die Fische in freistehenden 10-Gallonen-(38 L)-Becken mit einer Dichte von etwa zwei Fischen pro Gallone (3,8 L) Wasser. Statten Sie die Tanks mit aktiven Biofiltern, Luftsteinen und tauchbaren Heizungen aus. Alternativ kann man Hausfische auf einem aquatischen Rack-System verwenden.
  3. Halten Sie die Wasserqualitätsparameter in folgenden Bereichen ein: pH 7,0–8,0, Leitfähigkeit 400–700 μS, Temperatur 25–27 °C, <40 ppm Nitrat, <0,2 ppm Nitrite und 0,01–0,1 ppm Ammoniak.
  4. Haltet die Tiere unter einer 12-Stunden-Leuchtturm-12-Stunden-Dunkelphase und füttert sie einmal täglich mit kommerziellen Flocken.
  5. Wählen Sie Tiere zufällig aus diesen Becken für die experimentelle Zuteilung aus.
  6. Nach Abschluss des Experiments werden die Tiere für andere Forschungs- und Lehrzwecke umgenutzt oder durch Eintauchen in 250–500 mg/mL gepuffertem Trikain für 30 Minuten eingeschläfert, gefolgt von einer physikalischen Methode (z. B. Enthauptung), um den Tod zu gewährleisten. Verwenden Sie die eingeschläferten Tiere für nachfolgende Bioassays und/oder neurochemische Analysen.

2. 3-Kammer-Freischwimm-Aufgabengerät und Software mit offenem Becken

  1. Bau von Testkammern
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Kunststoffleiste am Boden jedes 5,5-Gallonen-Aquariums. Verwenden Sie ein Drehwerkzeug mit einem Abtrennrad, um den Kunststoff an den Ecken zu schneiden und das Entfernen zu erleichtern. Sobald die Kunststoffleiste aufgeschnitten ist, trennen Sie das Plastik mit einem gemeinsamen Spachtel vom Silikonkleber.
    2. Um die Gegenbeleuchtung zu diffusieren, decken Sie die Rückseite aller drei Tanks, das linke Ende eines Tanks und das rechte Ende des anderen Tanks mit der weißen Klebefolie ab. Lassen Sie die Enden am Aquarium unbedeckt, das als Mittelkammer dient.
    3. Setzen Sie eine schwarze horizontale Linie, um den Füllstand 4,5 cm unterhalb des oberen Randes an der Vorderseite jeder Kammer mit einem Emaillemarker oder mit schwarzem Grafikband anzuzeigen.
    4. Schneiden Sie ein Blatt Polarisationsfilter, das auf die unbedeckte Endseite jedes Flankentanks passt. Orientiere die Filterplatten um 90° zueinander. Verwenden Sie an allen vier Kanten durchsichtiges Klebeband, um zu verhindern, dass Wasser in den Raum zwischen dem Aquariumglas und dem Filtermaterial eindringt.
      HINWEIS: Die versetzte Ausrichtung der polarisierenden Filter verhindert, dass Reiztiere in einer flankierenden Stimuluskammer die Tiere (oder andere Reize) in der anderen Flankenkammer sehen können, während sie dennoch das Subjekt sehen können. Das Subjekt im mittleren Tank kann die visuellen Reize in beiden Flankenkammern sehen.
    5. Baue die Polyvinylchlorid-(PVC)-Basis so, dass sie die genaue Platzierung der Tanks auf der Aufbaubank anpasst. Schneiden Sie den unteren Teil des Sockels von einer 0,635 cm dicken weißen PVC-Platte von 21 cm x 122,5 cm und schneiden Sie die Endstücke aus einer 21 cm langen 1 x 2 PVC-Leiste.
    6. Teste die Enden auf der Basis mit allen drei Tanks an ihrem Platz. Stellen Sie sicher, dass die Trennwände (unten) einfach eingesetzt und entfernt werden und dass die Flankentanks nicht eng an den Seiten des mittleren Tanks angrenzen. Nach Abschluss der Probemontage verbinden Sie die Endstücke mit PVC-Klement an die PVC-Unterlage.
    7. Um die klaren Deckel für jede Kammer herzustellen, schneiden Sie das Polycarbonatblatt in drei Stücke, die den Außenmaßen des oberen Randes des 5,5-Gallonen-Beckens (40 cm × 21 cm) entsprechen. Schneiden Sie einen Rohrkanal (6 mm × 4 mm) um den Rand jedes Deckels, um eine sichere Position des Deckels oben auf der Kammer zu gewährleisten.
    8. Decken Sie die Kammern mit den Deckeln ab, wann immer Tiere in den Kammern gehalten werden. Platzieren Sie eine Tauchheizung und einen Luftstein, der an eine Aquarienluftpumpe angeschlossen ist, während die Tiere in ihren jeweiligen Kammern gehalten werden, um Temperaturkontrolle und Belüftung zu gewährleisten. Verwenden Sie ein dreifaches Luftventil, um den Luftstrom über alle drei Luftsteine auszugleichen.
    9. Machen Sie einfache, undurchsichtige Trennwände für die Platzierung zwischen der mittleren Kammer und jeder Flankenkammer, um zu kontrollieren, wann Testpersonen durch das Laminieren von zwei Bögen hellfarbigem A4-Karton visuell mit sozialen Reizen konfrontiert werden.
    10. Bereiten Sie die Trennwände für das Aufhängen und die Fernentfernung vor, indem Sie zwei Löcher von 85 mm und 125 mm entlang einer 210 mm langen Kante jedes laminierten Blechs stanzen.
    11. Schneiden Sie zwei 75 cm lange Stücke hochfester Schnur ab, fädeln die Schnur durch jedes Loch und verbinden Sie die übrigen Enden zusammen, sodass die beiden Platten zu einem mittigen Joch verbunden werden.
    12. Schneide ein 6 m langes Bindegarn durch. Binden Sie ein Ende der 6 m langen Schnur an die Passe, um eine zentrale, feste Leine zu schaffen, und führen Sie das freie Ende durch eine Drehscheibenrolle.
    13. Montiere die Drehscheibe an der Decke über dem mittleren Tank und stelle sicher, dass das Ende der Schnur außen an der Versuchsanlage hängt (Abbildung 1A).
  2. Bau der Beleuchtungsanlage
    1. Mach einen Rahmen aus 1/4 Zoll (0,635 cm) dicker weißer PVC-Platte für das Panellicht. Schneiden Sie zwei Endstücke (10 cm × 31,5 cm) sowie eine Oberseite und eine Unterseite (10 cm × 122 cm). Probieren Sie, die Rahmenteile so zusammenzufügen, dass das Panel im Rahmen passt. Sobald die Passform getestet ist, verbinden Sie die Rahmenteile mit PVC-Zement.
    2. Lass einen qualifizierten Elektriker ein dreiadriges Kabel an das Panellicht anschließen.
    3. Lass einen qualifizierten Elektriker den Schiebendimmer anschließen, um die Ausgangssteckdose im wasserdichten Gehäuse zu steuern. Stecken Sie das Panellicht in diese Steckdose.
    4. Stelle den Schieberegler ein, um die Helligkeit der Hintergrundbeleuchtung auf 350 Lux zu stellen. Füllen Sie die Kammern mit Wasser und bewegen Sie den Schiebedimmer, um die Helligkeit an der Vorderseite der Kammern auf 15 Lux einzustellen.
      HINWEIS: Forscher sollten die Beleuchtung vor, während und nach einer Untersuchung überprüfen, um sicherzustellen, dass die Helligkeitseinstellungen beibehalten wurden.
  3. Bau von Vorhang und Kamerarahmen
    1. Richte die Testbank mit dem Panellicht, dem Tankbodenpanel und den drei Kammern ein. Positionieren und stellen Sie die beiden Planenstangen vertikal an, sodass sie jeweils eng vom Boden bis zur Decke sitzen, mindestens 75 cm von der Vorderseite der Tanks.
    2. Machen Sie für jeden Vorhang eine obere Tasche, indem Sie ein Ende des Lakens über 60 cm falten und einen geraden Stich 6 cm von der oberen Falte nähen, um eine Tasche zu schaffen, in die das Rahmenstück hineingleiten kann.
    3. Missen Sie die Maße der Querverbindungs- und Stabilisierungsabschnitte des Rahmens entsprechend der Breite und Tiefe des zu verwendenden Bereichs.
      HINWEIS: Für die aktuelle Einrichtung im FishLab wurden die vertikalen Planenstangen 146,5 cm von der Rückwand in der Ecke des Labors angebracht. Die Innenplane ist 6,5 cm von der Seitenwand entfernt, während die äußere Planenstange 142,5 cm von der Seitenwand entfernt steht.
    4. Schneiden Sie drei Abschnitte elektrischer Metallrohrleitung (EMT) mit 143 cm Durchmesser, die als Stabilisierungsabschnitte für die Seiten des Rahmens verwendet werden. Führen Sie einen Abschnitt durch die obere Tasche des beweglichen Vorhangs und positionieren Sie sie horizontal 190 cm über dem Boden.
    5. Befestigen Sie den Abschnitt mit einer T-Klemme an der äußeren Plane am einen Ende und am anderen Ende der maßgefertigten 3D-gedruckten Fassung. Befestige die 3D-gedruckte Buchse mit Schrauben an der Rückwand. Befestigen Sie die anderen beiden Abschnitte an der inneren Planestange.
    6. Führen Sie den oberen Abschnitt durch die obere Tasche eines der festen Vorhänge und positionieren Sie sie 190 cm über dem Boden. Befestigen Sie die Innenplane mit einer T-Klemme an einem Ende und am anderen 3D-gedruckten Sockel am anderen Ende.
    7. Befestigen Sie die 3D-gedruckte Buchse mit Schrauben an der Seitenwand. Platzieren Sie den endgültigen Stabilisierungsbereich 120 cm über dem Boden und befestigen Sie ihn ähnlich wie die beiden anderen Stabilisierungsbereiche.
    8. Schneiden Sie ein weiteres Stück EMT-Rohr mit 127 cm Durchmesser, das als Stabilisierungsabschnitt für die Vorderseite des Rahmens verwendet wird. Führen Sie diesen Abschnitt durch die obere Tasche des zweiten festen Vorhangs und montieren Sie ihn 193 cm über dem Boden, indem Sie jedes Ende mit einer T-Klemme an den Planpenstangen befestigen.
    9. Schneiden Sie das verbleibende Stück EMT-Rohr mit 145 cm Durchmesser ab, damit es als Kameramontagestange verwendet wird. Stellen Sie diesen Abschnitt horizontal 88 cm über dem Boden auf, um die Kameras mit der Mitte der Tanks auszurichten. Stecken Sie ein Ende in eine 3D-gedruckte Buchse, die an der Wand geschraubt ist, und verwenden Sie die maßgefertigten 3D-gedruckten Querklemmen, um die Kamerastange fest an den Planenstangen zu halten (Abbildung 1B).
  4. Bau der Kameraanlage
    1. Klemmen Sie eine Kamerahalterung an der Kamerastange an, sodass die horizontalen und vertikalen Mittelpunkte der Kamera mit den entsprechenden horizontalen und vertikalen Mittelpunkten der Mittelkammer ausgerichtet sind.
      HINWEIS: Vor jeder Flankenkammer können zusätzliche Kameras montiert werden, wenn Forscher digitale Videos der Reaktionen lebender Tiere als visuelle Reize erhalten möchten. Die einfachste Einrichtung besteht darin, eine einzelne Kamera zu platzieren, um ein Video der zentralen Versuchskammer aufzunehmen. Für lebende soziale Reize in den Stimuluskammern möchten Forscher möglicherweise auch Videos der Kammern sammeln.
    2. Montiere jede Kamera am Gewindepfosten jeder Kamerahalterung. Stellen Sie jede Kamera so ein, dass das Bild auf die Beobachtungszone ihrer jeweiligen Kammer zentriert ist.
    3. Sichern Sie die USB-Kabel jeder Kamera an der Kamerastange mit Gurten oder Bändern, um ein Herabhängen der Kabel zu verhindern, was zu einer Fehlstellung der Kameras führen kann.
    4. Schneiden Sie ein 140 cm langes Drahtregal ab und befestigen Sie es vertikal an der Außenseite des Rahmens, um zu verhindern, dass die Kameras aus der Ausrichtung geraten. Montage des "Kamera-Käfigs" mit T-Klammern, die an den Planstangen befestigt sind.
      HINWEIS: Ein zweiter Kamera-Käfig kann an der Innenseite des Rahmens montiert werden, um zusätzlich zu verhindern, dass die Kameras aus der Ausrichtung gestoßen werden; Ein kleiner Abschnitt des Drahtgitters muss möglicherweise entfernt werden, wenn die Vorderseite der Kameras "eingeschlossen" ist, um eine Verdeckung der Tankbilder zu verhindern.
  5. Laden und konfigurieren Sie Akquisitionssoftware – Open Broadcaster Studio (OBS)
    1. Laden Sie OBS herunter und installieren Sie es auf einem Windows-betriebenen lokalen Computer. Starte OBS Studio und führe den Auto-Konfigurations-Assistenten aus, um die Einstellungen für die spezifischen Aufnahmebedürfnisse, Hardwareressourcen und Netzwerkbedingungen zu optimieren.
      HINWEIS: Dieses Tool ist unter Tools > Auto-Configuration Wizard verfügbar.
    2. Überprüfe die Grundeinstellungen, bevor du die Kamera konfigurierst. Stellen Sie die Basisauflösung (Leinwand) so ein, dass sie zur Anzeigeauflösung passt, und stellen Sie die Ausgabeauflösung (skaliert) auf die Aufzeichnungsauflösung (z. B. 720 Pixel).
    3. Erstellen Sie eine Szene, indem Sie mit Rechtsklick im Feld Szenen klicken (oder das Kreuz unten verwenden). Geben Sie der Szene einen Namen. Nutze die Szene, um das Stream-Layout zu definieren.
    4. Fügen Sie eine neue Quelle hinzu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Quellen-Feld klicken (oder das Plus-Symbol unten verwenden). Wählen Sie Videoaufnahmegerät , um eine Webcam hinzuzufügen. Geben Sie jeder Kamera einen eigenen Namen (z. B. "kamera-links", "kamera-mitte", "kamera-rechts"). Wiederholen Sie diesen Vorgang für zusätzliche Kameras oder Quellen bei Bedarf.
    5. Positionieren und die Quellen im Vorschaufenster anpassen. Stellen Sie sicher, dass die Kamera sichtbar ist, indem Sie bestätigen, dass sie über anderen Quellen in der Quellenliste aufgeführt ist. Um die Kameraansicht auf der Leinwand zu zentrieren, wählen Sie die Quelle in der Quellliste aus (ein rotes Begrenzungsfeld erscheint) und drücken Sie STRG+D (Zentrieren auf Bildschirm).
    6. Füllen Sie den gesamten Bildschirm mit einer Quelle, indem Sie STRG+F (auf den Bildschirm passen) oder STRG+S (Stretch to Screen) drücken, falls gewünscht. Schneide die Quelle zu, indem du die Alt-Taste gedrückt hältst, während du die Begrenzungsbox ziehst. Überprüfe den Beschnitt, indem du prüfst, ob die Ränder grün werden.
    7. Passen Sie Videoeigenschaften wie Helligkeit und Kontrast an, indem Sie auf die ausgewählte Kamera in der Quellenliste doppelklicken und "Video konfigurieren" auswählen. Ändern Sie die Einstellungen über das Eigenschaftenmenü .

3. Verhaltenstests

  1. Akklimatisierung
    1. Fülle alle drei Kammern mit Wasser aus den Gehäusetanks. Platzieren Sie undurchsichtige Barrieren zwischen den einzelnen Kammern und lassen Sie sie während der gesamten Eingewöhnungsphase an Ort und Stelle. Übertragen Sie ein Subjekt in die zentrale Versuchskammer und lassen Sie es sich mindestens 1 Stunde vor dem Test akklimatisieren.
      HINWEIS: Die Eingewöhnungszeit für die repräsentativen Ergebnisse wurde auf 3 Stunden festgelegt. Die Eingewöhnungsphase ist notwendig, damit die Tiere sich von momentanem Transferstress erholen und sich vor Verhaltenstests an die Umgebung der Kammer anpassen können.
    2. Zu Beginn der Akklimatisierungsphase werden die sozialen Reize in die flankierenden Stimuluskammern platziert. Zentriere die künstlichen sozialen Reize in der linken Reizkammer und übertrage einen kleinen Schwarm von 4 Fischen (2 Männchen und 2 Weibchen ähnlicher Größe, Alter und Vertrautheit) in die rechte Stimuluskammer.
      HINWEIS: Die Positionen der künstlichen sozialen Reize und der lebenden sozialen Reize waren im vorliegenden Protokoll festgelegt und nicht ausgeglichen, da frühere Studien33,34 keinen Effekt der Stimulusposition mittels OTFST festgestellt haben. Ein Gegengewicht in diesem Fall würde erfordern, die Anzahl der für die Forschung verwendeten Tiere unnötig zu verdoppeln, was den "3R" der Tierversuche widerspricht. Dieses Protokoll bietet Flexibilität hinsichtlich der Art der zu testenden Reize, z. B. statische Modelle, sympatrische oder neuartige Spezies usw.
    3. Während der Akklimatisierung werden alle Kammern mit lebenden Tieren mit einer tauchbaren Heizung (eingestellt auf 26 °C), einem Blasenstein, der mit der Aquarienluftpumpe verbunden ist, und einem Beckendeckel ausgestattet, um stabile Haltebedingungen zu gewährleisten. Entferne die Heizungen und Bubbler-Steine, bevor du eine experimentelle Sitzung startest.
  2. Experimentelle Tests
    1. Verifizieren Sie den Aktivitätsstatus der sozialen Reize, die in jedem der Flankentanks getestet werden, sowie der Testperson im mittleren Tank. Verwenden Sie die einzelne Kamera im mittleren Tank, um für jedes Testobjekt Videos aufzunehmen.
      HINWEIS: Die repräsentativen Ergebnisse dieses Protokolls sind eine Replikation einer einzigen Bedingung aus Velkey et al.33 , um die Präferenz von Zebrafischen zwischen sozialen Reizen mit niedriger Treue (mobile Modelle) und hochpräzisen (lebenden Schwarmen) zu testen.
    2. Öffnen Sie das OBS Studio, um mit der Aufnahme einer Session zu beginnen. Vergrößern Sie die mittlere Kameraansicht, sodass sie den Bildschirm füllt, indem Sie auf die Ecken des Videos klicken und ziehen. Wähle unten rechts auf dem Bildschirm unter Steuerung 'Aufnahme beginnen'.
    3. Unmittelbar nach Beginn der Aufnahme werden die undurchsichtigen Barrieren über das Flaschenzugseilsystem entfernt. Nehmen Sie 10 Minuten weiter auf und lassen Sie das Subjekt gleichzeitig beiden sozialen Reizen ausgesetzt sein, während es sich frei in der mittleren Versuchskammer bewegt.
    4. Beenden Sie die Sitzung, indem Sie unter Controls Stop Recording auswählen. Greifen Sie auf aufgezeichnete Sitzungen zu, indem Sie im linken oberen Menü Datei auswählen und im Dropdown-Menü Aufnahmen zeigen auswählen.
      HINWEIS: Die daraus resultierenden Videos liefern unstrukturierte Daten, die für verschiedene Analysen geeignet sind.
    5. Lebende Fische in Aufbewahrungsbecken überführen, das Wasser aus allen drei Kammern entfernen, gründlich mit Wasser spülen (vermeiden Sie, dass Wasser zwischen den polarisierten Filmen kommt), jede Kammer mit 5 % Zitronensäure besprühen, um zu desinfizieren, die Kammern über Nacht an der Luft trocknen lassen und zu Beginn des folgenden Versuchstages ausspülen, bevor sie wieder auf die Prüfbank gestellt werden.

4. Erfassung strukturierter Daten für Analysen

  1. Wählen Sie eine Bewegungsanalyse-Software aus (z. B. DeepLabCut; siehe https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut). Installieren Sie DeepLabCut auf dem Computer und folgen Sie der Benutzeranleitung bei https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html. Siehe die Informationen und das Benutzerhandbuch der ausgewählten Software für weitere Hinweise, falls Sie DeepLabCut nicht verwenden.
  2. Laden Sie vier bis fünf Videos in DeepLabCut zum Modelltraining und extrahieren Sie 20–30 Bilder pro Video. Definieren Sie mindestens drei primäre Verfolgungspunkte (z. B. Kopf, Trunk, Tail) und trainieren Sie das Netzwerk, diese Punkte über Frames hinweg zu verfolgen.
    HINWEIS: Für weitere Informationen konsultieren Sie bitte den DeepLabCut-Benutzerhandbuch unter https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html. Die repräsentativen Ergebnisse verwenden 22 Frames, die aus fünf Videos mit 3 Tracking-Punkten beschriftet sind.
  3. Verwenden Sie ein auf ResNet-101 basierendes neuronales Netzwerk, um das Modell zu trainieren. Bestimmen Sie die Anzahl der Iterationen, die zum Abschluss des Trainings erforderlich sind (zwischen 100.000 und 200.000 werden empfohlen). Bestimmen Sie einen p-Cutoff-Wert zwischen 0,5 und 1.
    HINWEIS: Für die repräsentativen Ergebnisse wurden 150.000 Iterationen verwendet, um das Modell mit einem p-Cutoff von 0,7 zu trainieren. Wenn das trainierte Netzwerk unter die 0,7 p-Grenze fällt, wird das Erhöhen des Videokontrasts oder die Änderung der Beschriftungskonvention dieses Problem beheben.
  4. Setzen Sie das vollständig trainierte DeepLabCut-Modell auf die verbleibenden experimentellen Videos ein. Extrahieren Sie Positionsdaten für jede Studie. Folgen Sie der Benutzeranleitung auf https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html.
    HINWEIS: Für die repräsentativen Ergebnisse validierten wir mit 2 Shuffles und stellten fest, dass der Testfehler 2 Pixel betrug: Zug 4 Pixel (mit einer Bildgröße von 1600 x 820 Pixeln). Das Netzwerk wurde dann genutzt, um die experimentellen Videos aus dem aktuellen experimentellen Setup zu analysieren.
  5. Verwenden Sie Programmiersoftware wie Python, um die Bewegung über die drei vertikalen Arenazonen gleicher Breite zu definieren und zu analysieren, um Präferenzen zu quantifizieren. Missen Sie die Zeit in der Zone an mindestens zwei Körperpunkten innerhalb der identifizierten Zone, um das Spurenrauschen zu reduzieren. Verwenden Sie die Formel: Gesamtzeit in der Zone = (Gesamtzahl der Frames in der Zone)/(Gesamtbildanzahl).
  6. Wenn ein Maß für Thigmotaxis gewünscht ist, quantifizieren Sie die Zonen durch die gesamte Körperlänge eines Zebrafisches aus den Beckenwänden, was eine Messung der passiven Tendenz der Versuchspersonen liefert, nahe einer vertikalen Grenze zu bleiben. Diese Maßnahme ist am besten für relativ größere Versuchsbecken geeignet.
  7. Verwenden Sie dieselbe Codiersoftware, um die Zeit zu definieren und zu messen, die bewegungslos verbracht wird (z. B. beim Einfrieren). Definieren Sie den Schwellenwert der Bewegung bei 2–5 Pixel pro Bild mit einer Mindestanzahl aufeinanderfolgender Frames von 15 Bildern.
    HINWEIS: Für die repräsentativen Ergebnisse wurde das Einfrieren mit einem Schwellenwert von 3 Pixel pro Bild für 15 Bilder identifiziert.
  8. Erstelle und exportiere Messgrößen für statistische Analysen und Visualisierungen.
    HINWEIS: Für die Datenanalyse siehe https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts. Wir

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Ergebnisse

Um die oben beschriebenen kostengünstigen Methoden zu validieren, wurde eine Bedingung aus den in Velkey et durchgeführten Experimenten AL.33 wurde mit dem heutigen kostengünstigen System repliziert. Die Probanden (N = 23, 11 Männer und 12 Frauen) wurden mit den künstlichen bewegten mobilen (niedrig-treuen) sozialen Reizen links und den lebenden Shoal-(hoch-treuen) sozialen Reizen rechts (Abbildung 2) präsentiert; da frühere

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Diskussion

Das aktuelle Protokoll zeigt, dass die derzeitige kostengünstige Anpassung des 3-Kammer-OTFST zuverlässig die soziale Präferenz erwachsener Zebrafische an der Zeit in der Zone charakterisieren kann. Mit kostengünstigen Baumaterialien, einer USB-verbundenen Webcam sowie Open-Source-Erfassungs- und Analysesoftware replizierte das vorliegende System erfolgreich die Erkenntnis, dass Zebrafische eine Schwärme lebender Artgenossen gegenüber weniger präzisen beweglichen Modellen bevorzugen. Die...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Planung der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; bei der Erstellung des Manuskripts; oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Danksagungen

Die Autoren möchten Rommel Pagkalinawan, Robby Buck, Elizabeth Hiltz, Haley Dewitt, Maia Tankersley, Alexis Thai-Nguyen, Grady Fleming, Jacob Young und Jack Medlin vom FishLab-Team der Christopher Newport University für ihre Beiträge zur Tierhaltung und Datenerhebung für das Validierungsexperiment danken. Die Autoren möchten Samantha Commons außerdem für ihre Unterstützung während ihres Community Captains Summer 2025 Program danken, einschließlich der Inventarisierung aller Komponenten des bestehenden kostenintensiven Setups sowie des kostengünstigen Setups. Die Autoren möchten außerdem dem Office of Student Research and Creative Activity der Christopher Newport University für die Finanzierung der K.K. im Rahmen des Undergraduate Summer Scholars Program danken. Abbildung 2 wurde in BioRender von Kinslow, K. (2025) erstellt. https://BioRender.com/wbf0wph.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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10-Gallon AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100110010gekauft bei lokalem Tierbedarf (1 bis 4)
12 Stücke 1-Zoll-T-RohrschellenJoyHua Trade, ChinaASIN #B0DF19DJF1gekauft bei Amazon.com (1)
2-polige ElektrodoseSigma Engineered Solutions, Raleigh, NC, USA# 14350gekauft bei lokalem Baumarkt (1)
3/4" silberfarbener metallischer elektrischer (EMT) Leitungsschlauch – 10 FußWheatland Tube, Inc., Wheatland, PA, USA #0550110000gekauft bei lokalem Baumarkt (3)
3-adriges KabelUtilitech, Inc., Charlotte, NC, USAUT010710gekauft bei lokalem Baumarkt (1)
3-polige SteckdoseEaton, Inc., Beachwood, OH, USA#270W-SP-LWgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
3-Wege-LuftventilPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModell VN3gekauft bei lokalem Tierbedarf (1)
A4-Karton (weiß), laminiertvariiertvariiertgekauft im Campus-Buchladen (2)
Aktiver Biofilter Penguin 100Spectrum Brands Pet, LLC, Blacksburg, VA, USA#PF00100Bgekauft bei lokalem Tierbedarf (1 bis 4)
LuftsteinePenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModell AS6Qgekauft bei lokalem Tierbedarf (3)
Aquarium-LuftschläuchePenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModell STD8gekauft bei lokalem Tierbedarf (1)
Schwarze Stoff-Doppelbettwäsche (167,6 cm x 243,8 cm)Royale Linens, Inc., Melville, NY, USA#00011342258875gekauft bei Amazon.com (3)
Brio 4k WebcamLogitech International S.A., Lausanne, Schweiz960-001419gekauft bei Amazon.com (1 bis 3)
Computer (ausreichend für den Betrieb von Open Broadcaster Studio & 1-3 Webcams)Dell, Inc., Round Rock, TX, USAOptiPlex Micro 7010gekauft bei dell.com (1)
Dimmbares lichtemittierendes Halbleiter (LED)-FlachlichtLithonia Lighting-Acuity Brands, Inc. Conyers, GA, USACTCL-153P-WHgekauft bei Amazon.com (1)
E-Z Up Staub-Eindämmungs-Stange (2er Pack)Trimaco, Inc., Cary, NC, USA# 00047034547330gekauft bei Amazon.com (1)
Fußmontage-SchnurvariiertVariesgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
Lineare PolarisationsfilterB&H Foto & Electronics, Inc., New York, NY USARosco #7300online gekauft (7)
Open Broadcaster SoftwareOBS Projectv32.0.0heruntergeladen von https://obsproject.com (1)
Polycarbonat-Folie (0,38"/9,6 mm dick)Spectraglass, ltd., Perth, SchottlandUPC # 608037376817gekauft bei Amazon.com (1)
Polyvinylchlorid (PVC)-Zement, 4 oz KanisterThe AZEK Co, Chicago, IL, USA#ARAD0004OZgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
Rahmenloses 5,5-Gallonen-AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100541424gekauft bei lokalem Tierbedarf (3)
Selbstklebende weiße Kunststofffolie CON-TACT Brand, La Miranda, CA, USA#16F-C9A952-06gekauft bei lokalem Baumarkt (1)
Schieberegler-Dimmer-SchalterLutron, Inc., Cooperburg, PA, USA#LECL-150H-WHgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
kleine SeilrollevariiertVariesgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
Submersible 50W-Heizgeräte (eingestellt auf 26C)Aqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100106251gekauft bei lokalem Tierbedarf (3 bis 7)
Super Clamp Kamera-MontageJINSUI, ChinaX0040GEYLRgekauft bei Amazon.com (1 bis 3)
Tetra Whisper 10 Aquarium-LuftpumpeSpectrum Pet, Home & Garden, Inc., Middleton, WI, USAUPC #046798778516gekauft bei lokalem Tierbedarf (1)
Wetterfeste 2-polige ElektrodoseHubbell, Inc., Shelton, CT, USA#MM2420Cgekauft bei lokalem Baumarkt (1)
Weiße PVC-Folie 1/4" x 24" 48"Royal Building Products, Bristol, TN, USA#3101gekauft bei lokalem Baumarkt (2)
Weißes PVC-Trimmbrett, nominal 1 x 2 (0,75" x 1/5" x 96")Royal Building Products, Bristol, TN, USA#7832-8gekauft bei lokalem Baumarkt (1)

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