Intrakranielle Brustkrebs-Hirnmetastasen Mausmodell zur Charakterisierung von Immun- und Stromzellen in Meningen und Olfaktorischen Bulben

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt Brustkrebsmetastasen im Gehirn mittels intrakranieller Impfung fest und charakterisiert durch Flusszytometrie wichtige lymphatische und Immunzell-Subsets, die die Hirnimmunität regulieren. Diese Analysen liefern Einblicke in die Dynamik der Immun- und Stromazellen, die die Gehirnmikroumgebung prägen, und unterstützen die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien.

Zusammenfassung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) ist von spezialisierten Immunschnittstellen umgeben, darunter die Meningen und der Riechbulb, die sowohl als erlaubte Wege für metastasierte Kolonisierung als auch als Zugangspunkte für anti-tumorale Immunantworten dienen können. Das Verständnis, wie sich die Dynamik von Immunzellen innerhalb dieser Strukturen während des metastatischen Fortschreitens entwickelt, ist entscheidend, um Mechanismen zu identifizieren, die das Tumorwachstum im Gehirn unterstützen oder einschränken. Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines Brustkrebs-Hirnmetastasen (BCBM)-Mausmodells durch intrakranielle Injektion von E0771-Brustkrebszellen in C57BL/6-Mäuse. Nach der Entwicklung des Tumors werden die Meningen und der Geruchsbulb sorgfältig seziert, enzymatisch verdaut und zu einzelligen Suspensionen verarbeitet. Diese Populationen werden anschließend mittels multiparametrischer spektraler Flusszytometrie analysiert, um lymphoide, myeloide und stromale Zell-Subsets innerhalb der ZNS-assoziierten Immunnischen umfassend zu charakterisieren. Dieser Workflow ermöglicht vergleichende Analysen zwischen tumortragenden und nicht-tumortragenden Kontrollgruppen und identifiziert Veränderungen innerhalb der ZNS-Immunschnittstellen, die der Tumorimmunumgehung zugrunde liegen und potenzielle therapeutische Ziele darstellen könnten. Insgesamt bietet das Protokoll einen reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung von BCBM und zur Untersuchung der Immunregulation an ZNS-peripheren Immunsystem-Schnittstellen. Es kann für weitere Krebszelllinien, Immuntherapien oder genetische Mausmodelle angepasst werden, um Immunresistenzmechanismen und therapeutische Reaktionen im Gehirnmikroumfeld zu untersuchen.

Einleitung

Hirnmetastasen sind die häufigsten bösartigen Tumore, die das zentrale Nervensystem (ZNS) betreffen und häufiger auftreten als primäre Hirntumore. Lungenkrebs, Brustkrebs und Melanom sind die Hauptkrebsarten, die am häufigsten^{ins Gehirn} metastasieren. Unter diesen stellen Brustkrebs-Hirnmetastasen (BCBM) eine große klinische Herausforderung dar, die 10–30 % der Patienten mit metastasierender Erkrankung betrifft und aufgrund verbesserter systemischer Therapien und Fortschritte in der Neuroimaging² eine zunehmende Häufigkeit zeigt. Die Prognose für Patienten mit BCBM bleibt schlecht, da verfügbare Behandlungen – einschließlich Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie – überwiegend palliativ sind und neurologische Symptome die Lebensqualität stark beeinträchtigen³. Obwohl gezielte Therapien und Immuntherapien als komplementäre Strategien erforscht werden, bleibt der klinische Nutzen der Immuntherapie bei Hirnmetastasen begrenzt ^4,5,6.

Jüngste Arbeiten haben unser Verständnis der Gehirnimmunität verfeinert und das Interesse an funktionellen lymphatischen Bahnen, die mit dem ZNS assoziiert sind, einschließlich lymphatischer Gefäße in den Meningen⁷ und der Nasenschleimhaut⁸, neu erneuert. Diese Strukturen bilden ein kontinuierliches lymphatisches Netzwerk, das das Gehirn umgibt und sich neben dem Riechbulb und der Cribriformplatte erstreckt und schließlich mit den zervikalen Lymphknoten verbunden ist. Dieses System spielt eine Schlüsselrolle bei der Flüssigkeitshomöostase, der Immunüberwachung und dem Zelltransport zwischen dem ZNS und peripheren lymphoiden Organen⁹. Mit dem wachsenden Interesse an immuntherapeutischen Ansätzen bei Hirntumoren und Metastasen zeichnen sich diese lymphatisch-immunen Schnittstellen als vielversprechende, aber noch wenig erforschte Wege heraus, über die systemische Immunität mit intrakraniellen Läsionen kommunizieren kann. Darüber hinaus sind die Mechanismen, die die Rekrutierung von Immunzellen in der Mikroumgebung des Gehirntumors steuern, und wie diese Zellen in dieser einzigartigen Umgebung interagieren, weiterhin schlecht verstanden. Zusammen unterstreichen diese Lücken die Notwendigkeit präklinischer Modelle und Verfahren, die eine umfassende Analyse von Tumor-Immun-Interaktionen ermöglichen und die Entwicklung von Strategien zur Verbesserung der Anti-Tumor-Immunität gegen Hirnmetastasen unterstützen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Erzeugung eines reproduzierbaren, immunkompetenten BCBM-Mausmodells durch stereotaxische intrakranielle Inokulation von E0771-Zellen mit der Isolierung und Dissoziation der Meningen und des Riechbulbus zur Immunophenotypisierung mittels spektraler Flowzytometrie kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht kontrollierte Modellierung von BCBM, um die Sicherheit und Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu bewerten, und ermöglicht eine tiefgehende Charakterisierung von Immun- und Strompopulationen an der lymphatisch-immunen Schnittstelle im Gehirn, wodurch Einblicke in die zellulären Akteure gegeben werden, die das Mikroumfeld des Gehirntumors prägen und die Behandlungsreaktionen beeinflussen.

Tiermodelle bleiben für die Untersuchung von Hirnmetastasen unverzichtbar, da viele kritische Aspekte des metastatischen Fortschreitens nicht in vitro repliziert werden können. Mehrere in-vivo-Mausmodelle wurden entwickelt, um Gehirnmetastasen zu erzeugen, jeweils mit spezifischen Vorteilen und Einschränkungen¹⁰. Spontane Metastasenmodelle, einschließlich orthotopischer Implantation oder gentechnisch veränderter Mausmodelle, ahmen den klinischen Krankheitsverlauf stärker nach, verursachen jedoch selten intrakranielle Läsionen, benötigen lange experimentelle Zeiträume und zeigen aufgrund weit verbreiteter extrakranieller Erkrankungen oft eine hohe Variabilität. Systemische Ansätze, darunter intrakardiale, intrakarotis- oder Schwanzvenen-Injektionen, führen Tumorzellen in den Kreislauf ein und ahmen hämatogene Verbreitung, Blut-Hirn-Schrank-Exvasation und Kolonisierung besser nach. Diese Modelle erfassen jedoch nicht die frühen Schritte der primären Tumorinvasion und erzeugen häufig umfangreiche und variable extrakranielle Metastasen, insbesondere in der Lunge. Unter den systemischen Modellen hat die intrakarotisartige Injektion die geringste Variabilität, erfordert jedoch fortgeschrittene chirurgische Expertise. Alternativ bietet die intrakranielle Injektion mehrere Vorteile, darunter eine präzise Kontrolle der Tumorposition, eine schnelle und reproduzierbare Tumorentwicklung sowie eine geringere Variabilität zwischen den Experimenten. Dieser Ansatz kann auch durch eine orthotopische primäre Tumorimplantation gefolgt von einer chirurgischen Entfernung ergänzt werden, um den metastatischen Verlauf genauer nachzuahmen. Obwohl die intrakranielle Injektion die vollständige metastatische Kaskade nicht wiederholt und nicht zur Untersuchung früher Invasion und Verbreitung geeignet ist, bietet sie ein robustes Modell zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit gegen etablierte Läsionen und zur Untersuchung von Interaktionen innerhalb der Gehirnmikroumgebung. Eine bekannte Einschränkung besteht darin, dass die Injektion selbst lokale Neuroentzündungen auslösen kann, was möglicherweise die Immunwerte beeinflusst, die durch den Vergleich von Immunprofilen bei injizierten und nicht injizierten Mäusen bewertet werden können.

Die Immuncharakterisierung der Meningen und des Riechbulbus bleibt ein relativ neues und wenig erforschtes Forschungsgebiet. Die meisten Studien basieren auf Proben¹¹ des gesamten Gehirns oder des Halswirbels, die die besondere zelluläre Zusammensetzung und spezialisierten Immunfunktionen dieser lymphatisch assoziierten Gewebe nicht erfassen. Die Wiederherstellung beider Strukturen bietet einen umfassenderen und informativeren Blick auf das Gehirnimmun. In Kombination mit multiparametrischer spektraler Flusszytometrie unterstützt dieser Workflow eine Hochdurchsatzprofilierung zahlreicher und seltener Immunzellpopulationen, die an der ZNS-peripheren Immunkommunikation beteiligt sind. Dazu gehört die Quantifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Markern, um Zelluntergruppen zu identifizieren, Aktivierungszustände zu bewerten und behandlungsinduzierte Veränderungen zu bewerten. Weitere Methoden für die CNS-Immunanalyse, die nicht von diesem Protokoll abgedeckt werden, sind Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF), die die räumliche Verteilung von Immunzellen erhalten, aber durch niedrige Marker-Multiplexing, subjektive Quantifizierung und Unterrepräsentation seltener Zelltypen¹² begrenzt sind. In jüngerer Zeit hat die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) die Möglichkeit erweitert, ZNS-Immunpopulationen zu profilieren, indem sie die Entdeckung zellulärer Zustände und Transkriptionsprogramme in hoher Auflösung ermöglicht. Trotz der Bereitstellung leistungsfähiger transkriptomischer Einblicke ist scRNA-seq durch Kosten, Dissoziationsartefakte, Transkriptverlust und Verlust der Proteinauflösung^13,14 begrenzt. Die Flowzytometrie bietet zwar keine räumliche Analyse und ist empfindlich gegenüber dissoziationsbezogenen Effekten, bietet aber eine überlegene phänotypische Auflösung durch ein fortschrittliches multiparametrisches Panel und eine robuste quantitative Immunprofilierung.

Zusammen bieten die hier beschriebenen Methoden eine flexible und leistungsstarke Plattform zur Modellierung von BCBM und zur Untersuchung der Immundynamik an den lymphatischen Schnittstellen des ZNS, um die präklinische Entwicklung von Therapien zu unterstützen, die sowohl die Mikroumgebung des Gehirntumors als auch die zugehörigen immunregulatorischen Signalwege ansprechen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien der Fakultät für Pharmazie der Universität Lissabon durchgeführt. Die Protokolle wurden von der portugiesischen zuständigen Tierschutzbehörde Direção-Geral de Alimentação e Veterinária überprüft und genehmigt (Referenz 0421/000/000/2021).

1. Vorbereitung von E0771-Zellen für die In-vivo-Einnistung

1. In einer sterilen Haube werden E0771-Zellen in einer T75-Flasche mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert, ergänzt mit 10 % (v/v) fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Penicillin und Streptomycin (PEST).
   1. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nach Erhalt des Lieferanten durch STR-Profilierung authentifiziert und routinemäßig als mykoplasmafrei bestätigt werden. Kultivieren Sie Tumorzellen mindestens 2–8 Passagen nach dem Auftauen vor der Hirnimplantation.
2. Am Tag der Einnistung sollten die Zellen gesund und zu 80–90 % zusammenfließen. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Gib Trypsin in die Flasche und bebrüte sie 5 Minuten bei 37 °C. Dann wird das Dreifache des Volumens des ergänzten Mediums hinzugefügt (DMEM mit 10 % v/v FBS und 1 % v/v PEST), um Trypsin zu neutralisieren und die Zellen zu dissoziieren.
4. Zellzellen in ein Rohr übertragen und bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. Entferne das Supernatant und suspendiere das Pellet in PBS für die Zellzählung.
5. Zentrifugiere erneut (300 x g für 5 Minuten), entsorge Supernatant und suspendiere die Zellen in PBS mit einer Konzentration von 1 x 10 5 E0771-Zellen in 2 μL pro Tier. Lassen Sie die Zellsuspension bis zur Tumorimpfung auf Eis. Bereiten Sie die Zellsuspension unmittelbar vor der Injektion vor.

2. Intrakranielle Tumorimpfung mit einem stereotaxischen Apparat

1. Besorge weibliche C57BL/6 Mäuse (6–8 Wochen alt) und gewöhne sie mindestens 7 Tage vor der Operation an die Tierklinik. Halten Sie Hausmäuse unter kontrollierten Bedingungen mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus und stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum bereit.
   HINWEIS: Mindestens fünf Tiere pro Versuchsgruppe werden empfohlen, um eine ausreichende statistische Stärke für eine sinnvolle vergleichende Immunprofilierung zwischen tumortragenden und Kontrollzuständen sicherzustellen.
2. Bereiten Sie das Operationsfeld und alle erforderlichen Materialien vor Beginn des Eingriffs vor:
   1. Chirurgische Instrumente: Skalpellklingen, Schere, Pinzette, Nadelhalter, Nahtdraht.
   2. Ausrüstung und andere: stereotaxisches Instrument, Glasspritze, Bohrer, Rasierer, Wattestäbchen, Heizkisse.
   3. Anästhesie: Ketamin-Xylazin (K-X) (25 mg/mL bzw. 2 mg/mL) in PBS in einer 15-mL-Röhre herbereiten.
   4. Analgesie: Buprenorphin mit 15 μg/mL in PBS in einem 15-mL-Röhrchen herbereiten.
   5. Weitere Lösungen: Povidon-Jod, Wasserstoffperoxid 3 % v/v (H₂O₂), Augensalbe.
      VORSICHT: H₂O₂ ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und kann Hautreizungen verursachen.
3. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von K-X (100 μL pro 10 g Körpergewicht). Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Ausbleiben einer Reaktion auf den Zehenkniff.
4. Tragen Sie auf beide Augen eine Augensalbe auf, um Dehydrierung zu vermeiden, und legen Sie die Maus während des gesamten Eingriffs auf ein Heizkissen.
5. Rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen.
6. Reinigen Sie den freiliegenden Schädel mit H₂O₂ mit einem Wattestäbchen in einer kreisenden Bewegung, um Bregma zu visualisieren. Wenn zu viel Schaum auftritt, entfernen Sie ihn mit einem trockenen Abstrich.
7. Positioniere die Maus im stereotaxischen Rahmen. Setze das Bregma als Referenzpunkt (0,0) und messe 2,5 mm seitlich und 0,5 mm vorne zum Bregma. Markiere die Injektionsstelle.
8. Entfernen Sie die Maus und bohren Sie ein kleines Loch an den markierten Koordinaten. Vermeiden Sie es, zu tief zu bohren, um Hirnschäden zu vermeiden.
9. Befestige die Spritze am Injektor. Cellen werden wieder suspendiert und die Glasspritze mit genügend Volumen für zwei Injektionen (4–5 μL) geladen. Bereiten Sie nicht mehr als zwei Injektionen gleichzeitig vor, um Zellablagerungen zu vermeiden.
10. Die Maus wird in der Stereotaktik neu positioniert, die Nadel mit dem Loch ausgerichtet und langsam bis zu einer Tiefe von 3,0 mm in das Hirnparenchym abgesenkt. Injizieren Sie Zellen (oder sterile PBS zur Scheinkontrolle) bei 1 μL/min.
11. Nach der Injektion die Nadel mindestens 1 Minute an Ort und Stelle halten, 1,5 mm zurückziehen, eine weitere Minute halten und dann vollständig zurückziehen. Dies minimiert den Rückfluss und gewährleistet eine ordnungsgemäße Zellablagerung.
12. Schließen Sie den Schnitt mit Nähten und tragen Sie Povidon-Jod auf. Buprenorphin (100 μL) subkutan verabreichen.
13. Halten Sie die Maus bis zur vollständigen Erholung von der Narkose auf einem Heizkissen. Bringen Sie die Maus zurück in einen sauberen Käfig und überwachen Sie täglich Beschwerden, neurologische Anzeichen oder Infektionen.

3. Maus-intrakardiale Perfusion

1. Betäuben Mäuse durch Injektion von K-X (100 μL pro 10 g Körpergewicht). Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Ausbleiben einer Reaktion auf den Zehenkniff.
2. Mit einer Schere machen Sie einen 5–6 cm langen Schnitt durch die Bauchwand und zwei Schnitte durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Achte darauf, keine größeren Blutgefäße durchzuschneiden.
3. Mit freiliegendem Herzen schneiden Sie den rechten Vorhof, um den Blutfluss zu ermöglichen. Injizieren Sie eiskaltes PBS mit einer 20-ml-Spritze mit einer 25-ml-× 1-Zoll-Nadel in den linken Ventrikel.
4. Stoppen Sie die Perfusion, wenn die austretende Flüssigkeit frei von Blut ist. Bei erwachsenen Mäusen benötigt er etwa 20 mL PBS.

4. Isolierung der Maus-Meninge und des Riechblöds

1. Nach der intrakardialen Perfusion wird die Maus mit einer chirurgischen Schere enthauptet. Entfernen Sie die Kopfhaut vollständig, um den Schädel freizulegen.
2. Mit einer Schere schneidet man den Schädel in der Querebene vom hinteren Bereich zu den Augen ab und achtet dabei darauf, das darunterliegende Hirngewebe nicht zu schädigen. Entfernen Sie das Gehirn vorsichtig mit einer feinen Pinzette, ohne Kontakt mit oder Abkratzen an der inneren Schädeloberfläche zu vermeiden.
3. Nach der Hirnentfernung bleiben die Dural-Meningen an der inneren Schädeloberfläche befestigt. Tauchen Sie den Schädel mindestens 5 Minuten in eiskaltes PBS, um eine intakte Trennung der Meningen zu ermöglichen.
4. Sezieren Sie die Riechkugel aus dem vorderen Bereich des Gehirns und übertragen Sie sie in eiskalten PBS zur vorübergehenden Lagerung bis zur Verarbeitung.
5. Mit einer fein spitzen Pinzette lösen Sie die Meningen vorsichtig von der inneren Schädeloberfläche, indem Sie die dünne Gewebeschicht vorsichtig anheben und abziehen. Übertragen Sie die Meningen in eiskalten PBS bis zur weiteren Verarbeitung. Vermeiden Sie das Zerreißen des Gewebes, um eine optimale Zellrückgewinnung nachgeschaltet zu gewährleisten.

5. Gewebedissoziation in Einzelzellen

1. Meningen
   1. Meninge in 3 mL RPMI 1640 übertragen, die 0,05 % Kollagenase II und DNase I enthalten. Inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 °C, wobei alle 10 Minuten sanft bewegt wird. Eine Überverdauung verringert die Lebensfähigkeit der Zellen und sollte vermieden werden.
   2. Führe verdautes Gewebe durch ein 40 μm Zellsieb in ein 50-mL-Rohr. Dissoziiere das verbleibende Gewebe mechanisch, indem du vorsichtig mit einer Spritze auf das Sieb drückst und waschen mit 5 mL PBS.
   3. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Supernatant entsorgen und das Pellet in 3 mL PBS wieder suspendieren.
   4. Wiederhole die Zentrifugation. Überlagerungsmittel entsorgen, das letzte Pellet im verbleibenden Volumen wieder suspendieren und auf eine U-untere 96-Well-Platte übertragen.
2. Olfaktorische Bulb
   1. Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch mit einem Spritzenpümpel. Fügen Sie 3 ml Verdauungslösung mit 0,02 % Kollagenase II in Hanks' Balanced Salt Lösung (HBSS) hinzu. 20 Minuten bei 37 °C bebrüten und alle 10 Minuten sanft umrühren.
   2. Zellsuspension wird durch ein 70-μm-Sieb in ein 50-mL-Rohr geleitet und mit 10 mL PBS gewaschen.
   3. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge Supernatant und suspendiere das letzte Pellet im verbleibenden Volumen wieder. Auf eine U-untere 96-Well-Platte übertragen.
3. Die Platten bei 4 °C aufbewahren, bis sie gefärbt sind.
   HINWEIS: Führen Sie die Färbung am selben Tag durch, um eine optimale Zelllebensfähigkeit sicherzustellen.

6. Zellfärbung und Erwerbung der Durchflusszytometrie

1. Panel-Design
   1. Bitte siehe Tabelle 1.
      HINWEIS: Das Panel in diesem Protokoll wurde für ein spektrales Durchflusszytometer konzipiert, das mit 4 Lasern (violett, blau, gelb-grün und rot) sowie insgesamt 51 Detektoren (48 Fluoreszenz + 3 Streukanäle) ausgestattet ist. Das Panel muss basierend auf der Konfiguration des Durchflusszytometers und den interessierenden Proteinen/Markern gestaltet werden.
2. Zellfärbung
   1. Zentrifugieren Sie die U-unteren 96-Bohrlochplatten bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Sorgfältig Supernatant entsorgen. Von diesem Schritt an schützen Sie die Platten vor Licht.
   2. Füge 50 μL Viabilitätsfarbe (FVD, Verdünnung 1:5000 in PBS) zu geeigneten Bohrlöchern hinzu und inkubiere 20 Minuten bei RT. Wasche mit 150 μL PBS, zentrifugiere bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorge Supernatant. Füge nur Viability-Farbstoff zu Viability-Kontrollen und Proben hinzu.
   3. Blockieren Sie Fc-Rezeptoren, indem Sie Zellen mit 30 μL Anti-CD16/CD32-Antikörper (0,01 μg/mL im FACS-Puffer: PBS mit 2 mM EDTA und 0,5 % BSA) für 10 Minuten auf Eis inkubieren. Waschen Sie mit 170 μL FACS-Puffer, zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie Supernatant.
   4. Fügen Sie 30 μL Antikörpermischungen oder einfarbige Kontrollen hinzu (hergestellt gemäß den in der Materialtafel im FACS-Puffer aufgeführten Antikörperverdünnungen) und inkubieren Sie 20 Minuten auf Eis. Waschen Sie mit 170 μL FACS-Puffer, zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie Supernatant.
   5. Cellen mit 100 μL 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 Minuten bei RT fixieren. Mit 100 μL PBS waschen, bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren und Supernatant entsorgen.
      HINWEIS: Für intrazelluläre Marker ersetzen Sie diesen Schritt durch Fixierung und Permeabilisierung mit einem kommerziellen Pufferset und führen Sie dann eine intrazelluläre Färbung durch, bevor die endgültige Resuspension erfolgt.
   6. Finale Zellpellets in 200 μL FACS-Puffer wieder suspendieren. Platten bei 4 °C aufbewahren, bis sie auf das Durchflusszytometer aufgenommen werden.
3. Einfarblich gefärbte und Fluoreszenz-Minus Eins (FMO)-Kontrollen
   1. Einfarbige Proben sind für die Entmischungsoptimierung erforderlich. Zellen werden für einfarbig gefärbte Proben verwendet, die Marker mit positiven und negativen Spitzen zeigen. Andernfalls wird die Verwendung von Kompensationsperlen bevorzugt und empfohlen, um eine optimale Entmischung zu erzielen. Bereiten Sie Kompensationsperlen für fluoreszierend konjugierte Antikörper gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
      HINWEIS: Die Vorbereitung von FMO-Kontrollen ist ein wichtiger Schritt, um eine ordnungsgemäße Begrenzung zu erreichen, insbesondere für Marker, die keine klaren positiven und negativen Spitzen zeigen. Bereiten Sie bei Bedarf mehrere FMO-Proben für verschiedene Fluorochrome vor.
   2. Bereiten Sie FMO-Proben für Zelloberflächenantigene vor, indem Sie den Schritten in Teil 6.2 folgen, aber den interessierenden Antikörper in Schritt 6.2.4 aus der Antikörpermischung ausschließen.
4. Aufnahme und Analyse der Flowzytometrie
   1. Schalten Sie das Zytometer EIN, starten Sie die Durchflusszytometer-Erfassungssoftware und bereiten Sie die Qualitätskontroll- (QC)-Perlen (1 Tropfen in 300 μL PBS) in einem 12 x 75 mm großen Proberohr vor, während die Maschine erwärmt wird (mindestens 30 Minuten).
   2. Reinigen Sie das Instrument durch Laufen: 3 Minuten 10 % V/V Bleichmittel, 30 Minuten H₂O bei hoher Durchflussrate. Setze die Durchflussrate für die nächsten Schritte wieder auf niedrig.
   3. Wählen Sie den QC-Tab, laden Sie das Rohr und lassen Sie die Perlen durch Start laufen. Sobald die Qualitätskontrolle abgeschlossen ist, erscheint eine Meldung mit der Aufschrift "Passed".
   4. Gehe zum Erwerbungsreiter, wähle oder erstelle das Experiment und starte die Erfassung, indem du Zellen nach FSC und SSC gating. Besorge unbefleckte und einfarbige Steuerungen, starte den Entmisch-Assistenten und speichere die Einstellungen. Besorge weiterhin gefärbte Proben.

Ergebnisse

Nach der intrakraniellen Inokulation von E0771-Zellen entwickelten Mäuse eine lokalisierte Brustkrebsläsion an den angestrebten stereotaxischen Koordinaten. Die stereotaxischen Koordinaten, die auf das striatale Parenchym abzielen (2,5 mm lateral, 0,5 mm vor dem Bregma und 3,0 mm ventral vom Bregma) wurden auf Basis von Standard-Mäushirnatlassen und zuvor beschriebenen intrakraniellen Implantationsansätzen^15,16 ausgewählt. Dieser Bereich wird häufig für die intra...

Diskussion

Durch die Kombination der intrakraniellen Tumorimplantation mit der Isolation, Dissoziation und Immuncharakterisierung der Meningen und des Riechkolbens ermöglicht dieses Protokoll eine detaillierte Untersuchung des dynamischen Zusammenspiels zwischen der Mikroumgebung des Gehirntumors und ZNS-assoziierten Immunschnittstellen. Die Methode ermöglicht reproduzierbare intrakranielle Tumorbildung, hochwertige Zellsuspensionen und eine robuste Auflösung von Immunsystem-Subsets. Die intrakrani...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphin
Cell strainer 40-µm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-µm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Wasserstoffperoxid 34,5 bis 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamin
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyd (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphat-gepufferter Saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazin
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable