Methodenartikel

Etablierung eines standardisierten Protokolls der Wirbelsäulen-Pinching-Manipulation für ein Rattenmodell für pädiatrisches Asthma

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DOI:

10.3791/70623

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1. Oktober 2026

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1College of Acupuncture and Massage, Nanjing University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein standardisiertes Protokoll für die Wirbelsäulenquetschmanipulation (SP) in einem Asthmamodell an jungen Ratten vor. Dieses Protokoll verringerte die Atemwegsentzündung, Hyperreagibilität und Remodeling in einem OVA-induzierten Asthmamodell. Die Studie könnte die Grundlage für die mechanistische Erforschung und klinische Übertragung bilden.

Zusammenfassung

Asthma ist die häufigste chronisch-entzündliche Atemwegserkrankung bei Kindern und zeichnet sich durch eine chronische Atemwegsentzündung, eine Hyperreagibilität der Atemwege (AHR) und eine Umbildung der Atemwege aus. In der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist die Wirbelsäulenquetschmanipulation (SP) eine weit verbreitete pädiatrische Massagetechnik zur Behandlung von Asthma und anderen kindlichen Erkrankungen. Trotz einer klinischen Anwendungsgeschichte von über 1.000 Jahren ist SP außerhalb Chinas weitgehend unbekannt. Zudem sind die zugrundeliegenden Wirkmechanismen von SP bislang unzureichend beschrieben. Dieser Artikel beschreibt ein praktikables und standardisiertes Protokoll für SP, das die wesentlichen Verfahren der klinischen Praxis nachbildet. Die Anwendung des Protokolls verbesserte die Atemwegsentzündung, die AHR und die Umbildung der Atemwege in einem juvenilen Rattenmodell des Asthmas. Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, wurden wichtige Verfahrensparameter standardisiert, darunter der Fingereindruck, die Manipulationsfrequenz, die Anzahl der Wiederholungen und die Dauer der Intervention. Das standardisierte Protokoll dieser Studie kann als Referenz für weitere Forschungsarbeiten zur Standardisierung von SP und ihren zugrundeliegenden Mechanismen bei experimentellem pädiatrischem Asthma dienen.

Einleitung

Die pädiatrische Asthma bronchiale zeichnet sich durch eine chronische Atemwegsentzündung, Atemwegshyperreagibilität (AHR) und Atemwegsremodeling1,2 aus. Sie beginnt häufig im frühen Kindesalter und ist die häufigste chronische Erkrankung bei schulkindlichen Kindern. Zu den derzeit üblichen konventionellen Therapien gehören inhalative Kortikosteroide, β₂-Rezeptoragonisten, Leukotrien-Rezeptorantagonisten und biologische Therapien3,4. Weltweit erreichen jedoch nur 44,1 % der Kinder und 55,4 % der Jugendlichen mit Asthma eine ausreichende Krankheitskontrolle5. Zudem kann die wiederholte Gabe systemischer oder inhalativer Kortikosteroide bei Kindern mit schlecht kontrolliertem Asthma zu Wachstumsstörungen beitragen6.

Als traditionelle äußere Therapieform ist die Massage (in China auch als Tuina bekannt) kostengünstig, gut verträglich und im Allgemeinen als sicher für Kinder anzusehen. Massage wird seit langem sowohl in China als auch in westlichen Ländern zur Vorbeugung und Behandlung von kindlichem Asthma eingesetzt7. Systematische Übersichtsarbeiten und Metaanalysen berichten über positive Ergebnisse der Massagebehandlung bei der Therapie von kindlichem Asthma7,8. Die Wirbelsäulenquetsch-Manipulation (SP) ist eine klassische und weit verbreitete Technik in der traditionellen chinesischen kindlichen Massage. Laut der Theorie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) führt die Stimulation des Gouverneur-Gefäßes (GV) und der Blasen-(BL-)Meridiane entlang des Rückens zu einer Modulation der Zang-Fu-Organfunktion, wodurch die systemische Homöostase aufrechterhalten und Krankheiten verhindert oder behandelt werden9,10,11. Frühere Studien zeigten, dass SP nicht nur atopische Symptome und Anzeichen bei Kindern verbessert, sondern auch die chronische Atemwegsentzündung in einem jungen Rattenmodell des Asthmas verringert12,13,14. Neben ihrer klinischen Anwendung wird SP häufig als hausbasierende Gesundheitsintervention praktiziert11,15. Trotz einer klinischen Geschichte von über eintausend Jahren ist SP außerhalb Chinas immer noch relativ unbekannt, und ihre zugrundeliegenden Mechanismen wurden bisher nicht umfassend erforscht. Daher sind standardisierte Tiermodelle unerlässlich, um die Wirkmechanismen von SP aufzuklären und deren breitere wissenschaftliche Bewertung und Anwendung zu unterstützen.

Mehrere Studien haben standardisierte Massageprotokolle für die Tierversuchsforschung etabliert. Eine frühere Studie entwickelte ein standardisiertes Protokoll zum Streichen des Rückens oder Bauches mit einer Geschwindigkeit von etwa 20 cm/s und einem Druck von 100 mm H₂O, um kardiovaskuläre excitatorische Reaktionen zu hemmen16. Kürzlich wurde gezeigt, dass wiederholte unidirektionale taktile Stimulation der Wirbelsäule entlang des GV mit einem mechanischen Stimulator die synaptische Umgestaltung im medialen präfrontalen Kortex eines Mausmodells der Autismus im Jugendalter fördert. In diesem Protokoll wurde ein mäßiger Druck von etwa 30–50 g mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 15,3 cm/s angewendet, ohne Unbehagen oder Verletzungen zu verursachen. Die Stimulation wurde zweimal täglich über einen Zeitraum von 10 Minuten über 21 Tage hinweg unidirektional von der kaudalen Region zum Nacken (okzipitalen Region) durchgeführt17. Allerdings unterscheidet sich manuelle Manipulation grundlegend von mechanischer Stimulation, und derzeit gibt es kein mechanisches Gerät, das die charakteristischen Bewegungen der SP reproduziert. Außerdem, obwohl mehrere Studien die Mechanismen der SP in Rattenmodellen von Asthma und anderen pädiatrischen Erkrankungen untersucht haben18, wurde bisher kein standardisiertes Protokoll etabliert, das die für die SP in Tierversuchen erforderliche Stimulationskraft und -geschwindigkeit definiert. Daher ist die Entwicklung eines standardisierten SP-Protokolls unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und mechanistische Untersuchungen zu erleichtern.

Allergisches Asthma ist das häufigste Phänotyp des kindlichen Asthmas19. Demzufolge sind Ovalbumin-(OVA-)Sensibilisierung und -Provokation die am weitesten verbreiteten Methoden zur Erstellung eines experimentellen Modells des kindlichen Asthmas20. Ratten eignen sich besonders zur Untersuchung manueller Therapieverfahren, da ihre größere Körpergröße eine manuelle Beeinflussung erleichtert. Außerdem bilden Rattenmodelle zuverlässig wesentliche pathologische Merkmale des allergischen Asthmas ab, einschließlich einer Th2-gerichteten Entzündung, AHR und der Umbildung der Atemwege21.

Frühere Studien zeigten, dass SP die Atemwegsentzündung bei jungen Ratten nach OVA-Sensibilisierung und -Provokation verringerte11,14. Daher hatte die vorliegende Studie die Etablierung eines standardisierten SP-Protokolls für ein Modell kindlicher Asthmaerkrankung an jungen Ratten zum Ziel, um zukünftige Untersuchungen der zugrundeliegenden Wirkmechanismen von SP zu erleichtern. Dieses standardisierte Protokoll bietet einen reproduzierbaren experimentellen Rahmen für mechanistische Studien sowie zukünftige translationsmedizinische Forschung zu SP in Tiermodellen der kindlichen Asthmaerkrankung.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Ausschuss für Tierversuche und Tierversuchstierhaltung der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin genehmigt (Nr. 202306A032). Alle Verfahren wurden gemäß den Leitlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labor­tieren sowie den ARRIVE-2.0-Leitlinien durchgeführt.

Es wurden dreißig 3 Wochen alte männliche spezifizierungs­pathogenfreie (SPF) Sprague-Dawley-(SD)-Ratten mit einem Gewicht von 45–55 g verwendet. Die Tiere wurden (drei pro Käfig) in einer SPF-Barrieranlage bei einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel, einer Temperatur von 22 ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30 %–40 % gehalten und hatten freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Basierend auf früheren Studien mit jungen Rattenmodellen des Asthmas11,14 wurde die Stichprobengröße so festgelegt, dass die Anzahl verwendeter Tiere gemäß dem Reduktionsprinzip der 3R minimiert wurde. Nach einer 7-tägigen Eingewöhnungsphase wurde das Ausgangsgewicht erfasst, und jeder Ratte wurde eine eindeutige Identifikationsnummer zugewiesen. Die Ratten wurden entsprechend ihrem Ausgangsgewicht stratifiziert und anschließend innerhalb jeder Schicht mithilfe einer Zufallszahltabelle einem von fünf Gruppen zugeordnet, wobei ein Zuordnungsverhältnis von 1:1:1:1:1 (n = 6 pro Gruppe) galt: Kontrolle (CN), Asthma (AS), Asthma + SP (AS+SP), Asthma + Methylprednisolon (AS+MP) sowie Asthma + SP + Methylprednisolon (AS+SP+MP). Die Zufallszuordnung und Gruppenzuweisung wurde von einem Untersucher erstellt, der nicht an den anschließenden Interventionen oder der Beurteilung der Ergebnisse beteiligt war.

Die Einschlusskriterien waren gesunde männliche SPF-SD-Ratten im Alter von 3 Wochen mit einem Ausgangsgewicht von 45–55 g, die ein normales Atemmuster aufwiesen und regelmäßige körperliche Aktivität zeigten. Ratten wurden ausgeschlossen, wenn sie Anzeichen einer Erkrankung zeigten oder während der Eingewöhnungsphase eine Abweichung des Körpergewichts von >20 % vom Kohortenmittelwert aufwiesen, oder wenn sie vor Abschluss der Interventionsphase verstarben. Während des gesamten Verfahrens wurde angemessene persönliche Schutzausrüstung getragen, einschließlich Laborkittel, Einwegmaske und Handschuhe. Tierische Kadaver und Gewebe wurden in zweilagige Biohazard-Beutel gelegt und vor der Entsorgung bei −20 °C gelagert. Kontaminierte Einstreu wurde als biohazardöser Feststoffabfall entsorgt, und scharfe Gegenstände wurden in zugelassenen durchstichsicheren Behältern für scharfe Gegenstände entsorgt. Zur terminalen Geweegewinnung wurde 20 %iges Urethan (5 mL/kg, i.p.) verabreicht, und eine tiefe Narkose wurde durch das Fehlen der Flexionsreflexe der Pfote und des Hornhautreflexes bestätigt.

1. Aufbau des Asthmamodells an jungen Ratten

HINWEIS: Das folgende Verfahren wurde verwendet, um das Asthmatikumodell an jungen Ratten zu etablieren12.

  1. Bereiten Sie die OVA/Al(OH)₃-Suspension unmittelbar vor jeder Injektion frisch zu. Lösen Sie 2 mg OVA der Klasse V direkt in 1 mL 4 % Al(OH)₃-Gel auf und wirbeln Sie die Mischung im Vortex, bis eine homogene Suspension vorliegt.
    ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass die Suspension vor der Injektion homogen ist. Falls eine Ausfällung auftritt, wirbeln Sie die Mischung kurz erneut im Vortex, um sie wieder aufzususpenderen. Lagern Sie die Suspension auf Eis und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Stunden nach der Herstellung.
  2. Injizieren Sie am 1., 8. und 15. Versuchstag jeweils 1 mL der OVA/Al(OH)₃-Suspension intraperitoneal. Injizieren Sie den Ratten der CN-Gruppe gemäß dem gleichen Zeitplan 1 mL sterile Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
  3. Reizen Sie die Ratten vom 21. bis zum 42. Versuchstag mit einer 2 %igen Lösung von OVA der Klasse II mittels eines Ultraschallverneblers. Führen Sie die letzten beiden aufeinanderfolgenden Reizungen mit 3 % OVA durch, um nach der Sensibilisierung eine Verschlimmerung auszulösen.
  4. Führen Sie die Vernebelung an jedem zweiten Tag über einen Zeitraum von 30 Minuten innerhalb von 3 Wochen durch. Stellen Sie jede Ratte einzeln in eine verschlossene Expositionsbox, die mit dem Ultraschallvernebler verbunden ist (Ultraschallfrequenz: 1,7 MHz ± 10 %; Vernebelungsrate: ≥3 mL/min; Partikeldurchmesser: <5 µm).
    ANMERKUNG: Überprüfen Sie den erfolgreichen Aufbau des Asthmamodells durch Beobachtung von Niesen, Kopfnicken während der Atmung, Mundatmung, Kontraktion der Bauchmuskulatur und Giemen.

2. Bedienung und Anwendung der Finger-TPS-Systemsoftware

  1. Stecken Sie den Sensorstecker senkrecht in die Leiterplatten-Schnittstelle. Verbinden Sie die Leiterplatte mit dem Computer über ein ca. 40 cm langes USB-C-Kabel, um ausreichende Betriebsflexibilität zu gewährleisten.
  2. Desinfizieren Sie die Hände und Fingerschoner. Stecken Sie Daumen und Zeigefinger der rechten Hand des Bedieners in die mit Sensoren ausgestatteten Fingermanschetten. Positionieren Sie die flexiblen Sensoren über der Mitte der Fingerkuppen und stellen Sie einen engen, faltenfreien Hautkontakt sicher.
  3. Führen Sie die Systemkalibrierung und Qualitätskontrolle für die Kraftmessung durch
    1. Überprüfen Sie die Sensoren und Anschlusskabel vor jeder Trainingssitzung des Bedieners und stellen Sie sicher, dass das Gerät ordnungsgemäß verbunden ist.
    2. Wählen Sie „N“ als Maßeinheit und stellen Sie den Messbereich auf −3,5 bis 32 N ein.
    3. Stellen Sie sicher, dass keine äußere Kraft auf die Sensoren wirkt. Führen Sie die „Tare“-Funktion aus, um das System zu nullen.
    4. Aufzeichnung der unbelasteten Grundlinie für 30 s. Beginnen Sie die Kraftmessung erst, wenn die Schwankungen der Grundlinie unter 0,02 N bleiben.
    5. Wiederholen Sie den Nullabgleich jedes Mal, wenn die Sensorposition oder die Spannung der Manschetten angepasst wird oder wenn eine Drift der Grundlinie beobachtet wird.
    6. Verwenden Sie das Finger-TPS-System, um die aufgebrachte Kraft während des Bedienertrainings zu überwachen. Halten Sie während des Rückwärtsstreichens eine Kraft von 5 ± 0,6 N und während der SP eine Kraft von 12 ± 2 N ein, wobei die vorgeschriebene Geschwindigkeit und Frequenz beibehalten werden muss.
    7. Die Kraftkurve wird nur akzeptiert, wenn die Grundlinie stabil bleibt, keine Signalunterbrechung oder Sättigung auftritt und die aufgebrachte Kraft innerhalb der vorgegebenen Zielbereiche liegt.
  4. Führen Sie die Rückwärtsstreichbewegung und die SP durch, während Sie die dynamische Kraftkurve überwachen. Passen Sie die Spannung der Fingermanschetten nach Bedarf an, bis eine stabile Kraftkurve erzielt wird.
  5. Üben Sie die Manipulationen unter Beobachtung der Echtzeit-Kraftkurve. Halten Sie während des Rückwärtsstreichens eine Zielkraft von 5 ± 0,6 N und eine Geschwindigkeit von etwa 5 cm/s ein, und während der SP eine Zielkraft von 12 ± 2 N bei einer Frequenz von 6–8 Wiederholungen/min. Der Bediener gilt erst dann als kompetent, wenn fünf aufeinanderfolgende Übungsversuche die Kriterien für Technik der Manipulation, Fingerkraft und SP-Frequenz erfüllen.
    HINWEIS: Der Bediener gilt erst als qualifiziert, wenn er die Zielkraft und Bewegungsparameter konsistent erreicht. Entfernen Sie die Fingerschoner vor der eigentlichen SP-Prozedur, um zusätzliche taktile Stimulation der Ratten zu vermeiden. Bei der Übernahme dieses Protokolls als Referenz für die SP-Studie sollten jedoch keine der in dieser Studie durchgeführten Tests zur interindividuellen Reproduzierbarkeit berücksichtigt werden.

3. Detaillierte Vorgehensweise der Dornquetschung

  1. Halten Sie die Ratte in Bauchlage sanft auf einer Handfläche. Stützen Sie die Vordergliedmaßen, indem Sie vorsichtig die vorderen Achselhöhlen mit Daumen und Zeigefinger umschließen, und lassen Sie die Vordergliedmaßen natürlich herabhängen. Achten Sie darauf, dass die Ratte ruhig bleibt und gleichmäßig atmet. Wenn Lautäußerungen, Gegenwehr oder Defäkation auftreten, lassen Sie die Ratte los und geben Sie ihr 2–3 Minuten Zeit, um sich anzupassen, bevor Sie sie erneut positionieren (Abbildung 1).
  2. Streichen Sie zweimal mit den rechten Zeige-, Mittel- und Ringfingern entlang des Governor Vessel (GV) vom Schulterbereich bis zur Schwanzwurzel. Wenden Sie eine Kraft von etwa 5 N an, um die Ratte vor der SP zu beruhigen.
  3. Zupfen Sie mit dem rechten Daumen dorsal und den Zeige- und Mittelfingern ventral die Haut an der Schwanzwurzel. Heben Sie die Haut sanft an, drehen und bewegen Sie die Finger dann kranial entlang der Wirbelsäule in Richtung Dazhui (GV14). Vermeiden Sie offensichtliche Anzeichen von Unbehagen. Halten Sie einen Fingerdruck von etwa 12 N aufrecht und führen Sie die Manipulation mit einer Frequenz von 6–8 Wiederholungen/min durch. Führen Sie 15 Wiederholungen vom ersten bis zum 21. Versuchstag und 25 Wiederholungen vom 22. bis zum 44. Tag durch.
  4. Wiederholen Sie den in Schritt 3.2 beschriebenen Streichvorgang auf dem Rücken, um die Behandlungssitzung abzuschließen und die Ratte zu beruhigen.
    HINWEIS: Laut der Theorie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) wird die SP entlang der Wirbelsäule durchgeführt, um die GV- und BL-Meridiane zu stimulieren (Abbildung 2). Der GV verläuft entlang der dorsalen Mittellinie von der Schwanzwurzel bis zu Dazhui (GV14), während das BL-Meridian etwa 3–6 mm seitlich zur Mittellinie liegt, abhängig von der Körpergröße22. Dazhui (GV14) befindet sich in der Mitte zwischen der siebten Halswirbel und dem ersten Brustwirbel. Erhöhen Sie die Anzahl der SP-Wiederholungen mit dem Alter, um dem klinischen Behandlungsprotokoll nachzueifern. Während des Rückenstreichens sollte die Ratte entspannt bleiben, ruhig atmen und kein Abwehrverhalten zeigen. Während der SP ist eine leichte Bogenstellung des Rückens und das Spreizen der Schnurrhaare zu erwarten, jedoch keine stressbedingte Harnentleerung, Defäkation, heftige Gegenwehr, Lautäußerungen oder Fluchtversuche.

4. Interventionsprotokolle

  1. Wiesen Sie Ratten der CN-Gruppe keine krankheitsspezifische Intervention zu. Führen Sie die Ratten sanft für die gleiche Dauer wie die AS+SP-Gruppe, um Handling-Effekte zu kontrollieren. Verabreichen Sie intraperitoneal physiologische Kochsalzlösung (1 mL/kg) nach dem gleichen Zeitplan wie bei Methylprednisolon-Injektionen.
  2. Unterziehen Sie Ratten der AS-Gruppe einer OVA-Sensibilisierung und -Provokation. Wenden Sie die gleichen Handling- und Kochsalzlösungs-Injektions-Kontrollverfahren an, die für die CN-Gruppe verwendet wurden.
  3. Unterziehen Sie Ratten der AS+SP-Gruppe einer OVA-Sensibilisierung und -Provokation. Wenden Sie das SP-Protokoll einmal täglich vor der Modellinduktion an.
  4. Unterziehen Sie Ratten der AS+MP-Gruppe einer OVA-Sensibilisierung und -Provokation. Verabreichen Sie Methylprednisolon (10 mg/kg; 2 mg/mL in Kochsalzlösung hergestellt) mittels intraperitonealer Injektion 30 Minuten vor jeder OVA-Provokation.
  5. Unterziehen Sie Ratten der AS+SP+MP-Gruppe den gleichen Verfahren wie der AS+MP-Gruppe. Wenden Sie das SP-Protokoll einmal täglich vor der Methylprednisolon-Injektion an.
    HINWEIS: Mit Ausnahme der AS+SP- und AS+SP+MP-Gruppen wenden Sie bei allen anderen Gruppen die gleichen Handling-Verfahren an, um unspezifische Handling-Effekte zu kontrollieren. Verwenden Sie für alle Injektionen sterile Einwegspritzen und entsorgen Sie die Nadeln in stichsicheren Spitzenschutzbehältern. Führen Sie die intraperitoneale Injektionsnadel seitlich zur Bauchmittelachse ein, um das Risiko einer viszeralen Verletzung zu minimieren. Um taktile Stimulation in den Nicht-SP-Gruppen zu kontrollieren, streicheln Sie die Ratten täglich viermal während der gleichen Intervention wie die SP-Gruppe. Wenden Sie die gleiche Streicheltechnik entlang des Rückens an wie bei den SP-Gruppen.

Ergebnisse

Das Körpergewicht ist ein wichtiger Indikator für das Wachstum junger Ratten. Vor der experimentellen Behandlung wurden keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht zwischen den fünf Gruppen beobachtet. Nach der Induktion des Asthma-Modells wies die AS-Gruppe ein signifikant geringeres Körpergewicht auf als die CN-Gruppe (P = 0.000; Abbildung 3A). Im Vergleich zur AS-Gruppe zeigte die AS+SP-Gruppe ein signifikant höheres Körpergewicht (P = 0.008; Abbildung 3A), während die AS+MP-Gruppe keinen signifikanten Unterschied aufwies (P = 0.975; Abbildung 3A). Ebenso zeigte die AS+SP+MP-Gruppe im Vergleich zur AS-Gruppe keinen signifikanten Anstieg des Körpergewichts (P = 0.925; Abbildung 3A). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass SP während der Asthma-Modellierung im Kindesalter und der Behandlung mit Methylprednisolon (MP) das Körpergewichtszunahme bei jungen Ratten fördert.

Nach der OVA-Herausforderung zeigten Ratten der CN-Gruppe keine Anzeichen von Atemnot, einschließlich Kurzatmigkeit, Niesen, Kopfnicken, Mundatmung, Kontraktion der Bauchmuskulatur oder Keuchen. Im Gegensatz dazu wiesen Ratten der AS-Gruppe typische Manifestationen von kindlichem Asthma auf, darunter Kurzatmigkeit, Niesen, Kopfnicken und Mundatmung. Diese klinischen Symptome ließen sich nach Behandlung mit SP, MP oder deren kombinierter Anwendung deutlich abschwächen.

Um die entzündungshemmenden Wirkungen von SP bei jungen Ratten mit experimentellem Asthma zu bewerten, wurden Lungenproben nach tiefer Anästhesie mit 20 % Urethan (5 mL/kg, i.p.) gemäß zuvor beschriebenen Verfahren12 entnommen. Die Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung und die Analyse der Expression proinflammatorischer Gene dienten der Beurteilung einer chronischen Atemwegsentzündung, während die Masson-Färbung zur Evaluierung der Atemwegsremodelierung eingesetzt wurde. Die Atemwegshyperreagibilität (AHR) wurde mittels Ganzkörperplethysmographie (WBP) durch Messung der verstärkten Pausen (Penh) bestimmt.

Nach routinemäßigen HE- und Masson-Färbungsverfahren23 wurden Lungen­schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und hinsichtlich der peribronchiolären Entzündung anhand einer modifizierten 0–4-Skala bewertet24. Die Asthma-Modellgruppe wies signifikant höhere Entzündungswerte auf als die CN-Gruppe (P = 0,000). Im Vergleich zur AS-Gruppe zeigten die Gruppen AS+SP, AS+MP und AS+SP+MP jeweils signifikant verminderte Entzündungswerte (P = 0,005, P = 0,006 bzw. P = 0,000), ohne dass zwischen den drei Behandlungsgruppen signifikante Unterschiede bestanden (Abbildung 4A, Tabelle 1).

Die Umbauprozesse der Atemwege wurden durch Quantifizierung der Kollagenablagerung um die Bronchiolen herum mittels Masson-Färbung bewertet. Die Kollagenablagerung wurde als auf den Umfang der Basalmembran normalisierter, kollagenpositiver Bereich ausgedrückt (µm2/µm). Die AS-Gruppe wies eine signifikant stärkere Kollagenablagerung auf als die CN-Gruppe (P = 0,000). Im Vergleich zur CN-Gruppe zeigten die AS+SP- und die AS+MP-Gruppe eine moderat erhöhte Kollagenablagerung (P = 0,050 bzw. P = 0,051), jedoch signifikant geringere Werte als die AS-Gruppe (P = 0,001 für beide Vergleiche). Die AS+SP+MP-Gruppe zeigte keinen signifikanten Unterschied zur CN-Gruppe (P = 0,105), wies jedoch im Vergleich zur AS-Gruppe eine signifikant verminderte Kollagenablagerung auf (P = 0,001). Zwischen den drei Interventionsgruppen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (Abbildung 4B, Tabelle 1).

In Abbildung 5 dargestellte repräsentative Kraftkurven, die mit dem Finger-TPS-System gewonnen wurden. Während des Bedienertrainings blieb die während des Zurückstreichens aufgezeichnete Kraftkurve bei etwa 5 N stabil (Abbildung 5A), während die während SP aufgezeichnete Kraftkurve wiederholte Kraftspitzen zeigte, die der Klemmmanipulation entsprechen, wobei die aufgebrachte Kraft innerhalb des vorgegebenen Zielbereichs gehalten wurde (Abbildung 5B). Diese Kraftprofile veranschaulichen die standardisierten Krafteigenschaften, die während des Bedienertrainings verwendet werden.

Die gesamte experimentelle Zeitleiste ist in Abbildung 6 zusammengefasst. Nach der 7-tägigen Eingewöhnungsphase wurde die OVA-Sensibilisierung gemäß dem festgelegten Zeitplan durchgeführt, gefolgt von wiederholten OVA-Herausforderungen. SP wurde während des vorgesehenen Interventionszeitraums den Gruppen AS+SP und AS+SP+MP verabreicht, während Methylprednisolon vor der OVA-Herausforderung in den entsprechenden Behandlungsgruppen appliziert wurde. Die WBP-Beurteilung und die Geweegewinnung erfolgten nach der letzten Herausforderung (Abbildung 6).

Die Ganzkörperplethysmographie wird häufig zur Beurteilung des Penh bei wachen, nicht fixierten Nagetieren eingesetzt, ohne dass dabei erhebliche Verletzungen oder Belastungen verursacht werden25. Obwohl Penh ein indirekter Indikator ist, der von der Atmungsdynamik und Umweltfaktoren beeinflusst wird, erfordert die direkte Messung des Atemwegswiderstands eine Anästhesie und Tracheotomie, die die Atemwegsphysiologie verändern können26. Es wurde jedoch berichtet, dass Penh mit invasiven Messungen des Lungengesamtwiderstands korreliert27. 24 Stunden nach der letzten OVA-Behandlung wurden die Ratten in nicht fixierte Kammern platziert und nacheinander Aerosol-PBS sowie Acetylcholin (Ach) in Konzentrationen von 3,125, 6,25, 12,5, 25 und 50 mg/mL ausgesetzt. Jede Aerosol-Belastung dauerte 2 min und wurde von einer 5-minütigen Aufzeichnungsphase gefolgt28. Die AS-Gruppe wies signifikant höhere Penh-Werte auf als die CN-Gruppe, während die Behandlung mit SP, MP oder deren kombinierter Anwendung die Penh-Werte signifikant senkte (P = 0,005; Abbildung 3B). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass SP die Atemfunktion bei asthmatischen Ratten verbesserte, eine Beobachtung, die noch weiterer Validierung bedarf, kombiniert mit direkten Messungen des Atemwegswiderstands (Raw).

Interleukin-4 (IL-4) initiiert eine Th2-vermittelte eosinophile Entzündung, während Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) zur AHR und zur Umbildung der Atemwege beiträgt und somit beide eine zentrale Rolle in der Pathogenese des kindlichen Asthmas spielen29. Zur weiteren Beurteilung der Atemwegsentzündung wurden die Expressionslevel von IL-4 und TNF-α in Lungengewebe mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bestimmt. Im Vergleich zur CN-Gruppe zeigte die AS-Gruppe eine signifikant erhöhte Expression von IL-4 und TNF-α (P = 0.000 bzw. P = 0.000; Abbildung 3C,D). Die Expression beider Zytokine war nach Behandlung mit SP oder MP signifikant vermindert, wobei die Kombination aus SP und MP die stärkste Reduktion bewirkte (P = 0.001 bzw. P = 0.000; Abbildung 3C,D).

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Abbildung 1: Detaillierte Vorgehensweise der Wirbelsäulenquetschung (SP) bei Ratten. (A) Die Ratte in Bauchlage auf der Handfläche des Bedieners halten. (B) Die Haut an der Schwanzwurzel einklemmen. (C) Die eingeklemmte Haut anheben. (D) Die Finger entlang der Wirbelsäule in kranialer Richtung drehen und bis zum Punkt Dazhui (GV14) vorrücken. Klicken Sie bitte hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des Governor-Gefäßes (GV), der Blasenmeridiane (BL) und des Akupunkturpunkts Dazhui (GV14) bei Ratten. Die Abbildung zeigt die anatomische Lage des GV, der BL-Meridiane und des Punktes Dazhui (GV14), die als Zielstrukturen für die Wirbelsäulenquetschungsmethode dienen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Auswirkungen der Wirbelsäulen-Eindrückmanipulation auf Körpergewicht, Atemwegsüberempfindlichkeit und pulmonale entzündliche Faktoren bei jungen Ratten. (A) Vergleich des Körpergewichts zwischen den Versuchsgruppen. (B) Vergleich der Werte für die erweiterte Pause (Penh). (C) Relative Genexpression von Interleukin-4 (IL-4) im Lungengewebe. (D) Relative Genexpression von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) im Lungengewebe. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *P < 0,05 und **P < 0,01 im Vergleich zur CN-Gruppe; #P < 0,05 und ##P < 0,01 im Vergleich zur AS-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Repräsentative histopathologische Veränderungen im Lungengewebe. (A) Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung zur Darstellung einer peribronchiolären Entzündung. (BMasson-Trichrom-Färbung zur Darstellung der Kollagenablagerung und der Umbildung der Atemwege. Die Bilder wurden bei 200-facher Vergrößerung aufgenommen× Vergrößerung. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Kraftkurven, die während der Dornenzupf-Manipulation mit dem Finger-TPS-System aufgezeichnet wurden. (A) Kraftkurve, die während der Rückwärtsstrich-Manipulation aufgezeichnet wurde. (B) Kraftkurve, die während der Dornenzupf-Manipulation (SP) aufgezeichnet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Experimenteller Zeitplan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

GruppeHE-EntzündungsscoreKollagenfläche/Basalmembranperimeter (μm²/μm)
CN1,10 ± 0,252,50 ± 0,43
AS2,32 ± 0,50**4,23 ± 0,53**
AS+SP1,66 ± 0,27##3,12 ± 0,56*##
AS+MP1,67 ± 0,31##3,12 ± 0,50*##
AS+SP+MP1,34 ± 0,27##3,01 ± 0,33##

Tabelle 1: Histopathologische Lungenbewertungsscores. Die peribronchiolare Entzündung wurde mittels HE-Färbung evaluiert und die Umbildung der Atemwege als kollagenpositiver Bereich, normiert auf den Umfang der Basalmembran, quantifiziert (µm2/µm). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SD (n = 5 pro Gruppe). *P < 0,05 und **P < 0,01 im Vergleich zur CN-Gruppe; #P < 0,05 und ##P < 0,01 im Vergleich zur AS-Gruppe.

Diskussion

Die Sensibilisierung und Provokation mit Ovalbumin (OVA) ist eines der am häufigsten verwendeten experimentellen Modelle zur Untersuchung von kindlichem Asthma30,31. Die vorliegende Studie zeigte, dass der standardisierte Wirbelsäulenquetsch-Handgriff (SP) die chronische Atemwegsentzündung, die Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR) und die Atemwegsremodeling-Prozesse abschwächte. Frühere klinische Studien haben gezeigt, dass die traditionelle kindliche Massage, einschließlich SP, Asthma und andere allergische Erkrankungen bei Kindern verbessert11,13,32. Zudem haben frühere Tierversuche nachgewiesen, dass SP die Atemwegsentzündung in jungen Rattenmodellen des Asthmas durch Modulation der Darmmikrobiota verringert12,15. Die vorliegende Studie belegte weiterhin, dass die Anwendung eines standardisierten SP-Protokolls die chronische Atemwegsentzündung, die AHR und das Atemwegsremodeling in einem jungen Rattenmodell des Asthmas verbesserte. Darüber hinaus verstärkte SP die therapeutischen Wirkungen von Methylprednisolon (MP), während es gleichzeitig dessen wachstumshemmende Nebenwirkungen reduzierte.

SP wird in China bereits seit über 1.000 Jahren praktiziert und zählt weiterhin zu den am häufigsten angewendeten Massagetechniken in der Pädiatrie zur Vorbeugung und Behandlung von Asthma und anderen kindlichen Erkrankungen12,15,33,34,35. Trotz ihrer langen klinischen Anwendungsgeschichte ist SP außerhalb Chinas immer noch relativ wenig bekannt. Nach der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin verlaufen die Du- und die Blasenmeridiane entlang oder benachbart zur Wirbelsäule und stehen in Verbindung mit den inneren Organen. Daher wird angenommen, dass die Stimulation dieser Meridiane die Funktion der inneren Organe reguliert, die Immunaktivität moduliert und die Widerstandskraft gegen Krankheiten verstärkt. SP besteht darin, die Haut entlang der Wirbelsäule zu kneifen, anzuheben, zu drehen und vorwärtszuschieben, wodurch sowohl der Du- als auch der Blasenmeridian stimuliert werden. Diese Manipulation übt gleichzeitig Druck- und Zugkräfte auf die Haut und das darunterliegende Fasziengewebe aus und erzeugt so eine moderate mechanische Stimulation. In der klinischen Praxis wird üblicherweise vor und nach SP eine sanfte Streichmanipulation auf dem Rücken durchgeführt, um die Stimulation zu mildern und den Patientenkomfort zu erhöhen. Das Rückenstreichen besteht aus sanften, abwärts gerichteten Streichbewegungen entlang des Rückens und ist in der pädiatrischen Massage weit verbreitet. Daher umfasst das standardisierte Protokoll aufgrund der Prinzipien klinischer Relevanz, Durchführbarkeit, Einfachheit und Reproduzierbarkeit sowohl die SP- als auch die Rückenstreichmanipulation.

Frühere Studien haben gezeigt, dass SP Entzündungen sowohl in der Lunge als auch im Hippocampus über immunmodulatorische Mechanismen reduziert12,36. Pädiatrisches Asthma ist gekennzeichnet durch eine Th2-geprägte Entzündung, die eng mit einer Immunstörung assoziiert ist37. Vorangegangene experimentelle Studien berichteten, dass das Streichen mit der Hand oder einem Pinsel die Immunantwort bei Mäusen regulierte, wenn es mit einem Druck von 100–150 mmH₂O (7–11 mmHg) und einer Geschwindigkeit von etwa 3 cm/s durchgeführt wurde38. Zudem wurde in einer klinischen Studie berichtet, dass Streichen mit einer Geschwindigkeit von etwa 1–10 cm/s als angenehmer empfunden wurde39. Basierend auf diesen Befunden wurde im standardisierten Protokoll eine Rückenstreichkraft von 5 ± 0,6 N und eine Geschwindigkeit von 5 cm/s gewählt, um eine angemessene beruhigende Wirkung zu erzielen. Druck, Frequenz und Anzahl der SP-Wiederholungen wurden auf Grundlage früherer Studien12,15 sowie verwandter Untersuchungen anderer Forschungsgruppen40,41 festgelegt. Obwohl frühere Studien entweder manuelles Rückenstreichen (20 cm/s; etwa 100 mmH₂O) oder mechanische GV-Stimulation (30–50 g; etwa 15,3 cm/s) standardisiert haben, um bei Nagetieren eine kardiovaskuläre Hemmung zu erreichen oder synaptisches Remodeling zu fördern, stellt manuelles SP eine eigenständige biomechanische Intervention dar, die auf taktilen und propriozeptiven Rückmeldungen beruht und daher durch bestehende mechanische Geräte nicht vollständig reproduziert werden kann. Dieser Unterschied unterstreicht die Bedeutung von standardisierten Protokollen für Anwender im Hinblick auf zukünftige translationsmedizinische Forschung zu taktilen Interventionen bei allergischem Asthma.

Zahlreiche in chinesischer Sprache veröffentlichte Studien haben gezeigt, dass SP die Immunfunktion moduliert und Entzündungen hemmt42,43,44. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand hat jedoch bisher keine Studie außerhalb der Forschungsgruppe der Autoren den Druck und die Geschwindigkeit von SP standardisiert, um eine bestimmte Erkrankung in Tiermodellen von pädiasthischem Asthma zu untersuchen. Frühere Arbeiten untersuchten die Mechanismen von SP in jungen Rattenmodellen von Asthma, einschließlich der Modulation der Darmmikrobiota, der erhöhten Produktion kurzkettiger Fettsäuren, der Verbesserung der Atemmuskelfunktion (z. B. Zwerchfellkraft) sowie der Abschwächung von Atemwegsentzündungen und pulmonaler Dysfunktion11. Die vorliegende Studie konzentrierte sich vorrangig auf die Etablierung eines standardisierten Protokolls, anstatt die zugrundeliegenden Wirkmechanismen umfassend aufzuklären. Ein hochpräzises taktil messendes Druckaufzeichnungssystem wurde verwendet, um die während des Rückenstreichens und von SP angewandte Kraft zu standardisieren, während die Geschwindigkeit und Frequenz der Manipulationen gemäß früherer Studien festgelegt wurden. Ratten wurden gewählt, da ihre Körpergröße eine stabile Handhabung und manuelle Anwendung von SP ermöglicht und dabei dem klinischen Vorgehen nahekommt. Das Rückenstreichens wurde mit den Fingern einer Hand durchgeführt, wie es in der pädiatrischen klinischen Praxis üblich ist. Aufgrund der geringeren Körpergröße der Ratten wurde SP mit drei Fingern einer Hand und nicht mit beiden Händen ausgeführt, wobei die wesentlichen biomechanischen Merkmale der klinischen Technik erhalten blieben. Diese Modifikation erzeugt eine Stimulation der GV- und BL-Meridiane im Rattenmodell, die der klinischen Situation eng entspricht. Da Messparameter zwischen verschiedenen taktilen Druckmesssystemen variieren können, könnte die Standardisierung der manuellen Manipulation anhand der Verhaltensreaktionen der Ratten während des Rückenstreichens und von SP eine höhere Reproduzierbarkeit ermöglichen als die alleinige Orientierung an gerätespezifischen Kraftmessungen. Frühere Studien zeigten zudem, dass Rückenstreichens antidepressive Wirkungen in CUMS-induzierten jungen Ratten hervorruft9, obwohl SP signifikant stärkere therapeutische Effekte erzielte. Folglich könnten die in der vorliegenden Studie beobachteten positiven Effekte teilweise auf den Beitrag der Rückenstreich-Technik zusätzlich zu den primären Wirkungen von SP zurückzuführen sein.

Mehrere Einschränkungen sollten berücksichtigt werden. Erstens war die Stichprobengröße relativ klein, was die Robustheit und Generalisierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigen könnte. Zweitens lag der Schwerpunkt der vorliegenden Studie hauptsächlich auf der Etablierung und Validierung eines standardisierten SP-Protokolls; daher wurden nur eine begrenzte Anzahl mechanistischer Endpunkte untersucht, anstatt die zugrundeliegenden biologischen Mechanismen umfassend aufzuklären. Daher erfolgte keine mechanistische Validierung – einschließlich der Zellzählung entzündlicher Zellen im Bronchoalveolären Lavagefluid (BALF), der Bestimmung von OVA-spezifischen IgE-Spiegeln, des Th2-Zytokinprofils (z. B. IL-5, IL-13) und der Analyse intrazellulärer Signalwege. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass SP die Atemfunktion bei asthmatischen Ratten verbesserte, ein Befund, der noch weiterer Validierung bedarf, kombiniert mit direkten Messungen des Atemwegswiderstands (Raw). Drittens wurden alle Handgriffe von einer einzigen geschulten Person durchgeführt, und die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen geschulten Personen wurde nicht bewertet. Schließlich wurde keine Interventionsgruppe mit ausschließlichem Rückenstreicheln eingerichtet, um die unabhängigen Effekte des Rückenstreichens von denen der SP zu unterscheiden. Künftige Studien sollten größere Stichprobengrößen umfassen, die Inter-Operator-Reproduzierbarkeit evaluieren, zusätzliche Kontrollgruppen einbeziehen und die molekularen Mechanismen, die den therapeutischen Wirkungen der SP zugrunde liegen, weiter untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie nichts offenzulegen haben. Während des Manuskripterstellungsprozesses wurden keine KI-Tools bei der Erstellung dieses Manuskripts verwendet. Die Autoren übernehmen die volle Verantwortung für Vollständigkeit und Genauigkeit des endgültigen Manuskripts.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Projektleiter Xiong Ying, Nr. 81973970, an der Nanjing University of Chinese Medicine) unterstützt. Die Autoren danken dem Institut für Pädiatrie, dem Jiangsu Key Laboratory of Children's Health and Chinese Medicine sowie dem Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research des Bildungsministeriums für die Bereitstellung von Räumlichkeiten, Instrumenten und Geräten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% Al(OH)3-GelShanxi ZHHC Biomedical Technology Co., LTD, ChinaBS010N/V
Ach (Acetylcholin)Sigma, USAA2251N/V
Adhäsions-MikroskopobjektträgerCitotest, Jiangsu, ChinaREF.188105
P/N.80312-3161		N/V
Bioabfalltüten für gefährliche StoffeNanjing Xinyuan Plastic Co., Ltd.HJ421-2008N/V
Biologische GewebetrocknungsmaschineKedee, Zhejiang, ChinaKD-HIIN/V
Biologische GewebeeinbettungsmaschineKedee, Zhejiang, ChinaKD-BMN/V
Biologische GewebeauftragsmaschineKedee, Zhejiang, ChinaKD-PIN/V
Buxco Research SystemsDSI Buxco, Wilmington, NC, USAPFTN/V
Verstellbarer Mischer (MX-S)DLAB, Beijing, China8031102000N/V
Zentrifuge für MikroplattenScilogex, USASCI-CF2800M E050S11B000798N/V
Reinraumbank Sanfa, Shanghai, ChinaSF-CJ-1AN/V
Konventionelle ZentrifugeDLAB, Beijing, ChinaD100BE: 9031001011N/V
Einweg-SterilhandschuheShanghai Kebang Medical Latex Equipment Co., Ltd.22010739https://www.sh-kebang.com/products_detail/6.html
Elektronische WaageJinghai, ShanghaiYP3001NN/V
Elektronische WaageJinghai,  Shanghai, ChinaYP3001NN/V
Finger-TPS-SystemPressure Profile System, Inc, USAAnwendbare Softwareversion: Chameleon 2018https://pressureprofile.com/body-pressure-mapping/finger-tps
 Fluoreszenz-OptikmikroskopOlympus, Tokio, JapanDP70N/V
Autoklav mit HochdruckdampfTomy, JapanSX-500N/V
Schnellzentrifuge mit KühlungEppendorf5418RN/V
Masson-Dreifachfärbungs-KitSolarbio, Shanghai, ChinaG1340N/V
Mikropipetten und sterile SpitzeneppendorfJ48931Lhttps://www.eppendorf.com/hk-en/Products/Liquid-Handling/All-Pipettes-Dispensers-Automated-Liquid-Handlers/Eppendorf-Reference2-p-PF-222171
MikrotomeLeica, DeutschlandRM2145N/V
MP (Natriumsuccinat von Methylprednisolon)Shyndec, Shanghai, ChinaH20070007N/V
NanoDrop Lite SpektrophotometerThermo Fisher Scientific, USAnd-ndl-pr-2yrw-cccN/V
 NebelungsreglerEmka, FrankreichVENT4:14554N/V
Undurchsichtige versiegelte UmschlägeNanjing Kongdu Printing Co., Ltd201701N/V
OVA (Grad II)Sigma, USAA5253N/V
OVA (Grad V)Sigma, USAA5503N/V
PCR-KitYeasen, Shanghai, China11201ES08N/V
Stichfeste KanülenabwurfboxNanjing Xinyuan Plastic Co., Ltd.KMT-15YN/V
Reverse-Transkriptions-KitBio.vazyme, Nanjing, ChinaR323N/V
Kleine ZentrifugenHettich, DeutschlandMIKRO 220R D-78532N/V
Sterile trockene WattebäuschchenZHENDE, Zhejiang, China202203121Bhttps://www.zhende.com/index.php?g=product&m=index&a=info&id=13
TrizolBio.vazyme, Nanjing, ChinaR771N/V
TiefkühllagergefrierschrankThermo Fisher Scientific, USA950GP-ULTSN/V
UltraschallverneblerJiangsu Yuwell Medical Instruments Co., Ltd., China402AIN/V
ViiATM7 Echtzeit-PCR-SystemLife TechnologiesTM, Singapur278882021N/V
GanzkörperplethysmographScrieq, Kanada1185162,1184031,1185898FV-FXM1-01, FX1-Ausatemkartusche: FV-FXM1 ET, FX1-Einatemkartusche: FV-FXM1-IA

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