Erzeugung von Polyacrylamid- und Silikon-Extrazellmatrixsubstraten mit definierter Steifigkeit für Anwendungen in der Zellbiologie

Summary

Obwohl die Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) ein entscheidender Regulator des zellulären Verhaltens ist, bleiben die zugrunde liegenden Sensor- und Transduktionsmechanismen unklar. Um dem entgegenzuwirken, stellen wir Protokolle zur Herstellung von polyacrylamid- und silikonbasierten Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit bereit, um unser Verständnis des Zell-ECM-Übersprechens zu vertiefen.

Abstract

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein entscheidender Regulator des Zellverhaltens, wobei die ECM-Steifheit als zentrales mechanisches Signal dient, das zelluläre Signale, Morphologie und Schicksal steuert. Die experimentelle Untersuchung steifkeitsabhängiger zellulärer Antworten ist jedoch oft durch die Verfügbarkeit reproduzierbarer, kosteneffizienter und zugänglicher Kulturplattformen mit präzise abstimmbaren mechanischen Eigenschaften begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt polyacrylamid- (PA)- und silikonbasierte Methoden zur Herstellung von ECM-Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit. Die Verfahren beschreiben Substratvorbereitung, Oberflächenfunktionalisierung und ECM-Proteinkonjugation, um eine konsistente Zelladhäsion über einen physiologisch relevanten Steifkeitsbereich zu gewährleisten. PA-basierte Substrate sind kompatibel mit nachgelagerten biochemischen Analysen, einschließlich Protein- und RNA-Extraktion, sowie hochauflösender Fluoreszenzbildgebung. Silikonbasierte Substrate sind für die Total Internal Reflection Fluoresescence (TIRF)-Mikroskopie optimiert, was die Visualisierung von Zell-ECM-Interaktionen an der Basalmembran ermöglicht. Darüber hinaus können weiche Substrate angepasst werden, um sphäroide Kulturen innerhalb einer konsistenten Bildebene zu unterstützen, was eine konsistente Bildaufnahme ermöglicht. Diese Methoden bieten robuste, kosteneffiziente und reproduzierbare Plattformen, um systematisch zu untersuchen, wie ECM-Steifigkeit zelluläre Prozesse reguliert, und fördern mechanistische Einblicke in Zell-ECM-Überschwung sowohl in physiologischen als auch in krankheitsbezogenen Kontexten.

Introduction

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein grundlegendes strukturelles und biochemisches Gerüst, das die mechanischen Eigenschaften von Geweben definiert und deren biologische Funktionen unterstützt. Beispielsweise sind elastische Gewebe wie Lunge und Arterien mit kollagen- und elastinbasierter ECM angereichert, die die mechanische Widerstandskraft für wiederholte Dehnungs-Rückstoßzyklen während der Atmung bietet. Im Gegensatz dazu enthält das zentrale Nervensystem glykosaminoglykanreiches ECM, das eine hochkomplizierte Umgebung schafft, die für neuronale Differenzierung und Signalübertragung optimiert^ist. Über verschiedene Gewebe im Körper hinweg reicht die Gewebesteifheit über mehrere Größenordnungen, von Hunderten von Pascals in Weichteilen wie Gehirn und Lunge bis hin zu Megapascal- und Gigapascal-Steifheiten in Sehnen und Knochen, jeweils ^2,3. Diese mechanischen Unterschiede sind nicht nur struktureller Natur, sondern spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellverhaltens ^4,5. Zum Beispiel durchlaufen mesenchymale Stammzellen eine steifkeitsabhängige Linienspezifikation, indem sie neuronale Schicksale auf weichen Substraten, myogene Schicksale auf intermediären Substraten und osteogene Schicksale auf steifen Substraten⁶ annehmen. Pathologische Veränderungen der ECM-Steifheit können ebenfalls abweichende zelluläre Reaktionen auslösen und zum Krankheitsausbruch und -verlauf beitragen ^7,8,9. Ebenso verändern Veränderungen der ECM-Eigenschaften rund um Zellen auch die Funktion der Organellen und verschiedene Zellverhaltensweisen^10,11. Trotz der anerkannten Bedeutung von ECM bei der Steuerung von Signalübertragung, Organellenfunktion und Krankheitspathogenese sind die Mechanismen, mit denen Zellen ECM-Signale erkennen und in biochemische Signale umwandeln, weiterhin unvollständig verstanden.

Der Fortschritt im Verständnis von Zell-ECM-Übersprache wurde teilweise durch die begrenzte Verfügbarkeit experimenteller Plattformen behindert, die eine präzise Kontrolle über ECM-Eigenschaften bieten und dabei vollständig kompatibel mit standardisierten biochemischen Assays und Bildgebungsabläufen bleiben. Darüber hinaus wird die Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen oft als technisch herausfordernd angesehen, da sie interdisziplinäre Expertise in Materialwissenschaften, Zellbiologie und Bioengineering erfordert. Diese Methode zielt darauf ab, diese Herausforderungen zu lösen, indem sie Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Erzeugung von PA- und silikonbasierten ECM-Substraten mit definierten mechanischen Eigenschaften bereitstellt, die in den meisten Nasslaborumgebungen leicht vorbereitet werden können.

PA-Hydrogele mit einstellbarer Steifigkeit sind Grundnahrungsmittel der Mechanobiologie; ihre Nützlichkeit wird jedoch oft durch hohe Kosten für Reagenzien für ECM-Konjugation, inkonsistente Oberflächenfunktionalisierung und schlechte Kompatibilität mit groß angelegten biochemischen Arbeitsabläufen beeinträchtigt. Darüber hinaus sind praktische und standardisierte Ansätze zur Probenentnahme und Bildgebung über Substrate mit unterschiedlicher Steifigkeit nicht gut etabliert. Diese Engpässe können mit unserer beschriebenen PA-Gel-Plattform gelöst werden, die durch vier zentrale Innovationen gekennzeichnet ist: (i) erhebliche Kostensenkung, (ii) reproduzierbare Funktionalisierungschemie, (iii) skalierbare Produktion durch wiederverwendbare Hardware und (iv) nahtlose Integration mit vielen konventionellen Zellbiologie- und biochemischen Assays. Dieser Ansatz nutzt verschiedene Verhältnisse von Acrylamid und Bisacrylamid, um Hydrogele mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften zu erzeugen (Tabelle 1). PA-Gele sind inert und konjugieren nicht direkt mit ECM-Proteinen. Daher wird eine UV-initiierte Polymerisationsreaktion mit freien Radikalen verwendet, um ein dünnes, vernetztes Netzwerk aus Di(Trimethylolpropan)-Tetraacrylat, Acrylsäure-N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Acrylat) und Bisacrylamid auf die Oberfläche von PA-Gelen zu konjugieren (Abbildung 1). Dieses Netzwerk erzeugt eine Dual-Action-Haftfläche für ECM-Proteine: Das NHS-Acrylat sorgt für eine stabile kovalente Verankerung für ECM-Proteine, während das Tetraacrylat eine einheitliche ECM-Proteinadsorption¹² ermöglicht. Darüber hinaus bieten wir Methoden an, die demonstrieren, wie Proteine und Nukleinsäuren wie RNA aus diesen Substraten auf eine Weise gewonnen werden können, die mit nachgelagerten zellbiologischen Analysen wie Western Blotting und Reverse Transcription-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) kompatibel ist. Darüber hinaus unterstützen die resultierenden kompilanten PA-Substrate auch die Bildung von Sphäroiden und positionieren Sphäroide in einer konsistenten Fokalebene, was eine systematische Analyse von 3D-zellulären Verhaltensweisen ermöglicht.

Im Gegensatz dazu schränken die optischen Einschränkungen von PA-Hydrogelen ihren Einsatz in fortgeschrittenen Bildgebungsverfahren ein, insbesondere in der Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF)^{Mikroskopie 14}. Um diese Einschränkung zu beheben, entwickelten wir mechanisch abstellbare, silikonbasierte ECM-Substrate, die für TIRF-Bildgebung optimiert sind. Diese Materialien zeigen einen Brechungsindex, der dem Glas nahekommt, während sie über einen breiten Bereich die einstellbare Steifigkeit erhalten (Abbildung 2A). Eine dünne Schicht Silikongel mit unterschiedlichen Teilverhältnissen wird vor der ECM-Konjugation auf ein Deckglas gespin-coated (Abbildung 2B und Tabelle 2). Die intrinsische Hydrophobie und chemische Trägheit von Silikon schließen jedoch eine direkte ECM-Konjugation aus. Daher implementieren wir eine Oberflächenmodifikationsstrategie, um die kovalente Anbindung von ECM-Liganden zu ermöglichen. Die Behandlung mit Sauerstoffplasma führt Hydroxylgruppen auf die Silikonoberfläche ein (Abbildung 2C). Anschließend wandelt (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) diese Hydroxylgruppen in reaktives Amin um. 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC), ein Carbodiimid-Quervernetzer ohne Länge, erleichtert dann die Bildung kovalenter Amidbindungen zwischen den Amingruppen auf der Geloberfläche und den Carboxylgruppen auf ECM-Proteinen.

Gemeinsam bieten diese ECM-Plattformen kosteneffektive, reproduzierbare und skalierbare Systeme zur Erforschung ECM-steifkeitsabhängiger Signalmechanismen. Ihre Flexibilität ermöglicht eine nahtlose Integration mit biochemischen Analysen, hochauflösender Bildgebung und Hochdurchsatz-Workflows, was die Untersuchung der Untersuchung ermöglicht, wie ECM-Steifigkeit das Zellverhalten beeinflusst und den Krankheitsverlauf antreibt.

Protocol

1. Erzeugung von PA-basierten ECM-Hydrogeln

1. Funktionalisierung von Glasoberflächen für die PA-Gel-Befestigung
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker aus. Spülen Sie zwischen den Schritten gründlich mit hochwertigem Wasser.
   1. Reinigen Sie die Glasoberflächen 3 Stunden lang mit 10 % Bleichmittel in einer chemikalienbeständigen Schale (z. B. Polystyrol). Verwenden Sie ausreichend Menge, um das Glas vollständig abzudecken und sicherzustellen, dass keine eingeschlossenen Blasen oder trockenen Stellen vorhanden sind.
      VORSICHT: Bleichmittel ist eine hochgradig korrosive und reaktive Chemikalie. Befolgen Sie die Sicherheitsanweisungen des Herstellers.
   2. Inkubieren Sie die Deckblätter 16 Stunden lang in 0,2 m Salzsäure (HCl) mit sanftem Rühren auf einem Shaker.
      VORSICHT: HCl ist sehr korrosiv und kann Hautverbrennungen verursachen. Tragen Sie geeignete PSA.
   3. Gib 0,1 M NaOH hinzu und inkubiere 1 Stunde.
      VORSICHT: NaOH-Lösungen sind korrosiv und können Hautverbrennungen verursachen. Tragen Sie geeignete PSA.
   4. Inkubieren Sie die Deckfolien in 0,5 % APTES in hochwertigem Wasser für 30 Minuten.
      VORSICHT: APTES ist giftig. Arbeiten Sie mit APTES in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA.
   5. Spülen Sie Deckfolien mit großem Wasservolumen ab, um eventuelle Rückstände von APTES zu entfernen.
      HINWEIS: Unvollständiges Waschen verursacht im nächsten Schritt eine Reaktion zwischen APTES und Glutaraldehyd und führt zu weißen Niederschlägen, die die Aktivierung der Glasoberfläche beeinträchtigen.
   6. Inkubieren Sie die Deckfolien 1 Stunde lang in 0,5 % Glutaraldehyd in PBS.
      VORSICHT: Glutaraldehyd ist giftig. Arbeiten Sie mit Glutaraldehyd in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA.
   7. Trocknen Sie die Überdeckfolien über Nacht auf saugfähigem Material (z. B. Papiertüchern). Bewahren Sie die Deckblätter bis zur Nutzung in einem sauberen, verschlossenen Behälter auf.
2. Herstellung von PA-Hydrogellösung und Gelguss
   HINWEIS: Die Formulierungen, die benötigt werden, um Hydrogele mit dem angegebenen elastischen Modul zu erhalten, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Empfohlene Gelvolumina und Glasmaße für verschiedene experimentelle Anwendungen sind in Tabelle 3 dargestellt.
   1. Mischen Sie PA-Hydrogelkomponenten in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenrohr, ohne Ammoniumpersulfat (APS) und Tetramethylethylendiamin (TEMED).
      HINWEIS: Bereiten Sie keine großen Mengen vor, da Gele mit höherer Steifigkeit schnell polymerisieren und vor Abschluss des Gießens aushärten können.
   2. Entgasen Sie die PA-Gelmischung, APS und TEMED-Röhrchen in einer Vakuumkammer bei 25 mmHg für 30 Minuten.
   3. Bereiten Sie die hydrophoben oberen Deckfolien vor, indem Sie wasserabweisende Beschichtungen mit einem Wattestäbchen reinigen. Stellen Sie sicher, dass Deckfolien frei von Flecken sind, um eine gleichmäßige Gelpolymerisation zu gewährleisten.
   4. Fügen Sie APS und TEMED in die entgaste Lösung hinzu und pipettieren Sie die Mischung dann vorsichtig auf die aktivierten Deckdecken.
   5. Legen Sie die hydrophoben Deckfolien auf die Lösung, um eine gleichmäßige, dünne Hydrogelschicht zu bilden. Lassen Sie die Gele 35 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen den Deckblättern eingeschlossen sind und die Lösung nicht über die Ränder hinausläuft.
      HINWEIS: Befolgen Sie die empfohlenen Mengen beim Gelguss, um die richtige Dicke sicherzustellen; Übermäßig dünne Gele ermöglichen es den Zellen, das darunterliegende^Glas-15 zu erkennen. Bevor Sie das Gelsandwich zerlegen, überprüfen Sie die Restmischung im Mikrozentrifugenrohr, um die Polymerisation zu bestätigen.
   6. Tauchen Sie das Hydrogel-Sandwich in PBS ein, um die Schichten zu trennen. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel am aktivierten unteren Deckglied haftet, und der hydrophobe obere Deckmantel löst sich leicht.
3. Funktionalisierung von Hydrogelen mit ECM-Liganden
   HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt müssen unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
   1. Sterilisieren Sie die Hydrogele, indem Sie sie in 70 % Ethanol eintauchen, und dann in Gewebekultur-Kunststoffwaren mit sterilem PBS übergeben.
      HINWEIS: Lassen Sie Hydrogele nicht über längere Zeit in Ethanol, da dies die Gele dehydriert und die ECM-Konjugation beeinträchtigt.
   2. Bereiten Sie eine Master-Mix-Funktionalisierungslösung vor, bestehend aus Wasser, Ethanol, HEPEES und Bisacrylamid (Tabelle 4).
      VORSICHT: Bisacrylamid ist beim Einatmen oder Einnehmen giftig.
   3. Bereite verdünnte Lösungen aus UV-Photoinitiator und Tetraacrylat vor. Beide Reagenzien sind in Ethanol gelöst (Tabelle 4).
      HINWEIS: Führen Sie jedes Mal serielle Verdünnungen von Tetraacrylat durch, da übermäßige Mengen zu Überpolymerisation und sichtbaren schwarzen Oberflächenablagerungen führen können (siehe Abbildung 3A).
   4. Wiegen Sie die erforderliche Menge NHS-Acrylat mit einer Analysewaage ab. NHS-Acrylat unmittelbar vor der Anwendung in 50 % Ethanol und 50 % Wasser resuspendieren.
      HINWEIS: Eine übermäßige Menge von NHS-Acrylat führt zur Bildung sichtbarer schwarzer Oberflächenablagerungen und kann zu einer ungleichmäßigen ECM-Beschichtung führen (Abbildung 3B).
   5. Fügen Sie UV-Photoinitiator, Tetraacrylat und NHS-Acrylatlösungen zur Hauptmischung hinzu, die in Schritt 1.3.2 hergestellt wird. Saugen Sie das PBS ab und geben Sie die Mastermischung zu den Gels, um sicherzustellen, dass sie vollständig bedeckt sind.
   6. Setzen Sie die Hydrogele (ohne Gewebekultur-Schüsseldeckel) für 400 Sekunden UV-Licht aus (UV-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von weniger als 365 nm).
      VORSICHT: Tragen Sie beim Arbeiten mit UV-Licht einen geeigneten Augenschutz.
   7. Entferne die Gels und lege sie auf Eis. Man aspiriert die Funktionalisierungslösung, dann wäscht man die Gele dreimal mit vorgekühltem sterilem 25 mM HEPES (pH 6,0), gefolgt von drei Waschen mit vorgekühltem sterilem 0,9 % NaCl.
   8. Inkubieren Sie die Hydrogele mit dem bevorzugten ECM-Liganden in vorgekühltem, sterilem 100 mM HEPES (pH 8,0) mit 100 mM NaCl über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalshaker.
      HINWEIS: Die Konzentration der ECM-Liganden kann nach Ermessen des Nutzers ausgewählt werden; es ist jedoch entscheidend, identische Ligandenkonzentrationen über alle Substrate mit unterschiedlicher Steifigkeit innerhalb derselben Charge zu halten.
   9. Aspiriere die ECM-Ligandenlösung vorsichtig 16 Stunden später. Wasche die Hydrogele dreimal mit PBS und gib serumfreies Basismedium (PBS) hinzu, um sie hydratisiert zu halten. Inkubieren Sie die Gele über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator, um die Sterilität vor der Zellaussäung zu überprüfen.
      HINWEIS: Das Substrat wird nach der nächtlichen Inkubation bei 37 °C im Basiskulturmedium trüb erscheinen, wenn eine Kontamination vorliegt.
   10. Verwenden Sie die Gele sofort für die Zellsäung oder lagern sie bei 4 °C in Basismedium für maximal 3 Wochen.

2. Erzeugung mechanisch abstimmbarer silikonbasierter ECM-Substrate

1. Herstellung von Glasdeckfolien für die Silikongelbeschichtung
   1. Reinigen Sie die Glasabdeckungen mit 3 M NaOH für 20 Minuten.
   2. Waschen Sie fünfmal gründlich mit hochwertigem Wasser und saugen Sie das Wasser am Ende ab. Lassen Sie sie an der Luft trocknen und verwenden Sie einen Stickstoffstrahl, um verbleibende Tröpfchen oder Ablagerungen zu entfernen.
2. Herstellung von Silikongel
   1. Wiegen Sie die Komponente A und Komponente B des zweiteiligen Silikonelastomers gemäß dem in Tabelle 2 angegebenen Gewichtsverhältnis mit einer analytischen Waage. Verwenden Sie eine geschnittene Pipettenspitze, um die viskosen Lösungen abzusaugen.
   2. Mischen Sie Komponente A und Komponente B gründlich mit einer Pipettenspitze, um eine vollständige Einbindung sicherzustellen.
   3. Entfetten Sie die Mischung in einer Vakuumkammer bei 25 mmHg für 10 Minuten.
3. Gelgießen auf Glasabdeckfolien
   1. Legen Sie einen Deckmantel auf eine Gummimatte auf dem Spin-Coater und sorgen Sie dafür, dass sie gut zentriert ist.
      HINWEIS: Die Gummimatte sorgt für eine ordnungsgemäße Vakuumversiegelung. Ohne eine ausreichende Abdichtung kann der Deckmantel verrutschen und brechen. Eine falsche Zentrierung kann zu einer nicht gleichmäßigen Beschichtung führen.
   2. Aktiviere den Staubsauger, um den Deckdeckel zu sichern.
   3. Geben Sie 100 μL der Gelmischung in die Mitte des Deckmantels. Spinncoat bei 500 U/min für 10 s, gefolgt von 8.000 U/min für 60 s.
   4. Backen Sie den beschichteten Deckmantel bei 80 °C für 2 Stunden. Lass sie auf Zimmertemperatur abkühlen.
      HINWEIS: Lagern Sie bis zu einem Monat bei Zimmertemperatur vor der Verwendung.
4. Funktionalisierung des Silikongels mit ECM-Liganden
   1. Setzen Sie die mit Silikongel beschichteten Überdeckfolien 5 Minuten lang mit Sauerstoffplasma bei 11 W Leistung aus.
      HINWEIS: Eine längere oder höhere Exposition gegenüber Sauerstoffplasma kann zu Rissen der Gele führen. Die optimale Kombination aus Leistung und Zeit muss je nach verwendeter Ausrüstung möglicherweise getestet werden.
   2. Bereiten Sie eine Silanisierungslösung vor, die 95 % Ethanol, 0,5 % APTES und 4,5 % dH2_{O enthält}.
      HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durch.
      VORSICHT: APTES ist giftig. Arbeiten Sie mit APTES in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA.
   3. Inkubieren Sie das gelbeschichtete Coverslip mit der Silanisierungslösung für 10 Minuten.
   4. Fünfmal gründlich mit PBS waschen.
   5. Bereiten Sie die ECM-Lösung mit 100 μg/mL EDC und dem gewünschten ECM in der gewünschten Konzentration in PBS vor.
      HINWEIS: EDC ist instabil in Lösung und empfindlich gegenüber Feuchtigkeit. Bereiten Sie es frisch vor der Verwendung vor und lagern Sie es fest geschlossen an einem kühlen, trockenen Ort, geschützt vor Feuchtigkeit und direktem Sonnenlicht.
      VORSICHT: EDC ist schädlich, wenn es geschluckt wird, und giftig, wenn es eingeatmet wird. Trage geeignete PSA und arbeite in einer Abzugshaube.
   6. Inkubieren Sie den Deckmantel mit der ECM-Lösung 1 Stunde bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C.
   7. Waschen Sie den Deckzettel fünfmal mit PBS. Spüle mit Basismedium ab und füge Zellen hinzu.
      HINWEIS: Die optimale Zelldichte hängt von der spezifischen Zelllinie und den experimentellen Zielen ab (z. B. Subkonfluent für Morphologie oder Monolayer für Zell-Zell-Adhäsion). Beispielsweise wird eine Dichte von 0,1 x 10⁶ Zellen/cm^² häufig für Fibroblasten verwendet, um innerhalb von 48 Stunden eine 50%ige Konfluenz zu erreichen.

3. Herstellung des ECM-Substrats für Immunfärbung und Bildgebung

1. Immunfärbung und Bildgebung auf PA-basierten Substraten
   HINWEIS: Achtzehn-Millimeter-PA-Hydrogele bieten in der Regel eine ausreichend abbildbare Fläche für quantitative Analysen. Für bildgebende Anwendungen werden die Hydrogele gegossen und Immunfärbung in "orangen Kammern" durchgeführt, die aus 15-ml-Röhren hergestellt werden. Verwenden Sie die orangefarbenen Kammern für mehrere Runden Gelgießen und Beizen wieder, sofern sie die strukturelle Integrität bewahren.
   1. Lochringe aus Polycarbonatfolie und Silikon-Gummifolie verwenden 18 mm Außendurchmesser und 14 mm Innenlochlochstanzen zur Herstellung von Abstandshaltern und Dichtungen.
   2. Schneide eine Öffnung in der Mitte einer 15-mL-Zentrifugenröhrenkappe mit einer Schere, um eine Kammer für Gelgießen und Färben zu schaffen.
   3. Ich habe das Zentrifugenrohr bei 14 mL gesehen. Schneiden Sie mit einem Skalpell ungleichmäßige Kanten ab und feilen Sie den Rand der Kappe, damit sie in eine Standardplatte mit 12 Öffnungen passt.
   4. Assembleren Sie das Hydrogel-Coverslip-Sandwich (wie in Abschnitt 1 beschrieben) und setzen Sie den Abstandsring auf den aktivierten Coverslip.
   5. Zerlege das Sandwich, sobald die Gele vollständig polymerisiert sind.
   6. Sterilisieren Sie die 18-mm-Hydrogele und übertragen Sie sie auf eine 12-Well-Gewebekulturplatte mit sterilem PBS.
   7. Führen Sie die ECM-Ligandfunktionalisierung wie in Abschnitt 1 beschrieben durch.
   8. Säe die Zellen aus und fixiere sie mit 4 % Formaldehyd.
      HINWEIS: Vermeiden Sie alkoholbasierte Fixativen, da sie die Gele dehydrieren und die strukturelle Integrität beeinträchtigen.
      VORSICHT: Formaldehyd ist giftig und muss immer in einer Abzugshaube verwendet werden.
   9. (Optional) Setzen Sie die Proben wieder auf die Zentrifugenröhrenkappenkammer zusammen. Verwenden Sie eine Silikondichtung, um die Kammer abzudichten.
      HINWEIS: Führen Sie mehrere Stunden vor der Färbung einen Lecktest mit PBS durch. Obwohl diese Methode mühsamer erscheinen mag, fördert sie eine gleichmäßige Färbung und reduziert den Antikörperkonsum.
   10. Führen Sie die Immunfluoreszenzfärbung gemäß den vom Nutzer bevorzugten Protokollen fort.
   11. Nach der Färbung werden Proben in PBS mit 50 % Glycerol ergänzt aufbewahrt. Fotografieren Sie die Proben so schnell wie möglich.
       HINWEIS: Vermeiden Sie Standard-Befestigungsmedien, die aushärten, da sie Hydrogele mit der Zeit reißen und Proben beschädigen können. Die Fluoreszenzintensität nimmt mit der Zeit ab; Bild innerhalb einer Woche für optimale Signalqualität.
   12. Geben Sie einen kleinen Tropfen PBS (oder Befestigungsmedium) auf die Glasbodenoberfläche einer Gewebekulturschale. Wenden Sie die gefärbten Hydrogele vorsichtig auf den Tropfen, sodass die Zellen zum Deckglas zeigen, und beginnen Sie mit der Bildgebung.
2. Immunfärbung und Bildgebung auf silikonbasierten ECM-Substraten
   1. Fixieren Sie die Proben mit 4 % Formaldehyd und färben Sie sie direkt auf eine Glasbodenschale nach einem Standard-Immunfluoreszenz-Protokoll. Vermeiden Sie alkoholbasierte Fixativen, da sie das ECM-Substrat brechen können.
   2. Bildproben direkt mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop.

4. Gewinnung von Proteinen und RNA aus Zellen, die auf ECM-Substraten plattiert sind

1. Mit einer Pinzette entferne die Gele vorsichtig aus der Kulturschale und tauche sie in steriles PBS, um restliche Kulturmedien und Serum abzuspülen.
   HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig mit den Deckblättern um, da sie äußerst empfindlich sind und leicht brechen können.
2. Tupfen Sie vorsichtig den Rand des Hydrogels auf Feuchttücher mit wenig Fussel, um überschüssiges PBS zu entfernen.
3. Fügen Sie dem Deckel einer Gewebekulturschale ein geeignetes Volumen RNA-Extraktionspuffer hinzu.
   HINWEIS: Phenol-Guanidin-basierte Reagenzien sind mit RNA-Extraktion aus PA-Gelen kompatibel. Protein-Lysepuffer können je nach experimentellen Anforderungen verwendet werden. Visualisieren Sie Proben unter dem Mikroskop nach der Inkubation des Lysepuffers, um eine vollständige Zellstörung sicherzustellen.
4. Legen Sie den Deckmantel (Gelseite nach unten) auf die Lyselösung. Heben und senken Sie das Hydrogel vorsichtig mehrmals, um eine gleichmäßige Lyse aller Zellen sicherzustellen.
5. Kratze vorsichtig die Geloberfläche, um das Lysat freizugeben.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine kommerziellen Kunststoff-Zellschürfer, da der starre Kunststoff die weichen Hydrogele beschädigen und das Lysat mit Gelstücken kontaminieren kann. Der weiche Kunststoff, der zur Herstellung von Abstandsräumern verwendet wird (siehe Schritt 3.1.1), ist für diesen Zweck geeignet und kann zu individuellen Schabern umfunktioniert werden.
6. Die RNA- oder Proteinlysate werden bei -80 °C bis zur weiteren Verarbeitung mit herkömmlichen biochemischen Methoden gelagert oder sofort verwendet.

5. Entstehung einer einplanigen sphäroiden Kultur

1. Bereiten Sie das 75 Pa PA Hydrogel auf 18-mm-Deckfolien vor und funktionalisieren Sie die Oberfläche mit Basalmembranextrakt (BME) oder einem anderen geeigneten ECM-Liganden, um die Zellbindung zu erleichtern.
2. Same Cells auf die ECM-beschichteten Hydrogele oder Silikongele mit der gewünschten Dichte anbringen.
3. Nach 2 Stunden entferne vorsichtig losgelöste Zellen und gib eine BME-Überlagerung in vorgekühltem Basalmedium hinzu.
   HINWEIS: BME polymerisiert beim Aufwärmen. Prechill-Tipps vor dem Pipetten. Der Anteil an integriertem BME wird durch die gewünschte mechanische Integrität und Stabilität des resultierenden 3D-Gerüsts bestimmt.
4. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einem Gewebekulturinkubator für 1,5 Stunden, um die BME-Polymerisation zu ermöglichen.
5. Fügen Sie vorsichtig Zellkulturmedium hinzu, um die 3D-Gele vollständig zu bedecken.
6. Kulturen unter Standardbedingungen aufrechterhalten. Die Zellen wachsen weiter und fügen sich im Laufe der Zeit zu 3D-Sphäroiden zusammen, bis das gewünschte experimentelle Endergebnis erreicht ist.

Results

Die mit den Formulierungen in Tabelle 1 erzeugte PA-Gelsteifigkeit wurde experimentell mit einem Rheometer getestet. Gels mit nominalen Steifigkeitswerten von 0,4 kPa, 6 kPa und 60 kPa, die sich über drei Größenordnungen erstrecken, wurden ausgewählt. Die gemessenen Steifkeitswerte betrugen 363 ± 76 Pa für 400-Pa-Gels, 6,41 ± 0,50 kPa für 6-kPa-Gels und 36 ± 8 kPa für 60-kPa-Gels (Abbildung 4A). Um die einheitliche ECM-Haftung an die PA-Gele zu beurteile...

Discussion

Das beschriebene ECM-Fertigungsprotokoll bietet einen reproduzierbaren, skalierbaren und kosteneffizienten Arbeitsablauf und kann in den meisten Laboren problemlos implementiert werden. Obwohl traditionelle Glas- und Kunststoffkulturwaren praktisch sind und eine schnelle Datenerhebung ermöglichen, gelingt es den synthetischen Substraten nicht, die physiologisch relevante Gewebesteifigkeit zu replizieren. Alternative mechanisch abstimmbare Substrate wie Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Gel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1,7 mL Mikrozentrifugenrohre	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-Well-Platten für Gewebekultur, behandelt	-	83.3921	Sarstedt
15 mL Zentrifugenrohre (für orange Kammer)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamid-Lösung	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid	28718-90-3	-	Sigma
4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Acrylamid-Lösung	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehyd	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm Gewebekulturschalen, behandelt	-	83.3901	Sarstedt
A549 Zellen	-	CCL-185	ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS-Ester (tris(triethylammoniumsalz))	-	A37572	Invitrogen
Ammoniumpersulfat	7727-54-0	-	Bio-Rad
Klare, schlagfestige Polycarbonatfolie (0,005 Zoll; Distanzhalter)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 Silikongel, Komponenten A und B	2624028	-	Dow
Dulbecco's Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Ethanol, wasserfrei	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Fötales Rinderserum	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectin	-	356008	Corning
Formaldehyd (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
Hochtemperatur-Silikongummi-Folie (0,020 Zoll; Dichtung)	-	86435K452	McMaster-Carr
Salzsäure	7647-01-0	-	BioShop
Großes Lochstanzer-Werkzeugset	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Borosilikatglasflasche für Medienlagerung, 250 ml	-	CLS1395250	Corning
Borosilikatglasflasche für Medienlagerung, 500 ml	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Mikroskop-Objektträger-Deckgläser, 18 mm Durchmesser	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Mikroskop-Objektträger-Deckgläser, 50 mm Durchmesser	-	1.84E+16	eBay
PBS (1x)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10x)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	17466-45-4	-	Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) Antikörper	-	85567	Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) Antikörper	-	3671	Cell Signaling Technology
Plasmareiniger	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR-Primer (vorwärts und rückwärts)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA-Synthese-Kit	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Schraubverschluss-Röhrchen, konischer Boden, 15 ml	-	62.554.101	Sarstedt
Schraubverschluss-Röhrchen, konischer Boden, 50 ml	-	62.547.205	Sarstedt
Serologische Pipette, 10 ml	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serologische Pipette, 25 ml	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serologische Pipette, 5 ml	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serologische Pipette, 50 ml	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Natriumhydroxid	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby Protein-Gel-Färbemittel	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol-Reagenz	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV-Kammer	-	165-5031	Bio-Rad