Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Summary

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt werden.

Abstract

Tröpfchen-Interface-Doppelschichten (DIBs) bieten eine abstimmbare Plattform zur Untersuchung der elektromechanischen Eigenschaften von Lipid- und Lipid-Peptidmembranen unter kontrollierter elektrischer Stimulation. DIBs ermöglichen sowohl Einzelkanal- als auch Ensemble-Ionenleitfähigkeitsmessungen über Membranflächen, die um Größenordnungen größer sind als herkömmliche Patch-Clamp-Techniken, und ermöglichen so Membrananalysen der elektromechanischen Deformation und deren Einfluss auf ionenleitende Peptide. Durch systematische Abstimmung der Membranstruktur durch die Bulk-Phase des Kohlenwasserstofföls (z. B. Hexadekan [C16] vs. Dodekan/Hexadekan [C12/C16] [25 %/75 %, v/v]) ermöglicht diese Bottom-up-Plattform systematische Variation der Membranzusammensetzung und der Ölumgebung, die die Membranviskoelastizität und strukturelle Reorganisation beeinflussen und damit die Peptidionenleitung beeinflussen. Detaillierte Verfahren sind vorgesehen für die Montage von Gramicidin-A-dotierten 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin-(DPhPC)-Membranen unter Verwendung verschiedener Kohlenwasserstofföl-Zusammensetzungen sowie für die Anwendung von Spannungsimpulsprotokollen, die Membranen in metastabile elektromechanische Zustände bringen. Die adaptive Membranionenleitung ist charakterisiert, einschließlich kurzfristiger plastizitätsähnlicher (STP-ähnlicher) und langfristiger Potenzierungs- und Depressionsähnlicher (LTP-ähnlicher/LTD-ähnlicher) Reaktionen in einem Modellmembransystem. Allgemeiner bietet dieses Protokoll einen robusten, reproduzierbaren Ansatz, um systematisch zusammensetzungsabhängige, membranbasierte elektromechanische Beiträge zum synaptisch-ähnlichen Leitverhalten zu untersuchen und zu verstehen, wie Lipidmembranumgebungen die Funktion der Ionenkanäle modulieren.

Introduction

Biologische Membranen sind kritische supramolekulare Strukturen, die die ionische Wärmeleitung regulieren und die Kommunikation zwischen Neuronen über elektrische und chemische Synapsen ermöglichen ^können. Diese Art der Kommunikation wird weiter durch synaptische Plastizität gesteuert, bei der strukturelle Veränderungen der Synapsen deren Stärke und Persistenz über einen Zeitraum^{von 5,6} modulieren, die üblicherweise in Begriffen von Kurzzeitplastizität (STP) und langfristiger Potenzierung oder Depression (LTP oder LTD) beschrieben werden. Diese Phänomene, die dynamische Veränderungen der Membranleitung als Reaktion auf neuronale Aktivität beinhalten, sind oft mit Neuroplastizität⁷ verbunden, die Lernen und Gedächtnis⁸ zugrunde liegt. Traditionelle Modelle der Plastizität betonen oft die biochemische Regulation von Ionenkanälen durch Proteinsynthese, Trafficking oder Phosphorylierung⁹. Die Rolle neuronaler Plasmamembranen in Modellen der Plastizität wurde jedoch größtenteils übersehen^10,11.

Patch-Clamp-Methoden werden seit über einem halben Jahrhundert zur Untersuchung der Elektrophysiologie des Einzel-Ionenkanals verwendet. Sie können jedoch nur Membranbereiche untersuchen, die viel kleiner sind als intakte Synapsen oder großflächige synthetische Modelle. Als solche stellen sie eine technische Einschränkung für die Untersuchung der Reorganisation und Deformation von mesoskaligen Membranen dar. Die Mesoskala wird zunehmend als kritische Längenskala zum Verständnis vieler Aspekte der Membranbiophysik ^12,13 anerkannt.

Es wird eine Methodik zur Verwendung von 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Tropfen-Interface-Doppelschichten (DIBs)^14,15 präsentiert, die mit dem monovalenten Peptid-Kationionophor gramicidin-A (gA) dotiert werden, um die ionische Leitung zu modellieren, ähnlich wie an einer elektrischen Synapse. Dieses System bietet mehrere wichtige Vorteile: (i) DIBs bieten eine abstimmbare Lipid- und Ölplattform, die eine systematische Membranreorganisation^{ermöglicht 16}; (ii) DIBs ermöglichen die Untersuchung von Single-Channel- und Ensemble-Channel-Ereignissen über einen Bereich von Längenskalen^17,18; und (iii) DIBs ermöglichen die Abfrage von submillimetergroßen 2-Membranpatches, die kollektiv elektromechanisch induzierte Membranrestrukturierungen erfassen, während die Fähigkeit zur Auflösung von Einkanal-Ionenleitungsereignissen^{erhalten bleibt 19,20}. Diese Methode eignet sich am besten für Studien, die eine gleichzeitige elektrische und optische Abfrage der Membranelektromechanik über Membranflächen erfordern, die größer sind als die mit herkömmlicher Patch-Klemme zugänglichen Bereiche, während dennoch die Fähigkeit erhalten bleibt, diskrete Kanalereignisse aufzulösen. Sie ist besonders nützlich, wenn das experimentelle Ziel darin besteht, zu untersuchen, wie Membranzusammensetzung, Ölumgebung und auferlegte Spannungswellenformen die kollektive Membranumstrukturierung und Peptidleitung beeinflussen. Die Methode ist weniger geeignet für Experimente, die eine native zelluläre Architektur oder direkte molekulare Auslesungen von Protein-Konformationsänderungen in intakten biologischen Membranen erfordern 19,20,21.

Durch physiologisch relevante elektrische Stimulation werden die DIBs in nichtgleichgewichtige stationäre Zustände getrieben, in denen die dynamische elektromechanische Umstrukturierung die Peptid-Ionenkanalleitung verändert. Diese emergenten Veränderungen in der ionischen Leitung sind beschreibend analog zu neurologischen STP-, LTP- und LTD-Phänomenen, die in der Neurowissenschaft 22,23,24 diskutiert werden. In der vorliegenden Studie werden diese Verhaltensweisen hauptsächlich als physikalische Reaktionen auf Membranebene auf elektrische Stimulation interpretiert, die mit intrinsischen mechanischen Eigenschaften der Membran wie Viskoelastizität und Kompressibilität in einem Modellmembransystem²⁵ verbunden sind. Bemerkenswert ist, dass die hier beschriebene Studie auf früheren Erkenntnissen aufbaut, dass Lipiddoppelschichten durch anhaltende Leitfähigkeitsverschiebungen und kapazitive Ladungsspeicherung nach Stimulation fundamentales elektrisches Gedächtnis zeigen können 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, das neue Einblicke in Mechanismen bietet, durch die Lipid-Doppelschichten adaptive, synaptisch ähnliche Funktionen in Abwesenheit komplexer zellulärer Mechanismen unterstützen können. Schließlich ermöglicht diese Methodik auch eine direkte Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehungen und wie emergentes makroskaliges Verhalten aus einfacher struktureller Reorganisation entsteht 21,25,27.

Protocol

Reinigen Sie alle Glas- und Vorbereitungsgeräte gründlich mit geeigneten Laborwaschmitteln und spülen Sie vor der Probenvorbereitung mit destilliertem Wasser. Tragen Sie jederzeit Schutzbrillen sowie Nitril- oder Latexhandschuhe, um Kontaminationen zu vermeiden. Entsorgen Sie alle chemischen Abfälle gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien. Stellen Sie sicher, dass flüchtige Lösungsmittel gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien ordnungsgemäß gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass der Raum und die Hardware im Experimentierlabor (Abbildung 1A), das Experimentiergefäß (Abbildung 1B) sowie elektrische und optische Verbindungen (Abbildung 1C) ungehindert und frei von Hindernissen bleiben.

1. Herstellung einer wässrigen Pufferlösung

1. Wiegen Sie die passende Menge an 3-(N-morpholin) Propansulfonsäure (MOPS) und Kaliumchlorid (KCl), um die gewünschten Endkonzentrationen zu erhalten (z. B. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl in 500 mL).
2. Fügen Sie die MOPS und KCl zu ~450 ml destilliertem Wasser in einem 500 mL Volumenkolben oder Graduierter Flasche hinzu und rühren Sie mit einer magnetischen Rührstange, bis sie vollständig gelöst sind.
3. Misse den pH-Wert mit einem kalibrierten pH-Messgerät. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 1 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Salzsäure (HCl) in 0,25 ml-Schritten beim kontinuierlichen Rühren hinzufügen.
4. Das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 500 ml bringen und gründlich mischen. Füllen Sie den Puffer in eine saubere, beschriftete Flasche, versiegeln Sie ihn und lagern Sie ihn bei 4 °C.
   HINWEIS: Verwenden Sie den Puffer bis zu ~2 Monate. Überprüfen und stellen Sie den pH-Wert vor jeder Anwendung auf 7,4 ein.

2. Herstellung der Gramicidin-Lagerlösung

1. In einer chemischen Abzugshaube geben Sie 5 mg Gramicidin A (gA) in ein sauberes 20-ml-Glasfläschchen. Gib 10 ml Methanol mit einer Glas- oder gasdichten Spritze hinzu und wirbel, bis das Peptid vollständig gelöst ist. Beschrifte das Fläschchen als "gA Stock" und lagere es bei -80 °C.
   HINWEIS: Ensemble-Experimente verwenden Lipid-Peptid-Molarverhältnisse von ~1:^10-4. Einzelkanal-Experimente verwenden ~10–100-faches unteres Peptid (1:10^–5–^10-6), um einzelne Ereignisse innerhalb kurzer Aufzeichnungszeiten (<1 Min) aufzulösen. Die Herstellung eines verdünnten Materials verbessert die Pipettgenauigkeit bei niedrigen Molarverhältnissen (< ~ 1:^10-4).
2. Reinigen Sie zwei zusätzliche saubere 20-ml-Glasphiolen mit Argongas für jeweils ~5 Sekunden, um Staub zu entfernen.
3. Geben Sie mit einer sauberen, gasdichten Spritze 9,9 ml Methanol in jedes ausgespülte Fläschchen.
4. Pipettieren Sie 100 μL der gA-Lagerlösung mit einer sterilen, gasdichten Spritze in eine Phiole, um ein Gesamtvolumen von 10,0 ml zu erhalten. Beschrifte dieses Fläschchen mit "A". Konzentration = 2,66 μM gA in Methanol.
5. Pipettieren Sie 100 μL Lösung "A" in das zweite Glasfläschchen, um ein Gesamtvolumen von 10,0 ml zu erhalten. Beschriften Sie dieses Fläschchen als Lösung "B". Konzentration = 26,6 nM gA in Methanol.
6. Phiolen mit Deckeln verschließen und mit Parafilm einwickeln.
7. Alle GA-Lösungen bis zur Anwendung bei -80 °C aufbewahren.

3. Herstellung von Lipid-Peptid-Vesikeln

1. Spüle ein sauberes 20-ml-Glasfläschchen mit Argongas für ~5 Sekunden aus.
2. Fügen Sie 4 mg 1,2-Diphytanyl-sn-Glycero-3-phosphocholin (DPhPC)-Lipid zur Phiole hinzu.
3. In einer Abzugshaube wird 1 ml Methanol mit einer Glaspipette hinzugefügt. Sanft kreisen oder vortexen, bis das gesamte Lipid aufgelöst ist.
4. Mit einer 500 μL gasdichten Spritze wird 178 μL Lösung "A" hinzugefügt (für Ensemble-Level-STP-Experimente; DPhPC:gA Molarverhältnis = 1:^10-4) oder 890 μL Lösung "B" (für Einkanal-Experimente; DPhPC:gA Molarverhältnis = 1:5×^10-6) in die DPhPC-Methanollösung. Sanft vortexen, um zu mischen.
5. Unter einem sanften Argonstrahl in der Abzughaube verdampfen Sie das Methanol, bis sich am Boden des Fläschchens ein dünner, gleichmäßiger Lipidfilm bildet.
6. Stellen Sie das offene Fläschchen in einen 40 °C Vakuumofen und ziehen Sie 10–12 Stunden oder über Nacht ein vollständiges Vakuum, um Reste des Lösungsmittels zu entfernen.
7. Entfernen Sie das Fläschchen aus dem Vakuumofen und fügen Sie 2 ml des in Abschnitt 1 für STP-Experimente vorbereiteten 0,1 M KCl-Puffers hinzu, was zu einer endgültigen Lipid- und Gramicidinkonzentration in Suspension von 2,36 mM bzw. 236 nM führt. Für Einkanal-Experimente fügen Sie 2 mL eines 1 M KCl-Puffers hinzu, wie in Abschnitt 1 vorbereitet. Vortex, um den Lipidfilm zu rehydratieren und eine 2 mg/mL Lipidsuspension zu erhalten, was zu einer finalen Lipid- und Gramicidinkonzentration in der Suspension von 2,36 mM bzw. 11,8 nM führt.
8. Das Fläschchen bei -80 °C mindestens 6 Minuten einfrieren und dann 6 Minuten auf einer 40 °C heißen Platte oder einem Wasserbad auftauen. Vortex kurz zum Mixen. Wiederholen Sie diesen Gefrier-Tau-Zyklus sechsmal, um die Bildung von multilamellen Vesikeln zu fördern.
9. Bauen Sie einen Lipid-Vesikelextruder mit einer 0,1 μm porendurchmesser spurgeätzten Membran nach den Anweisungen des Herstellers zusammen. Führen Sie 500 μL Puffer dreimal durch den Extruder, um die Membran zu hydratisieren, überprüfen Sie, dass keine Lecks vorliegen, und entsorgen Sie den Puffer.
10. Laden Sie 1 ml der aufgetauten Lipid-Peptid-Suspension in den Extruder ein und führen Sie 31 Durchgänge durch die 0,1 μm Membran durch, um unilamelläre Vesikel mit einem Durchmesser von ~100 nm zu erhalten und die Größenhomogenität sicherzustellen.
11. Übertragen Sie die extrudierten Vesikel (große unilamelläre Vesikel, LUV) in ein 1-mL PCR-Röhrchen, etikettieren Sie sie und lagern sie bei 4 °C. Verwenden Sie es innerhalb von 2 Wochen nach der Vorbereitung.
12. Versiegeln Sie die verbleibende nicht extrudierte Lipid-Protein-Suspension im ursprünglichen Fläschchen, wickeln Sie sie mit Parafilm ein und lagern Sie sie bei -80 °C für spätere Anwendung.
13. Wenn zuvor eingefrorene, nicht extrudierte Proben verwendet werden, schmelzen Sie bei 40 °C mit einer Heizplatte neu ein, lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur erwärmen und extrudieren Sie dann die Probe.

4. Herstellung von Agarosegel

1. Stellen Sie einen sauberen 50-mL-Glasbecher auf eine Heizplatte. Gib eine Agarosetablette zu 50 mL desselben Puffers hinzu, der zur Hydratation des Lipidfilms verwendet wird (z. B. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4), um eine 1%ige Agarosegellösung zu bilden.
2. Fügen Sie einen sauberen Teflon-Rührriegel hinzu und rühren Sie kräftig, bis sich die Tablette verteilt hat.
3. Decken Sie den Becher mit Alufolie ab und durchstoßen Sie ein kleines Lüftungsloch mit einem Metallspatel. Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 220–230 °C ein. Die Lösung wird klar und erreicht ein rollendes Kochen, was auf die vollständige Auflösung der Agarose hinweist.
4. Schalte die Hitze aus und entferne vorsichtig die Folie. Scanne jede Oberflächenfolie mit einem sauberen Metallspatel ab. Verwenden Sie die heiße Agaroselösung sofort zur Elektrodenbeschichtung oder lassen Sie sie im Becher abkühlen und erstarren für spätere Anwendung.
5. Nach der Elektroden-Agarosebeschichtung wird das verfestigte Agarose mit Folie abgedeckt, mit Parafilm versiegelt, beschriftet und bei 4 °C gelagert. Wenn nötig, erhitzen Sie es bis zum Kochen mit Rühren, bis es vollständig geschmolzen ist.

5. Herstellung von Elektroden

1. Schnitt von 0,125 mm Silberdraht in ~70 mm Längen für Headstage-Elektroden und ~130 mm für Masseelektroden.
2. Mit einer offenen Flamme (z. B. Handfeuerzeug oder Bunsenbrenner) halten Sie ein Ende jedes silbernen Drahtes horizontal im heißesten zentralen Kegel der Flamme, bis die Spitze schmilzt und eine kugelförmige Kugel mit ~0,2 mm Durchmesser bildet (Abbildung 2A).
3. Legen Sie die Drähte auf eine saubere Oberfläche und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Kugeln kugelförmig und ähnlich groß sind. Wenn eine Kugel länglich oder unregelmäßig ist, schneiden Sie die Spitze ab und wiederholen Sie das Schmelzen (Schritt 5.2).
4. Legen Sie die Enden beider silbernen Drähte in einen Glasbehälter mit frischem Haushaltsbleichmittel (Natriumhypochlorit, NaClO). Stellen Sie sicher, dass die Kugeln vollständig untergetaucht sind und mindestens 1 Stunde inkubieren, um die Oberfläche zu chlorieren und Ag/AgCl zu bilden. Ein mattes braun-graues Aussehen bestätigt eine erfolgreiche Chlorierung (Abbildung 2B).
5. Entfernen Sie die Drähte aus dem Bleichmittel, sobald die Kugelenden matt grau gefärbt sind, spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser aus und legen Sie sie auf eine saubere, fusselfreie Oberfläche zum Trocknen.
6. Besorge einen Pipettenhalter für die Kopfstufe und einen für die Masseelektrode. Schneiden Sie eine 100-mm-Borosilikatglas-Kapillare (1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser) mit einem Glasfräser in zwei Hälften.
7. Führen Sie eine Halbkapillare in den Pipettenhalter der Headstage ein und ziehen Sie den Halter fest, um sie zu sichern. Befestige eine komplette 100-mm-Kapillare auf den Halter der Masseelektrode und sichere sie.
8. Führen Sie das nicht-kugelige Ende des 130 mm Silberdrahts in die Kapillare der Masseelektrode ein, bis ~20 mm des Kugelendes herausragen. Klebe das gegenüberliegende Ende des Kabels an den Halter, sodass ~5 mm für die Erdungsverbindung freigesetzt werden.
9. Wiederholen Sie den nächsten Schritt mit einem 70-mm-Draht für die Headstage-Elektrode und sorgen Sie für einen festen Kontakt zwischen dem Draht und dem Headstage-Anschluss (goldfarbenes Stück). Schneide überschüssige Kabel am Ende des Headstage-Steckers ab.
10. Tauchen Sie jede chlorierte silberne Kugel direkt oberhalb der Kugel-Wellen-Verbindung in die Agarose, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu bilden. Tauche mindestens 10 Mal ein und aus.
11. Ziehen Sie die Elektrode heraus und lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur gelieren. Wiederholen Sie das Eintauchen bei Bedarf wieder, um eine glatte, gleichmäßige Agaroseschale von mehreren Dutzend Mikrometern Dicke zu erhalten. Vermeiden Sie es, den Draht zu hoch oder zu niedrig zu beschichten (Abbildung 2C).
12. Montage der Kopfbühne und der Masseelektroden auf Mikromanipulatoren. Verbinden Sie das freiliegende Erdungskabel (~5 mm) mit der Masse des Verstärkers mit einem Alligatorclip.
13. Mit einer Pinzette biegen Sie jede Elektrode vorsichtig in der Mitte zwischen Kugelende und Kapillare, sodass das Kugelende senkrecht zur Mikroskopstufe steht. Vermeiden Sie Biegungen größer als 90°, um optische Verzerrungen bei visuellen und videobezogenen Aufnahmen des Mikroskops zu minimieren.
14. Passen Sie die Ausrichtung der Elektroden in ihren Haltern so an, dass die mit Agarosen beschichteten Kugelenden senkrecht zur Bildfläche des Mikroskops stehen (Abbildung 3A).

6. Bildung von Tropfenschnittstellendoppellagen (DIBs)

1. Stellen Sie eine saubere, klare Petrischale auf die Bühne eines umgekehrten Mikroskops. Füllen Sie die Schale mit Alkanöl (z. B. 100 % Hexadekan oder 25 %/75 % V/V Dodekan/Hexadekan) bis zu einer Tiefe von ~ 5 mm (Abbildung 1B).
2. Mit den Mikromanipulatorsteuerungen lassen Sie beide mit Agarose beschichteten Kugelenden bis zu einer Tiefe von ~2,5 mm unter die Öloberfläche hinein. Vermeiden Sie schnelle Bewegungen mit dem Mikromanipulator, um Kollisionen zwischen Elektroden und Kugelkopf mit der Petrischale zu vermeiden.
3. Stellen Sie den Mikroskopfokus so ein, bis beide Kugelenden und ihre Agarosebeschichtungen scharf scharf scharf sind. Positionieren Sie die Elektroden nahe dem Rand des Sichtfeldes, sodass beide gleichzeitig beobachtet werden können.
4. Mit einer kalibrierten 2-μL-Pipette wird die extrudierte Lipid-Peptid-Vesikelsuspension aspiriert. Geben Sie langsam 250 nL der Aufhängung direkt auf jedes mit Agarose beschichtete Kugelende ab, wobei jeweils eine separate Pipettenspitze verwendet wird, ohne die Agaroseschale mit der Pipettenspitze zu berühren.
   HINWEIS: Um Handvibrationen zu minimieren und die Stabilität zu erhöhen, verankern Sie beide Ellbogen am Antivibrationstisch-Sims. Stabilisieren Sie das pipettierende Handgelenk mit der nicht pipettierenden Hand, tauchen Sie die Pipette langsam in das Öl ein und nähern Sie sich der Elektrode langsam. Ein kurzes Anhalten des Atems während des Tropfenladens kann unbeabsichtigte Bewegungen weiter reduzieren.
5. Lassen Sie die Tröpfchen sich ausbreiten, die Agaroseschale bedecken und unter der Schwerkraft von der Elektrode wegsinken. Beobachten Sie das Durchhängen von der Seite durch die Petrischalenwand, wenn sie frei ist (Abbildung 3B).
   HINWEIS: Die benötigte Zeit für das Durchhängen der Tröpfchen hängt von der Verteilung der Vesikelgröße, der Temperatur und der Agarosetopographie ab. Bei DPhPC DIBs warte mindestens 5 Minuten nach Tröpfchenabscheidung¹⁵.
6. Sanft den Antivibrationstisch anstoßen, um die Tropfenbereitschaft zu prüfen. Bestätigen Sie, dass sich die durchhängenden Tropfen mit einer leichten Verzögerung in Bezug auf die Bewegung der Elektrode bewegen, was auf die Bildung vollständig beschichteter lipid-monoschichtiger Tröpfchen hinweist.
   HINWEIS: Die verzögerte Bewegung tritt auf, weil die Bildung einer Lipidmonoschicht um den wässrigen Tröpfchen die Oberflächenspannung erheblich senkt und dadurch die physikalische Reaktion beim Bewegen der Elektrode im Öl verzögert.
7. Wenn dieses Verhalten nicht beobachtet wird, warten Sie weitere 2–3 Minuten und wiederholen Sie den Vorgang.

7. Elektrische Einrichtung und Doppelschichtüberwachung (visuell und elektrisch)

1. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, der Antivibrationstisch, der Faradaysche Käfig und alle elektrischen Bauteile, einschließlich Verstärker, Digitalisierer, Funktionsgenerator und Computer, an eine gemeinsame Masse angeschlossen sind (Abbildung 1).
2. Richten Sie die Instrumentenanschlüsse gemäß der Einrichtungsanleitung des Herstellers an. Verwenden Sie Abbildung 1C als schematische Referenz für die wesentlichen elektrischen und optischen Konfigurationen. Siehe die detaillierten Anweisungen zu Erdung³⁵, Hardware/Software-Konfiguration und Pipetten-Offset-Anpassung für DIB-Experimente.
   HINWEIS: Folgen Sie gerätespezifischen Einrichtungsanweisungen für alle in der Materialtabelle aufgeführten Software und Hardware.
3. Verbinden Sie die Headstage- und Masseelektroden mit dem Patch-Clamp-Verstärker.
4. Konfigurieren Sie einen externen Funktionsgenerator (oder den Ausgangskanal der Erfassungssoftware), um eine 10 Hz, 10 mV dreieckige Spannungswellenform zu erzeugen. Bestätigen Sie Amplitude und Frequenz an einem angeschlossenen Oszilloskop und innerhalb der Erfassungssoftware.
5. Nachdem die Tröpfchen ~ 10 Minuten durchgesackt sind, verwenden Sie die Mikromanipulatoren, um die beiden Tropfen sanft in Kontakt zu bringen. Stellen Sie die Elektrodenpositionen so an, dass die Kontaktfläche der Tröpfchen zunächst nicht größer als ~ 1/^{4 ihres} Durchmessers ist.
6. Schalten Sie die 10 Hz, 10 mV Dreieckswellenform ein und überwachen Sie die kapazitive Stromantwort mit dem Verstärker und der Akquisitionssoftware.
7. Warten Sie auf spontane Doppelschichtbildung, die elektrisch durch eine expandierende Spitze-zu-Spitze-Kapazitivstromantwort und optisch durch eine zunehmende innere Reflexion (ovales Erscheinungsbild) vom Doppelschichtkontakt angezeigt wird (Abbildung 4). Bestätigen Sie, dass reine Lipiddoppelschichten rechteckige Stromplateaus zum dreieckigen Spannungsreiz aufweisen, während gA-dotierte Doppelschichten bei ~1:^10-4 Lipid: Peptide geneigte Plateaus zeigen, die die Ensemble-Ionenleitung widerspiegeln.
8. Stellen Sie die Kontaktfläche des Tröpfchens an, indem Sie die Elektroden leicht bewegen, bis die Spitze-zu-Spitze-Kapazitivstromantwort auf die 10 Hz, 10 mV Dreieckswellenform zwischen ~100–200 pA für ~250 nL DIBs in C16- oder C12/C16-Ölen liegt, was einem Kapazitätsbereich von ~250–500 pF³³ entspricht.
   HINWEIS: Hochfrequente Impulse oder nicht null gleichstromhaltige Haltespannungen können Elektrowetting und übermäßige Doppelschichtausdehnung induzieren, was zu Tröpfchenkoaleszenz und Bruch der Doppelschicht führt. Der Bereich von 100–200 pA sorgt für ein Gleichgewicht zwischen Doppelschichtstabilität und Signal-Rausch-Stabilität und ermöglicht während der Stimulation eine ausreichende Flächenerweiterung.
9. Wenn sich das DiB zusammensetzt, heben Sie die Elektroden aus dem Öl. Spülen Sie die Elektrodenköpfe gründlich mit demselben wässrigen Puffer, der auch für die Lipidproben und Agarose verwendet wird.
10. Entfernen Sie alle wässrigen Tröpfchen aus der Petrischale mit einer sterilen Spritze. Bei Bedarf mit frischem Öl nachfüllen und Elektroden wieder eintauchen. Die LUV-Lösung wird wie in Abschnitt 6 beschrieben auf die Elektroden geladen und der Vorgang wiederholt.
11. Sobald stabile kapazitive oder leitfähige Antworten bestätigt sind, schalten Sie die Dreieckswellenform aus und lassen Sie den DIB mindestens 15 Minuten lang ausgleichen, bevor die Stimulationsprotokolle angewendet werden.

8. Elektrische Stimulationsprotokolle

1. Pulsexperimente (Ensemble-STP-ähnliche und LTP-/LTD-ähnliche Reaktionen)
   1. Konfigurieren Sie den Funktionsgenerator oder die Erfassungssoftware so, dass Spannungsimpulse mit der gewünschten Amplitude, Dauer und Intervall zwischen den Impulsen geliefert werden (z. B. PPF [gepaarte Impuls-Facilitation] und PPD [gepaarte Puls-Depression]-Muster).
   2. Öffne die Videoaufnahme-Software. Wählen Sie die entsprechenden Kamera- und Zielobjektiveinstellungen aus. Stelle die Bildrate auf mindestens 20 Bilder/s ein und stelle sicher, dass sie während der Aufnahme stabil bleibt.
   3. In der Datenerfassungssoftware stellen Sie die Abtastfrequenz für das aktuelle Signal auf mindestens 5 kHz ein.
   4. Klicken Sie auf Acquire > New Protocol , um ein neues Protokoll zu erstellen, oder auf Acquire > Edit Protocol , um ein bestehendes Protokoll zu modifizieren. Im Reiter Erfassungsmodus wählen Sie episodische Stimulation aus. Setze Runs/Trial auf 1 und Sweeps/Run auf 1.
   5. Setze die Sweep-Dauer auf 4 Sekunden länger als die gesamte experimentelle Dauer. Für ein 120-s-STP-Protokoll (60 s PPF + 60 s PPD) sollte die Sweep-Dauer auf 124 s gesetzt werden, um 2 s vor und nach dem Reiz zu ermöglichen.
   6. Im Reiter Eingänge weisen Sie den Aufnahmekanal dem aktuellen Eingang zu. Im Reiter Ausgänge weisen Sie den Stimulationskanal dem Spannungsausgang zu, der die Elektroden steuert.
   7. Öffnen Sie den Reiter Wellenform . In Spalte A stellen Sie den Typ auf Schritt, die erste Stufe auf 0 mV und die erste Dauer auf 2000 ms ein, um eine Vorstimulations-Basislinie zu definieren.
   8. In Spalte B (PPF) setzen Sie den Typ auf Schritt. Geben Sie die gewünschte Spannungsamplitude (z. B. +100 mV), die Pulsdauer (z. B. 100 ms) und die Zuggeschwindigkeit an, um das Intervall zwischen den Impulsen entsprechend dem Ziel-Duty Cycle (z. B. 90,9 %) festzulegen.
   9. In Spalte C (PPD) setzen Sie Typ ebenfalls auf Step mit derselben Amplitude und Pulszeit, erhöhen jedoch die Zuggeschwindigkeit oder das Interpulsintervall, um den gewünschten niedrigeren Duty Cycle (z. B. 28,6 %) zu erreichen.
   10. In Spalte D konfigurieren Sie eine Post-Stimulation-Basislinie, die mit Spalte A identisch ist (0 mV, 2000 ms).
       HINWEIS: Wenn die Gesamtdauer aller Epochen im Wellenform-Tab die Sweep-Dauer im Modus/Rate-Tab übersteigt, erhöhen Sie die Sweep-Dauer leicht, bis der Fehler behoben ist.
   11. Speichere das Protokoll mit einem beschreibenden Namen (z. B. "STP_120s").
   12. Starte die Videoaufnahme und starte dann sofort mit der elektrischen Erfassung/Stimulation, indem du auf den roten Kreis "Aufnehmen"-Button klickst, um Daten aufzunehmen. Alternativ können Sie einen digitalen Trigger so konfigurieren, dass der Beginn der Stimulation gleichzeitig die Videoaufnahme und die elektrische Erfassung auslöst.
   13. Für die ersten 60 Sekunden der Stimulation (PPF) steigt die gemessene Stromantwort in der Regel ab dem ersten Impuls an und kann ein sichtbares Plateau um t = 60 Sekunden erreichen, während für die letzten 60 Sekunden der Stimulation (PPD) die gemessene Stromantwort im Allgemeinen abnimmt (Abbildung 5). Am Ende des Protokolls wird die elektrische Erfassung und Videoaufnahme gleichzeitig eingestellt.
2. Einkanal-Experimente
   1. Am Frontpanel des Patch-Clamp-Verstärkers stellen Sie den External Command Input-Schalter auf AUS. Stellen Sie die Haltspannung auf +200 mV ein. Stellen Sie den eingebauten Tiefpassfilter des Verstärkers auf 1 kHz ein. In der Aufnahmesoftware stellen Sie die Abtastrate auf 10–50 kHz ein und wählen Sie einen kontinuierlichen "lückenlosen" Aufnahmemodus.
      HINWEIS: Hohe Abtastraten können das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten verringern. Die Verwendung höherer Abtastraten bei der Auflösung von schnellen Gating Transitions oder kurzlebigen Flackerzuständen ist wichtig. Die mittleren offenen Lebensdauern von Gramicidin A liegen typischerweise im Bereich von 0,1 s bis 10 s, während Flackerzustände auf sub-ms- und μs-Zeitskalen auftreten können; daher können Abtastraten von ~50 kHz notwendig sein, um solche^{Ereignisse 36} zu erfassen. Eine anschließende Einkanal-Idealisierungsanalyse mit JSMURF ermöglicht eine robuste Ereigniserkennung über Aufnahmen hinweg mit variablen Signal-Rausch-Verhältnissen³⁷.
   2. Ohne externen Befehl beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Basisstromsignals. Am Verstärker schalten Sie den Spannungsbefehl von AUS auf "+", um eine +200 mV Gleichspannung über das DIB anzuwenden.
   3. Rekord von ~15 Sekunden, um Einzelkanal-Ereignisse zu erfassen und gleichzeitig die Baseline-Drift zu begrenzen. Bei der molaren Konzentration von Lipid:gA von 1:5×^10-6 _{erscheint der} aufgezeichnete Strom stufenartig, bedingt durch die Bildung und Eliminierung von Kanalleitungs-Gating Ereignissen.
   4. Bevor Sie die Aufnahme stoppen, schalten Sie den Spannungsbefehl von "+" wieder auf AUS. Stoppen Sie die Datenerfassung und speichern Sie die Aufnahme mit einem beschreibenden Dateinamen (z. B. "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      HINWEIS: Einzelkanalaufnahmen definierter Dauer können auch durch eine programmierte episodische Stimulation mit fester Amplitude und Dauer wie in Abschnitt 8 für PPF/PPD beschrieben durchgeführt werden. Für "Post-PPF"-Einkanal-Experimente wird die episodische Stimulation mit +200 mV Gleichspannung unmittelbar nach den 60 Sekunden PPF gekoppelt.

9. Membranfläche und Flussextrapolation

1. Am Ende jedes Ensemble-Experiments (STP, LTP/LTD) bewegen Sie langsam eine Elektrode seitlich mit den Mikromanipulatoren, um das DIB abzutrennen.
2. Lockere den Mikromanipulator-Elektrodenhalter und drehe die Elektrode in ihrem Halter um ~45°, sodass der 125 μm lange silberne Draht in der Bildfläche liegt.
3. Stellen Sie die Elektrodenhochhöhe an, bis der Draht unter dem Mikroskop scharf scharf ist. Mach mit der Kamerasoftware ein Standbild oder einen Screenshot des fokussierten silbernen Drahts. Speichern Sie das Skalierungsbild für spätere Kalibrierung der Pixelgröße auf Millimeter.
4. Verarbeiten Sie die aufgezeichneten Stromspuren gemäß den in Ref. 28 beschriebenen Verfahren, um kontinuierliche, artefaktfreie Strom-Zeit-Daten zu erhalten (Abbildung 6A).
5. Bestimmen Sie die Frame-to-Time-Abbildung durch Teilung der Frame-Indizes durch die gemessene Bildrate und die Übereinstimmung mit den Erfassungszeitstempeln.
6. Importiere das Kalibrierungsbild der Skala und die Experimentrahmen in eine Bildanalysesoftware.
7. Verwenden Sie den bekannten Drahtdurchmesser (125 μm) aus dem Kalibrierungsbild der Skala, um die räumliche Skala mit der Software-Kalibrierungsfunktion (Analyze > Set Scale) einzustellen.
8. Für Flussberechnungen jedes Experiments wählen Sie N Zeitpunkte, die die gesamte Stimulationsperiode abdecken (z. B. 30 Zeitpunkte über das 120-seitige Experiment). Stellen Sie sicher, dass der erste Zeitpunkt dem ersten Stimulusimpuls entspricht.
9. An jedem Zeitpunkt missen Sie den DIB-Durchmesser, indem Sie eine Linie über den Schnittpunkt der Doppelschicht-Kante ziehen und deren Länge in kalibrierten Einheiten aufzeichnen.
10. Jeden gemessenen Durchmesser in Membranfläche (A) umrechnen, wobei die kreisförmige Geometrie angenommen wird oder der passende geometrische Ellipsenfaktor für die spezifische Lipid-Öl-Konfiguration verwendet wird. Nutzen Sie die resultierenden Bereiche, um die Entwicklung der Membranfläche über die Zeit für verschiedene experimentelle Bedingungen zu bewerten (Abbildung 6B).
11. Für jeden Zeitpunkt teilen Sie den entsprechenden Stromwert durch die Fläche, um den Fluss (I/A) zu erhalten. Teilen Sie alle N Flussdatenpunkte durch den ersten Flusswert, um einen Fluss zu erhalten, der auf den ersten Impuls normalisiert ist (I/A) / (I₀/A₀), wenn eine normalisierte Flussanalyse gewünscht ist (Abbildung 6C).
12. Plotte Fluss oder normalisierten Fluss vs. Zeit oder Pulsanzahl vs. Zeit. Wiederholen Sie die Flussanalyse für alle Ensemble-Experimente (STP, LTP/LTD) (Abbildung 6D).
13. Man interpretiere anhaltende Erhöhungen des Flusses oder normalisierten Fluss relativ zum ersten Impuls während PPD oder über 2 Minuten hinaus als verstärkte Leitung, während Rückkehren zum Ausgangsniveau oder Abnahmen unter dem ersten Pulswert auf eine gesenkte Leitung hinweisen. Nutzen Sie die resultierenden Zeitskalen, um Reaktionen als kurzfristiges plastizitätsähnliches Verhalten (<2 Min) oder langfristiges Potenzierungs- / Depressionsverhalten (> ~5 Min) zu klassifizieren.

10. Einzelkanalanalyse

1. Importiere rohe Einzelkanalaufnahmen in eine bevorzugte Analyseumgebung oder die clampSeg-Schnittstelle und siehe³⁷ für vollständige Beschreibungen und Erklärungen der Softwarefunktionen.
2. Verwenden Sie einen digitalen Tiefpassfilter , der dem experimentellen Aufnahmefilter entspricht (z. B. 1 kHz Bessel).
3. Parameterkonfiguration.
   1. Setze Alpha (α) = 0,05 und definiere das statistische Konfidenzniveau so, dass jeder erkannte Schritt <5 % Wahrscheinlichkeit hat, eine zufällige Rauschfluktuation zu sein.
   2. Geben Sie 5.000–10.000 Monte-Carlo-Iterationen pro 1-s-Segment an, um die Rauschverteilung zu schätzen und die statistische Robustheit der Ereigniserkennung zu erhöhen.
      HINWEIS: Verwenden Sie parallele Computerverarbeitung in 1 s "Chunks", falls verfügbar, um die Analysezeit zu verkürzen.
   3. Führe den JSMURF-Algorithmus auf der gefilterten Stromspur aus.
4. Modellvalidierung.
   1. Überlagern Sie die idealisierte (Rechteckwelle-)Leitfähigkeitsspur auf die gefilterte Stromspur und bestätigen Sie visuell, dass Schrittübergänge mit abrupten Änderungen im experimentellen Signal zusammenfallen.
   2. Verwenden Sie die bekannten Eigenschaften des Tiefpassfilters, um eine konvolverte Rekonstruktion der idealisierten Spur zu erzeugen und sie auf die Rohspur³⁷ zu legen. Bestätigen Sie, dass das rekonstruierte Signal genau mit der Zeit- und Amplitudenhülle des aufgezeichneten Stroms übereinstimmt.
5. Quantifizierung von Leitfähigkeit und Lebensdauern.
   1. Definieren Sie das niedrigste stabile Plateau in der idealisierten Spur als den geschlossenen Baseline-Zustand. Identifizieren Sie die erste von Null verschiedene Plateauamplitude als primäre Open-State-Leitfähigkeit (Einzelkanalniveau).
   2. Klassifiziere höhere ganzzahlige Vielfache dieser Amplitude als mehrkanalige offene Zustände (2+, 3+ usw.). Identifiziere intermediäre Plateaus, die stabil, aber niedriger als voll offene Niveaus sind, als Subkonduktanzzustände.
   3. Extrahieren Sie die Amplitude und Dauer jedes Ereignisses aus der idealisierten Spur und sortieren Sie sie, um Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme und Lebensdauerhistogramme zu erzeugen.
6. Amplitudenhistogramme und Lebenszeitverteilungen
   1. Vergleichen Sie idealisierte Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme mit Amplitudenhistogrammen, die direkt aus den gefilterten Daten generiert werden. Bestätigen Sie, dass die idealisierten Histogramme schärfere, besser getrennte Spitzen zeigen, die den diskreten Leitfähigkeitszuständen³⁷ entsprechen.
   2. Für jede experimentelle Bedingung wird die Überlebensfunktion N(t)/N(0) berechnet, wobei N(0) die Gesamtzahl der offenen Ereignisse (Voll- und Unterleitungsfähigkeit) und N(t) die Anzahl der Ereignisse mit Dauern länger als t ist. Schließen Sie geschlossene Zustandsintervalle aus dieser Analyse aus.
   3. Plotte N(t)/N(0) vs. Zeit und passe exponentielle Zerfallsfunktionen mit einer nichtlinearen Kleinste-Quadrat-Routine in einer bevorzugten Software an.
   4. Man interpretiert Rechtsverschiebungen bei den Spitzen der Leitfähigkeitsverteilung in Amplitudenhistogrammen als erhöhte Leitfähigkeit, längere Zerfallszeitkonstanten in N(t)/N(0) im Vergleich zu Zeitdiagrammen als erhöhte Open-State-Stabilität und linksverschobene Verteilungen als kürzere Kanallebensdauern.
      HINWEIS: Minimieren Sie Umweltstörungen wie Luftströmungen, Vibrationen und sich bewegende Objekte. Vermeiden Sie es, sich an den optischen Tisch zu lehnen, und halten Sie Gespräche vom experimentellen Aufbau fern. Bewahren Sie Mobiltelefone, Tablets, Laptops und andere persönliche elektronische Geräte mindestens 1,5 m vom Faraday-Käfig entfernt auf, um elektromagnetische Störungen zu reduzieren. Verwenden Sie ein optisch klares Ölreservoir und optimieren Sie die Beleuchtung und den Kontrast des Mikroskops, um die Kanten von Tröpfchen und Doppelschichten zu schärfen. Erwerben und/oder exportieren Sie Videos in Graustufen, wenn dies den Randkontrast verbessert und manuelle Messungen des DIB-Durchmessers vereinfacht. Für Experimente, die keine Temperatureinflüsse untersuchen, sollten die Laborumgebung, der Mikroskopstand und das Öl bei 21–22 °C gehalten werden.

Results

DIB-Versuchsaufbau
Das Aufnahmesystem befindet sich in einem Faradayschen Käfig auf einem Antivibrationstisch, wobei elektrische und Videodaten von zwei separaten Computern erfasst werden (Abbildung 1A), wobei ein einzelner Computer mit Splitscreen-Funktion verwendet werden kann. Die DIB-Probenumgebung besteht aus zwei mit Agarose beschichteten Elektroden, die in einem definierten Volumen Alkanöl eingetaucht sind (Abbildung 1B). Abbildung 1C zeigt einen Schaltplan der wesentlichen elektrischen und optischen Verbindungen für das in diesem Manuskript beschriebene experimentelle Aufbau.

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Antivibrationstisch und Faraday-Käfiggehäuse mit Hauptkomponenten angegeben, darunter Verstärker, Digitalisierer, Rauschfilter, Funktionsgeneratoren und eine Dual-Computer-Schnittstelle für elektrische und Videoaufnahme. (B) Draufsicht auf die DIB-Probenumgebung und Elektroden. (C) Schaltplan der elektrischen und optischen Verbindungen, die mit dem in diesem Manuskript beschriebenen experimentellen Aufbau verbunden sind. Alle einzelnen Komponenten teilen im Laborgebäude eine gemeinsame Basis. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (21–22 °C) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Herstellung und Qualitätskontrolle von Ag/AgCl-Elektroden
Das Schmelzen der silbernen Drahtspitze bildet eine kugelförmige Kugel (Abbildung 2A); minderwertige Schmelzen erscheinen länglich oder unregelmäßig. Die Chlorierung im Bleichmittel erzeugt eine stumpfe braun-graue Ag/AgCl-Oberfläche (Abbildung 2B). Eine dünne, gleichmäßige Agaroseschicht im Bereich von mehreren Dutzend Mikrometern Dicke auf der Kugel ist für stabile Tröpfchenstütze und elektrochemische Kopplung mit niedrigem Widerstand unerlässlich, während eine ungleichmäßige Beschichtung zu einer schlechten Tröpfchenbefestigung führt (Abbildung 2C).

Abbildung 2: Elektrodenvorbereitung. (A) Mikroskopbilder von guten und schlechten Elektrodenschmelzen. (B) Vergleich von nicht-chlorierten und chlorierten Elektrodenköpfen. (C) Beispiele für gute und schlechte Agarosebeschichtungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Elektrodenaufbau. (A) Draufsicht zur Winkelausrichtung der montierten Elektroden. (B) Seitenansicht zum Vergleich von nicht durchhängenden Tröpfchen unmittelbar nach der LUV-Belastung mit durchhängenden Tröpfchen nach der Monoschichtbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Positionierung der Elektroden und das Durchhängen des Tröpfchens
Draufsichtsansichten zeigen die korrekte Winkelpositionierung der Elektroden, um optische Verzerrungen zu minimieren (Abbildung 3A). Seitenansichten vergleichen nicht durchhängende (unmittelbar nach der Luv-Lösungsladung) und durchhängende, lipidbeschichtete Tröpfchen (nach 5 Minuten) (Abbildung 3B). Hängende Tröpfchen, die zur Bildung eines DIB verwendet werden, zeigen eine verzögerte physikalische Reaktion auf Bewegung aufgrund einer signifikanten Verringerung der Oberflächenspannung durch die Lipidmonoschichten, was die Bildung eines schwebenden wässrigen Tropfens, der vollständig von einer Lipidmonoschicht bedeckt ist, visuell bestätigt. Nachdem das Durchhängen etabliert ist, wird die Dreieckswellenstimulation eingesetzt, um elektrische Bestätigung der Doppelschichtbildung und Stabilität³⁵ zu liefern.

Abbildung 4: Tropfenschnittstellen-Doppelschichtbildung. (A) Zeitraffersequenz, die die Bildung und Expansion der Doppelschicht nach dem Kontakt des Tröpfchens zeigt. (B) Interne Membranreflexion zur Schätzung von Doppelschichtdurchmesser und Flächen. Die DIB-Bildgebung wird von unter dem Aufbau mit einem umgekehrten Mikroskop durchgeführt. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

DIB-Bildung und Flächenmessung
Sequentielle Bilder zeigen spontanes Doppelschicht-"Zippen" und die Flächenerweiterung, wenn zwei durchhängende Tröpfchen in Kontakt gebracht werden (Abbildung 4A). Die hellen, inneren ovalen Reflexionen am Tropfenkontakt werden verwendet, um den Doppelschichtdurchmesser und damit die Membranfläche über die Zeit zu schätzen (Abbildung 4B).

Abbildung 5: STP-Protokoll – Stimulation und Reaktion. Repräsentative aktuelle Antworten während der gepaarten Pulserleichterung (PPF, 0–60 s, rot) und der gepaarten Puls-Depression (PPD, 60–120 s, blau) sind (oben) zusammen mit dem entsprechenden Stimulationsprotokoll (unten) dargestellt. PPF- und PPD-Impulse dauern 100 ms mit OFF-Zeiten von 10 ms bzw. 250 ms, was zu Duty Cycles von 90,9 % bzw. 28,6 % führt. Die Erleichterung entspricht dem Nettoanstieg des Ionenstroms; Depression entspricht Nettoabnahmen. Aktuelle Antworten werden nur während der ON-Perioden aufgezeichnet; Für die Visualisierung werden Daten zwischen den Pulsen interpoliert, um die Gesamttrends in der aktuellen Phase hervorzuheben. Pulsschematische Zeitlängen und Anzahl der Pulse innerhalb der PPF- und PPD-Phasen sind nicht maßstabsgetreu dargestellt und werden zu Visualisierungszwecken illustriert. Repräsentative Current-Response-Daten reproduziert aus Podar PT et al., ²⁵ unter CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 Der Autor(en). Veröffentlicht von PNAS. Stimulationsschematik für das vorliegende Manuskript modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Elektrisches Stimulationsprotokoll zur Induzierung von kurzfristigem plastizitätsähnlichem Verhalten (STP-ähnlich)
Die hier bezeichneten Stimulationsmuster stellen die gepaarte Pulserleichterung (PPF) und Depression (PPD) analog zur neurowissenschaftlichen Terminologie dar, ähnlich wie Koner und Najem^28,29. Die gepaarte Pulserleichterung (PPF; 0–60 s) und die gepaarte Puls-Depression (PPD; 60–120 s) werden mit 100-ms-Impulsen mit Aus-Zeiten von 10 ms bzw. 250 ms geliefert, was Duty-Cycles von 90,9 % für PPF und 28,6 % für PPD entspricht. Das obere Panel zeigt repräsentative aktuelle Reaktionen während der ON-Perioden, während das untere Panel das Stimulationsmuster zeigt.

Strom-, Flächen- und Ionenfluss während STP und anschließender Langzeitstimulation
Der normalisierte Strom (I/I₀) für gA-dotierte DPhPC-Doppelschichten in C16- und C12/C16-Ölen ist während PPF und PPD dargestellt (Abbildung 6A). Die normalisierte Membranfläche (A/A₀), gemessen an 30 Zeitpunkten, zeigt eine ähnliche Flächenentwicklung in beiden Ölbedingungen trotz unterschiedlicher Strömungen (Abbildung 6B). Daten für normalisierten Strom und Fläche werden als Mittelwert ± S.D.-Wolken bzw. Balken über 28 unabhängige DiBs pro Ölbedingung dargestellt. Normalisierter Fluss, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀), trennt flächenunabhängige Änderungen der Leitfähigkeit und ist mit Veränderungen in der Membranleitung über die einfache Flächenerweiterung hinaus konsistent (Abbildung 6C). Diese Änderungen können jedoch sowohl Beiträge der Einkanalleitung als auch der Anzahl aktiver leitender Kanäle widerspiegeln. Eine verlängerte PPD-Stimulation von bis zu 30 Minuten erzeugt langfristig depressionsähnliches (LTD) Verhalten in C16-Membranen, hält jedoch einen erhöhten Fluss aufrecht, der mit LTP-ähnlichem Verhalten in C12/C16-Membranen übereinstimmt (Abbildung 6D). Zusammen zeigen diese Daten, dass die Membranzusammensetzung sowohl kurz- als auch langfristige, plastizitätsähnliche Veränderungen im ionischen Fluss moduliert.

Abbildung 6: Strom, Fläche und berechneter Ionenfluss von DIBs während STP und Übergang in LTP/LTD. (A) Normalisierter Strom (I/I₀) während PPF (0–60 s, weißer Hintergrund) und PPD (60–120 s, grauer Hintergrund) für gA-dotierte DPhPC-Membranen in C16 (orange) und C12/C16 (blau) Ölen, wobei jede Bedingung n = 28 unabhängig gebildete DIBs umfasst. (B) Normalisierte Membranflächen (A/A₀), gemessen an 30 Zeitpunkten, die vergleichbare Flächenbahnen trotz unterschiedlicher aktueller Reaktionen zeigen; Die Daten werden als Mittelwert ± S.D. über dasselbe n = 28 unabhängige DiB pro Ölbedingung dargestellt. (C) Normalisierter Fluss, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), wird aus den entsprechenden Strom- und Flächenmessungen berechnet und zeigt Veränderungen der Leitfähigkeit jenseits der Flächeneffekte. (D) Langfristiges Verhalten unter verlängerter PPD-Stimulation: Nach dem anfänglichen 120 s STP (grau schattiert) wurden DIBs 30 Minuten PPD mit ON = 100 ms und OFF = 250 ms (solide rot/grün) oder 30 s (orange/grau) Pulsen unterzogen. Der Flux fällt in C16-Membranen auf oder unter den Ausgangswert ab, was auf LTD-ähnliches Verhalten hinweist, bleibt aber in C12/C16-Membranen erhöht, was auf anhaltendes LTP-ähnliches Verhalten hinweist. Schattierte Bereiche stellen den propagierten Fehler aus I/I₀ und A/A₀ dar. Extended-PPD-Datensätze in (D) wurden aus n = 6 unabhängigen DIBs pro Ölbedingung für das 120-s-Protokoll gewonnen, gefolgt von 3 DIBs pro erweiterter PPD-Bedingung. Alle Datenpunkte sind ausschließlich zu Visualisierungszwecken verbunden. Die Panels A, B und D wurden unter CC BY-NC-ND 4.0 reproduziert. Copyright © 2025 Der Autor(en). Veröffentlicht von PNAS. Panel C wurde für das vorliegende Manuskript neu erstellt, basierend auf Daten, die in Podar PT et al. berichtet wurden, ²⁵. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Repräsentative 15-s-Einkanal-Stromspur aus einem gA-dotierten DIB, das nach PPF-Stimulation in C16-Öl gebildet wurde
Die Spur enthält das Rohsignal, das bei 50 kHz mit einem 1-kHz-Tiefpassfilter aufgenommen wurde, eine 250-Hz-8-Pol-Bessel-gefilterte Spur und die idealisierte JSMURF-Passung. Die niedrigste stabile Ebene definiert den geschlossenen Zustand, und höhere Stufen entsprechen Einkanal-, Mehrkanal- und Unterleitungsereignissen. Diese Spuren bilden die Grundlage für die Analyse von Leitfähigkeitsamplitude und Lebensdauer. Die angegebene Beispiel-Verweilzeit im Leitfähigkeitszustand repräsentiert die Dauer eines bestimmten Leitfähigkeitsniveaus, dessen Amplitude und Dauer den kombinierten Beitrag mehrerer gleichzeitiger vollständiger und/oder subkonduktaner Ereignisse widerspiegeln.

Leitfähigkeitsamplituden- und Lebensdauerverteilungen
Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme für C16- und C12/C16-Membranen (Abbildung 7A–B) vergleichen die Bedingungen vor und nach der PPF bei einem DPhPC:gA-Molarverhältnis von 1:5×10-6. Gaußsche Näherungen unter den Daten zeigen Verschiebungen der mittleren Leitfähigkeitsspitzen nach PPF an und lösen separate Spitzen auf, die zu Unterleitungs- und Mehrkanalzuständen gehören. Statistische Vergleiche der Leitfähigkeitsverteilungen wurden auf gepoolten Ereignisdaten mit Welchs t-Test und Mann-Whitney U-Test (α = 0,05) durchgeführt, wobei jede Bedingung aus 3 unabhängigen DIB-Aufzeichnungen bestand und N für einen gegebenen Leitfähigkeitszustand die Gesamtzahl der über diese Aufzeichnungen gepoolten Ereignisse angibt. Lebenszeit-Wahrscheinlichkeitsverteilungen N(t)/N(0) davor und danach (Abbildung 7C–D) zeigen, dass C12/C16-Membranen längerschwanzige Leitfähigkeitsverteilungen und veränderte Lebensdauern relativ zu C16 entwickeln, was auf Veränderungen der Kanalstabilität hinweist. Histogrammdaten sind repräsentativ für die gefilterte 15-s-Spur (rote Spur), die für jede Bedingung erfasst wurden. Leitfähigkeitszustands-Lebenszeitverteilungen wurden aus 3 unabhängigen DIB-Aufzeichnungen pro Bedingung generiert; Gepunktete Kurven bezeichnen einzelne Replikate, und Solide Kurven bezeichnen globale Exponentialanpassungen zu N(t) / N(0) vs t.

Abbildung 7: Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme und Verweilzeitverteilungen im Leitfähigkeitszustand. Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme für gA-Aktivität in (A) C16- und (B) C12/C16-Membranen vergleichen die Bedingungen vor PPF (grau) und nach PPF (orange / blau) bei einem molaren Verhältnis von 5 × 10^–6 gA:Lipid. Gaußsche Näherungen unter den Histogrammen zeigen Verschiebungen der mittleren Leitfähigkeitsspitzen und Standardabweichungen für Ein- und Mehrkanalzustände an. Verschiebungen der mittleren Leitfähigkeit nach PPF werden durch gestrichelte Linien (schwarz = vor PPF; blau/orange = nach PPF) und Pfeile angezeigt. Jede Bedingung repräsentiert 3 unabhängige DIB-Aufzeichnungen. Statistische Vergleiche der Leitfähigkeitsverteilungen wurden auf gebündelten Ereignisdaten mit Welchs t-Test und Mann-Whitney U-Test (α = 0,05) durchgeführt, wobei N für einen gegebenen Leitfähigkeitszustand die Gesamtzahl der über diese drei Aufzeichnungen addierten Ereignisse bezeichnet. Subkonduktanzereignisse wurden ebenfalls in die Analyse einbezogen, wobei repräsentative Subleitfähigkeitsverteilungen links vom ersten offenen Peak für jede Membranbedingung angezeigt wurden. Die lebenslangen Wahrscheinlichkeitsverteilungen von Leitfähigkeitszustandsereignissen in C16 (C) und C12/C16 (D) Membranen vor (orange / blau) und nach der PPF-Stimulation (dunkelorange / dunkelblau) bei 5×10^–6 M gA:lipid entsprechen den in Abbildung 7A–B gezeigten Leitfähigkeitsanalysen. Hier stellt N(t) die kumulierte Anzahl der vollständigen und subkonduktanzen Ereignisse mit Dauern dar, die länger als die Zeit t sind. Gepunktete Linien zeigen Lebensdauerverteilungen aus einzelnen Replikaten an (n = 3 unabhängige DIBs pro Bedingung), und feste Einsätze zeigen globale exponentielle Anpassungen, die mit nichtlinearer Kurvenanpassungssoftware durchgeführt werden. Die Panels A–D stammen aus Podar PT et al., ²⁵ und wurden für das vorliegende Manuskript unter CC BY-NC-ND 4.0 zusammengestellt. Copyright © 2025 Der Autor(en). Veröffentlicht von PNAS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Untersuchung von Einzelkanalverhalten – aktuelle Antwortspur für DIBs in C16 nach PPF-Stimulation. (A) Beispiel 15 s Stromspur mit Rohdaten (blau), gefiltert mit einem 250-Hz-8-poligen Bessel-Tiefpassfilter (rot) und der idealisierten Spur (grün) zur Identifikation der Leitfähigkeitszustände. Das niedrigste stabile Niveau definiert den Ausgangszustand "geschlossen". (B) Repräsentative Subleitfähigkeitsniveaus, die zwischen den 2^. und 3^. vollständigen Leitfähigkeitsniveaus detektiert wurden und durch deutliche Zwischenspitzen im Amplitudenhistogramm bestätigt werden (siehe Abbildung 7A, orange). Leitfähigkeitszeiten werden aus der Dauer jedes identifizierten Leitfähigkeitsniveaus (ohne den geschlossenen Zustand) extrahiert, um N(t)/N(0) Lebenszeitverteilungen zu erzeugen. Wiedergabe von Podar PT et al., ²⁵ unter CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 Der Autor(en). Veröffentlicht von PNAS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Nach PPF zeigen C12/C16-Membranen eine ausgeprägte Rechtsverschiebung der Leitfähigkeitsamplitudenverteilungen, was auf eine verbesserte Einkanal-Leitfähigkeit hinweist, begleitet von einer nach links verschiebenden Leitfähigkeitszeitverteilungen, die mit kürzeren Kanalöffnungszeiten vereinbar ist. Diese Veränderungen stimmen mit der elektromechanischen Verdünnung der C12/C16-Doppelschicht während PPF überein, wie durch direkte mechanische und Dickenmessungen in Ref. 25 bestätigt, die die energetische Barriere für den Ionentransport durch gA senkt und den Ionendurchsatz pro Öffnung erhöht, während die Kanalstabilität verringert wird. Im Gegensatz dazu zeigen C16-Membranen minimale Veränderungen in beiden Verteilungen, was ihre begrenzte strukturelle Anpassungsfähigkeit hervorhebt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die DIB-Plattform sowohl Ensemble- als auch Einzelkanalkorrelate der elektromechanischen Anpassung der Membran erfasst, einschließlich STP-ähnlicher und LTP/LTD-ähnlicher Veränderungen der ionischen Leitfähigkeit, die durch membranabhängige Dynamiken entstehen (Abbildung 8).

Discussion

Praktisch bietet diese Methode drei zentrale experimentelle Möglichkeiten: eine kontrollierbare Variation der Doppelschichtzusammensetzung durch die Lipidzusammensetzung und die Ölphase, gleichzeitige optische und elektrische Überwachung der Membranrestrukturierung sowie Zugang zu einem Membranflächenregime, das die Einkanal-Elektrophysiologie mit der mesoskaligen Membranmechanik^verbindet 14,15,20,21,25 . Diese Merkmale machen die Methode besonders nützlich für Struktur-Funktions-Studien in vereinfachten Membransystemen, bei denen die Membranelektromechanik und nicht die vollständige zelluläre Komplexität die experimentelle Perspektive von Interesse ist^{. 14,15,20,21,25,39}.

Dieses Protokoll beschreibt die Zusammenstellung und Analyse von Gramicidin-A-dotierten DIBs in Alkanölen, um die Fähigkeit von Lipidmembranen zu untersuchen, sich unter physiologisch relevanter elektrischer Stimulation umzustrukturieren 14,15,25,35,38. Im Vergleich zu Patch-Clamp-Techniken²¹ untersucht die DIB-Plattform Membranpatches, die um Größenordnungen größer sind, während eine ausreichende Auflösung bleibt, um diskrete Ionenkanalereignisse zu erfassen 14,15,19,20,21,28,38. Diese Fähigkeit ist besonders wertvoll, um mesoskalige elektromechanische Umstrukturierung (z. B. als Elektrobenetzung und Elektrokompression) aufzulösen und sie mit mikroskopischem Kanalverhalten zu verknüpfen, das zusammen unter physiologisch inspirierter Stimulation STP-, LTP- und LTD-ähnliche Membranleitfähigkeitsphänotypen hervorbringt 13,25,27,38. Das derzeitige DIB-System ist nicht dazu gedacht, die molekulare Komplexität biologischer Synapsen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 zu replizieren . Dementsprechend werden Begriffe wie STP, LTP, LTD, PPF und PPD in einem beschreibenden, analogiebasierten Sinne verwendet, um kurz- und langfristige Zunahmen und Abnahmen der Membranionenleitung unter definierten Stimulationsprotokollen zu kennzeichnen. Die Hauptergebnisse dieser Arbeit werden daher am direktesten in Bezug auf Membranelektromechanik, Leitfähigkeitsanpassung und zusammensetzungsabhängige Nichtgleichgewichts-Umstrukturierung in den DIBs interpretiert, was nützliche konzeptuelle Analogien und physikalische Perspektiven zur synaptischen Plastizität bieten kann, ohne mechanistische Äquivalenz mit neuronaler Schaltkreise oder biochemischer synaptischer Regulation zu implizieren 10,11,25,38.

Mehrere technische Schritte sind entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Eine sorgfältige Vorbereitung der Ag/AgCl-Elektrode, einschließlich gleichmäßiger Schmelzung der silbernen Kugelspitze, gründlicher Chlorierung und einer dünnen, gleichmäßigen Agaroseschicht, gewährleistet eine stabile Tröpfchenbefestigung und eine elektrochemische Kopplung^{mit niedrigem} Impedanz ^20,35. Die visuelle Bestätigung des Tropfendurchhängens und korrekte Elektrodenorientierung minimieren optische Verzerrungen während der Videoaufnahme und verbessern die Genauigkeit der Membranflächenmessungen. Die Kalibrierung nach der Erfassung mit dem bekannten Silberdrahtdurchmesser ermöglicht eine robuste Pixel-zu-mm-Konvertierung, die für eine zuverlässige Berechnung der Membranfläche und des Ionenflusses unerlässlich ist. In dieser Arbeit wird die Membranleitfähigkeit (Fluss) als Strom pro Flächeneinheit (I/A) definiert, und da sich die DIB-Fläche während des Elektrowettings ändert, erfordert eine genaue Flussquantifizierung zeitlich angepasste Strom- und Doppelschichtflächenmessungen 13,25,27,35.

Dieser Ansatz unterstützt außerdem komplementäre Ensemble-Level- und Einzelkanal-Readouts innerhalb derselben Plattform 14,15,20,25,35,38. Auf Ensemble-Ebene quantifizieren synchronisierte Video- und elektrische Aufnahmen dynamische Veränderungen in Fläche (Elektrowetting) und Strom, aus denen der Ionenfluss (Strom/Fläche) abgeleitet wird. Unter elektrischer Stimulation werden Membranen in nichtgleichgewichtsstationäre Zustände (NESS) getrieben, in denen die zusammensetzungsabhängige Membranumstrukturierung kurzzeitige plastizitätsähnliche Reaktionen erzeugt, die sich über längere Zeiträume zu längerzeitlich potentiationsähnlichen oder depressionähnlichen Verhaltensweisen entwickeln können (min)25,26,28,29,30,31,32,^33,38. Auf Einkanalebene beinhaltet die Analyse die Idealisierung von Stromleiterbahnen in stufenweise Leitfähigkeitsniveaus (geschlossene, Einkanal-, Mehrkanal- und Unterleitungszustände). Traditionelle Rechteckwellen-Idealisierungswerkzeuge lösen typischerweise nur eine begrenzte Anzahl diskreter Niveaus auf; für komplexere oder rauschere Daten werden modellfreie Idealisierungsmethoden wie JSMURF³⁷ bevorzugt. Kurze DC-Haltepotentiale, analysiert mit JSMURF, bieten eine statistisch rigorose Ereigniserkennung unter heterogenem Rauschen und liefern Leitfähigkeitsamplituden-Histogramme (ganzzahlige und subkonduktanzniveau) sowie N(t)/N(0)-Lebenszeitverteilungen. Das Überlagern idealisierter und gefilterter Amplitudenhistogramme ermöglicht eine visuelle und quantitative Kreuzvalidierung von Leitfähigkeitszuständen, während konvolvierte Rekonstruktionen (idealisierte Spuren, die durch den bekannten Tiefpassfilter geleitet werden) die Parameterwahl und die Ereignistreue³⁷ bestätigen.

Die Membranzusammensetzung, hier durch die umgebende Ölphase abgestimmt (z. B. C16 vs. C12/C16), wird voraussichtlich die Vikoelastizität der Doppelschicht und die Umstrukturierungskapazität unter elektrischer Stimulation modulieren, was mit den direkten Messungen in früheren Arbeiten 22,25,39 übereinstimmt. Es wird erwartet, dass konformere Membranen während PPF 22,23,25 eine stärkere, durch EC-bedingte Verdünnung und eine verbesserte hydrophobe Übereinstimmung mit gA zeigen, was zu einer erhöhten Einkanalleitung und -Erleichterung führt, die sich als LTP-ähnliches ^{Verhalten 25,38} stabilisieren kann. Im Gegensatz dazu zeigen steifere Membranen eine begrenzte strukturelle Reaktionsfähigkeit, geringere Leitfähigkeitsänderungen während PPF und PPD sowie eine Tendenz zu LTD bei längerem Pulsieren. Diese zusammensetzungsabhängigen Ergebnisse zeigen, wie Materialeigenschaften Membranen für unterschiedliche, funktional relevante Langzeitregime anfällig ^machen.

Die DIB-Plattform hat zudem wichtige Einschränkungen²¹. Die hier vorgeführte mechanistische Interpretation ist, dass Unterschiede in der Ölzusammensetzung die Eigenschaften des Doppelschichtmaterials und die Anfälligkeit für elektromechanische Umstrukturierungen verändern, was wiederum die Gramicidin-A-Leitung 22,23,25 moduliert. Diese Interpretation wird durch die vorherige Studie gestützt, die direkt die Membranviskoelastizität, die Grenzflächenspannung sowie dynamische Veränderungen der Membrandicke unter diesen Membranbedingungen und der Stimulation²² maß. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Materialeigenschaften jedoch in jedem Experiment nicht gleichzeitig gemessen und werden daher hier genutzt, um die unterschiedlichen strukturellen und mechanischen Reaktionen auf elektrische Stimulation von Membranen in C16- und C12/C16-Umgebungen zu unterstützen, anstatt die mechanistische Interpretation der Daten unabhängig festzulegen. Darüber hinaus können Ensemblestrom und -fluss sowohl Veränderungen in der Einkanalleitung als auch Veränderungen in der Anzahl der leitenden Kanäle widerspiegeln, die mit Membranfläche, Peptiddiffusion und Dimerisierung unter Nichtgleichgewichtsbedingungen^{variieren können} 17,18,22,23. Die umgebende Ölphase kann während der Stimulation auch dynamisch aus dem Doppelschichtkern eindringen oder zurückweichen, was zu einer Basisdrift bei Einzelkanalaufnahmen und allmählichen Veränderungen der Membranzusammensetzung über die Zeit beiträgt 13,21,25. Zusammen begrenzen diese Faktoren die Verwendung von Langdauer-Konstantspannungs-Aufzeichnungen zur Definition statischer Membraneigenschaften und betonen, dass DIBs sich als offene, dynamische Systeme und nicht als geschlossene Gleichgewichtsmembranen^verhalten 13,21,25. Während das vorliegende Protokoll zwar stimulationsabhängige, plastizitätsähnliche Veränderungen in der Leitung über die vorgesehenen experimentellen Zeiträume^25,38 erfasst, werden zukünftige Studien, die direkte mechanische Messungen mit gleichzeitigen elektrischen und optischen Aufzeichnungen kombinieren, möglicherweise neben fluoreszenzbasierter Einzelmolekülbildgebung kombinieren, erforderlich sein, um die jeweiligen Beiträge von Membranrestrukturierung, Kanalleitfähigkeit und Kanalpopulation besser zu klären^21,25.

Häufige Versagensarten sind instabile Tröpfchenanhaftung, unvollständiges Tropfendurchhängen, vorzeitige Tropfenkoaleszenz während der Doppelschichtbildung und eine schlechte optische Definition der Doppelschichtkante bei der Flächenanalyse. Instabile Tröpfchenanhaftung wird oft durch unregelmäßige Silberkugel-Geometrie oder eine ungleichmäßige Agarosebeschichtung verursacht und kann durch Überprüfung der Kugelsymmetrie und das Erhalten einer glatten Agaroseschale reduziert werden. Die Elektrodenladung erfordert außerdem eine manuelle Ablagerung von nanolitergroßen wässrigen Tröpfchen auf einen Submimeter-Elektrodenkopf, was eine erhebliche Hand-Auge-Koordination und Tiefenwahrnehmung über Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes (Luft vs. Öl) erfordert. Infolgedessen kann die Pipettespitze unbeabsichtigt die Agaroseschale berühren oder den Elektrodenkopf beim Abgeben verfehlen. Stabilitätssteigernde Techniken wie Handgelenksabstützung, langsame Pipettenentwicklung im Öl und Atemanhalten zusammen mit wiederholtem Üben können die Ladekompetenz verbessern. Darüber hinaus kann unvollständiges Durchhängen oder verzögerte Monoschichtbildung durch Heterogenität der Vesikel, Temperaturschwankungen oder Agarosetopographie entstehen und durch eine Verlängerung der Wartezeit nach Tröpfchenablagerung^{15, 20, 35} verbessert werden. Koaleszenz während der Doppelschichtbildung ist häufig mit übermäßiger Kontaktfläche oder übermäßig aggressiver elektrischer Stimulation (> ± 200 mV) verbunden und kann durch die Verwendung kleinerer anfänglicher Tröpfchenkontaktflächen gemindert werden, was zusätzliche Zeit für die Monoschichtstabilisierung ermöglicht und die niedrigamplitudige Dreieckswellenkapazitätsantwort vor dem Pulsen^von 25,35,38 überprüft.

Trotz dieser Einschränkungen ist die DIB-Plattform hoch abstellbar, skalierbar und reproduzierbar 14,15,20,21,25,35,38,40 und ergänzt die proteinzentrierte Elektrophysiologie, indem sie den Beitrag der Lipidmechanik ^{zur Leitung} isoliert. Durch die Vereinheitlichung von Ensemble- und Einzelkanalmessungen in einem System bietet dieses Protokoll einen praktischen Weg, um zu analysieren, wie elektrische Arbeit und Membranviskoelastizität zusammenwirken, um synaptisch-ähnliches leitfähiges Verhalten (STP-, LTP- und LTD-ähnliche Reaktionen) in einem steuerbaren Bottom-up-Modell^{zu erzeugen:} 25,29,30,31,32,33,33,38 . Als solche bietet die Methodik eine Grundlage für die systematische Untersuchung zusammensetzungsabhängiger Lernregeln in Membranen und zur Quantifizierung, wie mechanische und elektrische Kräfte Membranproteine über zeitliche und räumliche Skalen an ihre Wirtsdoppelschicht koppeln ^21,22,23,25. Zusammen positionieren diese Fähigkeiten DIBs als mächtiges Rahmenwerk, um komplexe neurobiologische Verhaltensweisen in handhabbare, testbare biophysikalische Mechanismen^zu dekonstruieren 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Diphytanoy-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC)	Avantipolare Lipide	850356P/850356C	Gekauft als lyophilisiertes Pulver (P) oder in Chloroform (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarose (0,5g Agarosetabletten)	Benchmark	A2501	Du kannst entweder die Pulverform oder die Tabletten verwenden;
Agilent Technologies 33522A Wellenformgenerator	Keysight	–	Du kannst jeden Wellenformgenerator mit BNC-Kabelausgängen verwenden
Argon (Ar)-Gas	Luftgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon komprimiert; Ultra Hohe Reinheit
Analytisches Gleichgewicht	Mettler Toledo	Modell: MS304S/03	Jede laborreife Analysewaage mit einer Genauigkeit von 0,0001 g
Axopatch 200B Verstärker	Molekulare Bauelemente	–
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Kapillaren aus Borosilikatglas	Weltpräzisionsinstrumente	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 Software-Suite	Molekulare Bauelemente	–
DigiData 1550B-System	Molekulare Bauelemente	–	Dazu gehören ein Mini-Extruder, 2 Spritzen, 100 PC-Membranen, 100 Filterstützen und 1 Halter/Heizblock
Dodekan, 99 %	Sigma-Aldrich	112-40-3
Extruderset mit Halter/Heizblock	Avantipolare Lipide	610000
Fidschi-Software	ImageJ	–
Gefrierschrank (-80 °F; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Modell: 8964; S/N: 828278-21
Glaswaren	VWR International	–
Gramicidin-A	Millipore Sigma	368020
Hexadekan, 99 %	Sigma-Aldrich	544-76-3
Brumm-Käfer-Geräuscheliminator (60 Hz)	A-M-Systeme	726300
Invertiertes Mikroskopsystem (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Jedes umgekehrte oder aufrechte Mikroskop kann verwendet werden
Isopropylalkohol	VWR International	BDH1133-4LP
Mikroelektrodenhalter	Weltpräzisionsinstrumente	MEH1S
Mikromanipulatoren	Sutter-Instrument	MP-285	Manuelle Manipulatoren können verwendet werden
Mikroskopkamera	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NIS-Elements Mikroskopkamera-Software	Nikon	–	Kameraaufnahmesoftware mit Live-View- und/oder Videofunktion kann verwendet werden. Live-View und gleichzeitige Bildschirmaufnahme können als Ersatz für Videoaufnahmen verwendet werden.
Parafilm M Allzweck-Laborfilm	Parafilm	PM999
Petrischale	-	-	Die Schüssel muss unten transparent sein und idealerweise auch an der Seitenwand
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Pulverfreie weiche Nitril-Untersuchungshandschuhe	VWR International	CA89-38-272
Kühler (4 & Grad; C)	Fisher Scientific	KATZENNUMMER: 97-938-1; Modellnummer: 3556FS
Silberdraht	GoodFellow	147-346-94
Umrühren der heißen Platte	Thermowissenschaftlich	SP131325