Isolierung einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und Sortierung nach Größe

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und zur Sortierung nach Zellgröße.

Zusammenfassung

Die frühe Embryogenese erfordert eine exponentielle Verringerung der Zellgröße, während der Embryo in den frühesten Entwicklungsstadien konstant bleibt. Die funktionelle Bedeutung und die Mechanismen, durch die die Zellgröße die Embryonalentwicklung beeinflusst, sind noch weitgehend wenig erforscht. Der frühe Xenopus-Embryo bietet ein einzigartiges System, um diese großen Lücken zu schließen. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen ist der frühe Xenopus-Embryo extrem groß und enthält einen Zellgrößengradienten, von kleinen Zellen am Tierpol bis zu großen Zellen am pflanzlichen Pol, über den gesamten Embryo in Stadien rund um den mittleren Blastula-Übergang. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Dissoziation einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und deren Sortierung nach Größe mit Zellsiebungen mit unterschiedlichen Maschenporengrößen. Wie durch Bildaufnahmen und Größenmessungen bestimmt, liegen die sortierten Zellen im erwarteten Größenbereich und können für Live-Zell-Analysen oder -sequenzierungen verwendet oder für die Bildgebung fixiert werden. Dieses System wird neues Licht darauf werfen, größenabhängige Regulierungsmechanismen während der frühen Entwicklung aufzudecken.

Einleitung

Die Zellgrößenänderung ist ein häufiges Merkmal der frühen Embryogenese, wenn die befruchtete Eizelle mehrere Spaltungsrunden durchläuft und eine zunehmende Anzahl von Zellen erzeugt. Obwohl viel über die Rolle der Zellgröße als Hauptparameter für zelluläre Funktionen ^1,2,3 bekannt ist, ist weniger bekannt, wie die Zellgröße die frühe Entwicklung beeinflusst. Jüngste Arbeiten in verschiedenen embryonalen Modellsystemen legen nahe, dass die Zellgröße die zygotische Genomaktivierung (ZGA)⁴ und die Zellschicksalsspezifikation⁵ reguliert, was eine wichtige Rolle für die Zellgröße bei Entwicklungsentscheidungen^{unterstützt.}

Der frühe Xenopus-Embryo ist ein wichtiges Modell zur Untersuchung der zellgrößenregulierten Entwicklungsentscheidungen. Da der frühe Xenopus-Embryo groß ist (~1,2 mm Durchmesser), lässt sich seine Größe leicht physisch manipulieren, was ihn nützlich macht, um die direkten Folgen einer Zellgrößenänderung zu bewerten. Beispielsweise können Mini-Embryonen unterschiedlicher Größe durch Verengung von 1-Zell-Embryonen mit Haarschleifen ^4,8 erzeugt werden, was dosisabhängige ZGA⁴ demonstriert. Außerdem enthält der frühe Embryo von Xenopus einen Gradienten von Zellgrößen entlang der tier-pflanzlichen Achse, wobei die kleinsten Zellen am Tierpol und die größten Zellen am pflanzlichen Pol liegen, was einen über 100-fachen Unterschied im^{Volumen 4} zeigt. Wichtig ist, dass wir durch die direkte Visualisierung und Quantifizierung entstehender Transkripte in einzelnen Zellen ganzer Mount-Embryonen eine Zellgrößenschwelle identifizierten, die ZGA⁴ reguliert. Darüber hinaus bestätigte die Isolierung einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und deren Sortierung nach Größe die Bedeutung des Zellgrößen-Schwellenwerts ZGA⁴.

Hier beschreiben wir die detaillierten Verfahren zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und deren Sortierung nach Größe. Frühe Xenopus-Embryonen können in einzelne Zellen dissoziiert werden, indem sie in Ca²⁺, Mg²⁺-freies Medium (CMFM)⁹ inkubiert werden, und diese Einzelzellen können weiter mit Zellfiltern mit unterschiedlichen Porengrößen sortiert werden. Die sortierten Zellen können gereinigt und in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, darunter Live-Zellanalyse, Sequenzierung oder bildgebende Tests.

Protokoll

Die hier beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Carolina genehmigt.

1. Lösungsvorbereitung

HINWEIS: Bereiten Sie vor Beginn des Protokolls die folgenden Lösungen vor.

1. 20× MMR vorbereiten: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl₂ und 40 mM CaCl₂ mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
2. Bereite Ca²⁺, Mg²⁺-freies Medium (CMFM) vor: Mische 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM KH₂PO₄, 2,4 mM NaHCO₃ und 1,0 mM EDTA. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
3. Bereiten Sie ein 1,5%iges Agarosegel in einer 60-mm-Petrischale vor: Fügen Sie 0,75 g Agarose zu 50 ml CMFM hinzu. Erhitze, um die Agarose in einer Mikrowelle aufzulösen. Füge 5–10 ml Agarosegel hinzu, um eine dünne Schicht in einer 60-mm-Petrischale zu überziehen.
4. Bereiten Sie ein 15%-Dichtegradientenmedium (Wt/Vol)/CMFM vor: Fügen Sie langsam 15 g Dichtegradientenmedium in 100 mL CMFM hinzu. Um das Auflösen zu erleichtern, wird auf einer Platte erhitzt und umgerührt, bis das Dichtegradientenmedium vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung bis zur Anwendung bei 4 °C aufbewahren.
5. 4 % PFA/1 vorbereiten× MEM: Mischen Sie 1 Fläschchen (10 ml) mit 16 % Paraformaldehyd-Stock und 4 ml 10× MEM (1000 mM MOPS pH 7,4, 20 mM EGTA und 10 mM MgSO₄). Fügen Sie ultrareines Wasser zu 40 ml hinzu.
   HINWEIS: Um Xenopus-Embryonen zu erhalten, folgen Sie einem Standardprotokoll für die Durchführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) (siehe zum Beispiel Sive et al., 2007)¹⁰. Der Embryo sollte im MMR von 0,1 × einsatzbereit sein.

2. Dissoziation früher Embryonen in Einzelzellen

1. Fügen Sie ~15 ml CMFM in eine neue 60-mm-Petrischale hinzu, die mit 1,5 % Agarose-Gel beschichtet ist. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 10–100 Embryonen (je nach experimenteller Bedarf) in die Schale zu bringen. Stell die Schüssel unter ein Stereomikroskop.
2. Verwenden Sie eine Pinzette in beiden Händen, um die Vatellinmembran vorsichtig zu entfernen, indem Sie sie mit einer Pinzette auf der Oberfläche der Embryonen auffangen und mit der anderen abziehen. Vermeiden Sie es, die Embryonen während des Prozesses zu schädigen.
3. Inkubieren Sie die devitellinierten Embryonen im CMFM für ~1 Stunde bei Raumtemperatur. Schütteln Sie die Schale sehr sanft alle 5 Minuten, um die Dissoziation der Zellen zu erleichtern. Überprüfen Sie regelmäßig, bis keine Blastomerhaufen mehr sichtbar sind (Abbildung 1).

3. Sortierung der dissoziierten Zellen nach Größe

1. Während der Blastomer-Dissoziation tauchen Sie die Zellfärbungen (40 μm, 70 μm und 100 μm) in einzelne Petrischalen ein, die mit CMFM gefüllt sind (Abbildung 2). Platzieren Sie die Gerichte in der Reihenfolge von links nach rechts, wie angegeben. Außerdem werden zwei weitere CMFM-gefüllte Teller zwischen den Gruppen eingebaut, um während jeder Sortierung kurz die Zellfärbungen zu waschen.
2. Rühren Sie die Schale mit den isolierten einzelnen Blastomeren sanft, um sie in der Mitte des Gerichts zu bereichern. Übertragen Sie die Blastomere vorsichtig in den 40-μm-Färber in CMFM.
3. Schüttle das Sieb vorsichtig ein paar Mal, damit die Blastomere < 40 μm durch das Sieb einsickern. Dann bewege das 40-μm-Sieb schnell zur CMFM-gefüllten Schale zum kurzen Waschen. Übertragen Sie die Blastomere im 40-μm-Sieb, die > 40 μm sind, vorsichtig in das 70-μm-Sieb.
4. Wiederhole die Schritte, bis die Blastomere im 100-μm-Sieb sortiert sind.
5. Rühren Sie jedes Gericht vorsichtig mit sortierten Blastomeren, um sie in der Mitte des Gerichts zu bereichern. Übertragen Sie die Blastomere (~4 mL) vorsichtig auf die Oberseite eines 0,5 mL 15%-Dichtegradientenmediums in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierröhrchen (FACS) (Abbildung 3). Vermeiden Sie das Mischen.
6. Lass das Röhrchen 10 Minuten stehen. Die intakten Blastomere setzen sich durch die Schwerkraft auf den Boden ab und trennen sich während des Sortierens und Transfers von den Eigelbklumpen der Burst-Blastomeren (Abbildung 3).
7. Je nach Zweck der nachgelagerten Experimente wird mit der Analyse von lebenden Zellen durchgeführt, die Blastomere in flüssigem Stickstoff für RNA-Arbeiten eingefroren oder die Blastomere für die Immunfärbung fixiert (Abbildung 3).

Ergebnisse

Xenopus laevis-Embryonen (n = 50) im Stadium 9 wurden im CMFM-Medium inkubiert, um nach diesem Protokoll in einzelne Blastomere zu dissoziieren (siehe Beispiel in Abbildung 1). Die dissoziierten einzelnen Blastomere wurden sequentiell mit den oben beschriebenen 40-μm-, 70-μm- und 100 μm-Zellsieren sortiert. Die unsortierte Kontrollmischung und er sortierte einzelne Blastomere wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und unter einem Hellfeldmikroskop abg...

Diskussion

Die Zellgröße ist grundlegend wichtig für zelluläre Funktionen³, und ihr Einfluss auf die frühe Entwicklung erfordert eine genauere Untersuchung in Modell-embryonalen Systemen. Hier haben wir die Details zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und zur Sortierung der Zellen nach Größe mittels Zellsiebe beschrieben, was potenziell für Zellgrößenstudien anwendbar ist. Diese Methode ermöglichte es uns, den direkten Beleg für di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 % Paraformaldehyd (PFA)	EMS	15710-S	Zur Herstellung der fixativen Lösung
60 mm Einweg-Petrischalen	VWR	25384-092	Für die Inkubation von Embryonen
ACCU-SCOPE 3075 Zoom-Stereomikroskope	VWR	470351-130	Zur Visualisierung von Embryonen
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9414	Zum Überziehen von Petrischalen
Zell-Sieb, 100 & Mikro; m	VWR	76327-102	Für die Sortierung von Zellen nach Größe
Zellsieb, 40 & Mikro; m	VWR	76327-098	Für die Sortierung von Zellen nach Größe
Zell-Siebe, 70 & Mikro; m	VWR	76327-100	Für die Sortierung von Zellen nach Größe
Einweg-Transferpipetten	VWR	414004-035	Für den Transfer von Embryonen
Dumont-Pinzette, Stil 5	Elektronenmikroskopiewissenschaften	72701-D	Zum Entfernen der Vitellinmembran
Glaspetrischale, 60 & Times; 15 mm	VWR	75845-542	Für die Inkubation von Embryonen