Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und zur Sortierung nach Zellgröße.
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Methodenartikel
Isolierung einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und Sortierung nach Größe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die frühe Embryogenese erfordert eine exponentielle Verringerung der Zellgröße, während der Embryo in den frühesten Entwicklungsstadien konstant bleibt. Die funktionelle Bedeutung und die Mechanismen, durch die die Zellgröße die Embryonalentwicklung beeinflusst, sind noch weitgehend wenig erforscht. Der frühe Xenopus-Embryo bietet ein einzigartiges System, um diese großen Lücken zu schließen. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen ist der frühe Xenopus-Embryo extrem groß und enthält einen Zellgrößengradienten, von kleinen Zellen am Tierpol bis zu großen Zellen am pflanzlichen Pol, über den gesamten Embryo in Stadien rund um den mittleren Blastula-Übergang. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Dissoziation einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und deren Sortierung nach Größe mit Zellsiebungen mit unterschiedlichen Maschenporengrößen. Wie durch Bildaufnahmen und Größenmessungen bestimmt, liegen die sortierten Zellen im erwarteten Größenbereich und können für Live-Zell-Analysen oder -sequenzierungen verwendet oder für die Bildgebung fixiert werden. Dieses System wird neues Licht darauf werfen, größenabhängige Regulierungsmechanismen während der frühen Entwicklung aufzudecken.
Einleitung
Die Zellgrößenänderung ist ein häufiges Merkmal der frühen Embryogenese, wenn die befruchtete Eizelle mehrere Spaltungsrunden durchläuft und eine zunehmende Anzahl von Zellen erzeugt. Obwohl viel über die Rolle der Zellgröße als Hauptparameter für zelluläre Funktionen 1,2,3 bekannt ist, ist weniger bekannt, wie die Zellgröße die frühe Entwicklung beeinflusst. Jüngste Arbeiten in verschiedenen embryonalen Modellsystemen legen nahe, dass die Zellgröße die zygotische Genomaktivierung (ZGA)4 und die Zellschicksalsspezifikation5 reguliert, was eine wichtige Rolle für die Zellgröße bei Entwicklungsentscheidungenunterstützt.
Der frühe Xenopus-Embryo ist ein wichtiges Modell zur Untersuchung der zellgrößenregulierten Entwicklungsentscheidungen. Da der frühe Xenopus-Embryo groß ist (~1,2 mm Durchmesser), lässt sich seine Größe leicht physisch manipulieren, was ihn nützlich macht, um die direkten Folgen einer Zellgrößenänderung zu bewerten. Beispielsweise können Mini-Embryonen unterschiedlicher Größe durch Verengung von 1-Zell-Embryonen mit Haarschleifen 4,8 erzeugt werden, was dosisabhängige ZGA4 demonstriert. Außerdem enthält der frühe Embryo von Xenopus einen Gradienten von Zellgrößen entlang der tier-pflanzlichen Achse, wobei die kleinsten Zellen am Tierpol und die größten Zellen am pflanzlichen Pol liegen, was einen über 100-fachen Unterschied imVolumen 4 zeigt. Wichtig ist, dass wir durch die direkte Visualisierung und Quantifizierung entstehender Transkripte in einzelnen Zellen ganzer Mount-Embryonen eine Zellgrößenschwelle identifizierten, die ZGA4 reguliert. Darüber hinaus bestätigte die Isolierung einzelner Zellen aus frühen Xenopus-Embryonen und deren Sortierung nach Größe die Bedeutung des Zellgrößen-Schwellenwerts ZGA4.
Hier beschreiben wir die detaillierten Verfahren zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und deren Sortierung nach Größe. Frühe Xenopus-Embryonen können in einzelne Zellen dissoziiert werden, indem sie in Ca2+, Mg2+-freies Medium (CMFM)9 inkubiert werden, und diese Einzelzellen können weiter mit Zellfiltern mit unterschiedlichen Porengrößen sortiert werden. Die sortierten Zellen können gereinigt und in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, darunter Live-Zellanalyse, Sequenzierung oder bildgebende Tests.
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Protokoll
Die hier beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Carolina genehmigt.
1. Lösungsvorbereitung
HINWEIS: Bereiten Sie vor Beginn des Protokolls die folgenden Lösungen vor.
- 20× MMR vorbereiten: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 und 40 mM CaCl2 mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
- Bereite Ca2+, Mg2+-freies Medium (CMFM) vor: Mische 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM KH2PO4, 2,4 mM NaHCO3 und 1,0 mM EDTA. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 ein. Autoklav und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
- Bereiten Sie ein 1,5%iges Agarosegel in einer 60-mm-Petrischale vor: Fügen Sie 0,75 g Agarose zu 50 ml CMFM hinzu. Erhitze, um die Agarose in einer Mikrowelle aufzulösen. Füge 5–10 ml Agarosegel hinzu, um eine dünne Schicht in einer 60-mm-Petrischale zu überziehen.
- Bereiten Sie ein 15%-Dichtegradientenmedium (Wt/Vol)/CMFM vor: Fügen Sie langsam 15 g Dichtegradientenmedium in 100 mL CMFM hinzu. Um das Auflösen zu erleichtern, wird auf einer Platte erhitzt und umgerührt, bis das Dichtegradientenmedium vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung bis zur Anwendung bei 4 °C aufbewahren.
- 4 % PFA/1 vorbereiten× MEM: Mischen Sie 1 Fläschchen (10 ml) mit 16 % Paraformaldehyd-Stock und 4 ml 10× MEM (1000 mM MOPS pH 7,4, 20 mM EGTA und 10 mM MgSO4). Fügen Sie ultrareines Wasser zu 40 ml hinzu.
HINWEIS: Um Xenopus-Embryonen zu erhalten, folgen Sie einem Standardprotokoll für die Durchführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) (siehe zum Beispiel Sive et al., 2007)10. Der Embryo sollte im MMR von 0,1 × einsatzbereit sein.
2. Dissoziation früher Embryonen in Einzelzellen
- Fügen Sie ~15 ml CMFM in eine neue 60-mm-Petrischale hinzu, die mit 1,5 % Agarose-Gel beschichtet ist. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 10–100 Embryonen (je nach experimenteller Bedarf) in die Schale zu bringen. Stell die Schüssel unter ein Stereomikroskop.
- Verwenden Sie eine Pinzette in beiden Händen, um die Vatellinmembran vorsichtig zu entfernen, indem Sie sie mit einer Pinzette auf der Oberfläche der Embryonen auffangen und mit der anderen abziehen. Vermeiden Sie es, die Embryonen während des Prozesses zu schädigen.
- Inkubieren Sie die devitellinierten Embryonen im CMFM für ~1 Stunde bei Raumtemperatur. Schütteln Sie die Schale sehr sanft alle 5 Minuten, um die Dissoziation der Zellen zu erleichtern. Überprüfen Sie regelmäßig, bis keine Blastomerhaufen mehr sichtbar sind (Abbildung 1).
3. Sortierung der dissoziierten Zellen nach Größe
- Während der Blastomer-Dissoziation tauchen Sie die Zellfärbungen (40 μm, 70 μm und 100 μm) in einzelne Petrischalen ein, die mit CMFM gefüllt sind (Abbildung 2). Platzieren Sie die Gerichte in der Reihenfolge von links nach rechts, wie angegeben. Außerdem werden zwei weitere CMFM-gefüllte Teller zwischen den Gruppen eingebaut, um während jeder Sortierung kurz die Zellfärbungen zu waschen.
- Rühren Sie die Schale mit den isolierten einzelnen Blastomeren sanft, um sie in der Mitte des Gerichts zu bereichern. Übertragen Sie die Blastomere vorsichtig in den 40-μm-Färber in CMFM.
- Schüttle das Sieb vorsichtig ein paar Mal, damit die Blastomere < 40 μm durch das Sieb einsickern. Dann bewege das 40-μm-Sieb schnell zur CMFM-gefüllten Schale zum kurzen Waschen. Übertragen Sie die Blastomere im 40-μm-Sieb, die > 40 μm sind, vorsichtig in das 70-μm-Sieb.
- Wiederhole die Schritte, bis die Blastomere im 100-μm-Sieb sortiert sind.
- Rühren Sie jedes Gericht vorsichtig mit sortierten Blastomeren, um sie in der Mitte des Gerichts zu bereichern. Übertragen Sie die Blastomere (~4 mL) vorsichtig auf die Oberseite eines 0,5 mL 15%-Dichtegradientenmediums in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierröhrchen (FACS) (Abbildung 3). Vermeiden Sie das Mischen.
- Lass das Röhrchen 10 Minuten stehen. Die intakten Blastomere setzen sich durch die Schwerkraft auf den Boden ab und trennen sich während des Sortierens und Transfers von den Eigelbklumpen der Burst-Blastomeren (Abbildung 3).
- Je nach Zweck der nachgelagerten Experimente wird mit der Analyse von lebenden Zellen durchgeführt, die Blastomere in flüssigem Stickstoff für RNA-Arbeiten eingefroren oder die Blastomere für die Immunfärbung fixiert (Abbildung 3).
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Ergebnisse
Xenopus laevis-Embryonen (n = 50) im Stadium 9 wurden im CMFM-Medium inkubiert, um nach diesem Protokoll in einzelne Blastomere zu dissoziieren (siehe Beispiel in Abbildung 1). Die dissoziierten einzelnen Blastomere wurden sequentiell mit den oben beschriebenen 40-μm-, 70-μm- und 100 μm-Zellsieren sortiert. Die unsortierte Kontrollmischung und er sortierte einzelne Blastomere wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und unter einem Hellfeldmikroskop abg...
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Diskussion
Die Zellgröße ist grundlegend wichtig für zelluläre Funktionen3, und ihr Einfluss auf die frühe Entwicklung erfordert eine genauere Untersuchung in Modell-embryonalen Systemen. Hier haben wir die Details zur Isolierung einzelner Zellen aus frühen Embryonen von Xenopus laevis und zur Sortierung der Zellen nach Größe mittels Zellsiebe beschrieben, was potenziell für Zellgrößenstudien anwendbar ist. Diese Methode ermöglichte es uns, den direkten Beleg für di...
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Offenlegungen
Der Autor erklärt keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Wir möchten dem Matthew Good Labor an der University of Pennsylvania für die Ausbildung danken. Diese Arbeit wurde teilweise vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 16 % Paraformaldehyd (PFA) | EMS | 15710-S | Zur Herstellung der fixativen Lösung |
| 60 mm Einweg-Petrischalen | VWR | 25384-092 | Für die Inkubation von Embryonen |
| ACCU-SCOPE 3075 Zoom-Stereomikroskope | VWR | 470351-130 | Zur Visualisierung von Embryonen |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9414 | Zum Überziehen von Petrischalen |
| Zell-Sieb, 100 & Mikro; m | VWR | 76327-102 | Für die Sortierung von Zellen nach Größe |
| Zellsieb, 40 & Mikro; m | VWR | 76327-098 | Für die Sortierung von Zellen nach Größe |
| Zell-Siebe, 70 & Mikro; m | VWR | 76327-100 | Für die Sortierung von Zellen nach Größe |
| Einweg-Transferpipetten | VWR | 414004-035 | Für den Transfer von Embryonen |
| Dumont-Pinzette, Stil 5 | Elektronenmikroskopiewissenschaften | 72701-D | Zum Entfernen der Vitellinmembran |
| Glaspetrischale, 60 & Times; 15 mm | VWR | 75845-542 | Für die Inkubation von Embryonen |
Referenzen
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
- Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
- Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
- Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
- Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
- Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
- Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
- Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
- Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen
