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Forschungsartikel

Klinische Auswirkungen von Serummatrix-Metalloproteinase-12 und Tumor-Cadherin-13 für molekulare Subtypisierung und personalisierte Therapie bei Lungenkrebs

128 Ansichten

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DOI:

10.3791/70633

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28. April 2026

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1Department of Respiratory and Critical Care Medicine IV (RICU), Xingtai People's Hospital, 2Department of Respiratory and Critical Care Medicine I, Xingtai People's Hospital, 3Department of Medical Oncology II, Xingtai People's Hospital, 4Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Huanghua Development Zone Boai Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie bewertet Serummatrix-Metalloproteinase-12 (MMP-12) und Tumor-Cadherin-13 (CDH13) als komplementäre Biomarker bei Lungenkrebs. Diese Marker korrelieren mit molekularen Subtypen, der Behandlungsreaktion und dem Überleben, was ihre potenzielle Anwendung bei Subtypisierung, Behandlungsstratifizierung und prognostischer Bewertung unterstützt.

Zusammenfassung

Lungenkrebs bleibt weltweit eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle, was vor allem auf seine biologische Heterogenität, häufige Spätphasen-Diagnosen und die Beschränkungen umfassender molekularer Tests zurückzuführen ist. Einzelne Biomarker reichen oft nicht aus, um klinische Entscheidungen zu steuern, was die Notwendigkeit komplementärer und klinisch praktikabler Indikatoren unterstreicht, die systemische und tumorspezifische Biologie integrieren. In dieser Einzelzentrum-Kohortenstudie wurden 262 Patienten mit Lungenkrebs eingeschrieben. Die Serummatrix-Metalloproteinase-12 (MMP-12)-Spiegel wurden mittels enzymgebundenem Immunsorbent-Assay (ELISA) gemessen, und die Expression von Tumorcadherin-13 (CDH13) wurde mittels Immunhistochemie (IHC) mit einem validierten immunreaktiven Score (IRS) bewertet. Die molekulare Subtypisierung wurde durch routinemäßige klinische Tests gewonnen, und Zusammenhänge mit Behandlungs-Antwort- und Überlebensergebnissen wurden mittels multivariabler logistischer und Cox-Regressionsmodelle bewertet. MMP-12 und CDH13 zeigten umgekehrte Verteilungen über molekulare Subtypen (P < 0,001), sodass die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR)/anaplastischen Lymphomkinase-(ALK)-veränderten Tumore einen niedrigeren MMP-12- und höheren CDH13-Wert aufwiesen, während Kirsten-Rattensarkom-virale Onkogen-homologe (KRAS)-mutante und Wildtyp-Tumore das entgegengesetzte Muster zeigten. Eine höhere Programmierte Death-Ligand-1 (PD-L1)-Expression war konsistent mit erhöhtem MMP-12 und einem reduzierten CDH13 (alle P < 0,05) assoziiert. Ein erhöhtes MMP-12 war unabhängig mit einer reduzierten objektiven Antwortrate (ORR) (adjustierte Odds Ratio [OR] = 0,662, P < 0,001) und schlechterem Überleben (progressionsfreies Überlebenshazard [PFS] Hazard Ratio [HR] = 1,382; Gesamtüberlebensrate [OS] HR = 1,421; beide P < 0,001) assoziiert, während ein höheres CDH13 eine verbesserte Antwort (adjustiert OR = 1,201, P < 0,001) und Überlebensrate (PFS HR = 0,884; OS HR = 0,862; beide P < 0,001). Die kombinierte Signatur mit hohem MMP-12/niedrigem CDH13 identifizierte eine Untergruppe mit signifikant schlechteren Ergebnissen (PFS HR = 2,281; OS-HR = 2,506; P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Serum-MMP-12 und Tumor CDH13 als komplementäre Biomarker für molekulare Subtypisierung, therapeutische Stratifizierung und prognostische Bewertung bei Lungenkrebs dienen könnten.

Einleitung

Lungenkrebs bleibt eine dominierende globale Gesundheitsbelastung und verursachte im Jahr 2022 weltweit fast 2,5 Millionen neue Fälle und etwa 1,8 Millionen Todesfälle. Trotz erheblicher Fortschritte bei Screening, Bildgebung und systemischer Therapie bleibt das Überleben für viele Patienten begrenzt, da Lungenkrebs biologisch heterogen ist und oft im fortgeschrittenen Stadium 2,3,4,5 diagnostiziert wird. Die Präzisionsonkologie ist daher zentral für die moderne Lungenkrebsversorgung geworden, insbesondere bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), wo umsetzbare Treiberänderungen molekulare Untergruppen mit unterschiedlichen natürlichen Geschichten und Behandlungssensitivitäten definieren6. Klinische Praxisrichtlinien empfehlen eine breite molekulare Profilierung bei fortgeschrittenen Erkrankungen, darunter EGFR, ALK, KRAS, ROS1, BRAF, MET exon 14 Skipping, RET, ERBB2 (HER2) und NTRK Fusionen, zusammen mit der Bewertung von Immunbiomarkern wie PD-L1 7,8,9,10. Diese Entwicklungen haben die Ergebnisse für ausgewählte Populationen verändert, aber auch neue klinische Engpässe geschaffen. Gewebe könnte für umfassende Tests unzureichend sein, die Bearbeitungszeit kann therapeutische Entscheidungen verzögern, und der Zugang zu hochwertiger Next-Gen-Sequenzierung variiert je nach Gesundheitssystem 7,9. Selbst wenn molekulare Tests verfügbar sind, bleibt die biomarkergesteuerte Therapie unvollkommen, da der molekulare Status die mikroökologischen Zustände des Tumors, die die Behandlungsreaktion und -resistenz beeinflussen, nicht vollständig erfasst. Die PD-L1-Expression wird weit verbreitet verwendet, weist jedoch als eigenständiger Prädiktor bekannte Einschränkungen auf, und die Tumormutationslast weist eine erhebliche Variabilität und Unsicherheit bei ihrer optimalen Anwendungauf. Diese Realitäten verdeutlichen den praktischen Bedarf an komplementären Biomarkern, die skalierbar, biologisch informativ sind und in der Lage sind, molekulare Subtypisierung und Behandlungsstratifizierung zu bereichern, wenn genomische Informationen unvollständig, verzögert oder mehrdeutig sind.

Die proteolytische Umgestaltung der extrazellulären Matrix und des Tumormikroumfelds ist eine solche biologisch verankerte Dimension, die zunehmend sowohl als Kennzeichen der Malignität als auch als bestimmender therapeutischer Wirkung anerkannt wird. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) regulieren die Invasion, Angiogenese, den Austausch von Immunzellen und die Zytokin-Signalübertragung und verknüpfen so tumorintrinsische Programme mit entzündlichen und stromalen Kontexten des Wirts11. Unter diesen Enzymen hat die Matrix-Metalloproteinase-12 (MMP-12), auch bekannt als Makrophage-Elastase, bei Lungenkrebs Aufmerksamkeit erregt, da sie über ein Spektrum menschlicher Lungentumoren exprimiert wird und offenbar mit aggressiven Phänotypen und schlechteren Ergebnissen assoziiert ist12. Neben seiner Gewebeexpression ist MMP-12 im Kreislauf messbar, was es als minimalinvasiver Biomarker mit potenzieller Nützlichkeit für die serielleÜberwachung attraktiv macht. Jüngste Multi-Krebs-Analysen haben die klinische Relevanz von MMP-12 im Lungenadenokarzinom weiter gestützt und deuten auf prädiktive und prognostische Rollen hin, die eine tiefere Untersuchung in klinisch umsetzbaren Untergruppen14 erfordern. Wichtig ist, dass zirkulierende Biomarker zunehmend zur Ergänzung gewebebasierter Tests in der Onkologie eingesetzt werden, und es wächst ein wachsendes Interesse an blutbasierten Indikatoren, die nicht nur die Tumorbelastung, sondern auch die Immun- und Stromdynamik widerspiegeln, die die Empfindlichkeit gegenüber systemischer Therapie beeinflussen15. Im Lungenkrebs, wo häufig Immuntherapie und gezielte Therapie eingesetzt werden, können Biomarker, die das Tumormikroumfeld widerspiegeln, besonders wertvoll sein, um Behandlungsheterogenität, frühe Resistenz und den Bedarf an Kombinationsansätzen zu verstehen16. Dieser biologische und klinische Kontext motiviert eine gezielte Bewertung von Serum-MMP-12 über ein diagnostisches Signal hinaus, insbesondere als Kandidatmarker, der mit molekularen Subtypen und therapeutischen Verläufen verknüpft ist.

Parallel dazu stellt Cadherin 13 (CDH13), auch bekannt als T-Cadherin oder H-Cadherin, eine mechanistisch eigenständige Achse dar, die für die Tumordifferenzierung, die Adhäsionssignalisierung und die epitheliale Plastizität relevant ist. CDH13 ist ein atypisches Cadherin, das über eine Glycosylphosphatidylinositol-Gruppe an die Membran gebunden ist und weithin als Tumorsuppressor bei mehreren Malignitätenbeschrieben wurde. Im NSCLC wurde die epigenetische Silencing von CDH13 durch Promotorhypermethylierung wiederholt berichtet und mit Tumorprogression sowie unerwünschten klinisch-pathologischen Merkmalenin Verbindung gebracht 18,19. Meta-analytische und integrative Evidenz stützt zudem darauf, dass CDH13-Hypermethylierung in NSCLC häufiger ist als in normalem Lungengewebe und diagnostische Relevanz20,21 haben könnte. Über seinen Wert als Marker für bösartige Transformation hinaus könnte der CDH13-Status plausibel mit der Behandlungssensitivität überschneiden. Experimentelle Arbeiten haben CDH13-Promotormethylierung und veränderte Expression mit Cisplatinresistenz-Phänotypen in Lungenkrebsmodellen in Verbindung gebracht, was die Möglichkeit eröffnet, dass CDH13 biologische Programme widerspiegelt, die mit der Therapie-Wirkungs- und Tumoranpassung unter Behandlungsdruck22 zusammenhängen. Diese Daten positionieren CDH13 zusammen als gewebebasierten Biomarker mit potenziellen Auswirkungen auf die Risikobiologie und therapeutische Stratifizierung. Im Gegensatz zu komplexen Multi-Omics-Assays kann CDH13 durch Immunhistochemie in routinemäßigen pathologischen Arbeitsabläufen bewertet werden, was eine praktische Übersetzung ermöglicht, wenn es additive Informationen über bestehende klinische und molekulare Marker hinaus liefert.

Zusammen stellen MMP-12 und CDH13 komplementäre biologische Kompartimente und Mechanismen dar. MMP-12 ist ein zirkulierender Auswerter, der immun- und stromale Aktivierung sowie proteasegesteuerte Remodellierung erfassen kann, während CDH13 ein Marker auf Gewebeniveau ist, der die tumorsuppressive Adhäsion und die epigenetische Regulation widerspiegelt. Wir vermuten, dass die Integration dieser Achsen die klinische Inferenz in zwei Schlüsselbereichen verbessern kann, die die Präzisionsonkologie bei Lungenkrebs definieren. Erstens kann ein kombiniertes Serum- und Gewebebiomarker-Framework ergänzende Informationen für die molekulare Subtypisierung liefern, entweder durch Assoziation mit handlungsfähigen Treiberänderungen und Immunbiomarker-Zuständen oder durch die Identifizierung biologisch kohärenter Phänotypen, die mit bestimmten Molekularklassen übereinstimmen, wenn genomische Tests begrenztsind 2,6,8,10 . Zweitens kann die integrierte Signatur die personalisierte Therapie informieren, indem sie die Risikostratifizierung verbessert und mit der Behandlungsauswahl und den Ergebnissen über zielgerichtete Therapie- und Immuntherapieparadigmen hinweg korreliert, wobei die Resistenz multifaktoriell ist und einzelne Marker unzureichendsind. In diesem Zusammenhang ist unser Ansatz bewusst pragmatisch. Anstatt molekulare Diagnostik zu ersetzen, will sie diese ergänzen, indem skalierbare, klinisch kompatible Messungen bereitgestellt werden, die schnell erfasst und zusammen mit Genotyp, PD-L1 und Stadium interpretiert werden können. Diese Strategie kann besonders in realen Situationen nützlich sein, in denen Gewebe knapp ist, wiederholte Biopsien unpraktisch sind oder die klinische Frage nicht einfach ist, ob ein Treiber vorhanden ist, sondern wie man die Behandlungssensitivität und das Fortschreitungsrisiko bei einem einzelnen Patienten vorherseht.

Dementsprechend bewerten wir in der vorliegenden Kohortenstudie die klinischen Implikationen von Serum-MMP-12 und Tumor CDH13 über molekulare Subtypen und Behandlungswege von Lungenkrebs hinweg. Konkret untersuchen wir, ob diese Biomarker einzeln und in Kombination mit wichtigen molekularen Klassen und therapeutischen Gruppierungen verbunden sind und ob sie prognostische Informationen liefern, die für eine personalisierte Behandlung relevant sind. Wir ordnen diese Arbeit zudem in ein breiteres Ökosystem alternativer Ansätze ein, darunter zirkulierende Tumor-DNA, Methylierungsprofilierung und multimodale Modellierung, die klinische, bildgebende und molekulare Merkmale integriert24,25. Die Neuheit unserer Studie liegt nicht darin, neue einzelne Biomarker vorzuschlagen, sondern darin, bewusst ein zirkulierendes Proteasesignal mit einer gewebebasierten Adhäsion und einem epigenetischen Marker zu integrieren, um eine klinisch umsetzbare Frage zu beantworten: Wie kann man molekulare Subtypisierung und Therapiepersonalisierung mit Messungen ergänzen, die in der Routinepraxis möglich sind? Durch die Erfassung komplementärer Dimensionen systemischer Tumor-Wirt-Interaktionen und der Tumor-intrinsischen Biologie geht dieser integrative Rahmen über frühere Studien hinaus, die MMP-12 oder CDH13 isoliert untersucht haben. Ein solcher Ansatz könnte eine praktische Brücke zwischen diagnostischer Pathologie und Präzisionstherapien bieten, mit potenziellen Anwendungen bei der Priorisierung molekularer Tests, der Kontextualisierung von Biomarker-Diskordanzen und der Verfeinerung individueller risikobasierter Behandlungsplanung.

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Protokoll

Alle Verfahren entsprachen institutionellen und nationalen Vorschriften und wurden vom Ethikausschuss des Volkskrankenhauses Xingtai (Nr. 2024-124) genehmigt. Die Verpflichtung zur schriftlichen informierten Einwilligung wurde aufgehoben, da routinemäßig gesammelte klinische Daten und Restproben verwendet wurden. Alle Daten wurden vor der Analyse anonymisiert.

Studiendesign, Setting und Gesamtschema
Diese Studie wurde als ein-zentrische Beobachtungskohorte durchgeführt, die darauf abzielte, die klinischen Implikationen von Serum-MMP-12 und Tumor CDH13 einzeln und in Kombination für die molekulare Subtypisierung von Lungenkrebs und personalisierte Therapie zu bewerten. Die Studie wurde im Xingtai People's Hospital durchgeführt. Geeignete Patienten, die zwischen Januar 2021 und Juni 2022 behandelt wurden, wurden identifiziert, und 262 aufeinanderfolgende Patienten, die die vorgegebenen Ein- und Ausschlusskriterien erfüllten, wurden aufgenommen.

Der gesamte Studienablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Schema zeigt den gesamten Prozess von der Patientenidentifikation bis zur Analyse, einschließlich Patientenscreening und -aufnahme, klinisch-pathologischer Charakterisierung und molekularer Profilierung, die aus routinemäßigen klinischen Tests, Entnahme und Verarbeitung von Vorbehandlungsserum, Tumorgewebevorbereitung für CDH13-Immunhistochemie, Quantifizierung von Serum-MMP-12, CDH13-Immunreaktiv-Scoring, Klassifikation der Erstlinientherapie und nachfolgenden Behandlungswege sowie longitudinalem Ergebnis Feststellung, einschließlich Behandlungsansprechwert, progressionsfreiem Überleben und Gesamtüberleben. Der Schaltplan unterscheidet diagnostische und molekulare Subtypisierungsanalysen von Behandlungs- und Ergebnisanalysen und gibt die Zeitpunkte an, zu denen Bioproben entnommen, molekulare Ergebnisse generiert, die Therapie eingeleitet und Nachuntersuchungen durchgeführt wurden.

Teilnehmerscreening, Zulassungskriterien und klinische Datenabstraktion
Potenziell berechtigte Patienten wurden während des vordefinierten Einschreibungszeitraums (Januar 2021 bis Juni 2022) aus dem Krankenhausinformationssystem und dem pathologischen Register identifiziert. Primärer Lungenkrebs wurde mittels Histopathologie bestätigt, ergänzt durch eine multidisziplinäre klinische Überprüfung, falls erforderlich. Aufeinanderfolgende erwachsene Patienten, die alle Zulassungskriterien erfüllten, wurden aufgenommen. Zu den Einschlusskriterien gehörten histologisch bestätigter primärer Lungenkrebs, die Verfügbarkeit einer Serumprobe vor der Behandlung vor Beginn einer Antitumortherapie (und vor der Operation bei Patienten, die sich einer Frontresektion unterziehen), Verfügbarkeit von Tumorgewebe, das für die CDH13-Immunhistochemie ausreichend ist, sowie die Verfügbarkeit von molekularen Subtypinformationen, die im Rahmen der routinemäßigen klinischen Behandlung erzeugt werden. Patienten mit dokumentierter Vorgeschichte eines weiteren bösartigen Tumors vor der Einschreibung, Patienten mit unzureichendem Serumvolumen oder beeinträchtigter Probenintegrität, Patienten ohne wertvolles Tumorgewebe für CDH13-Bewertung sowie Patienten, die vor der Ausgangsblutentnahme systemische Antikrebstherapie erhielten, wurden ausgeschlossen.

Kliniopathologische und Behandlungsdaten wurden aus elektronischen Krankenakten abstrahiert, indem ein standardisiertes Fallberichtsformular mit vordefinierten Variablendefinitionen und Codierungsregeln verwendet wurde. Zu den erfassten Variablen gehörten Demografie (Alter und Geschlecht), Rauchexposition, Leistungszustand der Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), Komorbiditäten, Bildbefunde aus der Basisaufnahme, histologischer Subtyp, Tumor-Knoten-Metastasestadium (TNM) (entsprechend dem während der Studienzeit verwendeten Stadiensystem), Laborparameter und detaillierte Behandlungsinformationen (einschließlich Erstlinienregime, Starttermine, Dosisanpassungen und Behandlungsübergänge). Die Rauchexposition wurde in Packjahren wie folgt quantifiziert: Packungsjahre = (Zigaretten pro Tag ÷ 20) × gerauchte Jahre. Wenn die Rauchgeschichte zwischen den Aufzeichnungen unvollständig oder inkonsistent ist, wurde die Rauchervariable als unbekannt klassifiziert und die Quelle als Diskrepanz im Abstraktionsprotokoll dokumentiert; Fehlverhalten wurde gemäß dem vorgegebenen statistischen Analyseplan behandelt.

Probenentnahme, -verarbeitung und -lagerung
Peripheres venöses Blut wurde zu Beginn vor Beginn einer Antitumortherapie zu Beginn entnommen. Serum wurde durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur getrennt. Der Serumsupernatant wurde in niedrigbindende Kryoviale übertragen, ohne die Zellschicht zu stören. Serum wurde in 200–500 μL Portionen aliquotiert, um die Frost-Tau-Zyklen zu minimieren, und die Aliquots wurden bis zur Chargenanalyse bei −80 °C gelagert. Der Zeitraum von der Blutentnahme bis zum Einfrieren für jede Probe wurde erfasst, und Proben mit einer Entnahme- bis Gefrierzeit von mehr als 2 Stunden wurden ausgeschlossen.

Vordefinierte präanalytische Qualitätskontrollverfahren wurden angewendet, indem Hämolyse und Lipämie bei der Verarbeitung dokumentiert wurden. Sichtbar hämolysierte Proben wurden von der ELISA-Quantifizierung ausgeschlossen. Serum-Aliquoten wurden unmittelbar vor dem Assay auf Eis aufgetaut, durch sanfte Inversion gemischt und bei 2.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um bei Bedarf Partikel zu entfernen. Starke Bewegungen und Vortexbildung wurden vermieden, um Blasenbildung und optische Artefakte während der Absorptionsmessungen zu verhindern.

Aufnahme und Vorbereitung von Tumorgewebe
Tumorgewebe wurde aus routinemäßigen diagnostischen Eingriffen (Biopsie, Bronchoskopie, Kernnadelbiopsie oder chirurgische Resektion) gewonnen. Das Gewebe wurde gemäß der pathologischen Standardpraxis in neutralem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte (3–4 μm) wurden auf geladenen Objektträgern zur Immunhistochemie vorbereitet. Ungefärbte Objektträger wurden in einer trockenen Umgebung bei Raumtemperatur gelagert und innerhalb eines vorgegebenen Abstands gefärbt, um den Antigenabbau zu minimieren. Ein Kettenprotokoll wurde geführt, das Probenkennungen mit deidentifizierten Studiencodes verknüpfte. Der Pathologe, der die CDH13-Bewertung durchführte, war auf Serum-MMP-12-Werte, molekularen Subtyp, Behandlung und Ergebnisse verblindet.

Serum-MMP-12-Quantifizierung durch enzymgekoppelten Immunsorbent-Assay (ELISA)
Peripheres venöses Blut wurde vor jeglicher Antitumortherapie entnommen, idealerweise innerhalb von 7 Tagen vor Biopsie oder Behandlungsbeginn. Das Serum-MMP-12 wurde mit einem kommerziellen menschlichen MMP-12 ELISA-Kit gemessen. Jedes Serum-Aliquot wurde einmal auf Eis aufgetaut, sanft gemischt und entsprechend der Anleitung des Kits doppelt geprüft. Auf jeder Platte wurde eine Standardkurve durch serielle Verdünnungen des bereitgestellten rekombinanten Standards erzeugt, und die Absorption wurde bei 450 nm mit einer Referenzkorrektur mittels eines Mikroplattenlesers abgelesen. Die Konzentrationen wurden berechnet, indem eine vierparametrige logistische Regressions-Standardkurve angepasst wurde. Um die analytische Robustheit zu gewährleisten, wurden auf jeder Platte interne Qualitätskontrollseren (QC) eingebaut und auf intraassay- und interassay-Präzision überwacht (Ziel-Koeffizienten der Variation, die mit der Assay-Validierung übereinstimmen). Wenn die Ergebnisse unter die untere Quantifizierungsgrenze fielen, wurde die Hälfte dieser Grenze für die statistische Analyse zugewiesen; Wenn die Ergebnisse die Obergrenze überschritten, wurde die Messung nach angemessener Verdünnung wiederholt. Um Batch-Effekte zu minimieren, wurden Proben zufällig über die Platten verteilt, und auf jeder Platte wurde ein identischer Satz QC-Seren angebracht, um die Variabilität zwischen den Platten zu verfolgen. Das Laborpersonal, das ELISA durchführte, war für klinische Gruppierungen und Ergebnisse blind.

Tumor-CDH13-Immunhistochemie und immunreaktive Scoring
Die CDH13-Immunhistochemie wurde an formalinfixierten, paraffin-eingebetteten Tumorschnitten mit einem validierten Anti-CDH13-Primärantikörper durchgeführt. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit einem polymerbasierten Detektionssystem nachgewiesen, und die Färbung wurde mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) visualisiert. Ein identischer Färbungsprozess wurde auf alle Studienproben angewendet; Die Objektträger wurden in Chargen verarbeitet, und entsprechende Kontrollen waren enthalten.

Paraffinblöcke wurden bei 3–4 μm abschnittiert, in Xylol deparaffinisiert und durch graduales Ethanol in destilliertes Wasser rehydriert. Die hitzeinduzierte Epitopenrückgewinnung erfolgte im Citratpuffer (10 mM, pH 6,0) mit einem Mikrowellenofen bei 95–100 °C für 15 Minuten, gefolgt von 20 Minuten Kühlung auf Raumtemperatur. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur für 10 Minuten abgeschreckt, und die Proteinblockierung wurde mit normaler Serumblocklösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Schnitte wurden über Nacht mit dem primären Anti-CDH13-Antikörper bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen wurde das polymerbasierte sekundäre Detektionsreagenz bei Raumtemperatur 20–30 Minuten lang angewendet, gefolgt von einer Visualisierung mit 3,3′-DAB-Chromogen für 3–5 Minuten unter mikroskopischer Überwachung. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin gekontert, durch gradiertes Ethanol dehydriert, mit Xylol behandelt und mit permanentem Montagemedium montiert.

Interne Qualitätskontrollen wurden bei jedem Verfärbungslauf einbezogen. Ein bekannter CDH13-positiver Gewebeschnitt wurde parallel als positive Kontrolle durchgeführt, und der primäre Antikörper wurde in der negativen Kontrolle weggelassen. Ein Durchlauf wurde nur akzeptiert, wenn die positive Kontrolle das erwartete Färbungsmuster mit angemessener Intensität zeigte, und die negative Kontrolle zeigte keine spezifische Färbung. Die Färbung wurde bei Durchläufen mit übermäßigem Hintergrund, fehlgeschlagener Steuerungsleistung oder mit einem unspezifischen Signal, das die Interpretation beeinträchtigt, wiederholt.

Die CDH13-Expression wurde mithilfe eines immunreaktiven Scores (IRS) quantifiziert, der aus der Färbungsintensität und dem Anteil positiver Tumorzellen abgeleitet wurde. Zwei ausgebildete Pathologen bewerteten alle Objektträger unabhängig voneinander, während sie auf Serum-Biomarker-Messungen, molekularen Subtyp, Behandlung und Ergebnisse verblindet waren. Unterschiedliche Bewertungen wurden durch gemeinsame Überprüfung an einem mehrköpfigen Mikroskop festgestellt, und das beurteilte IRS wurde erfasst. Die Färbungsintensität wurde als 0 (keine Färbung), 1 (schwach), 2 (moderat) oder 3 (stark) zugewiesen. Der Anteil der positiven Tumorzellen wurde als 0 (0 %), 1 (1–10 %), 2 (11–50 %), 3 (51–80 %) oder 4 (81–100 %) zugewiesen. Der IRS wurde wie folgt berechnet: IRS = Intensitätsscore × Anteilswert. Die IRS-Werte reichten von 0 bis 12. Die niedrige CDH13-Expression wurde als IRS ≤ 3 definiert, basierend auf einem häufig verwendeten Schwellenwert für immunreaktive Bewertung. IRS wurde sowohl als kontinuierliche Variable als auch als dichotomisierte Kategorie für nachgelagerte Analysen beibehalten, einschließlich Untergruppenvergleichen und kombinierter Biomarkermodellierung. Die Interobserver-Übereinstimmung wurde in einer vordefinierten Zufallsstichprobe bewertet, die 30 % der Fälle unter Verwendung einer gewichteten Kappa-Statistik ausmachte, und das Stichproben-Verfahren, die Einigungsschätzung und die Entscheidungsentscheidungen wurden in einem Audit-Trail dokumentiert.

Molekulare Subtypisierung und Behandlungsklassifikation
Die Informationen zum molekularen Subtyp wurden aus routinemäßigen klinischen Tests am diagnostischen Tumorgewebe gewonnen. Die Ergebnisse wurden durch klinisch validierte Assays in der Standardversorgung erstellt, darunter gezielte PCR-basierte Tests, gezielte Next-Generation-Sequenzierungspanels, Immunhistochemie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Für jeden Patienten wurden der Prüftyp, die Probenquelle, die Nachweis der Probenangemessenheit und das Berichtsdatum erfasst. Die Patienten wurden nach dem Status einer verwertbaren Treiberänderung klassifiziert, darunter EGFR-aktivierende Mutationen, ALK-Umstellungen, ROS1-Umstellungen, KRAS-Mutationen, BRAF-Mutationen, MET-Exon-14-Übersprung-Veränderungen, RET-Umstellungen, ERBB2-Veränderungen und NTRK-Fusionen. Der PD-L1-Tumorproportionsscore wurde an der durchgeführten Stelle aufgezeichnet, und die PD-L1-Expression wurde entsprechend den Schichten kategorisiert, die während des Studienzeitraums in der routinemäßigen Praxis verwendet wurden. Alle molekularen Subtypisierungskategorien wurden vor der Analyse vorgegeben. Wenn mehr als eine handlungsfähige Veränderung gemeldet wurde, wurden die Patienten nach einer vordefinierten hierarchischen Klassifikationsregel zugeordnet, die Veränderungen mit etablierten, genotypgesteuerten therapeutischen Implikationen in folgender Reihenfolge priorisierte: EGFR-Mutationen, ALK-Umstellungen, ROS1-Umstellungen, BRAF-Mutationen, MET-Exon-14-Überspring-Veränderungen, RET-Umstellungen, ERBB2-Veränderungen, NTRK-Fusionen und KRAS-Mutationen.

Behandlungsinformationen wurden aus medizinischen Unterlagen entnommen, einschließlich Erstlinienregime, Start- und Abschlussdaten sowie nachfolgenden Therapielinien. Die Erstbehandlung wurde in gegenseitig ausschließende Behandlungskategorien eingeteilt, die a priori definiert waren: genotypgesteuerte zielgerichtete Therapie, immuncheckpoint-inhibitorbasierte Therapie, Chemotherapie-basierte Therapie und multimodale Behandlung, die Chirurgie mit perioperativer systemischer Behandlung integrierte, je zutreffend. Das Indexdatum wurde als Startdatum der systemischen Erstlinientherapie definiert; Bei Patienten, die mit Frontresektion behandelt wurden, war das Indexdatum das Datum der Operation, und die anschließende systemische Therapie wurde laut klinischer Akte als adjuvans eingestuft. Für Analysen zur personalisierten Therapie wurden die Patienten gemeinsam nach molekularem Subtyp und Behandlungskategorie geschichtet, und Serum-MMP-12-Konzentrationen sowie die CDH13-Expression des Tumors wurden zwischen Driver-positiven und Driver-negativen Erkrankungen sowie zwischen gezielten Therapiegruppen und Immuncheckpoint-Inhibitor-Therapiegruppen verglichen.

Ergebnisdefinitionen und Nachverfolgung
Das Indexdatum wurde als Beginn der Erstlinien-Antitumortherapie definiert. Für Patienten, die mit einer voranschreitenden chirurgischen Resektion behandelt wurden, wurde das Indexdatum als Operationsdatum definiert; Die anschließende systemische Therapie wurde laut Krankenakte als adjuvans oder palliativ eingestuft. Jeder Patient wurde vom Indexdatum bis zum Tod, dem Datum des letzten bestätigten Kontakts oder dem administrativen Zensurdatum verfolgt, je nachdem, was zuerst eintritt. Die Nachbeobachtungsdauer wurde in Monaten erfasst, und für jeden Endpunkt wurden der Ereignisindikator sowie das entsprechende Ereignis- oder Zensurdatum beibehalten. Die Ergebnisse wurden durch eine strukturierte Abstraktion der elektronischen Patientenakte ermittelt, einschließlich Radiologieberichten, Dokumentationen der Onkologieklinik, stationären Unterlagen und bei Bedarf telefonischer Nachsorge. Ein vorgegebenes Fallberichtsformular wurde verwendet, und einheitliche Quellhierarchieregeln wurden angewendet. Wenn Daten oder Klassifikationen zwischen den Unterlagen variierten, wurden Unstimmigkeiten durch Priorisierung zeitgleicher radiologischer Berichte und Behandlungsentscheidungsnotizen behoben; Der endgültig bewertete Wert und seine unterstützenden Quellen wurden dokumentiert. Ein Folgeprotokoll mit Bilddaten, Behandlungsübergängen, Krankenhausaufenthalten und Kontaktversuchen wurde geführt, um Nachsorgeverluste zu minimieren und Rückverfolgbarkeit sicherzustellen.

Die Tumorantwort wurde bei Patienten mit messbarer Erkrankung gemäß RECIST Version 1.1 bewertet. Die beste Gesamtansprache wurde als vollständige Antwort, Teilantwort, stabile Erkrankung oder fortschreitende Erkrankung klassifiziert. Die objektive Ansprechrate wurde als vollständige oder teilweise Antwort definiert, und die Krankheitskontrollrate als vollständige Antwort, Teilantwort oder stabile Erkrankung. Reaktions- und Verlaufsdaten wurden auf Grundlage der frühesten dokumentierten Beweise zugewiesen.

Progressionsfreies Überleben (PFS) wurde definiert als der Zeitraum vom Indexdatum bis zum ersten Auftreten eines Krankheitsverlaufs oder Todes aus irgendeiner Ursache, je nachdem, was zuerst eintritt. Das Fortschreiten wurde hauptsächlich anhand radiologischer Berichte bestimmt, die den Verlauf gemäß RECIST 1.1 dokumentieren. Wenn Radiologie zum Zeitpunkt der klinischen Verschlechterung nicht verfügbar ist, wurde das von Ärzten dokumentierte Fortschreitung akzeptiert, wenn es explizit mit einer verschlechternden Tumorlast in Verbindung steht und eine Änderung der Krebsbehandlung bewirkt. Patienten ohne Ereignis am Tag der letzten objektiven Beurteilung wurden zensiert, was das Ausbleiben eines Fortschreitens bestätigte. Wenn eine neue systemische Therapielinie ohne explizite Dokumentation des Fortschreitens begonnen wurde, wurde die Bildgebung überprüft und zeitgleich klinische Dokumentation vorgelegt. Wenn der Fortschreiten nicht bestätigt werden konnte, wurden die Patienten bei der letzten röntgentechnischen Begutachtung vor einer Behandlungsänderung zensiert und die angewandte Entscheidungsregel festgehalten.

Das Gesamtüberleben (OS) wurde als das Intervall vom Indexdatum bis zum Tod durch jede Ursache definiert. Der Vitalstatus wurde anhand von Krankenhausunterlagen und ambulanten Nachsorgenotizen bestimmt, ergänzt durch strukturierte telefonische Bestätigungen bei Bedarf. Das Todesdatum wurde in der Krankenakte dokumentiert oder, falls nicht verfügbar, als das von der Familie während der Nachsorge bestätigte Datum, wobei unterstützende Unterlagen im Nachsorgeprotokoll festgehalten wurden. Patienten, die zum Zeitpunkt des letzten bestätigten Kontakts noch lebten, wurden zensiert.

Ein standardisierter Nachsorge-Workflow, der mit routinemäßigen Versorgungswegen abgestimmt ist, wurde implementiert. Während der aktiven systemischen Therapie wurden klinische Bewertungen in jedem Behandlungszyklus dokumentiert, und radiographische Nachuntersuchungen in regelmäßigen Abständen, die durch das klinische Protokoll bestimmt wurden, wobei Bildgebungsmodalität und Datum für jede Beurteilung erfasst wurden. Nach Abschluss der Erstlinientherapie oder während der postoperativen Überwachung wurden Nachsorgetermine und bildgebende Untersuchungen gemäß dem institutionellen Zeitplan erfasst. Wenn eine persönliche Nachsorge nicht durchgeführt werden konnte, wurde eine strukturierte telefonische Nachsorge durchgeführt, um die Fortsetzung der Behandlung zu bestätigen, Krankenhausaufenthalte zu dokumentieren, den Krankheitsstatus wie durch externe Bildgebung dokumentiert zu bestätigen, sofern zutreffend, und den Überlebensstatus zu bestätigen. Alle verpassten Besuche, unerreichbare Versuche und Gründe für das Abbrechen der Nachsorge wurden dokumentiert. Bevor ein Patient als durch Nachsorge verloren klassifiziert wurde, wurde Kontakt mindestens zweimal an verschiedenen Tagen versucht, und jeder Versuch wurde erfasst.

Die prozedurale Trennung zwischen Biomarkerbewertung und Ergebnisfeststellung wurde beibehalten. Mitarbeiter, die Serum-MMP-12-Messungen und CDH13-Scoring durchführten, waren auf klinische Ergebnisse blind. Die Outcome-Abstraktion wurde wann immer möglich ohne Zugang zu Biomarker-Ergebnissen durchgeführt. Ein zweistufiges Entscheidungsverfahren wurde für Progressions- und Antwortendpunkte angewandt. Ein geschulter Abstractor bestimmte die Ereignisklassifikation und Termine nach den vorgegebenen Regeln, danach überprüfte ein leitender Kliniker die Zuweisungen eigenständig. Unstimmigkeiten wurden durch eine gemeinsame Prüfung des ursprünglichen Radiologieberichts, der Onkologie-Notizen und des Behandlungszeitplans behoben, und eine Prüfungsspur aller Entscheidungsprozesse wurde aufrechterhalten.

Konsistenzprüfungen zur Identifizierung unwahrscheinlicher Sequenzen, einschließlich Ereignissen vor dem Indexdatum, Behandlungsübergängen ohne entsprechende Bewertungen oder Sterbedaten ohne unterstützende Dokumente, wurden durchgeführt. Markierte Fälle wurden durch Rückkehr zu Quelldokumenten und Aktualisierung des Datensatzes mit einer datierten Korrekturnotiz abgestimmt, die den Grund für die Änderung und die unterstützenden Beweise angibt.

Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit SPSS (Version 26.0) und R (Version 4.3.0) durchgeführt. Kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilbereich) dargestellt, je nachdem, und kategoriale Variablen als Zählungen und Prozentsätze dargestellt. Gruppenvergleiche verwendeten parametrische oder nichtparametrische Tests, je nach Anwendung, mit Chi-Quadrat- oder Fisher-Exakt-Tests für kategorische Daten. Alle Tests waren zweiseitig, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant galt.

Kovariaten wurden a priori basierend auf klinischer Relevanz und vorherigen Evidenzen ausgewählt, und derselbe Kovariatensatz wurde auf verwandte Modelle angewandt, um die Vergleichbarkeit zu unterstützen. Zentrale Anpassungsvariablen umfassten Alter, Geschlecht, Rauchexposition, TNM-Stadium, ECOG-Leistungsstatus und histologischen Subtyp, mit zusätzlicher Anpassung für die Behandlungsgruppe, wenn das Analyseziel innerhalb der behandelten Populationen der molekulare Subtyp ist. Multikollinearität wurde anhand von Varianzinflationsfaktoren bewertet, und problematische Kollinearität wurde mit vorgegebenen Variablenreduktionsregeln behandelt. Angepasste Odds-Ratios mit 95%-Konfidenzintervallen und zweiseitigen P-Werten wurden berichtet. Die Anzahl der Kovariaten, die in den multivariablen logistischen und Cox-Regressionsmodellen enthalten sind, wurde vorab festgelegt und relativ zur Anzahl der Ergebnisereignisse begrenzt, um das Risiko einer Überanpassung zu minimieren. Das Verhältnis von Ereignissen pro Variablen blieb für alle Modelle akzeptabel (≥10). Für multikategorische molekulare Subtyp-Ergebnisse wurden entweder multinomielle logistische Regressionsmodelle angepasst oder eine Reihe binärer logistischer Vergleiche mit einer vorgegebenen Referenzkategorie durchgeführt, wobei die Modellierungsstrategie klar formuliert wurde.

Das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben wurden mit Kaplan–Meier-Schätzungen analysiert, und die Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rank-Test verglichen. Die Zusammenhänge zwischen Biomarkern und Endpunkten wurden mittels Cox-Proportional-Hazard-Regression quantifiziert, wobei Hazard Ratios mit 95%-Konfidenzintervallen berichtet wurden. Multivariable Cox-Modelle wurden unter Verwendung vordefinierter klinisch-pathologischer Kovariaten, einschließlich molekularer Subtyp und Behandlungskategorie, erstellt, um die Auswirkungen auf eine personalisierte Therapie zu bewerten. Die Annahme proportionaler Gefahren wurde mit Schoenfeld-Residualdiagnostik und log-minus-log-Überlebensdiagrammen bestätigt. Wenn die Annahme der proportionalen Gefahren für eine Kovariate verletzt wurde, wurde das Problem mit einem vorgegebenen Ansatz wie Stratifizierung dieser Kovariate oder der Einbeziehung eines zeitabhängigen Interaktionsterms gelöst, und die endgültige Modellspezifikation wurde veröffentlicht.

Fehlende Daten wurden mit einer vorgegebenen Strategie behandelt. Wenn die Fehlfunktion minimal war, wurden vollständige Fallanalysen durchgeführt; ansonsten wurde mehrfache Imputation mit Kettengleichungen verwendet, wobei alle Variablen in den analytischen Modellen einbezogen wurden. Zehn imputierte Datensätze wurden generiert und gepoolte Schätzungen nach Rubins Regeln berechnet. Bei Analysen mit mehreren Untertypvergleichen oder mehreren Endpunkten wurde die Falschentdeckungsrate mit einem vorgegebenen Verfahren gesteuert, oder die Analysen wurden klar als explorativ bezeichnet, um Transparenz hinsichtlich der Multiplizität zu gewährleisten.

Der Analysedatensatz wurde vor der Modellanpassung gesperrt, und es wurde ein umfassendes Datenwörterbuch geführt, das jede Variable, jede Einheit, jedes Codierungsschema und den zulässigen Bereich definierte. Duplikate Qualitätskontrollproben über Prüfplatten wurden eingeschlossen, um die Variabilität zwischen den Platten zu quantifizieren und die Drift zu überwachen. Für die immunhistochemische Bewertung wurden die Bewertungsrubrik, die Blindierungsverfahren und die Bewertung der Interobserver-Übereinstimmung dokumentiert, und für unterschiedliche Fälle wurden Adjudikationsprotokolle geführt. Programmierte Bereichsprüfungen und logische Konsistenzprüfungen über wichtige Variablen hinweg, einschließlich Indexdatum, Stichprobenentnahmedatum, Behandlungsbeginn und Ergebnisdaten, wurden implementiert. Alle statistischen Skripte und versionskontrollierten Ausgabeprotokolle wurden erhalten, um eine vollständige Replikation des analytischen Workflows zu ermöglichen.

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Ergebnisse

Kohortenassemblage und Molekular-Subtyp-Verteilung
Der gesamte Studienablauf ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Insgesamt wurden 262 aufeinanderfolgende Patienten mit Lungenkrebs eingeschlossen und in vier klinisch relevante molekulare Subtypen geschichtet: EGFR (n = 92), ALK (n = 48), KRAS (n = 54) und Wildtyp-Patienten (n = 68). Die klinisch-pathologischen Ausgangsmerkmale unterschieden sich zwischen den Subtypen (Tabelle 1). Patienten mit EGFR- und AL...

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Diskussion

Diese Studie bewertet die komplementären Rollen von Serum-MMP-12 und Tumor CDH13 als integrierter Biomarkeransatz zur Unterstützung der klinischen Interpretation molekularer Subtypen und der Therapiestratifizierung bei Lungenkrebs. Die Kernhypothese ergibt sich aus den komplementären biologischen Rollen dieser beiden Biomarker: MMP-12, eine zirkulierende Protease, die immunstromale Remodellierung und Tumoraggressivität widerspiegelt, und CDH13, ein gewebebasierter Tumorsuppressor, der mi...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken aufrichtig die Beiträge des medizinischen und pflegerischen Personals des Xingtai People's Hospital für ihre Unterstützung bei der Patientenrekrutierung, der Sammlung klinischer Daten und der Bioprobenverarbeitung. Diese Studie wurde vom Xingtai Key Research and Development Program Project (Nr. 2024ZC116) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antikörper, Anti-CDH13 (T-Cadherin)Abcam, Cambridge, Großbritannienab15126Primärer Antikörper für die Immunhistochemie; validiert für FFPE-Gewebe
Zentrifuge (Hochgeschwindigkeitskühlung)Eppendorf, Hamburg, Deutschland5424 RVerwendung für Serumtrennung und Probenklärung
DAB-Substrat-KitZSGB-Bio, Peking, ChinaZLI-9017Für den chromogenen Nachweis in der Immunhistochemie
ELISA-MikroplattenleserBioTek Instrumente, Winooski, USAELx800Verwendet für Absorptionsmessungen bei 450 nm mit Referenzkorrektur
Formalin (10 % neutral gepuffert)Sinopharm Chemical Reagent Co., Shanghai, China10009218Zur Fixierung von Biopsien und chirurgischen Gewebeproben
Hämatoxylin- und Eosin-FärbungssetSolarbio, Peking, ChinaG1120Für Gegenfärbung und Qualitätskontrolle von IHC-Objektträgern
Menschliches MMP-12 ELISA-KitAbcam, Cambridge, Großbritannienab246533Quantitative Messung der Serummatrix-Metalloproteinase-12
Mikroskop (Hellfeld)Nikon, Tokio, JapanEclipse E200Verwendet zur Bewertung der CDH13-Immunfärbung und Scoring
MikrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, DeutschlandRM2235Für das Schneiden von paraffineingebettetem Gewebe bei 3– 4 & Mikro; m-Dicke
MontagemediumSolarbio, Peking, ChinaS2100Für die dauerhafte Montage des Verschlusses nach der IHC-Beizung
Paraffin-EinbettungsstationLeica Biosystems, Wetzlar, DeutschlandEG1150Zur FFPE-Gewebeblockvorbereitung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA10010023Verwendet zum Waschen während der IHC-Verfärbung
Polymer-DetektionssystemMXB Biotechnologies, Fuzhou, ChinaDAB-0031Sekundäres Detektionskit für IHC
R Statistische SoftwareR-Stiftung für statistische Berechnung, Wien, ÖsterreichVersion 4.3.0Verwendung für statistische Analysen und Modellierung
Serum-SeparatorröhrenBD Vacutainer, Franklin Lakes, USA367988Zur Entnahme peripheren venösen Blutes
SPSS-StatistiksoftwareIBM Corp., Armonk, USAVersion 26.0Verwendet für die statistische Analyse kontinuierlicher und kategorischer Daten
SpeicherkryovialeCorning Inc., Corning, USA430488Niedrigbindende Kryoviale zum Aliquotieren von Serumproben
Wasserbad (zur Antigenentnahme)Grant Instruments, Cambridge, GroßbritannienJBN26Hält während der Antigenentnahme eine konstante Temperatur

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