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Methodenartikel

Multi-Locus-Sequenzierung zur Zerrungstypisierung von Toxoplasma gondii

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DOI:

10.3791/70645

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26. Mai 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung und Genotypisierung von Toxoplasma-Gondii-Stämmen mittels tragbarer Nanoporensequenzierung ausgewählter genetischer Marker, wodurch skalierbare, gezielte Stammerkennung in laborgetreuen Isolaten ermöglicht wird, mit potenzieller zukünftiger Anwendung in Überwachungsumgebungen.

Zusammenfassung

Toxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter apikomplexaner Parasit, der durch eine erhebliche genetische Vielfalt gekennzeichnet ist und präzise molekulare Ansätze zur Stammerkennung erfordert. Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren Workflow für gezielte Multi-Locus-Genotypisierung kultivierter T. gondii-Isolate zu etablieren. Das Verfahren umfasst die in-vitro-Vermehrung repräsentativer Typ-I- (RH) und Typ-II-(ME49)-Stämme, die Extraktion genomischer DNA, die locusspezifische Amplifikation der SAG2 - und SAG3-Gene sowie sequenzierungsbasierte Analysen zur Erkennung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und Insertion/Deletion (INDEL)-Ereignissen. Sequenzierungsdaten werden verarbeitet, um konsensbasierte Konsenssequenzen mit hoher Zuverlässigkeit zu erzeugen und eine vergleichende Ausrichtung zur Identifizierung von dehnungsspezifischen Polymorphismen durchzuführen. Die Anwendung dieses Workflows auf archetypische Stämme zeigte eine hohe Kartierungseffizienz, eine konstante Lesetiefe über Zielloci und eine genaue Wiederherstellung erwarteter Amplicongrößen, was eine zuverlässige Erkennung der genetischen Variation auf Locusebene bestätigte. Obwohl eine umfassende Genotypzuweisung zusätzliche standardisierte Marker erfordert, bietet dieses Protokoll einen skalierbaren und reproduzierbaren Rahmen für gezielte genetische Charakterisierung von laborgetreuen T. gondii-Isolaten und unterstützt eine konsistente Multi-Locus-Sequenzanalyse.

Einleitung

Toxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter apikomplexaner Parasit und eine bedeutende zoonotische Bedrohung für Nahrung und Wasser, der in der Lage ist, nahezu alle warmblütigen Tiere zu infizieren, wobei Feliden als maßgeblicheWirte dienen. Infektionen bei Menschen und Tieren treten häufig durch die Aufnahme von Gewebezysten oder sporulierten Oocysten auf, und die Fähigkeit des Parasiten, zwischen Tachyzoit- und Bradyzoitstadien zu wechseln, ermöglicht eine langfristige Persistenz in neuronalen und muskulären Geweben, was sowohl zur fleischübertragenen als auch zur Umweltübertragung beiträgt 2,3.

Obwohl drei klonale Linien (Typen I, II und III) in Europa und Nordamerika dominieren, wurde weltweit eine umfangreiche genetische Vielfalt, einschließlich atypischer und rekombinanter Stämme, dokumentiert, insbesondere in Regionen mit reichen Wildtierreservoirs4. Eine genaue Stamm-Diskriminierung ist daher unerlässlich, um Übertragungsdynamiken zu klären, Ausbrüche zu untersuchen und regionale Epidemiologie zu verstehen. Traditionelle Genotypisierungsansätze wie PCR-RFLP, Sanger-basierte Multi-Locus-Sequenztypisierung (MLST) und Mikrosatellitenanalyse haben wesentlich zu unserem Verständnis der Populationsstruktur von T. gondii beigetragen, sind jedoch in Auflösung, Durchsatz und Fähigkeit zur Erkennung intragenotypischer Variationen begrenzt. Diese Ansätze erfordern oft mehrere separate Reaktionen und können Einfügungen, Deletionen oder komplexe Haplotypen innerhalb polymorpher Loci1 nicht nachweisen. Die Short-Read-Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat die Erkennung seltener Varianten verbessert, bleibt jedoch bei der Identifizierung komplexer struktureller Veränderungeneingeschränkt 4.

Langlese-Sequenzierungsplattformen, insbesondere Oxford Nanopore Technologies, bieten nun die Möglichkeit, kontinuierliche, hochpräzise Lesungen zu erzeugen, die zur Auflösung von strukturellen Varianten und hochpolymorphen Loci5 geeignet sind. Ihre Portabilität, Echtzeit-Analyse und Kompatibilität mit ampliconbasierten Arbeitsabläufen machen sie zu vielversprechenden Werkzeugen für Feldanwendungen und Ausbruchsuntersuchungen6. Trotz dieser Vorteile bleiben standardisierte Multi-Locus-Longread-Workflows für routinemäßige T.-gondii-Genotypisierung begrenzt.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir einen skalierbaren Long-Read Amplicon-Sequenzierungs-Workflow eingerichtet, der zwei polymorphe Loci anspricht (Abbildung 1). In Kombination mit einer Konsenspolierung und einer Variantenaufruf-Pipeline ermöglicht dieser Ansatz eine genaue Erkennung von SNPs und INDELs und unterstützt die Diskriminierung auf Belastungsniveau. Das Protokoll eignet sich für Labore, die für PCR-Amplifikation und Long-Read-Sequenzierung ausgestattet sind, und wurde mit kultivierten Isolaten validiert. Während eine Anpassung an primäre klinische oder Umweltproben möglich sein kann, erfordern solche Anwendungen zusätzliche Optimierung und Validierung. Insgesamt bietet dieser Workflow einen strukturierten Rahmen für gezielte molekulare Charakterisierung und kann epidemiologische Untersuchungen unterstützen.

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Protokoll

Diese Studie verwendete etablierte Laborparasitenstämme und kommerziell gewonnene humane Fibroblastenzelllinien. Keine menschlichen oder tierischen Probanden waren direkt beteiligt.

HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, werden Puffer und Reagenzien in diesem Protokoll in den in der Materialtabelle aufgeführten kommerziellen Bausätzen bereitgestellt.

1. Biomarker-Auswahl

  1. Laden Sie genomische Sequenzen von SAG2 und SAG3 im FASTA-Format aus der ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app) Genomdatenbank herunter.
  2. Führen Sie paarweise Sequenzausrichtungen mit EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water) durch.
  3. Wählen Sie Ampliconregionen ≤1.600 Basenpaare (bp) aus, um die Sequenzierungszeit zu minimieren und eine effiziente PCR-Amplifikation sicherzustellen.
  4. Stellen Sie sicher, dass jede Region informative SNPs oder INDEL-Polymorphismen für die Dehnungsdifferenzierung enthält.

2. Kultur und Ernte von Toxoplasma gondii tachyzoiten

  1. Erhaltung der Wirtszellkulturen
    1. Beziehen Sie menschliche Vorhautfibroblasten (HFFs) aus einer zertifizierten kommerziellen Quelle und kultivieren Sie sie in einem vollständigen Wachstumsmedium, das aus Dulbeccos Modified Eagle Medium besteht, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
    2. Inkubieren Sie Kulturen bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.
  2. Pflege und Ausweitung der Parasitenlinien.
    1. Infizieren Sie Fibroblast-Monoschichten bei 80–90 % Konfluenz mit Tachyzoiten bei einer Infektionsmultiplikation von 1–3 Parasiten pro Wirtszelle. Für eine T25-Flasche mit etwa 1 × 106 Fibroblasten fügen Sie 1–3 × 106 Tachyzoite hinzu.
    2. Untersuchen Sie Kulturen täglich mit einem Invertiertlichtmikroskop mit 20× oder 40× Vergrößerung. Identifizieren Sie die Zelllyse des Wirts durch Beobachtung einer weitreichenden Monoschichtstörung.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Fibroblastkulturen über Passage 20 hinaus, um kulturbezogene Artefakte zu vermeiden.
    3. Ernte von Tachyzoiten.
      1. Sammeln Sie Kulturen, wenn ≥90 % Zelllyse des Wirts sichtbar ist.
      2. Zentrifugiere mit 1.300 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
      3. Die Kugel wird durch sanftes Pipettern in 10 ml steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung wieder suspendiert und erneut bei 1.300 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Wiederhole das noch einmal.

3. Extraktion genomischer DNA und Amplicon-Generierung

  1. Genomische DNA mit einem auf Siliziumdioxid basierenden genomischen DNA-Reinigungskitextrahieren 7. ELUTE DNA in 50 μL Elutionspuffer.
  2. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer.
  3. Speichern Sie DNA bei 4 °C für Kurzzeit oder −20 °C für die Langzeitspeicherung.
  4. Bereiten Sie PCR-Reaktionen mit einer hochpräzisen DNA-Polymerase-Mastermischung, locusspezifischen Primern (ergänzende Tabelle 1) und nukleasefreiem Wasser vor.
  5. Durchführung einer PCR-Verstärkung mit einem kalibrierten Thermalzykler unter folgenden Zyklusbedingungen: (a) Anfangsdenaturierung bei 98 °C für 30 Sekunden, (b) 35 Zyklen mit 98 °C für 10 Sekunden; locusspezifische Glühung: 60 °C für SAG2, 68 °C für SAG3, 30 s; 72 °C für 20 Sekunden, (c) Endverlängerung: 72 °C für 2 Minuten.
  6. Verifizieren Sie PCR-Produkte durch Elektrophorese an einem 1,5%igen Agarosegel.
  7. Reinigen Sie PCR-Produkte mit einem säulenbasierten PCR- und Gelextraktionsreinigungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers8. Elute DNA in 15–20 μL Elutionspuffer.
    HINWEIS: Die PCR-Effizienz und -Ausbeute können durch geringe DNA-Schablatequalität, -konzentration oder suboptimale Reaktionsbedingungen reduziert werden. Wenn die Amplicon-Ausbeute niedrig ist, überprüfen Sie die Integrität der DNA-Vorlage mit Agarosegel-Elektrophorese sowie Konzentration und Reinheit mit einem Spektrophotometer. Auch die Temperaturen und Konzentrationen von PCR-Glühelementen sollten für die verwendeten Primerpaare optimiert werden, und die PCR-Zykluszahl sollte bei Bedarf erhöht werden.

4. Bibliotheksvorbereitung für Langlesesequenzen

  1. Endreparatur und DA-Tailing
    1. Alle Reagenzien auftauen und gründlich durch Vortex mischen. Verdünnen Sie die DNA-Kontrollprobe mit 10,5 μL Elutionspuffer nur bei der ersten Anwendung und lassen Sie sie auf Eis.
      HINWEIS: Magnetperlen immer gründlich vortexen, bevor man sie benutzt.
      VORSICHT: Nicht vortexieren Sie die End-Prep-Enzymmischung; Rühren Sie vorsichtig durch Pipetteren.
    2. Pipettieren Sie 200 fmol (~130 ng für ein 1 kb Fragment) jeder DNA-Probe in 0,2 mL PCR-Röhren und passen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 11,5 μl an.
    3. Fügen Sie pro Tube 1 μL verdünnte DNA-Kontrollprobe hinzu und mischen Sie durch Pipettern 10–20 Mal.
    4. Bereiten Sie pro Probe eine Endprep-Mastermischung vor, die 1,75 μL Reaktionspuffer und 0,75 μL Enzymmischung (einschließlich 5 % Überschuss) enthält.
    5. Fügen Sie jedem Sample 2,5 μL Mastermix hinzu, mischen Sie sanft und drehen Sie kurz herunter.
    6. Inkubieren Sie in einem Thermozyklus bei 20 °C für 5 Minuten, gefolgt von 65 °C für 5 Minuten.
  2. Reinigung der am Ende präparierten DNA
    1. Übertragen Sie die 15-μL-Reaktion in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr mit niedriger DNA-Bindung.
    2. Füge 15 μL neu aufgehängte magnetische Perlen hinzu, vermische sanft und drehe sie kurz.
    3. Inkubiere die Proben auf einem Rotatormixer für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    4. Bereite frisches 80%-Ethanol zum Waschen vor.
    5. Setze die Schläuche auf ein magnetisches Gestell, bis die Perlen Pellet sind, und entferne vorsichtig das Supernatant.
    6. Waschkugeln zweimal mit 200 μL 80% Ethanol.
      HINWEIS: Lassen Sie die Perlen vollständig pelletieren und entfernen Sie dann vorsichtig das Ethanol.
    7. Perlen an der Luft getrocknet für ~30 S; Vermeiden Sie Übertrocknen, um Risse zu vermeiden.
    8. Perlen in 10 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendieren und 2 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
    9. Röhrchen auf ein magnetisches Rack setzen und 10 μL Eluat in ein sauberes, wenig DNA-bindendes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
    10. Missen Sie die DNA-Konzentration mit 1 μL auf einem Spektrophotometer.
  3. Natives Barcode
    1. Tau-/TA-Ligase-Mastermix, EDTA, Short Fragment Buffer (SFB) und native Barcodes (NB01–NB24).
    2. Weisen Sie einzelne Barcodes den Proben 1–24 zu.
    3. Setzen Sie die Barcoding-Reaktion mit 7,5 μL end-prepped DNA, 2,5 μL Native Barcode und 10 μL Blunt/TA-Ligase-Master-Mix zusammen
    4. Gründlich durch 10–20 Pipettieren vermischen.
    5. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur und beenden Sie die Reaktion mit 4 μL EDTA, vermischen Sie gründlich durch Pipetteren und drehen Sie kurz herunter.
    6. Pool-Proben wurden in ein 1,5 mL niedrig-DNA-bindendes Mikrozentrifugenrohr eingeblendet. Fügen Sie magnetische Perlen bei 0,4 × dem gesamten gesammelten Probenvolumen hinzu (z. B. fügen Sie 230 μL Perlen zu 575 μL gesammelter DNA hinzu). Gründlich durch Pipetteren mischen und dann 10 Minuten lang auf einem Rotatorenmixer bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Waschen Sie die Perlen mit 700 μL Short Fragment Buffer (SFB). Schnippen Sie die Perlen, um sie wieder zu suspendieren, nach unten zu drehen, dann bringen Sie die Probe zurück ins magnetische Regal und lassen Sie die Perlen pelletieren. Entferne den Puffer mit einer Pipette und entsorge ihn dann.
    8. Wiederhole den vorherigen Schritt.
    9. Drehen Sie das Rohr ab und setzen Sie das Rohr wieder auf das Magnetrack. Pipettiere eventuelle Pufferreste ab.
    10. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Rack und suspendieren Sie das Pellet in 35 μL nukleasefreiem Wasser, indem Sie vorsichtig klicken.
    11. Inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten mit intermittierendem Mischen und übertragen Sie das Eluat dann in ein sauberes, niedrig-DNA-bindendes Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Adapterligierung und Bibliotheksreinigung
    1. Verbinde die Ligationsreaktion mit 30 μL pooled barcoded DNA, 5 μL Native Adapter, 10 μL Ligation Buffer (5×) und 5 μL T4 DNA-Ligase.
    2. Mischen Sie die Reaktion gründlich durch sanftes Pipetteren und kurzes Drehen nach unten. Inkubiere die Reaktion 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    3. Fügen Sie der Reaktion 20 μL neu aufgehängte magnetische Perlen hinzu und mischen Sie sie durch Pipetten. Inkubiere 10 Minuten auf einem Rotatorenmixer bei Zimmertemperatur.
    4. Drehen Sie die Probe und das Pellet auf dem Magnetregal herunter. Lass das Rohr auf dem Magneten und pipette das Supernatant entfernen.
    5. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 125 μL Short Fragment Buffer (SFB) hinzufügen. Schnippen Sie die Perlen, um sie wieder aufzuhängen, drehen Sie sie nach unten, dann stecken Sie das Rohr zurück ins Magnetregal und lassen Sie die Perlen pelletieren. Entfernen Sie das Überlagermittel mit einer Pipette und entsorgen Sie es dann.
    6. Wiederhole den vorherigen Schritt.
    7. Drehe dich nach unten und setze das Rohr wieder auf den Magneten. Pipette alle restlichen Überstandsmittel ab. Entfernen Sie das Rohr vom Magnetrack und setzen Sie das Pellet in einen 15 μL Elutionspuffer (EB) wieder auf.
    8. Drehen Sie herunter und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37°C. Rühre die Probe alle 2 Minuten, indem du sie 10 Sekunden lang sanft schnippst, um die DNA-Eluation zu fördern.
    9. Pellet die Perlen auf einem Magneten einsetzen, bis das Eluat klar und farblos ist, mindestens 1 Minute lang.
    10. Entferne und bewahre 15 μL Eluat mit der DNA-Bibliothek in einem sauberen 1,5-mL niedrig-DNA-bindenden Mikrozentrifugenröhre.
    11. Quantifizieren Sie die endgültige Bibliothek mit einem Spektrophotometer.

5. Flusszellvorbereitung und Nanoporensequenzierung

  1. Durchflusszellenvorbereitung
    1. Inspizieren Sie die Durchflusszelle und bestätigen Sie ≥80 aktive Poren.
    2. Bereiten Sie die Primingmischung vor, indem Sie 117 μL Spüllösung mit 3 μL Seillösung in einem Mikrozentrifugenrohr kombinieren, sodass ein Gesamtvolumen von 120 μL entsteht. Sanft durch Pipettern mischen, um Luftblasen zu vermeiden. Laden Sie das gesamte 120-μl-Priminggemisch langsam in den Priming-Port der Durchflusszelle, wobei während des Ladens keine Luftblasen entstehen.
  2. Bibliotheksladen und -sequenzierung
    1. Bereiten Sie die Sequenzierungsmischung vor, indem Sie 15 μL Sequencing Buffer (SB), 10 μL Library Beads (LIB) und 5 μL DNA-Bibliothek kombinieren. Rühren Sie vorsichtig, indem Sie 3–5 Mal auf und ab pipetten, um Blasen zu vermeiden. Das resultierende 30-μL-Sequenzierungsgemisch ist geladen oder kann bei Bedarf auf 45 μL eingestellt werden.
    2. Langsam werden 30–45 μL des Sequenzierungsgemisch durch Drop-Drop-Drop-Dosierung in den Probenanschluss der Durchflusszelle eingeläutet.
      VORSICHT: Vermeiden Sie Luftblasen und lassen Sie die Pipettenspitze nicht die Membran berühren. Schließen Sie den Ladeport nach dem Abgeben sicher.
    3. Beginnen Sie mit der Sequenzierung mit aktiviertem Echtzeit-Basisaufruf und überwachen Sie die Porenaktivität.
    4. Sequencing wird fortgesetzt, bis ≥500× Abdeckung pro Amplikon erreicht ist (empfohlen ≥1000×), um eine ausreichende Lesetiefe für präzise Basisaufrufe, zuverlässige Konsenssequenzgenerierung und eine sichere Erkennung niederfrequenter Varianten sicherzustellen.
      HINWEIS: Falls eine geringe Sequenzierungsabdeckung erkennbar ist, sollten Sie sicherstellen, dass hochwertiger Amplicon-Eingang bei der erforderlichen Konzentration, ausreichend aktive Flowzellenporen vorhanden ist und die Sequenzierung erweitert wird, um die empfohlene Abdeckung zu erreichen.

6. Datenverarbeitung und Variantenanalyse

  1. Basisaufruf und Demultiplexing
    1. Führen Sie hochpräzises Basecalling mit plattformassoziierter Basecalling-Software mit Standardeinstellungen für hohe Genauigkeit durch, um PRO-FASTQ-Dateien zu generieren. Demultiplex liest per Barcode und behält nur Lesungen, die Qualitätskontrollfilter passieren.
  2. Read Mapping und BAM-Verarbeitung
    1. Laden Sie die Toxoplasma gondii Referenzgenomassemblage GCF_000006565.2 (TGA4) aus der Genomdatenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) herunter. Extrahiere Chromosom VIII (NC_031476.1) für die SAG2-Analyse und Chromosom XII (NC_031480.1) für die SAG3-Analyse . Indexiere die Referenzsequenzen mit SAMtools und erstelle einen Ausrichtungsindex mit einem Long-Read Alignment Index Builder.
    2. Map liest auf das indexierte Referenzgenom mit einem Long-Read-Ausrichtungsalgorithmus, der für Nanopore-Sequenzierungsdaten optimiert ist (z. B. voreingestellt für Long-Read Mapping; -ax map-ont).
    3. Konvertiere die Ausrichtungsausgabe in BAM-Format, sortiere und indexiere BAM-Dateien mit SAMtools. Fügen Sie jeder BAM-Datei mit den Picard-Tools Lesegruppeninformationen hinzu. Berechnen Sie die durchschnittliche Abdeckung pro Locus mithilfe von Tiefenstatistiken und erstellen Sie Kartierungsstatistiken mit Flagstat-Metriken.
  3. Konsenssequenzgenerierung
    1. Erzeugen Sie Per-Amplicon-Konsenssequenzen mit einem neuronalen Netzwerk-basierten Konsenspolierungsalgorithmus mit Standardparametern. Exportieren Sie Konsenssequenzen im FASTA-Format für nachgelagerte Analysen.
    2. Führen Sie referenzbasierte Ausrichtung und vergleichende Sequenzanalysen mithilfe öffentlich zugänglicher genomischer Datenbanken durch. Visualisieren Sie Lese-Ausrichtungen und polymorphe Positionen mit Genomvisualisierungssoftware.
  4. Variantenruf
    1. Führen Sie Variantenerkennung mit einem konsensusbasierten variantenaufrufenden Algorithmus durch. Trennen Sie Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und Einfügungs-/Löschereignisse (INDELs) mithilfe von Variantenauswahlwerkzeugen (Supplementary File 1).
    2. Wende Qualitätsfilterschwellenwerte an. Für SNPs werden Varianten mit z. B. QD < 2.0, FS > 60.0 oder MQ < 40.0 gefiltert. Für INDELs werden Varianten mit z. B. QD < 2.0 oder FS > 200.0 gefiltert.
    3. Komprimieren und indexieren gefilterte VCF-Dateien mit Standard-VCF-Verarbeitungstools. Generiere variante Statistiken mit VCF-Zusammenfassungsprogrammen.
  5. Genotypzuweisung
    1. Extrahiere lokusspezifische Varianten aus den SAG2 - und SAG3-Regionen und vergleiche polymorphe Profile mit Referenzstammsequenzen, um T. gondii-Genotypen zuzuordnen.

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Ergebnisse

Die genomische DNA von Toxoplasma gondii wurde erfolgreich durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, die auf zwei genetische Marker abzielt: SAG2 und SAG3 (Abbildung 2). Nach der Reinigung ergaben die PCR-Produkte unterschiedliche Bänder der erwarteten Größen bei der Agarose-Gelelektrophorese, entsprechend 639 bp (SAG2) und 1158 bp (SAG3). Die Klarheit und Konsistenz dieser Bänder bestätigte eine er...

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Diskussion

Diese Studie zeigt den Nutzen der Oxford Nanopore Long-Read-Sequenzierung in Kombination mit einem gezielten Multi-Locus-Ansatz für eine schnelle und zuverlässige Genotypisierung von Toxoplasma gondii. Indem wir uns auf zwei gut charakterisierte Oberflächenantigenloci, SAG2 und SAG3, konzentrieren, stellen wir durch vergleichende Analysen der RH (Typ I) und ME49 (Typ II) Stämme einen Nachweis für die auf Oxford Nanopore basierende Multi-Locus-Sequenzierung ein ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom ägyptischen Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung finanziert, vertreten vom ägyptischen Büro für Kultur- und Bildungsangelegenheiten in London, sowie von UKRI MRC (MR/X502947/1). Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose-PulverThermo Fisher Scientific16500100Für Gelelektrophorese
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Zellkulturmedium
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow-Workflow zur Verarbeitung und Analyse von Nanopore-Amplikon-Sequenzierungsdaten; Version 1.2.1 wurde für reproduzierbare Analyse von MinION-Daten verwendet.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow-Workflow zur Ausrichtung von Nanopore-Sequenzierungsreads an Referenzsequenzen und integrierter Visualisierung mittels IGV; Version 1.2.3 wurde für reproduzierbare Analyse von MinION-Daten verwendet.
Ethylalkohol, reinMerck Life Science51976-500ML-FFür Bead-Reinigung
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Zusatz für Zellkultur
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Flow-Cell-Waschung
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Größenbestätigung
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Aus neonataler Vorhaut isolierte humane Dermalfibroblasten; verwendet für Parasiten-Vermehrung
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Flow Cell für Sequenzierung
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BNanopore-Sequenzierungsgerät; Sequenzierung wurde mit MinKNOW-Software (v25.09.16) für Gerätesteuerung und Echtzeit-Basen-Calling durchgeführt.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ASoftware für MinION Mk1B Gerätesteuerung, Echtzeit-Sequenzierung und Basen-Calling; Version 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Barcoding für multiplexierte Proben
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367DNA-Ligatur
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Adapter-Ligatur
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Verwendet in der DNA-Ligatur
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Bibliothek-Präparation
Nuclease-freies WasserThermo Fisher ScientificR0581Molekulare Biologie-Qualität
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5PCR-Produkt-Reinigung
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Antibiotika-Mischung
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Waschpuffer
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SHochgenauigkeits-Polymerase
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504DNA-Extraktion
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Adapter-Ligase-Enzym
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102DNA-Färbemittel
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Laden von Proben in das Gel
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Für das Passieren von HFFs
1× TAE oder 1× TBE Puffer——Laufpuffer
2× PCR-Vormischung——Bereit gemischt für PCR

Referenzen

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Genotypisierungs-WorkflowExtraktion genomischer DNAlocusspezifische AmplifikationSAG2-GenSAG3-GenEinzelnukleotid-PolymorphismusSequenzabgleich
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