Ein Continuous Culture Millifluidic Device zur Untersuchung von Escherichia coli unter niedrigen und schwankenden Nährstoffbedingungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für das millifluidische kontinuierliche Kulturgerät (MCCD) vor, das die Kultivierung von Bakterienpopulationen unter konstanten nährstoffarmen Bedingungen (bis zu hunderten nanomolaren Konzentrationen) oder zeitlichen Nährstoffschwankungen auf einem winzigen Zeitrahmen ermöglicht.

Zusammenfassung

Mikrobielle Lebensräume in der Natur zeichnen sich oft durch niedrige Konzentrationen gemischter Nährstoffe, räumliche Heterogenität und zeitliche Schwankungen aus. Traditionelle Laborkultivierungsmethoden können diese Bedingungen jedoch nicht replizieren. Chargenkulturen können das Wachstum in nährstoffarmen Umgebungen nicht aufrechterhalten, während Chemostaten ein stetiges Wachstum mit einem einzigen limitierenden Nährstoff aufrechterhalten, aber schwierig umzusetzen sind, wenn das Ziel ist, definierte niedrige Konzentrationen von Nährstoffmischungen zu halten oder schnelle Schwankungen einzuführen. Mikrofluidische Systeme erzeugen dynamische Umgebungen, liefern jedoch unzureichende Biomasse für populationsnahe omische Analysen. Um diese Einschränkungen zu beheben, führen wir das millifluidische kontinuierliche Kulturgerät (MCCD) ein, eine vielseitige Plattform zur Untersuchung mikrobieller Reaktionen auf stabile und schwankende Nährstoffbedingungen. Der MCCD beherbergt Bakterienpopulationen in einem Sterivex-Filter (0,45 μm Polyvinylidenfluorid [PVDF] poröse Filtermembran), wo ein kontinuierlicher Medienfluss stabile Kulturbedingungen erhält und gleichzeitig Nährstoffabbau verhindert. Ein dreifaches Magnetventilsystem, gesteuert über maßgeschneiderte Matlab-Software, ermöglicht präzise, winzige Nährstoffschwankungen. Dieses Protokoll bietet einen Schritt-für-Schritt-Leitfaden für den Betrieb des MCCD in zwei Modi: (1) konstanten nährstoffarmen Bedingungen und (2) schwankenden Nährstoffbedingungen. Mit diesem System wuchs Escherichia coli exponentiell in einer Mischung aus Aminosäuren und Nukleobasen, die in zigen bis hunderten nanomolaren Konzentrationen vorkommen und Zellkonzentrationen im Bereich von^10,9 Zellen/ml erreichte. Durch die Nachbildung von Schlüsselmerkmalen natürlicher mikrobieller Lebensräume ermöglicht das MCCD die Untersuchung des bakteriellen Wachstums und der Physiologie unter kontrollierten, aber ökologisch relevanten Bedingungen bei E. coli und anderen mikrobiellen Arten.

Einleitung

Bakterien in natürlichen Lebensräumen treffen auf eine Nährstofflandschaft, die oft sowohl in Zusammensetzung als auch Konzentration variiert und über ein breites Zeitspektrum schwanken kann: 1,2,3,4. In Umgebungen wie dem Ozean⁵, Boden³ und Darm⁶ wird das mikrobielle Wachstum häufig durch einen oder mehrere essentielle Nährstoffe eingeschränkt, und die Nährstoffverfügbarkeit kann sich durch physikalische, chemische und biologische Prozesse verändern⁴. Diese Nährstoffmischungen und ihre Schwankungen treiben mikrobielle Strategien für Überleben und Wachstum an und formen Reaktionen auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation⁴.

Mikrobielle Anpassungen an die Nährstoffdynamik finden auf Gemeinschafts-, Populations- und Einzelzell-Ebene statt. Auf Gemeinschaftsebene können Schwankungen das Artenkoexistenz⁷ fördern, die Zusammensetzung der Gemeinschaft und die metabolische Aktivität mit zeitlicher Variation⁸ koordinieren und neue Arten Möglichkeiten zur Besiedlung⁹ schaffen. Auf Populationsebene können sich ändernde Nährstoffbedingungen die Evolution beschleunigen, indem sie genetische Veränderungen¹⁰ auswählen oder phänotypische Variabilität induzieren, einschließlich Bet-Hedging-Strategien¹¹, die das Überleben unter unvorhersehbaren Bedingungen verbessern. Auf Einzelzellebene passen Bakterien ihre Physiologie an die Nährstoffumgebung^{an 12,13}. Ein kürzlich berichtetes Beispiel ist eine spezifische Physiologie, die Bakterien unter schwankenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil verschafft¹⁴. Da Bakterien häufig unter Nährstoffbeschränkungen stoßen, ist es unerlässlich, zu untersuchen, wie sie auf niedrige und variable Nährstoffbedingungen reagieren – sowohl als einzelne Zellen als auch innerhalb von Populationen oder Gemeinschaften –, um ihr Verhalten in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen.

Chemostate eignen sich gut zur Untersuchung des Wachstums unter Einschränkung durch einen einzelnen Nährstoff, sind jedoch schwer anzuwenden, wenn das Ziel ist, die Konzentrationen mehrerer Nährstoffe in Mischungen mit niedriger Konzentration zu kontrollieren. Chemostate sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der bakteriellen Anpassung an Nährstoffbegrenzung, indem sie eine gut kontrollierte, stabile Umgebung bieten. Ihre Wirkung beschränkt sie jedoch grundsätzlich auf Bedingungen, in denen das Wachstum durch ein einziges essentielles Nährelement begrenzt wird. Bei einem Chemostat wird die Verdünnungsrate so angepasst, dass das zelluläre Wachstum die Versorgung eines begrenzten Nährstoffs ausgleicht und so die Wachstumsrate statt der Konzentrationen einzelner Nährstoffe¹⁵ festhält. Dieser Rahmen lässt sich nicht leicht auf Umgebungen mit Mischungen austauschbarer Nährstoffe – wie mehrere Kohlenstoffquellen – verallgemeinern, da die Verdünnungsrate nur die Gesamtwachstumsrate steuert, nicht die Konzentrationen jeder einzelnen Komponente im^{Medium 16,17}. Daher entstehen die Konzentrationen einzelner Nährstoffe und deren Konutzungsmuster aus der mikrobiellen Nutzung und nicht aus extern verschriebenen^16,17.

Außerdem können Nährstoffschwankungen in Chemostaten zwar induziert werden, aber schnelle Schwankungen oder einzelne Verschiebungen auf der Minutenskala sind aufgrund der typischerweise großen Kulturvolumen schwer zu erreichen. Mikrofluidische Geräte haben sich als leistungsstarke Werkzeuge zur Schaffung präziser, niedriger Konzentration und schwankender Nährstoffumgebungen erwiesen¹⁴. In Kombination mit Videomikroskopie ermöglichen sie die Messung des Einzelzellwachstums. Obwohl mikrofluidische Systeme die Quantifizierung der Expression ausgewählter Proteine mittels fluoreszierender Reporter ermöglichen, sind typische mikrofluidische Geräte im Gegensatz zu Chemostaten zu klein, um die für omische Analysen benötigte Biomasse zu erzeugen, beispielsweise zur Untersuchung des Proteoms einer Bakterienpopulation. Um diese Lücke zu schließen, entwickelten wir das millifluidische kontinuierliche Kulturgerät (MCCD).

Der MCCD ermöglicht das bakterielle Wachstum unter kontrollierten Nährstoffbedingungen, einschließlich konstanter nährstoffarmer Bedingungen mit minimaler oder keiner Erschöpfung, sowie schwankender Nährstoffbedingungen, wobei ein kontinuierliches Kultursystem verwendet wird, das ausreichend Biomasse für nachgelagerte Analysen erzeugen kann. Der MCCD verwendet einen 0,45 μm PVDF-Filter als Kulturbehälter, in dem das Medium kontinuierlich durch eine peristaltische Pumpe aufgefüllt wird, die frisches Medium aus einem Reservoir liefert (Abbildung 1A). Die poröse Membran des Filters hält Bakterien zurück, während sie einen vorgegebenen Nährstofffluss ermöglicht, der selbst bei niedrigen Nährstoffkonzentrationen (Hunderte von nanomolaren bis mikromolaren Bereich) eine Nährstofferschöpfung verhindert. Da Biomasse zurückgehalten wird, während das frische Medium kontinuierlich durch das Gerät fließt, weist das MCCD Ähnlichkeiten mit Retentostaten¹⁸ auf, bei denen Zellen erhalten bleiben, während das Medium erneuert wird. Die MCCD unterscheidet sich jedoch von klassischen Retentostaten in ihrer Architektur und Art der Nährstoffabgabe. Der Retentostat arbeitet typischerweise als gerührter Bulkreaktor, bei dem die Zellen in einem gut gemischten Kulturvolumen suspendiert werden. Unter solchen Bedingungen hängt die Nährstoffverfügbarkeit vom Gleichgewicht zwischen Mëschung, Diffusion und zellulärer Aufnahme ab, und lokale Erschöpfung oder Gradienten können auftreten, insbesondere bei niedrigen Nährstoffkonzentrationen und hoher Zelldichte. Im Gegensatz dazu sammeln sich im MCCD die Zellen direkt auf der Membran innerhalb der kleinvolumigen Sterivex-Kartusche und bilden Schichten, die nur wenige Zellen dick sind und kontinuierlich dem fließenden Medium ausgesetzt sind. Im Patronenmodul wird kein aktives Mixing auferlegt; stattdessen wird das Medium stromaufwärts homogenisiert und durch kontinuierlichen Fluss geliefert. Nährstoffe werden durch konvektiven Transport durch die dünnen Zellschichten zugeführt, und da die Diffusionsdistanz gering und die Durchflussrate hoch ist, werden lokale Nährstoffgradienten minimiert. Daher werden die Nährstoffbedingungen, die die Population erfährt, hauptsächlich durch die Zusammensetzung des einströmenden Mediums bestimmt, was konsistentere und besser definierte nährstoffarme Bedingungen ermöglicht, als es in gerührten Retentionssystemen gewährleistet werden kann.

Abbildung 1: Das millifluidische kontinuierliche Kulturgerät (MCCD) für Bakterienkulturen unter niedriger Konzentration oder schwankenden Nährstoffbedingungen. (A) Schaltplan des MCCD für konstante Nährstoffbedingungen. Eine peristaltische Pumpe treibt den Fluss des frischen Mediums aus einem Reservoir durch einen 0,45 μm PVDF-Filter mit Bakterienzellen. Die poröse Membran im Filter hält die Bakterien zurück und lässt das Medium hindurch. Der kontinuierliche Mediumfluss sorgt für konstante Nährstoffbedingungen im Filter, selbst bei sehr niedrigen Nährstoffkonzentrationen. (B) Schaltplan des MCCD für schwankende Nährstoffbedingungen. Ein softwaregesteuertes dreifaches Magnetventil stromaufwärts der peristaltischen Pumpe wechselt den mittleren Zufluss zwischen zwei Reservoirs ab (z. B. hohe Nährstoffkonzentration, C_hoch, und niedrige Nährstoffkonzentration, C_niedrig). Die Software steuert die Position des Kolpels, um die aktive Zuflussquelle zu bestimmen. (C) Fluidische Baugruppe für konstante Nährstoffbedingungen. Ein Deckel mit drei Silikonröhren, die sich darüber verteilen, verschließt die Flasche mit frischem Medium. Ein Rohr ist mit einem Entlüftungsfilter zur Belüftung verbunden, während die anderen beiden Medium zu den Filtern führen. Barb-zu-Male Luer-Anschlüsse verbinden diese Schläuche mit dem Peristaltikrohr und verbinden jedes Peristaltik mit einem Einwegrückschlagventil, das als Eintrittspunkt zum Filter dient. Der Filterauslass ist außerdem mit einem Einweg-Rückschlagventil ausgestattet. Das Bild zeigt zwei Proben, die jeweils in einem Filter enthalten sind. (D) Fluidische Baugruppe für schwankende Nährstoffbedingungen. Die Metallplattform beherbergt den Mikrocontroller und die elektronischen Bauteile, die zwei Magnetventile über maßgeschneiderte MATLAB-Software steuern. Gewinde-zu-Barb-Anschlüsse verbinden sowohl die Ein- als auch die Auslasse der Magnetventile mit dem Schlauch. Jede Klappe hat zwei Einlässe für die beiden alternativen Medien, hier ein Medium mit hoher Nährstoffkonzentration, C_High, rot markierte Röhren, und ein Medium mit niedriger Nährstoffkonzentration, C_Low, blau markierte Rohre. Das Medium befindet sich in verschlossenen Flaschen mit einem Entlüftungsfilter, wie in (C). Die Auslässe der Magnetventile sind über peristaltische Schläuche, wie bei der Stationsbaugruppe (C), mit den Filtern verbunden. Das Bild zeigt zwei Proben, die jeweils in einem Filter enthalten sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusätzlich ermöglicht die Integration eines softwaregesteuerten Dreifach-Magnetventils stromaufwärts des Sterivex-Filters dem Benutzer, den Mediumstrom zwischen zwei Medien in verschiedenen Reservoirs umzuschalten (Abbildung 1B). Daher kann das Gerät verwendet werden, um die Reaktion von Bakterien entweder auf eine stabile Umgebung bei konstanten (einschließlich niedriger Konzentration) Nährstoffbedingung oder auf Nährstoffschwankungen mit Schwankungen von mehreren Minuten oder länger zu untersuchen.

Dieses Protokoll beschreibt die Zusammenstellung und den Betrieb des MCCD zur Untersuchung von Bakterien sowohl unter Nährstoffarm- als auch unter fluktuierenden Nährstoffbedingungen. Als Beispiel bietet dieses Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung eines Wachstumsexperiments mit Escherichia coli NCM3722 in zwei Betriebsmodi des MCCD: konstanten nährstoffarmen Bedingungen und schwankenden Nährstoffbedingungen. Das MCCD-Setup lässt sich leicht an andere Nährstoffbedingungen und mikrobielle Arten anpassen, was es zu einer vielseitigen Plattform macht, um die bakterielle Physiologie unter Nährstoffumgebungen zu untersuchen, die typisch für die Natur sind.

Protokoll

1. Bakterienwachstum unter konstanten Nährstoffbedingungen

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung einer Wachstumskurve von E. coli NCM3722 unter einem sehr verdünnten Rich-Defined Medium ("Low RDM")-Zustand. Diese Wachstumskurve erstreckt sich über 12 Stunden, wobei alle 2 Stunden eine Probe entnommen wird (insgesamt 6 Zeitpunkte). Das zentrale Prinzip dieses Protokolls ist, dass jeder Zeitpunkt einem einzelnen Sterivex-Filter entspricht (im Folgenden als 0,45 μm PVDF-Filter bezeichnet). Um eine Probe zu entnehmen, wird die Kultur im Filter durch Zentrifugation verkehrt herum entnommen, die Zellnummer quantifiziert und der Filter entsorgt. Jeder 0,45 μm PVDF-Filter liefert nur eine Probe. Die Vorbereitung des Experiments erfordert die Definition von drei zentralen experimentellen Parametern: der Durchflussrate der peristaltischen Pumpe, der Experimentdauer und der gewünschten Anzahl von Proben (d. h. der Anzahl der 0,45 μm PVDF-Filter). Stellen Sie die Anfangsdurchflussrate auf 2 mL/min ein. Passen Sie diesen Parameter nach Bedarf an (z. B. erhöhen Sie die Durchflussmenge, um die Versorgung mit einem sehr verdünnten Nährstoff aufrechtzuerhalten).

1. Herstellung von Medium und Materialien
   HINWEIS: Da jeder Filter einer einzelnen Zeitpunktprobe entspricht, variiert die experimentelle Laufzeit jedes 0,45 μm PVDF-Filters je nach Sammelzeit (z. B. 2 Stunden für den ersten Zeitpunkt, 4 Stunden für den zweiten Zeitpunkt usw.).
   1. Schätzen Sie das erforderliche Volumen des Kulturmediums anhand der Formel
      ,
      wobei n die Anzahl der Proben ist (0,45 μm PVDF-Filter), Q die Durchflussrate (in mL/min) und t_i die experimentelle Laufzeit (in Minuten) für jede Probe.
   2. Multiplizieren Sie mit 1,2, um ein zusätzliches Volumen von 20 % hinzuzufügen, um die Variation der Durchflussrate zu berücksichtigen. Für dieses Beispiel berechnen Sie
      
   3. Runden Sie das berechnete Volumen nach oben auf (z. B. bereiten Sie in diesem Beispiel 6.200 mL vor).
   4. Bereiten Sie Material zur Sterilisation vor (siehe Tabelle 1).
      HINWEIS: Bereiten Sie die Materialien am Tag vor dem Experiment vor und sterilisieren Sie, um die Einsatzbereitschaft zu gewährleisten und Verzögerungen zu minimieren. Autoklaven dieser Materialien, mit Ausnahme der Einweg-Luer-Ventile; Sterilisiere die Ventile mit 70 % Ethanol.
      1. Verbinden Sie beide Enden von sechs Silikon-Peristaltikröhren mit "Male Luer to Barb"-Kunststoffanschlüssen, indem Sie das Barb-Ende der Fitting in das Rohr einführen. Decken Sie die Male Luer-Enden mit Alufolie ab, um eine Verunreinigung zu verhindern.
         HINWEIS: Sechs Peristaltikröhren werden vorbereitet, da das Experiment sechs 0,45 μm PVDF-Filter verwendet. Alle Röhren werden später auf denselben peristaltischen Pumpenkopf montiert, sodass alle Filter denselben Durchfluss erhalten.
      2. Stellen Sie den Schlauch in einen geschlossenen, sterilisierbaren Behälter.
      3. Platzieren Sie die Lüftungsfilter in einen geschlossenen, sterilisierbaren Behälter.
      4. Platzieren Sie die Flaschendeckel mit Silikonschläuchen, die durch die Deckel führen, in einen geschlossenen, sterilisierbaren Behälter.
         HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Flaschendeckel mit Tuben sind mit drei Röhren ausgestattet, die die Deckel durchqueren: zwei Röhren gleichen Durchmessers zur Zugabe von Medium zu den 0,45 μm PVDF-Filtern und ein drittes Rohr mit größerem Durchmesser. Diese Schläuche sind sicher an den Kappen befestigt und können nicht entfernt werden.
      5. Tauchen Sie 12 Einweg-Luer-Rückschlagventile in eine 70%ige Ethanollösung und lassen Sie sie über Nacht sterilisieren.
         HINWEIS: (PAUSEPUNKT) Sterilisierte Materialien können bis zu 24 Stunden vor dem Experiment unter Wasser gelagert und bei Raumtemperatur versiegelt werden. Vor der Anwendung werden die Ventile aus dem Ethanol entfernt und mit sterilem ultrareinem Wasser abgespült, um die restlichen Ethanolreste zu entfernen. Alternativ können Rückschlagventile mit autoklavfähigen Materialien 3D-gedruckt werden, um eine Sterilisation durch Autoklavierung statt durch Ethanolbehandlung zu ermöglichen.
   5. Autoklaven des peristaltischen Schläuches, Entlüftungsfilters, Flaschendeckel, abgestufter Zylinder und Flaschen mit Standard-Laborausrüstungseinstellungen.
   6. Bereiten Sie 6.200 mL Low Rich-Definition Media (RDM; siehe Materialtabelle) vor, indem Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzien mischen.
      HINWEIS: Bereiten Sie das Medium am Tag des Experiments vor, während der etwa 5-stündigen Wartezeit nach Beginn der Vorkultur (siehe Schritt 1.2.1). Dies bewahrt die mittlere Frische und minimiert das Kontaminationsrisiko.
2. Herstellung einer bakteriellen Vorkultur
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Vorkultur in der exponentiellen Phase, um das Experiment zu starten. Während dieser Phase wachsen Bakterien konstant, synthetisieren Zellbestandteile auf ausgewogene Weise und teilen sich mit einer definierten Zellmasse. Verwenden Sie exponentielle Zellen, um die Variabilität zu minimieren und den physiologischen Ausgangszustand zu standardisieren.
   1. Am Tag vor dem Experiment bereiten Sie eine Übernachtkultur (ON) wie folgt vor: Inokulieren Sie 3 ml vollständiges RDM mit einem gefrorenen Glycerol-Fond von E. coli NCM3722 in einem sterilen 15-mL-Kulturrohr. Die Kultur über Nacht (~16 H) bei 37 °C mit dem Schütteln bei 200 U/min in einem schüttelnden Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: (PAUSEPUNKT) Sobald die ON-Kultur im Inkubator ist, werden an diesem Tag keine weiteren Schritte befolgt. Setzen Sie das Protokoll am nächsten Tag fort, indem Sie mit Schritt 1.2.2 fortfahren.
   2. Am Tag des Experiments bereiten Sie die Vorkultur wie folgt vor: 6 μL ON-Kultur zu 6 mL vollständigem RDM hinzufügen. Teilen Sie sie gleichmäßig in zwei 15-mL-Kulturröhren auf und beschriften Sie die Röhren als A und B. Beide Röhren bei 37 °C mit dem Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Die Vorkultur benötigt typischerweise etwa 5 Stunden, um die exponentielle Phase zu erreichen (OD₆₀₀ ≈ 0,5). Nutzen Sie diese Zeit, um das frische Medium vorzubereiten (siehe Schritt 1.1.6). Gehen Sie erst mit Schritt 1.2.3 fort, wenn OD₆₀₀ etwa 0,5 erreicht hat.
   3. Überwachen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit Röhre B. Führen Sie das Experiment fort, wenn OD₆₀₀ etwa 0,5 erreicht, was auf ein exponentielles Wachstum des vollständigen RDM für E. coli NCM3722 hinweist (siehe Abschnitt 1.4).
      HINWEIS: Beginnen Sie das Experiment mit exponentiellen Zellen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Startbedingungen zu standardisieren.
3. Vorbereitung eines Experiments im MCCD mit konstanten Nährstoffbedingungen
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.3.1 bis 1.3.5 unmittelbar nach Beginn des Wachstums der Vorkultur in einem sterilen Biosicherheitsschrank durch.
   1. Verteilt das gesamte mittlere Volumen auf jede Flasche.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Flaschen als mittlere Reservoirs. Verwenden Sie Flaschendeckel, die mit zwei mittleren Dosenrohren ausgestattet sind, wobei jedes Rohr einen Mittel- bis zu einem 0,45 μm PVDF-Filter liefert. Verteilt das gesamte Mediumvolumen (vorbereitet in Schritt 1.1.6) auf die Flaschen basierend auf der benötigten Menge jeder Zeitpunktprobe (d. h. jedem 0,45 μm PVDF-Filter) im Verlauf des Experiments.
      1. Verwenden Sie die in Schritt 1.1.1 angegebene Formel, um das benötigte Mediumvolumen für jeden 0,45 μm PVDF-Filter zu bestimmen. Zum Beispiel unter Verwendung folgender Begriffe:
         
         Die insgesamt benötigten mittleren Bände für jeden Zeitpunkt, chronologisch geordnet, betragen 288, 576, 864, 1152, 1440 und 1728 mL.
      2. Verteilt werden die berechneten Mediumvolumina auf Flaschen, wobei die benötigten Mengen für zwei Zeitpunkte in einer einzigen Flasche gruppiert werden. Zum Beispiel: ~900 mL in einer 1-L-Flasche (für Zeitpunkte 1 und 2), ~2.100 mL in einer 2,5-L-Flasche (für Zeitpunkte 3 und 4), ~3200 mL des Mediums in einer 4-L-Flasche (für Zeitpunkte 5 und 6).
   2. Verschließen Sie jede Flasche mit den Flaschendeckeln (Abbildung 1C). Ziehen Sie die Kappen sicher fest, um Undichtigkeiten zu vermeiden.
   3. Schließen Sie einen 0,2 μm großen Entlüftungsfilter an das breiteste Silikonrohr an, das vom Flaschendeckel mit dem Schlauch herausragt (Abbildung 1C). Dies ermöglicht einen sterilen Luftaustausch während des Experiments.
   4. Befestigen Sie ein Ende jedes peristaltischen Rohrs (mit bereits angebrachten Anschlüssen; siehe Abschnitt 1.1.4 zur Materialvorbereitung) an den kleineren Silikonröhren, die von den Flaschendeckeln mit Röhren ausgehen (Abbildung 1C). Stellen Sie sichere Verbindungen sicher, um die Sterilität zu erhalten. Lassen Sie die Alufolieabdeckung am freien männlichen Luer-Schlossverschluss sitzen, bis das Experiment beginnt, um eine Verunreinigung zu verhindern.
   5. Stellen Sie die Flaschen mit dem zusammengebauten Schlauch und der Peristaltikpumpe in einen auf 37 °C eingestellten Brutkasten. Sichern Sie das Rohr in den Kanälen des Kopfes der peristaltischen Pumpe.
      HINWEIS: Alle peristaltischen Schläuche sind am selben Pumpkopf einer einzelnen peristaltischen Pumpe montiert, sodass alle 0,45 μm PVDF-Filter das Medium derselben Pumpe erhalten. Die Verwendung einer einzelnen Pumpe stellt sicher, dass die Durchflussrate zwischen den Filtern identisch ist und verhindert Variabilität, die durch Unterschiede zwischen den Pumpen entstehen könnte.
4. Protokoll eines Experiments im MCCD mit konstanten Nährstoffbedingungen
   1. Verdünnen Sie die Vorkultur (OD = 0,5) um 1:10, indem Sie 600 μL Vorkultur zu 5,4 ml frischem niedrigem RDM hinzufügen.
   2. Mit einer 1-mL-Pipette wird 1 ml der verdünnten Vorkultur in jedes der sechs 0,45 μm-PVDF-Filter eingeführt.
   3. Spülen Sie die Einwegrückschlagventile mit autoklaviertem ultrareinem Wasser und schließen Sie an jedem Ende jedes 0,45 μm PVDF-Filters eines an.
   4. Entfernen Sie die Alufolieabdeckungen von den Peristaltik-Rohranschlüssen.
   5. Verbinden Sie jeden der sechs 0,45 μm PVDF-Filter mit einer männlichen Luer-Fitting am peristaltischen Schlauch (Abbildung 1C).
   6. Stellen Sie die Durchflussrate an der peristaltischen Pumpe auf 2 mL/min ein und starten Sie den Durchfluss. Definiere diesen Moment als Zeit 0.
   7. Platzieren Sie einen Abfallbehälter unter den 0,45 μm PVDF-Filtern, um den Abfluss aufzufangen.
      HINWEIS: Abbildung 2A zeigt die vollständige Montage des Experiments im Inkubatorkasten.
5. Probenentnahme
   1. Nach 2 Stunden ziehen Sie einen der beiden 0,45 μm PVDF-Filter ab, die an die 1-Liter-Flasche angeschlossen sind.
   2. Schrauben Sie die Einwegrückschlagventile ab und setzen Sie den 0,45 μm PVDF-Filter in ein 50-mL Zentrifugenrohr mit dem Einlass nach unten.
   3. Zentrifugiere das Zentrifugenrohr mit dem 0,45 μm PVDF-Filter bei 2.000 × g für 2 Minuten.
   4. Mit einem Rohrschneider üben Sie sanften Druck auf das Kunststoffgehäuse am Ende aus, das dem Auslass am nächsten ist, um den 0,45 μm PVDF-Filter zu öffnen.
      HINWEIS: Desinfizieren Sie den Rohrschneider vor der Verwendung (z. B. durch Abwischen mit 70 % Ethanol), um eine Verunreinigung beim Öffnen des 0,45 μm PVDF-Filters zu vermeiden.
   5. Lösen Sie den inneren Zylinder, der die poröse Membran enthält, und entsorgen Sie den Abschnitt des Filters, der die Membran hält.
   6. Spülen Sie die Innenwände des 0,45-μm-PVDF-Filters (die senkrecht zur Strömungsrichtung) mit dem im Zentrifugenrohr gesammelten Kulturmedium ab.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass alle während der Zentrifugation an den Wänden eingeschlossenen Zellen gesammelt werden.
   7. Missen Sie das gesammelte Gesamtvolumen mit einer 5-mL-serologischen Pipette.
   8. Zu folgenden Zeitpunkten (4 Stunden, 6 Stunden, 8 Stunden, 10 Stunden und 12 Stunden) ziehen Sie die entsprechenden 0,45 μm PVDF-Filter ab und wiederholen Sie die Schritte 1.5.2–1.5.6. Folgen Sie dieser speziellen Reihenfolge:
      1. Bei 4 Stunden zieht man den zweiten 0,45 μm PVDF-Filter ab, der an die 1-L-Flasche angeschlossen ist.
      2. Bei 6 Stunden und 8 Stunden ziehen Sie die 0,45 μm PVDF-Filter ab, die an die 2,5-Liter-Flasche angeschlossen sind.
      3. Bei 10 und 12 Stunden zieht man die 0,45 μm PVDF-Filter ab, die an die 4-Liter-Flasche angeschlossen sind.
         HINWEIS: Folgen Sie dieser Reihenfolge, um die Abtastzeitpunkte mit den in Schritt 1.3.1 verteilten Mediumvolumina abzugleichen.
6. Downstream-Analysen
   1. Nehmen Sie aus jeder Probe drei 100-μL-Aliquoten und fixieren Sie mit Glutaraldehyd eine Endkonzentration von 1,5 %.
      VORSICHT: Glutaraldehyd ist giftig, ein starker Reizstoff und potenziell ein Sensibilisierer. Führe sie in einer chemischen Abzugshaube und trage dabei geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrille). Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Entsorgen Sie glutaraldehydhaltige Abfälle gemäß den institutionellen Vorschriften für gefährliche chemische Abfälle.
   2. Verwenden Sie die fixierten Proben, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter mit Durchflusszytometrie nach der Markierung mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff zu zählen.
      VORSICHT: Fluoreszierende DNA-Farbstoffe können mutagen sein. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie farbstoffhaltige Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.
      HINWEIS: Als Alternative zur DNA-Färbung und Durchflusszytometrie können die Zelldichten geschätzt werden, indem ein kleines Volumen der Probe auf reich-mittleren Agarplatten (z. B. LB-Agar) aufgetragen und koloniebildende Einheiten (CFUs) gezählt werden.
   3. Multiplizieren Sie die Zellenzahl pro Mikroliter mit dem in Schritt 1.5.7 gemessenen Gesamtvolumen, um die Gesamtzahl der Zellen im 0,45 μm PVDF-Filter zu berechnen.
   4. Zentrifugiere das restliche Volumen in 1,5-mL Mikrozentrifugenröhren bei 10.000 × g für 4 Minuten.
   5. Entferne das Überwasser.
   6. Lagern Sie die Zellpellets bei -80 °C für zukünftige Analysen (z. B. Transkriptomik).

Abbildung 2: Experimentelle Montage des MCCD. (A) Foto der MCCD-Einrichtung für konstante Nährstoffbedingungen. Das Setup ist in einer Inkubatorbox untergebracht, um eine konstante Temperatur zu gewährleisten, wobei ein Abfallbehälter das Durchflussmedium aufnimmt. (B) Fotografie des MCCD-Setups für schwankende Nährstoffbedingungen. Die mit rotem Klebeband beschriftete Flasche enthält ein Medium mit hoher Nährstoffkonzentration (C_High), während die mit blauem Klebeband beschriftete Flasche ein Medium mit niedriger Nährstoffkonzentration (C_Low) enthält. Die Metallplattform in der Mitte trägt die Bauteile, die Nährstoffschwankungen steuern, entsprechend den in Abbildung 1D beschriebenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Bakterienwachstum unter schwankenden Nährstoffbedingungen

1. Montage eines Reglers für ein Magnetventil
   HINWEIS: Steuern Sie das Dreifach-Magnetventil mit einer mikrocontrollerbasierten Schaltschaltung, die mit einem Computer verbunden ist, der eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche (GUI) verwendet, die in MATLAB entwickelt wurde.
   1. Bauen Sie den Steuerkreis des Magnetventils zusammen (Abbildung 3A).
      1. Verbinde einen digitalen Ausgangspin des Mikrocontrollers mit der Basis eines NPN-Transistors über einen 1 kΩ-Widerstand.
      2. Verbinden Sie den Kollektor des Transistors mit dem Minuspol des Magnetventils.
      3. Verbinden Sie den Emitter des Transistors mit Masse.
      4. Verbinden Sie den Pluspol des Magnetventils mit einer externen Gleichstromversorgung, die mit der Ventilspannung kompatibel ist.
      5. Setze eine Diode über die Magnetventilanschlüsse. Verbinden Sie die gestreifte Seite der Diode mit der positiven Zuleitung.
         HINWEIS: Die Diode unterdrückt Spannungsspitzen, die entstehen, wenn das Magnetventil ausgeschaltet wird.
   2. Befestigen Sie Kunststoffanschlüsse mit "Gewinde an Schlauchbarb" an den Magnetventilen, damit das Barb-Ende nach außen ausragt.
   3. Installiere MATLAB R2022b oder später auf einem Computer mit USB-Konnektivität.
   4. Installieren Sie das MATLAB-Supportpaket, das für die serielle Kommunikation mit Mikrocontroller-Hardware erforderlich ist.
   5. Verbinden Sie die Mikrocontroller-Platine mit dem Computer über ein USB-Kabel, um eine serielle Kommunikation herzustellen.
   6. Öffnen Sie die MATLAB-basierte Benutzeroberfläche, die zur Erzeugung schwankender Nährstoffbedingungen im MCCD verwendet wird (verfügbar im Link https://github.com/juanitaLara/MCCD).
   7. Überprüfen Sie die Verbindung zwischen den Magnetventilen und der MATLAB GUI-Plattform:
      1. Öffnen Sie die GUI-Plattform in Matlab und klicken Sie auf die Schaltfläche "Verbinden " (Abbildung 3B). Warte, bis die Meldung "Controller hat sich erfolgreich verbunden" im Befehlsfenster erscheint.
      2. Geben Sie einen Wert für den Zeitsprung ein (z. B. 5 s für die Hoch- und Tiefphasen) unter dem automatisierten Betriebspanel .
      3. Beobachte die Magnetventile und achte auf das Klickgeräusch , das sie beim Wechseln zwischen den beiden Medien erzeugen.
      4. Überprüfen Sie mit einer Uhr, dass die Magnetventile genau im angegebenen Intervall (z. B. alle 5 Sekunden) umschalten.
         HINWEIS: Führen Sie diese Überprüfung vor jedem Experiment durch, um die Kommunikation und das korrekte Ventilschalten zu bestätigen. (PAUSENPUNKT) Nach Überprüfung des Magnetventilbetriebs kann das System mehrere Stunden im Inkubator zusammengesetzt bleiben, bevor das Experiment beginnt.
2. Herstellung von Medien und Materialien
   HINWEIS: Dieses Protokoll beinhaltet das Wechseln der Nährstoffbedingungen zwischen niedrigem und hohem RDM mit einer Dauer von 1 Stunde (30 Minuten bei hohem RDM, gefolgt von 30 Minuten bei niedrigem RDM). Das Experiment läuft drei Stunden Schwankungen, wobei zwei Proben entnommen werden: (1) Bei 3 Stunden 1 Minuten (hohe RDM-Phase, unmittelbar nach dem Wechsel von niedrig auf hoch) und (2) bei 3 Stunden 31 Minuten (niedrige RDM-Phase, unmittelbar nach dem Wechsel von hoch zu niedrig).
   1. Schätzen Sie die erforderlichen Fördermedienvolumen nach experimentellen Phasen.
      1. Berechnen Sie zunächst die benötigten Volumina für die ersten 3 Stunden (drei volle Fluktuationsperioden):
         niedriges RDM-Volumen = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0,45 μm PVDF-Filter] = 432[mL]
         hohes RDM-Volumen = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0,45 μm PVDF-Filter] = 432[mL]
      2. Berechnen Sie das benötigte Volumen für die letzte 30-Minuten-Phase:
         hohes RDM-Volumen = 1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[0,45 μm PVDF-Filter] = 72[mL]
      3. Runden Sie die Volumina auf bequeme Werte ab (z. B. 500 mL niedriges RDM und 600 mL hohes RDM).
   2. Bereiten Sie Materialien für die Autoklav-Sterilisation vor (siehe Tabelle 3), indem Sie den Schritten 1.1.4 –1.1.5 folgen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Materialien am Tag vor dem Experiment vor und sterilisieren Sie, um die Bereitschaft sicherzustellen und Verzögerungen am Experimenttag zu minimieren (Schritte 2.2.3 und 2.2.4). Dieses Setup erfordert im Vergleich zu den Konstant-Nährstoff-Experimenten zusätzliche Schläuche, um Medienflaschen direkt mit dem Magnetventil anzuschließen (Abbildung 1B,D). Diese Rohre benötigen nur eine "Barb-zu-Male Luer"-Verbindung, da die Magnetventilanschlüsse vormontiert sind. Decken Sie die Enden dieser Röhren vor dem Autoklavieren mit Alufolie ab.
   3. Sterilisiere die vorbereiteten peristaltischen Schläuche, Entlüftungsfilter, Deckel, abgestufte Zylinder und Flaschen in einem Autoklaven.
   4. Tauchen Sie vier Einweg-Luer-Rückschlagventile in eine 70%ige Ethanollösung und lassen Sie sie über Nacht sterilisieren.
      HINWEIS: (PAUSENPUNKT) Sterilisierte Rückschlagventile können über Nacht in Ethanol untergetaucht bleiben und bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur versiegelt gelagert werden. Vor der Anwendung spülen Sie die Ventile mit sterilem Milli-Q-Wasser.
   5. Reinigen und sterilisieren Sie die Magnetventile, indem Sie sie 3–5 Mal mit 70 % Ethanol spülen, gefolgt von ultrareinem Wasser 3–5 Mal.
   6. Am Tag des Experiments, während der etwa 5-stündigen Wartezeit nach der Vorkulturvorbereitung (siehe Schritt 2.3), bereiten Sie 500 ml Low RDM und 600 mL High RDM vor, indem Sie die in Tabelle 4 aufgeführten Reagenzien mischen.
      HINWEIS: Die Vorbereitung des Mediums am Tag des Experiments sorgt für Frische und minimiert das Kontaminationsrisiko.
3. Herstellung einer bakteriellen Vorkultur
   1. Befolgen Sie die in Schritt 1.2 beschriebenen Schritte.
4. Vorbereitung eines Experiments im MCCD mit schwankenden Nährstoffbedingungen
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.4.1–2.4.4 unmittelbar nach Beginn des Wachstums der Vorkultur in einem sterilen Biosicherheitsschrank durch.
   1. Geben Sie jedes Medium in eine 1-Liter-Flasche.
   2. Versiegeln Sie die Flaschen mit den vormontierten Deckeln, die mit drei Anschlüssen und vorinstalliertem Silikonrohr ausgestattet sind. Ziehen Sie die Kappen sicher fest, um Undichtigkeiten zu vermeiden.
   3. Schließen Sie einen 0,2 μm Lüftungsfilter an das breite Silikonrohr an, das von einem der Anschlüsse an jedem Flaschendeckel herausragt.
   4. Verbinden Sie das "Einlassrohr" (in Abbildung 1D dargestellt) mit den Silikonschläuchen, die von den Flaschendeckeln mit dem Schlauch ausgehen, bevor Sie es an die Magnetventile anschließen:
      1. Befestige ein Ende des Silikonschlauchs (mit nur einer angeschlossenen Fitting) am Schlauch, der vom niedrigen RDM-Flaschendeckel herausragt.
      2. Lassen Sie die Alufolieabdeckung auf dem freien männlichen Luer-Verschluss, bis die Flaschen zum Inkubator gebracht werden, um eine Verunreinigung zu verhindern.
      3. Wiederhole Schritt 2.4.4.1 für die High-RDM-Flasche.
   5. Platzieren Sie die Flaschen mit ihrem zusammengebauten "Einlassrohr", der Peristaltikpumpe und den Magnetventilen mit dem Regler in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator.
   6. Verbinden Sie das "Einlassrohr" (in Schritt 2.4.4 befestigt) folgendermaßen mit den Einlässen der Magnetventile:
      1. Verbinden Sie die beiden Schläuche der niedrigen RDM-Flasche mit einem der beiden Einlässe in jedem Magnetventil (Schläuche mit blauem Klebeband in Abbildung 1D beschriftet).
      2. Verbinden Sie die beiden Schläuche von der High-RDM-Flasche mit einem der beiden Einlässe in jedem Magnetventil (Schläuche, die in Abbildung 1D mit rotem Klebeband gekennzeichnet sind).
   7. Schließen Sie ein peristaltischpumpenkompatibles Silikonrohr (mit nur einem Verschluss) an den Ausgang jedes Magnetventils an (Abbildung 1D). Lassen Sie die Alufolieabdeckung auf der freien Male Luer-Verschlussöffnung, bis das Experiment die Sterilität aufrechterhält.
5. Protokoll eines Experiments im MCCD mit schwankenden Nährstoffbedingungen
   1. Überprüfen Sie die Verbindung zwischen den Magnetventilen und der Matlab-Software durch Schritt 2.1.7.
   2. Geben Sie die gewünschten Zeitstufenwerte für die Fluktuationen in die Matlab-GUI-Plattform ein: Geben Sie Zeitschritte von 1800 s bei High RDM (30 min) und 1800s in Low RDM (30 min) ein.
   3. Wählen Sie unter dem Menü Start vom Start Low aus, um in der Low RDM-Bedingung zu starten (Abbildung 3).
   4. Setze die beiden 0,45 μm PVDF-Filter wie in Schritt 1.4 beschrieben.
   5. Starte das Experiment.
      HINWEIS: Abbildung 2B zeigt die vollständige fluidische Baugruppe dieses Experiments.
6. Probenentnahme
   1. Sammeln Sie Proben wie in Schritt 1.5. Den ersten 0,45 μm PVDF-Filter nach 3 Stunden 1 Minuten und den zweiten nach 3 Stunden 31 Minuten ernten.
      HINWEIS: Zieh zuerst einen der beiden Filter ab; Beide Filter werden vom gleichen Medium gespeist.
7. Downstream-Analysen
   1. Befolgen Sie die in Schritt 1.6 beschriebenen Schritte, um die Anzahl der Zellen mittels Durchflusszytometrie zu zählen und Proben für nachgelagerte Analysen (z. B. Transkriptomik) zu verarbeiten und zu lagern.

Abbildung 3: Steuerung der Magnetventile, um Nährstoffschwankungen zu verursachen. (A) Schaltplan der elektronischen Schaltung, die zur Steuerung des Magnetventils verwendet wird. Die Schaltung besteht aus einer Mikrocontrollerplatine, einem Transistor, der als Schaltelement dient, einem Widerstand, der mit der Transistorbasis verbunden ist, und einer Rückschlagdiode, die quer über dem Magnetventil angebracht ist, um die Schaltung vor Spannungsspitzen beim Ventilschalten zu schützen. Der Mikrocontroller steuert den Transistor, der wiederum die Stromversorgung an das Magnetventil umschaltet. Angepasst mit Genehmigung aus Ref. ²⁰ . (B) Nachdem die Mikrocontrollerplatine sowohl mit dem Computer mit der Benutzeroberfläche als auch mit einer Stromquelle verbunden ist, die von den Magnetventilen benötigt wird, wird die Kommunikation durch Klicken auf den Verbinden-Button hergestellt. Die Ventile können manuell über das manuelle Bedienfeld bedient werden, in dem der Benutzer das zu fliegende Medium auswählt (z. B. "Hoch" oder "Niedrig"). Alternativ erlaubt das Bedienfeld für automatisierte Operationen dem Benutzer, das Anfangsmedium und die Zeitschritte (in Sekunden) für jede Phase (Hoch und Niedrig) anzugeben und die Operation durch Klicken auf die Starttaste zu starten. Der Echtzeitmonitor zeigt eine Stufenfunktion (0 = Niedrig, 1 = Höchst) über die Zeit an, die anzeigt, welches Medium in den vorangegangenen Sekunden durch die Magnetventile zu den Filtern floss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

In dieser Studie verwendeten wir das MCCD, um die Wachstumsrate von E. coli NCM3722 unter konstanten nährstoffarmen Bedingungen bei drei RDM-Konzentrationen zu quantifizieren. Diese Konzentrationen wurden aus der von Neidhardt¹⁹ beschriebenen Rich-Defined Medium (RDM)-Formel abgeleitet, wobei die Aminosäure- und Nukleobasenpräparate auf 0,5 %, 0,25 % bzw. 0,01 % der ursprünglichen Formulierung verdünnt wurden.

Replizierte Wachs...

Diskussion

Bakterielle Kultivierungsmethoden, die die Nährstoffkomplexität natürlicher Umgebungen erfassen, sind unerlässlich, um das Studium der mikrobiellen Physiologie über vereinfachte Laborbedingungen hinaus voranzubringen. Natürliche Ökosysteme enthalten Nährstoffmischungen aus einem breiten Konzentrationsbereich, die oft keine maximalen Wachstumsraten^{unterstützen –} 1,3,4,21,22,23.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1k Ohm Widerstand	BC Robotics	ELC-021	Leistungsbelastbarkeit: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC-Rückspannung: 50 V; mittlerer Gleichrichterstrom: 1 A
3-stop Platin-gehärtete Silikon-peristaltische Schläuche	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Innendurchmesser 0,8 mm; Außendurchmesser 2,4 mm; kompatibel mit verwendeter peristaltischer Pumpe
3-Wege-Magnetventile	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminiumfolie			Geeignet für Autoklavieren
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoklav	Systec	D-200	Oder von anderer Firma
Verschlusskappe mit drei Anschlüssen – für 1 und 2 L Flaschen	Nalgene	2162-0531	Oder von anderer Firma (stellen Sie sicher, dass sie zu den ausgewählten Flaschen passen)
Verschlusskappe mit drei Anschlüssen – für 4 L Flasche	Nalgene	2162-0830	Oder von anderer Firma (stellen Sie sicher, dass sie zu den ausgewählten Flaschen passen)
Zelldichtemesser CO8000	WPA biowave		OD-Meter
Zentrifuge	Eppendorf	5804R	Zentrifuge, die für 50 mL Falcon-Röhrchen geeignet ist
Zentrifuge	Eppendorf	5424R	Zentrifuge, die für 1,5 und 2 mL Eppendorf-Röhrchen geeignet ist
Kegelförmiges Zentrifugenröhrchen - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon-Röhrchen
Kulturröhrchen (14 mL, steril)	Greiner bio-one		Kulturröhrchen
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Auf 70% verdünnen
Durchflusszytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyd 25%	Sigma Aldrich	G5882	Oder von anderer Firma
Maßzylinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	Oder von anderer Firma
Inkubatorbox			Maßgefertigte Inkubatorbox – Wenden Sie sich für Konstruktionsdetails an die entsprechenden Autoren
LabV1 Intelligente peristaltische Pumpe mit niedrigem Durchfluss	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Erhältlich bei Darwin Microfluidics
Luer-Stecker auf Barb-Anschluss	Aldrich	Z277142	Luer-Stecker auf Barb-Adapter kompatibel mit 0,8 mm ID-Schlauch (siehe Abbildung 1C)
Luer-Stecker auf Gewinde	Aldrich	Z277142	Zum Verbinden des Magnetventils mit dem "Einlassschlauch" (siehe Abbildung 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b oder höher	Software zum Ausführen der kundenspezifischen Software für die Magnetventile
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS-Medium für Enterobakterien
Einweg-Luer-Rückschlagventil	Masterflex	30505-92	Verhindert Rückfluss in die Mediumreservoirs
Rohrschneider - 0-37 mm	KS Tools	2222051	Oder von anderer Firma
Pipetten-Set	Fisher Scientific	05-403-151	Oder von anderer Firma
Platin-gehärtete Silikonschläuche - 1/16 Zoll	Nalgene	8060-0020	Innendurchmesser 1/16 Zoll (1,6 mm); wird für Experimente mit schwankenden Nährstoffen verwendet
Platin-gehärtete Silikonschläuche - 1/8 Zoll	Nalgene	8060-0030	Innendurchmesser 1/8 Zoll (3,2 mm); wird für Experimente mit schwankenden Nährstoffen verwendet
Polypropylen-Copolymer-Flasche - 1 L	Nalgene	2126-1000	Oder von anderer Firma
Polypropylen-Copolymer-Flasche - 2 L	Nalgene	2126-2000	Oder von anderer Firma
Polypropylen-Copolymer-Flasche - 4 L	Nalgene	2126-4000	Oder von anderer Firma
Serologische Pipette - 5 mL	Corning	CLS4487	Oder von anderer Firma
Lötfreier Steckbrett	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV-Filter - 0,45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Farbstoff	Invitrogen	S7563	Nukleinsäure-Farbstoff für Zellzählung im Durchflusszytometer
TIP120 Darlington-Transistor	BC Robotics	TRN-005
Röhrchen - 1,5 mL	Eppendorf	3810X	Röhrchen zum Zentrifugieren von Zellkulturen und zum Lagern von Pellets
Entlüftungsfilter	Millex	SLFG05000	0,2 µm hydrophober Entlüftungsfilter
Abfallbehälter			Das Fassungsvermögen sollte mindestens das gesamte Medienvolumen betragen, das im Experiment verwendet wird