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Forschungsartikel
Dieser Artikel beschreibt die schützenden Effekte der Yiqi Huayu Jiedu Formel (YQHYJDF) gegen Lungenschäden durch Hemmung der Makrophagenchemotaxis und Neutrophilenrekrutierung durch Unterdrückung der IL-6, IL-1β, TNF-α, PI3K/AKT, MAPK und NF-κB-Signalwege sowie die Downregulation der Chemokine CCL2, CCL7 und CCL12.
Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine lebensbedrohliche Form des Atemversagens mit weit verbreiteter Entzündung der Lunge. Basierend auf jahrzehntelanger klinischer Praxis von Professor Du Huaitang wurde die Yiqi Huayu Jiedu-Formel (YQHYJDF) eingesetzt, um Symptome bei ARDS-Patienten zu lindern. Obwohl formale klinische Studien fehlen, deuten vorläufige Beobachtungen auf sein therapeutisches Potenzial hin, was weitere Untersuchungen rechtfertigt. Um ihre Schutzmechanismen zu erläutern, wurden Netzwerkpharmakologie, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Validierungsexperimente sowohl in vivo als auch in vitro integriert. Ein ARDS-Rattenmodell wurde durch die Schwanzveneninjektion von LPS nach einer vorbereiteten Intervention mit YQHYJDF entwickelt. Zur Bewertung der pathologischen Veränderungen wurde eine histopathologische Analyse durchgeführt. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um differenziell exprimierte Gene zwischen Gruppen zu erforschen. Eine Netzwerkpharmakologieanalyse wurde durchgeführt, um den potenziellen Schutzmechanismus von YQHYJDF gegen ARDS vorherzusagen. Nach dieser Vorhersage wurde der Mechanismus sowohl durch In-vivo - als auch in vitro-Experimente mit quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR), enzymgekoppeltem Immunsorbent-Assay (ELISA) und Western Blot weiter validiert. Die Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung zeigte, dass YQHYJDF signifikant histopathologische Veränderungen der Lunge verbesserte, die Infiltration von Entzündungszellen verringerte und die Lungenverletzungswerte senkte. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zeigte, dass YQHYJDF die Chemotaxe der Makrophagen effektiv regulierte und die Neutrophilenrekrutierung im ARDS-Lungengewebe signifikant abschwächte. Die Analyse der Netzwerkpharmakologie zeigte, dass die Wirksamkeit von YQHYJDF auf ARDS durch die Hemmung der PI3K/AKT-, MAPK- und NF-κB-Signalwege erreicht werden kann. In-vivo-Experimente zeigten, dass YQHYJDF die mRNA-Expression von IL-6, IL-1ß und TNF-α im Lungengewebe deutlich unterdrückte und die abweichende Aktivierung der PI3K/AKT-, MAPK- und NF-κB-Signalwege reduzierte. In-vitro-Experimente zeigten, dass YQHYJDF die Synthese und Sekretion von Ccl2, Ccl7 und Ccl12 in LPS-induzierten RAW264.7-Zellen effektiv hemmte. Die Schutzwirkung von YQHYJDF auf ARDS ist wahrscheinlich mit der Unterdrückung der Chemotaxis von Makrophagen und entzündlichen Reaktionen im Lungengewebe verbunden.
Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine schwere klinische Erkrankung, die sich als akutes hypoxämisches Atemversagen äußert und durch die radiographische Entdeckung beidseitiger Lungeninfiltrationen diagnostiziertwird. Trotz Fortschritten in der Intensivmedizin bleibt die ARDS-Sterblichkeit bei 30 % bis 50 %, und keine spezifischen pharmakologischen Therapien konnten die Ergebnisse signifikant verbessern2. Die Ätiologie von ARDS umfasst Infektionen, Traumata, Aspiration, Einatmen giftiger Substanzen und akute Pankreatitis, die alle zu einer fortschreitenden Beeinträchtigung der Lungenfunktion und potenziell lebensbedrohlichem Atemversagen führenkönnen. Obwohl die Pathogenese von ARDS multifaktoriell ist, spielen dysregulierte und unkontrollierte Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle beim Ausbruch und Fortschreiten der Krankheit. Dementsprechend stellt die gezielte Zielsetzung der entzündlichen Kaskade eine entscheidende Strategie zur Verringerung der ARDS-assoziierten Sterblichkeit dar.
Als zentrale Vermittler der angeborenen Immunität spielen Makrophagen eine entscheidende Rolle in der ARDS-Pathogenese. Die Rekrutierung zirkulierender Monozyten in verletztem Lungengewebe und deren anschließende Differenzierung in proinflammatorische Makrophagen stellen einen zentralen pathophysiologischen Mechanismus dar, der dem Krankheitsverlaufzugrunde liegt 6,7. Sobald sie aktiviert sind, setzen Makrophagen große Mengen entzündlicher Mediatoren frei, darunter Zytokine und Chemokine, wodurch die Lungenschädigung vervielfacht und der Entzündungszyklus 8,9 aufrechterhalten wird. Bemerkenswert ist, dass Makrophagen durch mehrere funktionelle Zustände zur ARDS-Pathogenese beitragen, darunter Polarisation, Pyroptose, Phagozytose und Chemotaxis, von denen jeder ein unterschiedliches therapeutisches Ziel darstellen kann 10,11,12.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) hat erhebliches Potenzial bei der Behandlung von ARDS über Multi-Target- und Multi-Pathway-Mechanismen gezeigt, einschließlich entzündungshemmende, antioxidativer und alveolärer Reparaturprozesse 13,14,15. Die Forschung zu TCM-basierten Interventionen für ARDS konzentriert sich zunehmend auf ihr Potenzial, Immunantworten zu modulieren, wie etwa die Abschwächung von Zytokinstürmen und die Wiederherstellung der Immunhomöostase 16,17,18. Die Yiqi Huayu Jiedu-Formel (YQHYJDF), ein verschreibungspflichtiges Rezept, das auf TCM-Prinzipien zur Qi-Supplementierung, Förderung der Blutzirkulation und zur Beseitigung von Blutstasis sowie Entgiftung basiert, besteht aus Astragalus membranaceus, Scutellaria baicalensis, Lonicera japonica, Panax notoginseng, Paeonia lactiflora, verarbeitetem Citrus aurantium, Lepidium apetalum und Morus alba-Rinde, und hat eine potenzielle klinische Wirksamkeit gegen ARDS gezeigt. Frühere Studien haben gezeigt, dass der YQHYJDF bei ARDS-Modellratten vor Lungenschäden schützen kann, indem er die Aktivität der Neutrophilenadhäsion reduziert und entzündungsbedingte Signalwege hemmt 19,20,21. Die genauen Schutzmechanismen, durch die es bei ARDS Vorteile bringt, müssen jedoch noch geklärt werden.
Das Aufkommen der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat unser Verständnis der zellulären Heterogenität und der dynamischen Veränderungen in Krankheitskontexten revolutioniert22,23. Diese Technologie ermöglicht eine beispiellose Auflösung zur Analyse zelltypspezifischer transkriptionsprogramme und zur Identifizierung zuvor unbekannter zellulärer Subpopulationen, die amKrankheitsverlauf beteiligt sind. In der ARDS-Forschung hat sich scRNA-seq als wertvoll erwiesen, um komplexe Immunzelllandschaften zu charakterisieren und neuartigeSchutzziele aufzudecken. Die Kombination aus Einzelzellsequenzierungstechnologie mit TCM-Forschung bietet einen leistungsstarken, hochauflösenden Ansatz zur Entschlüsselung komplexer pathologischer Mechanismen 26,27,28. Zu diesem Zweck wurde scRNA-seq-Technologie eingesetzt, um die Mechanismen zu erforschen, mit denen der YQHYJDF in LPS-induzierte ARDS-Modelle eingreift und so Belege für weitere klinische Anwendungen liefert.
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Diese Studie wurde vom Tierschutz- und Ethikausschuss des Dongzhimen-Krankenhauses, Universität für Chinesische Medizin Peking (Genehmigung Nr. 24-54) geprüft und genehmigt und nach institutionellen Richtlinien für die ethische Versorgung und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Insgesamt wurden 18 männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten gekauft, 6 Wochen alt und mit einem Gewicht von 220 ± 10) g (Tierlizenznummer: SCXK (jing) 2025-0008). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Tiere
Die Tiere wurden im Labortierzentrum des Dongzhimen-Krankenhauses, Universität für Chinesische Medizin in Peking, gehalten, mit 3 Ratten pro Käfig unter Standardernährungsbedingungen bei einer Temperatur von 22–24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50%–70%. Die Experimente wurden nach einer 7-tägigen Akklimatisierungsphase durchgeführt, in der die Ratten zufällig in eine leere Kontrollgruppe, eine ARDS-Modellgruppe und eine YQHYJDF-Gruppe eingeteilt wurden, was zu 6 Ratten pro Gruppe führte. Nach der Randomisierung in drei Gruppen mit jeweils sechs Ratten wurden drei Ratten pro Gruppe für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung der linken Lunge bestimmt, während alle Ratten pro Gruppe das rechte Lungengewebe für histopathologische Untersuchungen, qPCR, ELISA und West-Blot-Analysen bereitstellten.
2. Vorbereitung von YQHYJDF
Der YQHYJDF besteht aus Astragalus membranaceus (30 g), Panax notoginseng (10 g), Paeonia lactiflora (15 g), verarbeitetem Citrus aurantium (12 g), Lonicera japonica (15 g), Scutellaria baicalensis (10 g), Morus alba-Rinde (15 g) und Lepidium apetalum (15 g). Alle Kräuter wurden in destilliertem Wasser (10x Volumen) dekokt und mit spezieller Ausrüstung zu Pulverextrakt verarbeitet (Chargennummer: 20250228). In der klinischen Praxis wird YQHYJDF in einer Dosis von 122 g pro Formulierung verschrieben, wobei eine Formel täglich verabreicht wird. Bei einem Erwachsenenkörpergewicht von 60 kg beträgt die menschliche Äquivalentdosis von YQHYJDF 2,03 g (rohes Medikament)/kg/Tag. Basierend auf der auf Körperoberfläche basierenden Dosisumwandlung zwischen Ratten und Menschen wird die entsprechende Dosis für Ratten auf das 6,25-fache der des Menschen geschätzt. Daher wurde die Dosierung, die Ratten verabreicht wurde, auf 12,2 g (Roharzneimittel)/kg/Tag bestimmt. Da das Verhältnis der rohen Kräuter zum Extrakt bei YQHYJDF 2:1 beträgt, beträgt die äquivalente Extraktdosis für Ratten 6,1 g/kg/Tag. Der Extrakt wurde in destilliertem Wasser gelöst, um eine Stocklösung mit einer Konzentration von 0,61 g/ml herzustellen, die bei 4 °C für die spätere Verwendung gelagert wurde.
3. Pharmakologische Intervention
Die Blank-Kontrollgruppe und die ARDS-Modellgruppe erhielten destilliertes Wasser mittels oralem Gavage in einer Dosis von 1 mL pro 100 g Körpergewicht. Die YQHYJDF-Gruppe erhielt eine vorgefertigte YQHYJDF-Lösung mittels oraler Gavage in einer Dosis von 1 ml pro 100 g Körpergewicht. Vor der Verabreichung wurden sowohl das destillierte Wasser als auch die YQHYJDF-Lösung in einem 37 °C warmen Wasserbad vorgewärmt. Gavage wurde täglich um 8:00 Uhr an 7 aufeinanderfolgenden Tagen aufgeführt.
4. Etablierung des ARDS-Modells
6 Stunden nach der abschließenden intragastrischen Verabreichung am 7. Tag wurden Ratten der ARDS-Modellgruppe und der YQHYJDF-Gruppe einer Schwanzvenen-Injektion mit LPS-Lösung (2 mg/kg) unterzogen, während die Blank-Kontrollgruppe über denselben Weg eine äquivalente Menge von 0,9 % Natriumchlorid-Injektion (2 mg/kg) erhielt. 16 Stunden später wurden alle Ratten betäubt und Proben entnommen.
5. Probenentnahme und -verarbeitung
Die Ratten wurden mit Isofluran und einer Gasanästhesiemaschine betäubt (nach institutionell genehmigten Protokollen). Die Brusthöhle der Ratte wurde mit einem Skalpell geöffnet, und die Lunge war vollständig dissoziiert. Das linke Lungengewebe wurde in eine spezialisierte Konservierungslösung für die anschließende Einzelzellsequenzierung gelegt, während die rechte Lunge in zwei Teile geteilt wurde: Eine Portion wurde für die histopathologische Analyse in 4 % Paraformaldehyd fixiert, die andere wurde für qPCR-, ELISA- und Western-Blot-Analysen in flüssigem Stickstoff gefroren.
6. Lungenhistopathologische Untersuchung
Das rechte Lungengewebe wurde 12 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend mehrmals mit PBS ausgespült. Das Gewebe wurde schrittweise mit einer graduierten Ethanolserie dehydriert, mit Xylol in einer Abzughaube gereinigt, mit geschmolzenem Paraffin infiltriert und in Paraffinblöcke eingebettet. Die Schnitte wurden mit einer Dicke von 4 μm geschnitten, auf einem 45 °C Wasserbad zur Expansion geschwommen und auf klebeschichtete Glasverkleidungen montiert. Die Objektträger wurden in einem 60 °C-Ofen getrocknet und anschließend gemäß dem Herstellerprotokoll einer Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung unterzogen. Nach der Montage mit neutralem Balsam wurden die Schnitte weiter einer Ganzobjektaufnahme unterzogen.
Die Lungenverletzung wurde mit einem standardisierten semi-quantitativen Bewertungssystem (0–4, wobei 0 = normal, 4 = schwer) auf Basis von vier Parametern bewertet wurde: Neutrofilinfiltration, interstitielle Entzündung, Ödem und Verstopfung. Jeder Parameter wurde auf einer Skala von 0 bis 4 entsprechend dem Ausmaß der pathologischen Beteiligung bewertet: 0, keine pathologischen Veränderungen; 1, Beteiligung von ≤25 % des untersuchten Fachs; 2.≤50 %; 3.≤75 %; und 4, diffuse Beteiligung des gesamten Feldes. Der endgültige Wert für Lungenverletzungen jedes Tieres wurde als Summe aller 4 Parameter berechnet:29,30.
7. Herstellung eines medikamentenhaltigen Serums
Eine separate Kohorte von sechs männlichen SD-Ratten (3 Ratten pro Gruppe, gleiche Alters- und Gewichtsspanne wie das Hauptexperiment, unter identischen Bedingungen untergebracht) wurde ausschließlich zur medikamentenhaltigen Serumpräparation verwendet und war unabhängig von den 18 Ratten, die im Haupt-in-vivo-Experiment verwendet wurden. Sie wurden einmal täglich für sieben aufeinanderfolgende Tage ununterbrochen mit YQHYJDF oder einem entsprechenden Volumen destillierten Wassers verabreicht. 12 Stunden vor der letzten Amtszeit wurde das Essen mit freiem Zugang zu Wasser gefastet, während dessen zwei aufeinanderfolgende Dosen YQHYJDF oder destilliertes Wasser verabreicht wurden. Eine Stunde nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten betäubt, und Blut wurde aus der Bauchaorta entnommen. Vollblut wurde bei 1.500 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um Serum zu isolieren. Das gewonnene Serum wurde bei 56 °C in einem Wasserbad für 30 Minuten inaktiviert und anschließend durch einen 0,22 μm-Filter zur Sterilisation gefiltert. Nach dem Aliquotieren wurde das Serum bis zur Anwendung bei -80 °C gelagert.
8. Kultivierung und Behandlung von RAW264.7-Zellen
RAW264,7 Mausmakrophagenzellen wurden in hochglukosehaltigem Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2 gehalten. Alle In-vitro-Experimente wurden mit drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt, die jeweils separat durchführte RAW264.7-Zellbatches unter identischen experimentellen Bedingungen verwendeten.
Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von YQHYJDF-medikamentenhaltigem Serum oder normalem Rattenserum behandelt. Die optimale Interventionskonzentration wurde mittels des MTS-Proliferationstests bestimmt. Um die optimale Interventionskonzentration zu bestimmen, wurden RAW264,7-Zellen YQHYJDF-haltigem Serum in Konzentrationen von 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % und 25 % (v/v) ausgesetzt, wobei normales Rattenserum in gleichwertigen Konzentrationen als Kontrollgruppen diente. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach 24 Stunden Inkubation mit dem MTS-Proliferationstest bewertet. Die Zelllebensfähigkeit blieb bei Konzentrationen bis zu 10 % über 85 %, während Konzentrationen von 15 % und darüber zu einem fortschreitenden und signifikanten Rückgang der Zelllebensfähigkeit führten. Daher wurde für alle nachfolgenden Experimente ein 10%iges (v/v) YQHYJDF-haltiges Serum als optimale Konzentration ausgewählt, da es die höchste pharmakologisch relevante Konzentration darstellte, die die akzeptable Zelllebensfähigkeit bewahrte.
Für das Experiment wurden 1 × 106 RAW264.7-Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und mit YQHYJDF-Medikamentenhaltigem Serum oder normalem Rattenserum behandelt. Die Polarisation wurde durch Stimulation mit 1 ug/mL LPS induziert, und diese Induktion wurde 72 Stunden lang aufrechterhalten. Diese Dauer wurde auf Grundlage von vorläufigen Experimenten ausgewählt und etablierte Protokolle zur Induzierung eines stabilen M1-ähnlichen Entzündungsphänotyps in RAW264.7-Zellen, wodurch die vollständige Expression und Sekretion von Zielchemokinen ermöglicht wird. Nach dem Eingriff wurden die Zellen durch Pipettieren abgetrennt und bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant wurde für die enzymgekoppelte Immunsorbent-Analyse (ELISA) gesammelt, und Zellpellets wurden mit TRIzol für die anschließende qPCR-Detektion lysiert.
9. Single-Cell-Suspensionsvorbereitung
Frisches Rattenlungengewebe wurde in etwa 1 mm3 Fragmente zerkleinert, dreimal mit eiskalten PBS gewaschen und enzymatisch mit dem Tumor-Dissoziations-Kit für 30 Minuten bei Zimmertemperatur dissoziiert. Die resultierende Zellsuspension wurde durch 70 μm und 40 μm Zellsiebe gefiltert, gefolgt von Zentrifugation (4 °C, 300 × g, 10 min). Nach der Entfernung des Supernatanten wurden die roten Blutkörperchen mit einem Puffer der roten Blutkörperchen 10 Minuten bei 4 °C lysiert. Die übrigen Zellen wurden zweimal mit DPBS gewaschen, die 0,04 % BSA enthalten. Die Zellsuspensionen wurden auf eine Endkonzentration von 1.000 Zellen/μL angepasst, und Proben mit einer Zelllebensfähigkeit > 80 % galten als für eine weitere Analyse qualifiziert.
10. Vorbereitung und Sequenzierung einer Einzelzell-RNA-Bibliothek
Einzelzell-RNA-Bibliotheken wurden mit dem High-Throughput Single-Cell RNA Library Prep Kit konstruiert. Die Zellen wurden mit barcodeierten Perlen mit dem DNBelab C-TaiM 4 Tröpfchengenerierungssystem eingeschlossen, gefolgt von einer Reverse-Transkription bei 42 °C für 90 Minuten. Nach der magnetischen Perlen-basierten Reinigung von Reverse-Transkriptionsprodukten wurde cDNA PCR-amplifiziert und gereinigt. Sequenzierungsbibliotheken wurden durch cDNA-Fragmentierung, Endreparatur, Adapterligierung und Indexierungs-PCR konstruiert und anschließend auf einer Hochdurchsatz-Next-Generation-Sequenzierungsplattform (NGS) mit gepaarter Endsequenzierung sequenziert.
11. Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatenverarbeitung
Rohsequenzierungsdaten wurden mithilfe der scRNA-Analysepipeline für Probendemultiplexing, Barcode-Verarbeitung und eindeutige Molekular-Identifier-(UMI)-Zählung verarbeitet. Verarbeitete Lesungen wurden mit splice-kompatibler RNA-Sequenzierungs-Leseausrichtungssoftware auf das Ratten-Referenzgenom ausgerichtet. Gültige Zell-Barcodes wurden mithilfe der Funktion "barcodeRanks" aus einem Softwarepaket zur Vorverarbeitung von tröpfchenbasierten RNA-Sequenzierungsdaten identifiziert. Die Genexpressionsquantifizierung wurde mit Genexpressionsquantifizierungssoftware durchgeführt, und die nachgelagerte Analyse erfolgte in R mit dem Seurat-Paket.
Zur Qualitätskontrolle wurden für jede Zelle folgende Kennzahlen berechnet, darunter: (1) Anzahl der nachgewiesenen Gene (nFeature_RNA); (2) Gesamtzahl der UMI-Zahlen (nCount_RNA); (3) Prozentsatz der mitochondrialen Genexpression (Gene mit "mt-"-Präfix); (4) Prozentsatz der Hämoglobin-Genexpression, um eine Kontamination roter Blutkörperchen auszuschließen. Zellen wurden erhalten, wenn sie folgende Kriterien erfüllten: 500–7.000 nachgewiesene Gene, Mitochondrien-Gen-Anteil <20 %, Hämoglobin-Gen-Anteil <3 % und Gesamt-UMI-Zahlen >1.000. Die Daten wurden mit der "LogNormalize"-Methode mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 normalisiert. Hochvariable Gene wurden mit der "VST"-Methode identifiziert, und die besten 2.000 Gene wurden für die nachgelagerte Analyse ausgewählt. Die Zellzyklus-Scoring wurde mithilfe von Seurats eingebauten Zellzyklusmarker-Genen und Zellzykluseffekten (G2M. Score und S.Score) wurden während der Datenskalierung regressiert. Potenzielle Doublets wurden mit einem computergestützten Werkzeug zur Erkennung von Doublets in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten identifiziert und entfernt, und als Doublets klassifizierte Zellen wurden aus den folgenden Analysenausgeschlossen 31.
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde an sehr variablen Genen durchgeführt, und die ersten 30 Hauptkomponenten wurden anhand der Ellbogen-Plot-Inspektion32 ausgewählt. Batch-Effekte über Proben hinweg wurden mit einem Softwarepaket zur Batch-Effektkorrektur und Integration von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten33 korrigiert. Das Zellclustering wurde mit dem Leiden-Algorithmus durchgeführt, der in Seurats FindClusters-Funktion mit einer Auflösung von 0,1 implementiert wurde, um wichtige Zelltypen zu identifizieren. Die Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurde für die Visualisierung auf Basis der von Harmony korrigierten ersten 30 Hauptkomponenten angewendet. Die Annotation des Zelltyps wurde auf Basis der Expression kanonischer Markergene durchgeführt, die mit der FindAllMarkers-Funktion identifiziert wurden (Wilcoxon-Rangsummentest, logfc.threshold = 0,25, p < 0,05). Hauptzelltypen wurden identifiziert, darunter: Makrophagen/Monozyten (Cd163, Aif1, C1qa), natürliche Killerzellen (Nkg7, Klrd1), B-Zellen (Cd79a, Ms4a1), T-Zellen (Cd3e, Cd3d), Endothelzellen (Cav1, Pecam1), Neutrophile (S100a9, S100a8), Fibroblasten (Col1a1, Den), Epithelzellen (Epcam, Ager, Sftpc) und andere kleinere Zelltypen basierend auf in der Literatur dokumentierten Markern. Makrophagen und Monozyten wurden für eine tiefgehende Subset-Analyseextrahiert 34. Die differentielle Genexpressionsanalyse zwischen experimentellen Gruppen wurde mit der MAST-Methode für jeden Zelltyp durchgeführt. Gene mit angepasstem p-Wert < 0,05 und |log2-facher Veränderung| > 0,25 wurden als signifikant unterschiedlich ausgedrückt angesehen. Die funktionelle Anreicherungsanalyse wurde für die Analyse von Gene Ontology (GO) und Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) mit dem clusterProfiler-Paket durchgeführt.
12. Vorhersage der Netzwerkpharmakologie
Die Inhaltsstoffe von YQHYJDF wurden von der Traditional Chinese Medicine Pharmacology Platform (https://www.tcmsp-e.com/#/database)35 bezogen. Die Komponenten wurden anhand der Kriterien orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 getestet, um die Wirkstoffe36,37 zu identifizieren. Die entsprechenden Genziele dieser Wirkstoffe wurden weiter aus der TCMSP-Datenbank gewonnen. Mit dem Schlüsselwort "Akutes Atemnotsyndrom" wurden verwandte Zielgene aus der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/)38 abgerufen. Die überlappenden Ziele zwischen YQHYJDF-bezogenen und ARDS-bezogenen Zielen wurden als Schlüsselziele der YQHYJDF für die Behandlung von ARDS identifiziert. Ein regulatorisches Netzwerk aus Wirkstoffen und Schlüsselzielen von YQHYJDF für die ARDS-Behandlung wurde mit Cytoscape konstruiert und visualisiert. Die wichtigsten Ziele wurden auf Protein-Protein-Interaktion (PPI) mit Hilfe der STRING-Datenbank analysiert, und das PPI-Netzwerk wurde mit Cytoscape39,40 visualisiert. Die Top 20 Ziele, geordnet nach Grad der Konnektivität, wurden in einem Balkendiagramm mit R-Software dargestellt. Die wichtigsten Ziele von YQHYJDF für die ARDS-Behandlung wurden über die R-Software (https://www.r-project.org/) in die Bioconductor-Datenbank (https://www.bioconductor.org/) für die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse41 importiert. Signalwege mit P< 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen, und jene, die direkt mit menschlichen Krankheiten oder dem Stoffwechsel zusammenhängen, wurden ausgeschlossen. Die Top 15 Signalwege und ihre zugehörigen Gene wurden verwendet, um ein "Ziel-Gen-Signalweg"-Netzwerk zu konstruieren, das mit Cytoscape42 visualisiert wurde.
13. Echtzeit-quantitative PCR
Lungengewebe wurde in flüssigem Stickstoff zermalmt. Ungefähr 100 mg Gewebeprobe oder 5 × 106 Zellen wurden in 1 ml Trizol-Reagenz lysiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 200 μL Chloroform wurde das Gemisch energisch 15 s vortexiert, bei Raumtemperatur 3 Minuten inkubiert und schließlich bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde sorgfältig gesammelt und mit einem gleichen Volumen Isopropanol durch sanfte Inversion vermischt, gefolgt von einer Inkubation bei -20 °C über Nacht. Nach der Zentrifugation (4 °C, 12.000 x g, 15 min) wurde das Überlagerungsmittel entsorgt und das RNA-Pellet zweimal mit 75 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und in DEPC-behandeltem RNase-freiem Wasser gelöst. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer gemessen.
Für die komplementäre DNA-(cDNA)-Synthese wurde 1 μg Gesamt-RNA mit einem Reverse-Transkriptions-Set in einem 20-μL-Reaktionssystem (15 Minuten bei 42 °C, gefolgt von 95 °C für 5 Sekunden, um die Reaktion zu beenden) rückwärts transkribiert. qPCR wurde mit dem SYBR Green Real-Time PCR Master Mix durchgeführt. Jede 20 μL Reaktionsmischung enthielt 10 μL SYBR Green Master Mix, 2 μL cDNA-Vorlage, jeweils 0,8 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM) und 7,4 μL ddH2O. Die Amplifikation erfolgte auf einem quantitativen Echtzeit-PCR-System (qPCR) unter folgenden Bedingungen: eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und Glühung/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Das ß-Aktin-Gen wurde als interne Referenz verwendet, und die relative Expression der Zielgene wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Die verwendeten Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
14. Western-Blot-Analyse
Der RIPA-Lysepuffer, ergänzt mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Phosphataseinhibitoren, wurde hergestellt und auf Eis gelegt. Das Lungengewebe wurde in flüssigem Stickstoff gemahlen, und 20 mg Gewebepulver wurden präzise mit einer Präzisionswaage gewogen und in 250 μL Eiskalispuffer homogenisiert. Die Mischung wurde 30 Minuten auf Eis gelysiert, gefolgt von einer Zentrifugation (4 °C, 12.000 x g, 15 min), um das Supernatant zu sammeln. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit bestimmt, und alle Proben wurden mit einem RIPA-Lysepuffer auf dieselbe Konzentration eingestellt. Die Proteinproben wurden mit einem 5× SDS-Ladepuffer gemischt und durch Kochen bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert. Gleiche Mengen denaturierter Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und dann auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % (w/v) fettarmer Milch im TBST-Puffer für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit entsprechend verdünnten primären Antikörpern bei 4 °C über Nacht. Die Verdünnungsverhältnisse betrugen 1:1000 für den spezifischen primären Antikörper und 1:80.000 für den β-Aktin-Hauptantikörper. Nach dreimaligem Waschen mit TBST (jeweils 10 Minuten) wurden die Membranen mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:2500 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei weiteren TBST-Waschen (10 Minuten pro Wasch). Die Proteinbänder wurden mit einem ECL-Chemilumineszenzsubstrat nachgewiesen und mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem abgebildet. Die Bandintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert. Um die Aktivität der Signalwege zu bewerten, wurden die relativen Konzentrationen phosphorylierter Proteine auf ihre entsprechenden Gesamtproteine normalisiert (p-AKT/AKT, p-p38 MAPK/p38 MAPK und p-NF-κB p65/NF-κB p65). β-Actin wurde als Ladekontrolle verwendet, um die konsistente Proteinbelastung über Proben hinweg zu bestätigen.
15. ELISA
Das Zellkultur-Supernatant wurde durch Zentrifugation gewonnen (10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zur anschließenden Detektion). Vor dem Test durfte das ELISA-Kit 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ausgleichen. Standardlösungen wurden durch zweifache serielle Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Sowohl Standards als auch Proben wurden den vorbeschichteten Mikroplattenbohrlöchern hinzugefügt. Anschließend wurden biotinylierte Detektionsantikörper, Enzymkonjugat, chromogenes Substrat und Stop-Lösung sequentiell wie im Kit-Protokoll vorgeschrieben hinzugefügt. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen, mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm. Die Konzentration des Zielproteins in jeder Probe wurde anhand der Standardkurve bestimmt, die mit einer Kurvenanpassungs- und Regressionsanalyse-Software erzeugt wurde.
16. Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit einer Software für statistische Analysen durchgeführt. Daten für kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Für Vergleiche zwischen den drei experimentellen Gruppen (Blankkontrollgruppe, ARDS-Modellgruppe und YQHYJDF-Vorbehandlungsgruppe) wurde zunächst eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) angewandt, um die Gesamtunterschiede in der Gruppe zu testen. Wenn ein statistisch signifikanter Haupteffekt identifiziert wurde, wurden nachträgliche paarweise Vergleiche mit Tukey's Honestly Significant Difference (HSD)-Test durchgeführt, um die familienweise Fehlerquote unter mehreren Vergleichen zu kontrollieren. Ein zweiseitiger p-Wert von weniger als 0,05 galt als statistisch signifikant.
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Schutzwirkungen von YQHYJDF auf die Lungenpathologie bei ARDS-Ratten
Die histologische Untersuchung von HE-gefärbten Lungenschnitten aus der Blankkontrollgruppe zeigte gut erhaltene alveoläre Strukturen mit intakten Alveolarwänden, Fehlen von alveolärer oder interstitieller Verstopfung oder Ödem sowie nur minimale Infiltration von entzündlichen Zellen (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu zeigten Lungengewebe aus der ...
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ARDS ist eine kritische Atemwegserkrankung, die durch eine übermäßige und dysregulierte Entzündungsreaktiongekennzeichnet ist. Der pathologische Prozess beginnt mit einer Schädigung der alveolaren Epithelzellen und der pulmonalen Kapillarendothelzellen, was eine entzündliche Kaskade auslöst, die zu einer erhöhten Durchlässigkeit der alveolär-kapillaren Membran, übermäßiger Exsudation, die zu ein...
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Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt in dieser Arbeit.
Die Autoren danken dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das Horizontale Projekt des Dongzhimen-Krankenhauses, Universität für Chinesische Medizin in Peking (HX-DZM-202114).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | Servicebio | G1101 | |
| 5x Protein Loading Buffer | Solarbio | P1040 | |
| ABI 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351107 | |
| AKT Antikörper | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| Antikörperverdünnungslösung | Beyotime Biotechnology | P0268 | |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| Bovines Serumalbumin (BSA) | Sangon Biotech | A600332-0005 | |
| clusterProfiler R-Paket | Yu Lab (Guangchuang Yu) | 4.0.5 | RRID:SCR_016884 |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 | RRID:SCR_003032 |
| DNBelab C-TaiM 4 System | MGI Tech Co., Ltd. | Nicht zutreffend | scRNA-seq Bibliothekserstellungssystem |
| DNBelab Single-Cell Library Prep Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000020432 | |
| DoubletFinder R-Paket | McGinnis, C.S. et al. | 2.0.3 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 10010031 | |
| Escherichia coliLipopolysaccharid (LPS) | Sigma-Aldrich | L6511 | |
| Harmony R-Paket | Korsunsky, I. et al. | 1.0 | RRID:SCR_022206 |
| Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbeset | Solarbio | G1120 | |
| HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZB-5305 | |
| HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZB-2301 | |
| Isofluran | RWD Life Science | R510-22 | |
| MACS Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| MGISEQ-2000RS Sequenzierungsplattform | MGI Tech Co., Ltd. | Nicht zutreffend | scRNA-seq Sequenzierungssystem |
| Mouse CCL12/MCP-5 ELISA Kit | Novus Biologicals | MCC120 | |
| Mouse CCL2/MCP-1 ELISA Kit | 4A Biotech | CME0046 | |
| Mouse CCL7/MCP-3 ELISA Kit | Novus Biologicals | KA2199 | |
| MTS Assay Kit | Promega | G3580 | CellTiter 96 AQueous One Lösung |
| NanoDrop 2000 Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NF-κB p65 Antikörper | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| Magermilchpulver | Solarbio | D8340 | |
| p38 MAPK Antikörper | Abclonal | A14401 | |
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | Solarbio | P0010 | |
| Phosphatase-Inhibitor-Cocktail | Beyotime Biotechnology | P1081 | |
| Phospho-AKT (Ser473) Antikörper | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| Phospho-p38 MAPK Antikörper | Abclonal | AP0526 | |
| PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) | EMBL-EBI | Nicht zutreffend | https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/ |
| Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran | Millipore | IPVH00010 | |
| R-Projekt für statistische Berechnungen | The R Foundation | 4.1.3 | RRID:SCR_001905 |
| RAW 264.7 Zelllinie | ProcellLifeScience&TechnologyCo.,Ltd. | GCL-0190 | |
| Rote Blutkörperchen Lysis Puffer | Tiangen Biotech | RT122-1 | |
| Reverse Transkriptionssystem | Promega | A3500 | |
| RIPA Lysis Puffer | Solarbio | R0010 | |
| RNase-freies Wasser | Ambion | AM9937 | |
| SDS-PAGE Elektrophoresepuffer | Servicebio | G2144 | |
| Seurat R-Paket | Satija Lab | 4.1.1 | RRID:SCR_016341 |
| SPSS Statistics | IBM | 26.0 | RRID:SCR_002865 |
| STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference) | Dobin, A. et al. | 2.7.10a | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | |
| TBST Puffer (10X) | Solarbio | T1085 | |
| TE Puffer, pH 8,0 | Ambion | AM9858 | |
| Tris-Glycin Transferpuffer | Servicebio | G2017 | |
| Trypanblau-Lösung | Gibco | 15250061 | |
| β-Aktin Antikörper | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | TA-09 |