Computergestützte Wirkstoff-Screening und Validierung von Dong-Medikamenten zur Untersuchung von Fieber und Husten

Zusammenfassung

Hier haben wir ein multidimensionales Netzwerk der "Komponenten-Ziel-Pathway-Krankheit" aufgebaut, das Netzwerkpharmakologie-Screening, molekulares Andocken und LPS-induzierte Mausmodellvalidierung integriert. Durch die Festlegung klarer Schlüsselparameter ermöglicht es die effiziente Identifizierung der aktiven Bestandteile der Tong-Ethniemedizin, Lengyuxiao Tang, und die Überprüfung eines wiederholbaren Prozesses.

Zusammenfassung

Um systematisch die aktiven Inhaltsstoffe der Dong-Ethniemedizin zu überprüfen und zu überprüfen, ist Lengyuxiao Tang (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. und Zingiber officinale Roscoe) zur Behandlung von Fieber und Husten etablierte dieses Verfahren einen Methodikprozess, der Netzwerkpharmakologie und experimentelle Verifikation integrierte. Erstens wurden unter Verwendung der pharmakologischen Datenbank und Analyseplattform (TCMSP) mit einer oralen Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und einer Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 als Kriterien die wichtigsten aktiven Komponenten von LYXT untersucht und die zugehörigen Ziele für Fieber und Husten aus mehreren Krankheitsdatenbanken erhoben. Anschließend wurde das "Komponenten-Ziel-Krankheit"-Interaktionsnetzwerk aufgebaut, und durch topologische Analyse sowie Genontologie (GO) sowie die Kyoto-Enzyklopädie der Gen- und Genomenanreicherung (KEGG) wurden die Kernaktionsziele (CYP3A4, POR) und Schlüsselsignalwege (MAPK-Signalweg) identifiziert. Molekulare Andocktechnologie wurde eingesetzt, um die Bindfähigkeit wichtiger Komponenten an Kernziele zu überprüfen. Abschließend wurde ein Modell der chronischen Bronchitis durch intranasale Instillation von Lipopolysaccharid (LPS) etabliert, und die in vivo entzündungshemmende Wirksamkeit der prognostizierten Hauptwirkstoffe wurde bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass Komponenten wie β-Carotin und Saparenol, die durch Netzwerkpharmakologie untersucht wurden, in Tierversuchen unterschiedliche Grade entzündungshemmender Effekte zeigten und ihre Mechanismen möglicherweise die Hemmung des MAPK/p38-Signalwegs beinhalten. Dieses Programm bietet ein wiederholbares Beispiel für das Screening und die Mechanismenforschung aktiver Bestandteile in traditionellen ethnischen Medizinen.

Einleitung

Die Dong-Medizin ist ein ethnomedizinisches System im Rahmen der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM), das von der Dong-Ethnie in Guizhou, Hunan und Guangxi praktiziert wird. Sie repräsentiert ihr kumulatives empirisches Wissen, das sich über Generationen hinweg entwickelt hat. Dieses System integriert Kräutermedizin, Akupunktur, Knochensetting, Massage, Diättherapie und spirituelle Praktiken. Ihre besonderen Merkmale ergeben sich aus der historischen geografischen Isolation der Gruppe und der mündlichen Überlieferung, die eine einzigartige, praxisbasierte Pharmakopei förderte, die an die lokale Umwelt und kulturelle Überzeugungen angepasst war.

Anhaltendes Fieber, eine Erkrankung, die entsteht, wenn der Körper seine Temperatur nicht kontrollieren kann, ist ein Zeichen dafür, dass der Körper dysfunktional ist, und eine wichtige Selbstschutzfunktion in menschlichen Zellen¹. Es existieren viele verschiedene Methoden zur Behandlung von Erhitzungsmitteln der Dong-Nationalität. Darunter wird Fieber in inneres Fieber und äußeres Fieber eingeteilt. Inneres Fieber bezeichnet Hitze, die durch innere Krankheiten verursacht wird, und äußeres Fieber bezeichnet die durch Kälte oder Trauma erzeugte Wärme². Exogenes Fieber beeinträchtigt meist die Magen-Darm-Funktion³. Dong National Ärzte verwenden eine erkältungshemmende Fieberbehandlung zur Behandlung von Fieber. Unter den verschiedenen Dong-Medikamenten ist Lengyuxiao Tang (LYXT) ein Standardabkok bei Fieber und Schmerzen, bestehend aus Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. und Zingiber officinale Roscoe, die ständig geschlagen und mit Wasser vermischt^werden. Es wird hauptsächlich bei Fieber und Kopfschmerzen eingesetzt, die durch eine Erkältung verursacht werden.

Die aktiven Bestandteile von LYXT und ihre zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind jedoch weiterhin wenig verstanden. Um diese Lücke zu schließen, verwendete die vorliegende Studie einen Netzwerkpharmakologie-Ansatz, um potenzielle Wirkstoffe und Zielgruppen vorherzusagen. Um diese Vorhersagen zu validieren, wurde ein gut etabliertes, von Lipopolysaccharid (LPS) induziertes Mausmodell der Lungenentzündung ausgewählt, da es die wichtigsten entzündlichen Reaktionen von Fieber und Husten nachahmt, einschließlich Leukozytininfiltration und pro-inflammatorischer Zytokinproduktion.

Im Zuge der Arzneimittelforschung haben verschiedene Studien gezeigt, dass Verbindungen mit mehreren Proteinzielen interagieren können. Daher verlagert sich das Paradigma "ein Medikament, ein biologisches Ziel" hin zu einem Systempharmakologie-Paradigma. Eine Verbindung, die mit mehreren biologischen Zielproteinen von Viren oder Bakterien interagiert, kann nützliche pharmakologische^{Effekte bieten}. Die Analyse der Netzwerkpharmakologie ist eine praktikable und wirkungsvolle Methode, um den teuren und langwierigen Wirkstoffforschungsprozess zu mildern. Sie kann uns helfen, Wechselwirkungen zwischen Medikamenten besser zu verstehen, die Ursachen der Krankheit vorherzusagen, alternative Medikamente für die beabsichtigten pharmakologischen Effekte ohne Nebenwirkungen vorzuschlagen und die Bioaktivitäten der traditionellen Medizin vorherzusagen. Chemoinformatische Ansätze, molekulares Andocken und datenbasierte Modellierung wurden erfolgreich angewandt, um Bioaktivitäten vorherzusagen und Mechanismen zu analysieren. Diese Methoden erleichtern die schnelle Entdeckung antiviraler und antibakterieller Verbindungen mit klinischem Potenzial und werden auch verwendet, um die Wirksamkeit und Nebenwirkungen von Medikamenten^zu erklären. Zum Beispiel ist Imatinib-Mesylat, ein kleines Molekül, ein Inhibitor des Kausalfaktors bei chronischer myelogener Leukämie, des Fusionsproteins Bcr-Abl, blockiert aber auch die Aktivität mehrerer Tyrosin-Kinasen wie Abl, Kit und PDGFR⁷. Daher ist die Forschung zur Identifizierung von Medikamenten und ihren Zielen weiterhin entscheidend für die potenzielle Behandlung von Krankheiten, was uns hilft, die Mechanismen zu verstehen, mit denen Arzneimittelverbindungen auf molekularer Ebene Krankheiten behandeln. Computational Modelling und Netzwerkanalyseansätze können potenzielle Medikamente und Ziele genau abschirmen, und multiplikative Interaktionsanalyse kann eine theoretische Grundlage und praktische Orientierung für experimentelle Verifikationen liefern. In diesem Artikel wurden durch die Nutzung des Suchwerkzeugs für den Retrivalen interaktierender Gene/Proteine (STRING), der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) sowie anderer Datenbanken, kombiniert mit der Analyse der dynamischen Genontologie (GO) und der Wegweganalyse, die Daten zu den Wirkstoffen und verwandten Aktionsproteinen des Dong-Medikaments LYXT bei Fieber und Husten erhoben und der Mechanismus der kombinierten Behandlung der Wirkstoffe untersucht. die eine spezifische theoretische Referenz für weitere Forschung am Dong-Medikament LYXT bieten kann, eine reproduzierbare Strategie zur Erforschung der pharmakologischen Mechanismen ethnomedizinischer Formeln bietet und Einblicke in die Entwicklung neuer entzündungshemmender Mittel bietet.

Protokoll

Das Tierversuchsprogramm wurde vom Ethics Committee für experimentelle Tiere der Universität Lanzhou überprüft (D2024-292). Sie entspricht den Prinzipien des Tierschutzes, des Tierschutzes und der Ethik sowie den einschlägigen Bestimmungen der nationalen Ethik zum Wohl von experimentellen Tieren.

1. Vorbereitung der Datenbank und Software

1. Wirkstoff-Screening und Zielgen-Sammlung
   1. Greifen Sie auf die TCM-System-Pharmakologiedatenbank und Analyseplattform (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) zu, und führen Sie separate Suchen mit den lateinischen Namen jedes Krauts in der LYXT-Formulierung durch, nämlich Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. und Zingiber officinale Roscoe, als Schlüsselwörter, um alle chemischen Verbindungen zu finden, die mit jedem Kraut verbunden sind.
   2. Wenden Sie die Screening-Kriterien an, um die gefundenen Verbindungen für jedes Kraut wie folgt zu filtern: Für Verbena officinalis L. setzen Sie die orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30,1 % und die Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,12; für Zingiber officinale Roscoe setzte OB ≥ 60 % und DL ≥ 0,13; für Samenpharbitiden setzen Sie OB ≥ 16,93 % und DL ≥ 0,50. Anschließend werden die gefilterten Verbindungslisten aller drei Kräuter zusammengeführt und doppelte Einträge basierend auf einzigartigen TCMSP-Kennungen entfernt, um die endgültige Liste der Wirkstoffe in LYXT zu erstellen.
   3. Exportiere alle Zielproteine, die mit diesen Wirkstoffen assoziiert sind, aus der TCMSP-Datenbank als Tabelle mit Verbindungsidentifikatoren und Zielproteinnamen und importiere diese Zielproteinliste dann in die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/).
   4. Verwenden Sie das UniProtKB ID-Mapping-Tool, um alle Zielproteinnamen in offizielle menschliche Gensymbole umzuwandeln, wobei die Kartierungsrichtung von Proteinname zu Genname gesetzt wird, und entfernen Sie alle Einträge, die kein gültiges Gensymbol haben, um die endgültige Liste der Zielgene zu erstellen, die mit LYXT-aktiven Komponenten assoziiert sind.
2. Gensammlung und Überlappungsanalyse von Krankheitszielgen
   1. Laden Sie fieber- und hustenbedingte Gene aus der GeneCards-Datenbank (www.genecards.org) herunter, indem Sie separat mit den Schlüsselwörtern "Fieber" und "Husten" suchen, Gene mit einem Relevanzscore ≥ 5 behalten und die Ergebnisse beider Suchanfragen in der Datenbank zusammenführen.
   2. Laden Sie fieber- und hustenbezogene Gene aus der therapeutischen Zieldatenbank (TTD) (db.idrblab.net/ttd) herunter, indem Sie separat mit den Schlüsselwörtern "Fieber" und "Husten" suchen, alle zugehörigen Zielgene herunterladen und die Ergebnisse beider Suchanfragen in der Datenbank zusammenführen.
   3. Laden Sie fieber- und hustenbedingte Gene aus der PharmGkb-Datenbank (www.pharmgkb.org) herunter, indem Sie separat mit den Schlüsselwörtern "Fieber" und "Husten" suchen, alle zugehörigen Gene herunterladen und die Ergebnisse beider Suchanfragen in der Datenbank zusammenführen.
   4. Laden Sie fieber- und hustenbezogene Gene aus der Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank (www.omim.org) herunter, indem Sie separat mit den Schlüsselwörtern "Fieber" und "Husten" suchen, alle zugehörigen Gene herunterladen und die Ergebnisse beider Suchanfragen in der Datenbank zusammenführen.
   5. Laden Sie fieber- und hustenbedingte Gene aus der DrugBank-Datenbank (go.drugbank.com)⁸ herunter, indem Sie separat mit den Schlüsselwörtern "Fieber" und "Husten" suchen, alle zugehörigen Gene herunterladen und die Ergebnisse beider Suchanfragen in der Datenbank zusammenführen.
   6. Führen Sie die aus allen fünf Datenbanken gewonnenen Genlisten zu einer einzigen umfassenden Liste zusammen und entfernen Sie doppelte Gensymbole, um die endgültige Liste der fieber- und hustenbedingten Krankheitszielgene zu erstellen.
   7. Vergleichen Sie die Zielliste der Krankheit aus Schritt 1.2.6 mit der LYXT-Liste der aktiven Komponenten-Zielgene aus Schritt 1.1.4, um die sich überlappenden Gene auszuwählen, die beiden Listen gemeinsam sind, und exportieren Sie diese überlappende Genliste als CSV-Datei.
3. ID-Umwandlung und Querschnittsanalyse
   1. Laden Sie die überlappende Genliste aus Schritt 1.2.7 in die R-Umgebung und greifen Sie auf die DAVID-Website (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) auf.
   2. Laden Sie die sich überlappende Genliste auf DAVID hoch, wobei die Art auf Homo sapiens und der Listentyp auf Gensymbol gesetzt ist, und führen Sie dann das funktionale Annotationstool zur Querschnittsanalyse aus.
   3. Konvertiere die Symbol-IDs der sich schneidenden Proteine in Ensemble-IDs mithilfe der Gen-ID-Umwandlungsfunktion innerhalb von DAVID, wobei die Umwandlungsrichtung vom Gensymbol zur Ensemble-ID gesetzt wird.
   4. Exportieren Sie die konvertierte Ensemble-ID-Liste zusammen mit den ursprünglichen Gensymbolen als CSV-Datei zur nachgelagerten Anreicherungsanalyse.

2. Screening der wichtigen Wirkstoffe und Zielproteine

1. Aufbau von Compound-Target-Netzwerken
   1. Laden Sie die sich schneidende Genliste aus Schritt 1.2.7 und die LYXT-Liste der aktiven Komponenten-Zielgene aus Schritt 1.1.4 in die R-Umgebung und führen Sie dann eine Vergleichsanalyse durch, um Verbindungen zu identifizieren, die sowohl mit den Zielgenen als auch mit den sich schneidenden Genen assoziiert sind.
   2. Importieren Sie die Verbindungen zwischen Verbindungen und Zielgruppen in Cytoscape Version 3.8.1 und erstellen Sie das Netzwerkdiagramm "LYXT-Fever and Cough-Target", um die Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und ihren zugehörigen Zielen zu visualisieren.
2. Datenerfassung von Protein-Protein-Interaktionsdaten
   1. Importieren Sie die Gen-ID-Datei für die Schnittmenge von LYXT-Aktivstoffzielen und Fieber- und Hustenzielen, die in Schritt 2.1.1 erhalten wurden, in die STRING-Datenbank bei https://stringdb.org/, wählen Sie Homo sapiens als Art und mehrere Proteine als Datenverarbeitungsmethode aus.
   2. Filtern Sie die Protein-Protein-Interaktionen, indem Sie die Konfidenzschwelle auf ≥ 0,90 setzen und Proteine mit sehr geringer Korrelation isolieren, und erstellen Sie dann eine TSV-Datei mit den gefilterten Interaktionsdaten für die nachgelagerte Analyse.
3. Bestätigung der Schnittschnittanalyse
   1. Verwenden Sie die R-Sprache, um die Schnittmenge zwischen den Zielproteinen der Wirkstoffe und den Zielproteinen Fieber und Husten zu analysieren und so den in Schritt 1.2.7 identifizierten überlappenden Genset zu bestätigen.
   2. Bereiten Sie diesen bestätigten überlappenden Gensatz für die anschließende Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) vor.

3. Screening der wichtigsten Zielproteine

1. PPI-Netzwerkvisualisierung
   1. Importiere die gefilterten Interaktionsdaten aus Schritt 2.2.2 in Cytoscape Version 3.8.1 und verwende das Netzwerkvisualisierungstool, um das PPI-Netzwerkdiagramm zu zeichnen.
   2. Installieren und öffnen Sie das CytoNCA-Plugin innerhalb von Cytoscape und verwenden Sie dieses Plugin, um topologische Analysen durchzuführen, indem für jeden Knoten im Netzwerk folgende Parameter berechnet werden: Gradzentralität (DC), Zwischenzentralität (BC), Nähezentralität (CC), Eigenvektorzentralität (EC), Netzwerkzentralität (NC) und lokale Durchschnittskonnektivität (LAC).
2. Identifikation von Schlüssel-Zielproteinen mittels medianenbasiertem Screening
   1. Exportieren Sie die berechnete topologische Parametertabelle aus CytoNCA als CSV-Datei, die alle Knotenkennungen sowie deren entsprechende DC-, BC-, CC-, EC-, NC- und LAC-Werte enthält.
   2. Berechnen Sie den Medianwert für die Gradzentralität (DC) über alle Knoten im Netzwerk hinweg und identifizieren Sie alle Knoten mit einem DC, der größer als das Doppelte des Medianwerts ist.
   3. Berechnen Sie die Medianwerte für Nähezentralität (CC) und Zwischenzentralität (BC) über alle Knoten im Netzwerk hinweg und behalten Sie dann aus den in Schritt 3.2.2 identifizierten Knoten nur jene Knoten, die gleichzeitig CC größer als den Medianwert und BC größer als den Medianwert erfüllen, nach dem von Kibble et ^al.9 beschriebenen Screening-Ansatz.
3. Finale Schlüssel-Ziel-Kompilierung
   1. Kompiliere die Bekennungen der erhaltenen Knoten aus Schritt 3.2.3 in eine Liste der wichtigsten Zielproteine und exportiere diese Liste als CSV-Datei.
   2. Wenden Sie diese medianbasierte Screening-Regel (DC größer als das Doppelte des Medians, CC größer als der Median und BC größer als der Median) als alleiniges Kriterium für die Identifikation der Schlüsselziele im gesamten Manuskript an und gewährleisten Sie die Konsistenz mit dem einheitlichen Screening-Ansatz im Protokoll.

4. GO-Anreicherungsanalyse und KEGG-Signalweganalyse

1. Funktionale Anreicherungsanalyse mit der DAVID-Datenbank
   1. Nach der von Tanabe et ^al.10 beschriebenen Methode wird die sich schneidende Genliste aus Schritt 1.3.4 im Gensymbolformat in die DAVID-Datenbank https://david.ncifcrf.gov/ hochgeladen, die Art auf Homo sapiens gesetzt und der Listentyp auf Gensymbol gesetzt.
   2. Führen Sie eine GO-Anreicherungsanalyse durch, indem Sie GOTERM_BP_DIRECT für biologische Prozesse, GOTERM_CC_DIRECT für zelluläre Komponenten und GOTERM_MF_DIRECT für molekulare Funktion auswählen, und führen Sie die KEGG-Anreicherungsanalyse durch KEGG_PATHWAY durch.
   3. Setzen Sie die Signifikanzschwelle auf p < 0,05 und wenden Sie die Benjamini-Hochberg-Korrektur für False Discovery Rate (FDR) für mehrfache Tests an, dann laden Sie die Anreicherungsergebnisse als CSV-Dateien herunter, die Begriffsnamen, Genzählungen, p-Werte, FDR-angepasste p-Werte und zugehörige Gene enthalten.
2. Bubble-Chart-Erstellung mit der OmicShare-Cloud-Plattform
   1. Importiere die GO-Anreicherungsergebnisse aus Schritt 4.1.3 in die OmicShare-Cloud-Plattform https://www.omicshare.com/tools und wähle das GO-Blasendiagramm-Tool aus.
   2. Laden Sie die Ergebnisdatei mit Begriffsnamen, Genzählungen und p-Werten hoch und konfigurieren Sie das Tool dann, um die 20 wichtigsten Begriffe mit den niedrigsten p-Werten anzuzeigen.
   3. Stellen Sie die x-Achse ein, um das Anreicherungsverhältnis darzustellen, die y-Achse, um die GO-Terme aufzulisten, die Blasengröße, um die Genanzahl darzustellen, und die Blasenfarbe, um den p-Wert darzustellen.
   4. Erstellen Sie das Blasendiagramm und laden Sie es als hochauflösende Bilddatei herunter.
3. KEGG-Signalwegvisualisierung mit KEGG Mapper
   1. Sortiere die KEGG-Pfadanreicherungsergebnisse nach p-Wert in aufsteigender Reihenfolge und wähle die 20 wichtigsten Pfade mit den kleinsten p-Werten aus.
   2. Für jeden ausgewählten Pfad greifen Sie https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html auf die KEGG-Datenbank zu, um das Pfaddiagramm zu erhalten.
   3. Identifizieren Sie die Zielproteine aus der sich schneidenden Genliste, die in jedem Signalweg vorhanden sind, indem Sie mit den Signalweg-Gensätzen aus den Anreicherungsergebnissen abgleichen.
   4. Greifen Sie auf das KEGG-Mapper-Tool https://www.kegg.jp/kegg/mapper/ zu, wählen Sie die Funktion Farbpfad, geben Sie die Liste der sich schneidenden Gensymbole und die KEGG-Signalwegkennung ein und erstellen Sie ein farbcodiertes Signalwegdiagramm, bei dem die identifizierten Zielproteine rot markiert sind.
   5. Kompiliere alle Ausgaben der Anreicherungsanalyse, einschließlich der GO-Anreicherungs-CSV-Dateien für drei Kategorien, der KEGG-Pfad-Anreicherungs-CSV-Datei, des Blasendiagramms und der farbcodierten Pfaddiagramme für die 20 wichtigsten Pfade, und exportiere diese Dateien dann für die nachgeschaltete Analyse.

5. Verifikation des molekularen Andockens

1. Laden Sie die 3D-Strukturen wichtiger Proteine (wie CYP3A4 und POR, die als Schlüsselziele in der Netzwerkanalyse identifiziert wurden) aus der RCSB-PDB-Datenbank https://www.rcsb.org/ herunter, wählen Sie Strukturen mit Auflösung ≤ 2,5 Å aus Homo sapiens, die einen kokristallisierten Liganden enthalten, um die aktive Stelle zu definieren, und laden Sie die Strukturdateien der aktiven Verbindungen herunter (einschließlich Beta-Carotin, Spathulenol und Beta-Sitosterol) aus der PubChem-Datenbank im SDF-Format.
2. Bereite die Proteinstrukturen mit AutoDockTools vor, indem Wassermoleküle und der kokristallisierte Liganden entfernt werden, polare Wasserstoffe hinzugefügt und Gasteiger-Ladungen zugewiesen werden, dann werden die vorbereiteten Proteine im PDBQT-Format gespeichert, die Verbindungen SDF-Dateien mit Open Babel in das PDB-Format umgewandelt, rotierbare Bindungen für jeden Liganden in AutoDockTools erkannt und die Liganden im PDBQT-Format gespeichert.
3. Definieren Sie die Andockgitterbox mit den Maßen 60 × 60 × 60 Å zentriert auf den Koordinaten der Bindungsstelle des kokristallisierten Liganden, führen Sie dann das molekulare Andocken mit AutoDock Vina mit der Exhaustivität auf 8 und num_modes auf 10 durch, um für jedes Liganden-Protein-Paar 10 Bindungsposen zu erzeugen.
4. Importieren Sie die resultierenden Andockdateien und deren entsprechende Zieldateien in PyMOL, identifizieren und speichern Sie das Andockmodell mit der niedrigsten Bindungsenergie (am meisten negativen Wert) als repräsentative Pose.
5. Dann reichen Sie dieses Modell bei https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ der PLIP-Datenbank ein, um die Wechselwirkungen zwischen den kleinen Molekülen und Proteinen zu analysieren, einschließlich Wasserstoffbrücken, hydrophober Wechselwirkungen, π-Stacking und Salzbrücken.
6. Berechnen und kompilieren Sie die Bindungsenergien aller aktiven Komponenten in LYXT mit den Zielproteinen, die mit Fieber und Husten assoziiert sind, und erstellen Sie anschließend eine Zusammenfassungstabelle mit Verbindungsnamen, Zielproteinen, Bindungsenergien (kcal/mol) und wichtigsten Interaktionstypen zur Darstellung im Ergebnisabschnitt.
   HINWEIS: Das R-Rezept, das für die Analyse der Netzwerkpharmakologie verwendet wird, ist in Supplementary File 1 verfügbar.

6. Tierversuche

1. Experimentelle Zeitleiste
   1. Gewöhnen Sie die Tiere für eine Woche, führen Sie dann LPS oder Kochsalzlösung am Tag 0 durch, führen Sie täglich von Tag 7 bis Tag 20 für zwei Wochen Medikamente durch und führen am Tag 21 eine Euthanasie mit Probenentnahme durch.
2. Tierbeschaffung und -gruppierung
   1. Kaufe 60 erwachsene männliche C57BL/6 Mäuse mit einem Gewicht von 25 ±± 4 g, füttere die Mäuse eine Woche lang und teile sie dann zufällig in eine normale Kochsalzlösungsgruppe (6 Mäuse) und eine LPS-verletzte Gruppe (54 Mäuse) auf.
   2. Am Tag 7 vor Behandlungsbeginn wird die LPS-Verletzte Gruppe zufällig in sieben Untergruppen mit jeweils 6 Mäusen unterteilt: Modellgruppe, positive Gruppe (Dexamethason, 50 mg·^kg-1·^d-1), LYXT-Behandlungsgruppe (200 mg·^kg-1·^d-1), Beta-Carotin-Gruppe (50 mg·^kg-1·^d-1), Spathulenol-Gruppe (50 mg·^kg-1·^d-1), und der Beta-Sitosterolgruppe (50 mg·^kg-1·^D-1).
      HINWEIS: Behandlungsabgabe und Ergebnisbewertungen waren blind.
3. Modell der LPS-induzierten Lungenentzündung
   1. Geben Sie 2 % Pentobarbitalnatrium per intraperitonealer Injektion in einer Dosis von 60 mg/kg zur Anästhesie. Bestätigen Sie eine moderate Tiefe der Anästhesie durch das Ausbleiben einer Tail-Pinch-Reaktion. Schließlich berechnen Sie anhand des aufgezeichneten Körpergewichts das erforderliche Injektionsvolumen von LPS bei einer Konzentration von 10 mg/mL.
   2. Bereiten Sie die Nasenverabreichung vor, indem Sie das genau berechnete Volumen der LPS-Lösung in die Pipette ziehen. Halten Sie die Maus fest, indem Sie mit der rechten Hand die Basis ihres Schwanzes greifen und mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand den Kopf sanft an den Ohren festhalten.
   3. Spülen Sie die Flüssigkeit langsam aus, bis sich an der Pipettenspitze ein kleiner Tropfen (etwa 2 μL) bildet. Führe den Tropfen vorsichtig nahe an das rechte Nasenloch der Maus, bis er Kontakt hat. Sofort und zügig heben Sie die linke Hand um 30–40 cm nach oben und bringen Sie sie dann vorsichtig und die Maus wieder in die Ausgangsposition.
      HINWEIS: Es ist notwendig, auf die Nasenlöcher der Maus zu achten, um den Aufwärtszustand aufrechtzuerhalten.
   4. Verwenden Sie die gleiche Methode, um kleine Flüssigkeitstropfen in das linke Nasenloch der Maus zu geben und sie nacheinander in das linke und rechte Nasenloch zu geben, bis die Flüssigkeitsinfusion abgeschlossen ist.
   5. Dann lass die Maus los, fixiere die Maus mit Klebeband auf dem Mausboard und halte die Position mit dem Bauch nach oben und dem Kopf nach oben für mehr als 4 Stunden. Nachdem die Maus aufgewacht ist, wird sie zur Beobachtung zurück in den Käfig gesetzt, nach der von Lorenz et ^al.11 beschriebenen Methode.
4. Bronchoalveolare Lavage-Flüssigkeitssammlung
   1. Die LPS-verletzten Mäuse werden zufällig in sieben Gruppen unterteilt: negative Kontrollgruppe, Modellgruppe, positive Gruppe (Dexamethason, 50 ^mg.kg-1.d-1), LYXT-Behandlungsgruppe (200 ^mg.kg-1.d-1), Beta-Carotin-Gruppe (50 ^{mg.kg-1.d-1),} Spathulenol-Gruppe (50 ^mg.kg-1.d-1) und Beta-Sitosterol-Gruppe (50 ^{mg.kg-1.d-1),} mit jeweils sechs Mäusen in jeder Gruppe.
      HINWEIS: Bereiten Sie LYXT wie folgt zu: Mischen Sie Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. und Zingiber officinale Roscoe-Pulver in einem Massenverhältnis von 5:3:2.  Mische das Pulver mit Wasser bei 1:30 (g/mL) und Reflux bei 80 °C für 2 Stunden. Filtern und konzentrieren Sie die Lösung (30 °C, 0,01–0,08 MPa) und lösen Sie sie in Wasser, um eine 2 g/mL Lösung herzustellen. Beta-Carotin, Beta-Sitosterol und Spathulenol wurden als Referenzstandards für die experimentelle Validierung verwendet. Verabreichen Sie die Medikamente jeder Gruppe einmal täglich für zwei Wochen, beginnend eine Woche nach der LPS-Behandlung. Euthanasie die Tiere durch eine Überdosis Thiopental (100 mg/kg), so Jin et ^al.12.
   2. Intubieren Sie den Ventrikel mit einer Kanüle Nr. 23. Anschließend wird langsam 10 ml PBS unter einem Druck von 25 cm H₂O in das Lungengewebe injiziert und diese Lavage etwa 6 Mal wiederholt, um bronchoalveolare Lavage-Flüssigkeit (BALF) zu erhalten, nach der von Pinheiro et ^al.13 beschriebenen Methode.
5. Leukozyten- und Zytokinanalyse in BALF und Serum
   1. Zentrifugieren Sie das gesammelte BALF bei 500 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Das Zellpellet in 1 ml PBS neu suspendieren, 1:10 mit Trypanblau verdünnen und die Gesamtzahl der Leukozyten mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop mit 400× Vergrößerung zählen.
   2. Nehmen Sie die BALF-Überlagerungs- und Serumproben von der Herzpunktion ab.
   3. Messung der TNF-α-, IL-1β- und IL-18-Konzentrationen mit kommerziellen ELISA-Bausätzen gemäß den Anweisungen des Herstellers, messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser und berechnen Sie die Konzentrationen aus Standardkurven. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in BALF mit dem BCA-Test.
6. Validierung aktiver Komponenten durch HE- und WB-Analyse
   1. Um aktive Bestandteile zu identifizieren, die zur LYXT-Wirksamkeit beitragen, wird das LPS-induzierte Lungenentzündungsmodell nach Abschnitt 6.3 neu etabliert.
   2. Kaufen Sie 60 Mäuse, akklimatisieren Sie sich für eine Woche und teilen Sie sie zufällig in fünf Gruppen (n = 12 je): Modellgruppe, LYXT-Gruppe (200 mg·^kg-1·^d-1), Beta-Carotin-Gruppe (50 mg·^kg-1·^d-1), Spathulenol-Gruppe (50 mg·^kg-1·^d-1) und Kombinationsgruppe (jeweils 25 mg·^kg-1·^d-1 ).
   3. Führen Sie LPS am Tag 0 und Behandlungen von Tag 7 bis Tag 20 wie in Schritt 6.3 beschrieben durch. Am 21. Tag sammeln Sie Lungengewebe¹⁴.
7. Histologische Analyse
   1. Fixieren Sie den linken oberen Lungenlappen in 4 % Paraformaldehyd für 24 Stunden, legen Sie Paraffin ein, schneiden Sie 5 μm-Abschnitte ab und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE) durch.
   2. Untersuchen Sie Schnitte unter einem Lichtmikroskop mit einer Vergrößerung von 200× und 400×, um die Infiltration von entzündlichen Zellen und die Verdickung der Alveolarwand zu bewerten. Machen Sie repräsentative Bilder.
8. Western-Blot-Analyse
   1. Homogenisierung des Lungengewebes im Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Puffer mit Protease- und Phosphataseinhibitoren. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bicinconinsäure-(BCA)-Test.
   2. Füllen Sie 30 μg Protein pro Bohrloch auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Gele, übertragen Sie sie auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen und blockieren Sie mit 5 % fettfreier Milch.
   3. Inkubieren Sie über Nacht mit primären Antikörpern gegen p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 und β-Actin bei 4 °C, anschließend mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern.
      HINWEIS: Die Verdünnung der Antikörper ist in der Materialtabelle angegeben.
   4. Visualisieren Sie Bänder mit ECL-Substrat, nehmen Sie Bilder auf und quantifizieren Sie Intensitäten mit ImageJ. Normalisiere die Expression des Zielproteins auf β-Actin oder Gesamtp38.

Ergebnisse

Die TCMSP-Datenbank wurde verwendet, um 409 aktive LYXT-Inhaltsstoffe zu sammeln. Davon stammen 58 Inhaltsstoffe von Verbena officinalis L., 86 von Semen Pharbitidis und 265 Wirkstoffe von Zingiber officinale Roscoe. Sechsundzwanzig wichtige Wirkstoffe wurden gemäß dem Index untersucht: OB ≥ 30,1 % und DL ≥ 0,12 für Verbena officinalis L., OB ≥ 60 % und DL ≥ 0,13 für Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93 % und DL ≥ 0,50 für Semen Pharbitidis (...

Diskussion

Dieses Papier identifizierte erfolgreich 26 Wirkstoffe und 207 potenzielle Ziele von LYXT, einem traditionellen Dong-Medikament-Decoction, der bei Fieber und Husten verwendet wird. Wichtige Erkenntnisse umfassen die Identifizierung von CYP3A4 als kritisches Zielprotein durch Netzwerktopologieanalyse sowie die experimentelle Validierung von LYXT, Beta-Carotin und Spathulenol als aktive Verbindungen mit signifikanten entzündungshemmenden Effekten in einem LPS-induzierten Lungenentzündungsm...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, China	27095-1-AP	Kaninchen polyklonal, 1:500
Anti-IL-1β	Proteintech, Wuhan, China	66737-1-Ig	Maus-Monoklona, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, China	14064-1-AP	Kaninchenpolyklonal, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, China	28796-1-AP	Kaninchenpolyklonal, 1:1000
Anti-TNF-Α	Proteintech, Wuhan, China	80258-6-RR	Kaninchen monoklonal, 1:500
Anti-β-Actin	Proteintech, Wuhan, China	66009-1-Ig	Maus monoklonal, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Version 1.5.6	Molekulare Andocksoftware
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Version 1.5.6	Molekular-Andockvorbereitungswerkzeug
BCA-Protein-Assay-Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225	Zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Beta-Carotin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Hochreinheit Standard, >95 %
Beta-Sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Hochreinheit Standard, >95 %
C57BL/6 Mäuse	Medical Animal Center der Lanzhou University 	-	Erwachsener männlich, 25 Jahre alt; 4 g
Zytoscape	https://cytoscape.org/	Version 3.8.1	Netzwerkvisualisierungs- und Analysesoftware
Dexamethason	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D4902	Positive Kontrolle
ECL-Substrat	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	WBKLS0500	Für die Western-Blot-Erkennung
ELISA-Bausätze
GraphPad-Prisma	https://www.graphpad.com/	Version 8.0 oder höher	Software für statistische Analysen und Grafiken
Hämatoxylin und Eosin (H& E) Fleckenset	Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Peking, China	G1120	Bei Lungengewebefärbungen
Histologie
HRP-konjugierte Antimaus	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7G	Sekundärer Antikörper, 1:5000
HRP-konjugiertes Antikaninchen	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-7H	Sekundärer Antikörper, 1:5000
IL-18 ELISA-Kit	Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Peking, China	SEKH-0016	Zur Messung von IL-18 in BALF und Serum
IL-1β ELISA-Trikot	Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Peking, China	SEKM-0004	Zur Messung von IL-1 & Beta; in BALF und Serum
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Version 1.53	Bildanalyse-Software
Lipopolysaccharid (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630	From  Escherichia coli  O111:B4
LYXT Rohstoffe	Huaihua-Universität	-	Pulvermischung von  Pharbitis nil  (L.) Choisy,  Verbena officinalis L., und  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, w/w/w)
Weitere Materialien
Pentobarbitalnatrium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P3761	2%-Lösung für die Anästhesie
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Protein-Ligand-Interaktionsprofiler
PVDF-Membranen	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	IPVH00010	Für den Transfer des Westlichen Blotts
PyMOL	https://pymol.org/	Version 2.5	Molekulare Visualisierungssoftware
R	https://www.r-project.org/	Version 4.0 oder höher	Statistische Berechnungs- und Grafiksoftware
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N1205	Hochreinheit Standard, >95 %
STRING	https://stringdb.org/	-	Suchwerkzeug zur Abrufung interagierender Gene/Proteine
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Pharmakologie-Datenbank für traditionelle chinesische Medizin
Thiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T102	Für Euthanasie
TNF-α ELISA-Trikot	Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Peking, China	SEKM-0034	Zur Messung von TNF-& Alpha; in BALF und Serum
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Datenbank für Proteinsequenzen und Annotationen