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Methodenartikel

Seneszenz assoziiert mit Neurodegeneration: Gleichzeitige Beurteilung der β-gal-Aktivität und Nissl-Färbung in histologischen Bereichen des Nagerhirns

107 Ansichten

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DOI:

10.3791/70676

⸱

17. Juli 2026

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wird als Werkzeug präsentiert, um seneszenzassoziierte β-Galaktosidase-Aktivität zu erkennen, eine Nissl-Färbung zur gleichzeitigen Bewertung von Seneszenz und neuronaler Integrität durchzuführen sowie Zusammenhänge zwischen Senezenzbelastung und Neurodegeneration zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die zelluläre Seneszenz ist ein physiologischer Prozess, der durch einen irreversiblen Zellzyklusstopp gekennzeichnet ist, der die Geweberegeneration und -funktion beeinträchtigt. Dieses Phänomen hat sich als Haupttreiber der Neurodegeneration etabliert, befeuert durch die Ansammlung von seneszenten Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS). Seneszente Zellen erwerben einen pro-inflammatorisken, senescenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP), der chronische Neuroinflammation erhält und die neuronale Mikroumgebung stört. Folglich sind wesentliche Prozesse wie Neurogenese, synaptische Plastizität und neuronales Überleben beeinträchtigt. Eine umfangreiche Literatur verbindet zelluläre Senezenz mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer oder Multipler Sklerose sowie akuten neuronalen Schäden wie zerebraler Ischämie oder traumatischer Hirnverletzung.

Die kombinierte Bewertung der seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität und Nissl-Färbung in histologischen Schnitten bietet einen umfassenden Ansatz, um zelluläre Seneszenz und neuronale Integrität gleichzeitig im selben Gewebekontext zu bewerten. Diese Strategie ermöglicht eine präzise räumliche Korrelation zwischen der Ansammlung von seneszenten Zellen in spezifischen verletzlichen Bereichen (z. B. Hippocampus oder Kortex) und neuronalem Verlust oder Gewebeschädigen. Durch die Integration eines funktionellen Markers der Seneszenz mit einem klassischen Indikator für neuronale Morphologie und Dichte stärkt dieser Ansatz die interpretative Robustheit der Analyse. Darüber hinaus ermöglicht es eine genauere Charakterisierung des Zusammenhangs zwischen seneszenter Belastung und neurodegenerativen Veränderungen und maximiert so die Informationen aus begrenzten Gewebeproben.

Darüber hinaus kann dieses Protokoll bestimmen, wie die seneszente Zellakkumulation als Reaktion auf Interventionen (pharmakologische, genetische Manipulation usw.) in Nagetiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen stattfindet, und so ein kraftvolles Werkzeug zur Analyse dieses Beitrags zur Pathophysiologie bietet.

Einleitung

Die zelluläre Seneszenz ist definiert durch einen im Wesentlichen irreversiblen Stillstand des Zellzyklus, begleitet von umfangreichen makromolekularen Veränderungen1. Darüber hinaus erhalten seneszente Zellen einen hypersekretorischen Phänotyp (SASP), der durch die robuste Sekretion einer Vielzahl proinflammatorischer Zytokine, Wachstumsfaktoren undProteasen gekennzeichnet ist. Zusammen tragen diese Faktoren zur Schaffung eines pro-inflammatorisken Mikroumfelds bei, das die Alterung verstärkt und die Gewebehomöostase beeinflusst. Im zentralen ZNS sammeln sich seneszente Zellen mit dem Alter zunehmend an, insbesondere in Regionen, die anfällig für altersbedingte Pathologiensind. Die zelluläre Seneszenz spielt eine bedeutende Rolle bei den funktionellen Veränderungen im Zusammenhang mit Alterung und neurodegenerativen Erkrankungen, wobei die Belastung der seneszenten Zellen während des normalen Alterns schrittweise zunimmt. Mehrere Zelltypen im ZNS sind anfällig für Seneszenz, darunter Astrozyten, Mikroglia, Oligodendrozyten, Neuronen und neuronale Stammzellen4. Zunehmende Evidenz weist auf die Alterung dieser ZNS-Zellpopulationen in die Ätiopathologie mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen hin, darunter Alzheimer, Parkinson, frontotemporale Demenz, amyotrophe Lateralsklerose und Multiple Sklerose5. Neurodegenerative Erkrankungen wurden mit zellulärer Seneszenz6 in Verbindung gebracht, und es wurde gezeigt, dass sich seneszente Zellen in der Nähe von Amyloid-β-Plaques und neurofibrillären Knoten ansammeln. Altersbedingte Zunahmen der SA-β-gal-Aktivität wurden in Nagetierhirnen beschrieben (z. B. 3, 8, 17 und 24 Monate), wobei statistisch signifikante Erhöhungen am deutlichsten in der ältesten Kohorte (24 Monate)7 sichtbar sind.

Verschiedene Studien liefern wichtige Einblicke in die Beziehung zwischen histologischen Veränderungen und funktionellen Ergebnissen, wie kognitiven Beeinträchtigungen und metabolischer Dysregulation, in pathologischen Tiermodellen, die die funktionellen oder verhaltensbedingten Korrelate von Hirnverletzungen untersuchen 8,9.

Trotz umfangreicher Forschung gibt es keinen einzigen universellen Marker, der seneszente Zellen zuverlässig identifiziert und sie von anderen nicht-proliferativen Zuständen unterscheidet; der am weitesten verbreitete Marker der zellulären Senezenz ist jedoch das lysosomale Enzym seneszenzassoziiert β-Galactosidase (SA-β-gal), das bei pH 6 nachgewiesen wird, einem Hydrolaseenzym, das die Hydrolyse von β-Galaktosiden zu Monosacchariden katalysiert. Ein entscheidender Unterscheidungsfaktor ist der pH-Wert. SA-β-gal zeigt optimale Aktivität bei pH 6, im Gegensatz zu bakteriellen β-Galaktosidase, die bei pH 7,4 wirkt, und endogener lysosomaler β-Galaktosidase, die bei sauren pH-Werten von 3 bis 57,10 wirkt.

Zelldichte und Gehirnzytoarchitektur sind grundlegende Determinanten für neuronale Organisation und Funktion. Die räumliche Verteilung und Häufigkeit spezifischer Zellpopulationen sind entscheidend für die Schaltungsfunktion, und ihre genaue Quantifizierung ist unerlässlich, um neuropathologische Zustände mit selektiver zellulärer Verwundbarkeit oder -verlust zu untersuchen. Die Nissl-Färbung, eine Standardmethode in der Neurowissenschaft, ist eine weit verbreitete histologische Methode zur Bestimmung der neuronalen Dichte und Zytoarchitektur im Nervengewebe. Durch die selektive Beschriftung von Nissl-Körpern innerhalb neuronaler Somata ermöglicht diese Methode eine zuverlässige Visualisierung und Quantifizierung neuronaler Populationen über Hirnregionen11. Neben ihrer Robustheit zeichnet sich die Nissl-Färbung durch ihre technische Einfachheit, niedrige Kosten und relativ kurze Bearbeitungszeit aus, was sie zu einem praktischen und zugänglichen Werkzeug für routinemäßige neuroanatomische und neurodegenerationsbezogene Untersuchungen macht.

Die kombinierte Bewertung von Nissl-Färbung und seneszenzassoziierter β-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität innerhalb desselben histologischen Abschnitts bietet einen robusten, räumlich aufgelösten Rahmen zur gleichzeitigen Untersuchung neuronaler Integrität und seneszenter Zelllast. Dieser integrative Ansatz ermöglicht die direkte Abbildung der Seneszenz auf regionsspezifische neurodegenerative Merkmale, einschließlich neuronalem Verlust und zytoarchitektonischer Störung. Die Verbindung eines klassischen strukturellen Markers mit einem funktionellen Indikator der Seneszenz stärkt die Dateninterpretation und zeigt mechanistische Verbindungen zwischen seneszenter Zellansammlung und Gewebedysfunktion auf, während die analytische Ausbeute aus begrenzten Proben maximiert wird.

Wichtig ist, dass sich diese Strategie besonders gut für Studien mit begrenzter Gewebeverfügbarkeit, longitudinale oder interventionelle Designs (z. B. senolytische oder senomorphe Behandlungen) sowie regionsspezifische Analysen in komplexen zerebralen Strukturen eignet, bei denen die Korrelation von Seneszenz mit neuronaler Verwundbarkeit entscheidend ist.

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Protokoll

Führen Sie alle Tierverfahren gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durch und holen Sie eine vorherige Genehmigung des zuständigen Ethikausschusses ein. Dieses Protokoll entspricht dem aktuellen mexikanischen offiziellen Standard für die Pflege und Nutzung von Labortieren (NOM-062-ZOO-1999 (Muñoz, 2001)), einer vorherigen Überarbeitung und Genehmigung durch die Ethik- und Forschungsausschüsse sowie den institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (CICUAL) der Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). Die Tiere wurden vom Vivarium der Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, geliefert.

HINWEIS: Um die gleichzeitige Beurteilung der seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität und Nissl-Färbung im Nagetierhirngewebe zu ermöglichen, verwendet dieses Protokoll 4 % paraformaldehydfixierte Nagehirn, die bei -20 ± 1 °C kryosektioniert werden. Alle Abschnitte werden zunächst auf SA-β-gal-Aktivität geprüft (Schritt 1), dann Nissl-gebeizt (Schritt 2) und anschließend mit einem Antifade-Montagemedium montiert (Schritt 3). Nach der Verarbeitung werden die Objektträger unter einem hellfeldigen optischen Mikroskop untersucht, wodurch hochauflösende Bilder der interessanten Bereiche für weitere Analyse aufgenommen werden können.

1. Vorbereitung von Gewebeschnitten und Nachweis der seneszenzassoziierten β-Galaktosidase-(SA-β-gal) Aktivität

  1. Vorbereitung von Gehirnschnitten
    1. Erhalte die Gehirne durch transkardiale Perfusion mit Paraformaldehyd bei 4 % gemäß dem zuvor von Wu et al., 2021 beschriebenen Protokoll. Überführen Sie das Gehirn in eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,01 % Natriumazid zur langfristigen Speicherung bei 4 °C.
    2. Um mit dem Protokoll fortzufahren, geben Sie das Gehirn in eine 30%ige Sucharoselösung, warten Sie, bis es auf den Boden sinkt, und lagern es dann bei -20 bis -80 °C. Dieses Protokoll kann in verschiedenen Nagetierhirngeweben (z. B. Ratte, Maus, Meerschweinchen) angewendet und in 2-Methylbutan eingefroren werden.
    3. Kryoschnitt des Gewebes bei -20 ± 1 °C, um einheitliche Schnitte in optimaler Schneidetemperatur (O.C.T.) Compound (20–40 μm Dicke) einzubetten und auf gelatinebeschichteten Glasobjektträgern zu montieren.
    4. Befestige Abschnitte auf Glasrutschen und lagere sie unter kalten Bedingungen bis zur Benutzung.
  2. Nachweis von seneszenzassoziierter β-Galaktosidase (SA-β-gal) Aktivität.
    1. Bereiten Sie die SA-β-gal Färbelösung frisch am Tag der Anwendung aus den in Tabelle 1 gezeigten Lösungen vor.
    2. Stellen Sie die Lösung auf pH 6,0 an, um die Spezifität der SA-β-gal-Aktivität sicherzustellen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die SA-β-gal Färbelösung vor der Verwendung vor; Vermeiden Sie das Vormischen in einer wässrigen Lösung.
      5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) ist in wässriger Lösung nicht stabil.
  3. Gleiche die Temperatur von Gewebeobjekten aus.
    1. Entferne die Objektträger aus dem Kühlraum.
    2. Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas und lassen Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
    3. Befeuchte die Abschnitte, indem du genug PBS hinzufügst, um die Objektträger im Coplin-Glas zu bedecken.
    4. Platzieren Sie die Rutschen für 5 Minuten auf einen Orbitalshaker mit niedriger Geschwindigkeit bei RT.
    5. Wiederhole die Wäsche einmal.
  4. Bereite die Objektträger zum Färben vor.
    1. Entfernen Sie das überschüssige PBS vorsichtig von den Kanten des Objektträgers mit saugfähigem Papier.
    2. Ziehen Sie um jeden Abschnitt eine hydrophobe Barriere mit einem wasserabweisenden Barrierestift und vermeiden Sie den Kontakt mit dem Gewebe.
  5. Führen Sie SA-β-gal Färbung durch
    1. Platziere die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer.
    2. Mit einer Mikropipette wird pro Schnitt etwa 200 μL Färbelösung hinzugefügt, um eine vollständige Abdeckung des Gewebes sicherzustellen.
    3. Inkubiere bei 37 °C für 48 Stunden.
    4. Nach der Inkubation entferne die Flecklösung mit saugfähigem Papier.
    5. Platziere die Objektträger in ein Coplin-Glas, füge PBS hinzu, um die Objektträger zu bedecken, und gib eine sanfte Bewegung auf einem langsamen Orbitalshaker für 5 Minuten bei RT.
      ANMERKUNGEN: Verwenden Sie keinen CO₂-Inkubator. Fahren Sie sofort zum Nissl-Beizen.

2. Nissl-Flecken

  1. Bereite eine funktionierende Lösung für Nissl vor.
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen wie in Tabelle 2 beschrieben vor.
    2. Aus den Standardlösungen wird die Nissl-Arbeitslösung hergestellt, indem 15 ml Cresyl-Violett-Lösung mit 85 ml Acetatpuffer gemischt werden.
    3. Filtern Sie die Lösung, um Niederschläge mit Filterpapier zu entfernen (Grade 4, 20-25 μm Porengröße).
    4. Nach der Filterlösung vorwarmen Sie bei 37 °C mindestens 30 Minuten (bzw. 40–43 °C im Wasserbad).
    5. Gib unmittelbar vor der Anwendung 10 Tropfen 0,1 M Essigsäure in die Nissl-Arbeitslösung.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Nissl-Arbeitslösung bis zu viermal am selben Tag; Nicht über Nacht lagern.
    6. Bereiten Sie gesäuertes Ethanol vor, indem Sie 95 ml absolutes Ethanol in einen Volumenkolben geben und 15 Tropfen 0,1 M Essigsäure hinzufügen. Mit destilliertem Wasser auf 100 ml bringen und gründlich mischen.
  2. Konditioniere die Objektträger vor.
    1. Geben Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas, fügen Sie bei Bedarf PBS hinzu, um die Objektträger zu bedecken, und bebrüten Sie sie bei 37 °C für 5 Minuten.
  3. Beizabschnitte.
    1. Immerse gleitet vorsichtig in die vorgewärmte Nissl-Lösung, Slide für Dia.
    2. Inkubieren Sie die Objektträger 5–20 Minuten in Nissl-Lösung.
      HINWEIS: Die Zeit hängt von der Gewebedicke ab. Beobachte die Färbung alle 5 Minuten, bis eine tiefviolette Farbe erscheint.
  4. Wasche die Abschnitte.
    1. Spülen Sie die Objektträger vorsichtig 1 Minute lang in destilliertem Wasser ab. Auf die Objektträger im Coplin-Glas mit frischem destilliertem Wasser für weitere 1 Minuten übergeben.
    2. Bewerten Sie die Färbungsqualität. Beobachten Sie Objektträger unter einem Hellfeldmikroskop (10× Objektiv).
    3. Überprüfen Sie in einem Brightfield-Mikroskop eine intensive violette Punktfärbung mit minimalem Hintergrund.
      HINWEIS: Wenn der Hintergrund zu viel ist, tauchen Sie 10 Sekunden lang in gesäuertes 95%iges Ethanol ein.
    4. Sofort auf absolutes Ethanol für 10 Sekunden umsteigen, um die Differenzierung zu stoppen.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf erneut und wiederholen Sie die Färbungsschritte (8.1-9.3), wenn die Färbung schwach ist.
  5. Dehydrieren und die Objektträger entfernen.
    1. Immerse-Slides in Xylol für mindestens 5 Minuten (bis zu 2 Stunden bei Bedarf)
      HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, da das Gewebe innerhalb von ~2 Minuten austrocknet.

3. Montage

  1. Bereite das Montagemedium vor.
    1. Mische 8 ml Montagemedium mit 2 ml Xylen.
      HINWEIS: Bereiten Sie nur das erforderliche Volumen vor; Das Montagemedium härtet schnell aus.
    2. Entferne die Objektträger aus dem Xylol und tupfe die Ränder vorsichtig ab. Platzieren Sie die Rutschen auf einer ebenen Oberfläche.
    3. Trage ~120 μL des Montagemediums auf das Gewebe auf.
    4. Legen Sie den Deckdeckel langsam von einer Seite hinein, um Blasen zu vermeiden.
  2. Trockne die Folien und mache Bilder.
    1. Lass die Objektträger bei RT mindestens 5 Minuten trocknen.
    2. Beobachten Sie unter einem Hellfeldmikroskop und machen Sie Bilder von interessanten Gebieten.
    3. Nach der Montage erfordert das vollständige Trocknen des Montagemediums eine längere Zeit (24 Stunden).
  3. Bewahren Sie die Objektträger auf.
    1. Lagere die Folien bei RT für die langfristige Erhaltung (über viele Monate) auf.

4. Quantifizierung der Alterszeit

HINWEIS: Dieser Ansatz wird als qualitative Bewertung angewandt; wenn das Studiendesign dies jedoch verlangt, kann es auf quantitative Analysen ausgeweitet werden.

  1. Definieren Sie die Senezenzbelastung als die relative Häufigkeit von seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-gal)-positiven Zellen innerhalb eines definierten Interessensbereichs (ROI). Formulieren Sie diese Metrik als Prozentsatz positiver Zellen relativ zur Gesamtzellzahl oder als Dichte positiver Zellen pro Flächeneinheit (Zellen/mm2).
  2. Wählen Sie das Interessengebiet (ROI) aus. Identifizieren Sie ROIs anhand standardisierter neuroanatomischer Orientierungspunkte mithilfe eines für die Art und das Alter passende Gehirnatlas. Empfohlene Regionen umfassen hippocampale Unterfelder (CA1, CA3, dentate gyrus) und kortikale Bereiche mit definierter laminarer Organisation.
    1. Wählen Sie 3–5 nicht überlappende Felder pro ROI und Abschnitt aus.
    2. Analysieren Sie mindestens 2–3 Schnitte pro Tier, verteilt in gleichmäßigen anatomischen Abständen.
    3. Beibehalten Sie die identische ROI-Größe und -Form über alle Proben hinweg.
    4. Blenden Sie den Bediener während der ROI-Auswahl vor experimentellen Bedingungen und minimieren Sie die Verzerrung.
  3. Bilder aufnehmen.
    1. Aufnahmen Sie Bilder mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, unter standardisierten Bedingungen:
      1. Verwenden Sie konsistente Vergrößerungen (z. B. 10× für regionale Überblicke, 20× oder 40× für die Quantifizierung).
      2. Halten Sie bei allen Proben konstante Beleuchtung, Belichtungszeit und Weißabgleich aufrecht.
      3. Vermeiden Sie eine Sättigung des SA-β-gal-Signals (blau) und sorgen Sie für eine klare Sichtbarkeit der Nissl-Verfärbung (lila).
      4. Speichern Sie Bilder in einem verlustfreien Format (z. B. TIFF) für die nachgelagerte Analyse.
  4. Die Bilder vorbereiten.
    1. Vorverarbeitung mit Bildanalysesoftware durchführen (z. B. ImageJ/Fiji)13.
      1. Konvertiere Bilder bei Bedarf in das RGB-Format.
      2. Wenden Sie Hintergrundsubtraktion an, um ungleichmäßige Beleuchtung zu korrigieren.
      3. Normalisieren Sie den Kontrast gleichmäßig über alle Bilder hinweg, ohne die relative Signalintensität zu verändern.
      4. Vermeiden Sie Überverarbeitung, die die Signalgrenzen verzerren könnte.
  5. Identifizieren Sie SA-β-gal-positive Zellen.
    1. Positive Zellen werden anhand des Vorhandenseins eines bestimmten blauen Niederschlags definiert, der im Zytoplasma lokalisiert ist. Verwenden Sie Farbgrenzwerte, um das blaue Signal zu isolieren (z. B. empirisch bestimmte Farb-/Sättigungs-/Intensitätsbereiche).
    2. Validiere Schwellenwerte mit negativen Kontrollen (junges oder unbehandeltes Gewebe), um Hintergrundfärbungen auszuschließen.
  6. Morphologische Konsistenz mit zellulären Profilen bestätigen, die bei der Nissl-Färbung beobachtet wurden.
  7. Quantifizierungsansätze
    1. Zellbasierte Quantifizierung: Zählen Sie SA-β-gal-positive Zellen manuell oder mit halbautomatischen Werkzeugen. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit demselben ROI mittels Nissl-Färbung.
    2. Schnelle Ergebnisse wie folgt:
      Seneszenzlast (%) = (SA-β-gal-positive Zellen/Gesamtzellen) ' 100
    3. Dichtebasierte Quantifizierung: Berechnung der Anzahl der SA-β-gal–positiven Zellen pro Flächeneinheit:
      Zelldichte = Positive Zellen/ROI-Fläche (mm2)
    4. Schwellenwertdefinition und Kontrollen: Erkennen Sie Erkennungsschwellenwerte empirisch:
    5. Verwenden Sie negative Regler, um die Hintergrundsignalpegel zu definieren.
    6. Fügen Sie positive Kontrollen hinzu (z. B. gealtertes Gehirngewebe oder stressinduzierte Modelle), um die Sensitivität zu validieren.
    7. Wenden Sie identische Schwellenwerte auf alle Proben innerhalb eines Experiments an. Dokumentieren Sie alle Schwellenwerte, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

5. Datennormalisierung und statistische Analyse

  1. Normalisieren Sie die Senezenzlast, um regionale Unterschiede in der Zelldichte zu berücksichtigen; Verwenden Sie Nissl-Färbung, um die Gesamtzellzahl pro ROI zu schätzen – durchschnittliche Messungen über ROIs, Schnitte und Tiere. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneten Tests (z. B. t-Test, ANOVA) je nach experimenteller Gestaltung durch.
  2. Geben Sie Daten als Mittelwert ± SEM oder SD an, wobei die Anzahl der biologischen Replikate (n) angegeben wird.
  3. Blindierung und Reproduzierbarkeit: Führen Sie alle Quantifizierungsanalysen unter verblindeten Bedingungen durch. Validieren Sie die Reproduzierbarkeit durch: (a) unabhängige Analyse durch mindestens zwei Beobachter oder (b) Neuanalyse einer Teilmenge von Bildern zur Bewertung der Intra-Beobachter-Variabilität.
  4. Einschränkungen der Quantifizierungsstrategie: Quantitative Ergebnisse interpretieren, wo möglich, zusammen mit komplementären Markern. Darüber hinaus kann die Variabilität der Färbungsintensität zwischen den Schnitten die schwellenwerte Quantifizierung beeinflussen und sollte sorgfältig kontrolliert werden.

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Ergebnisse

Die kombinierte Anwendung von seneszenzassoziierter β-Galactosidase (SA-β-gal) Färbung und Nissl-Färbung ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung der seneszenten Zellbelastung und neuronaler Zytoarchitektur innerhalb desselben Hirnabschnitts.

Nach dem SA-β-gal Färbeverfahren (Schritt 1) untersuchen Sie die Objektträger unter einem Hellfeldmikroskop. Eine erfolgreiche Färbung wird durch das Vorhandensein eines deutlich blauen Niederschlags angezeigt, das in ...

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Diskussion

Derzeit bleibt die begrenzte Verfügbarkeit robuster, spezifischer Werkzeuge zur Identifizierung, Isolierung und selektiver Entfernung von seneszenten Zellen im ZNS ein großes Hindernis für mechanistische Studien. Diese methodische Lücke schränkt unsere Fähigkeit ein, die kausalen Beiträge der zellulären Seneszenz zur Neuropathologie von bloßer Korrelation mit dem Krankheitsverlauf zu trennen. Der hier vorgestellte Arbeitsablauf kombiniert SA-β-gal enzymatische Detektion mit Nissl-Gegenfä...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Programme Dirección General de Asuntos del Personal Académico, UNAM (PAPIIT IN224624) sowie von den Programmen Ciencia de Frontera, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) Ciencia de Frontera CBF-2025-I-1337 und dem UNAM Posdoctoral Program (POSDOC) unterstützt. RJRC erhielt Fellowship-Nummer 1020262 von der CONAHCyT. VSV erhielt ein Postdoktorandenstipendium vom Programa de Becas Postdoctorales, Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA), UNAM.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MethylbutaneSIGMAM32631-500ML
5-Bromo-4-chlor-3-indolyl β-D-Galactopyranosid (X-Gal)PROMEGAV394ABei -30 bis -10 °C lagern
Zitronensäure MERCK251275-5G
KresylviolettacetatSIGMAC5042-10G
DPX-Einbettungsmittel für die HistologieSIGMA06522-500ML
FilterpapierWhatmanWHA1001929
EisessigSIGMA695092-500ML
Hydrophober Stift MERCKZ672548
Histologisch reines XylolSIGMA534056-500ML
FeuchtigkeitskammerSTAINTRAY25501
Magnesiumchlorid wasserfreiSIGMAM8266-100GAnpassen der Molarität, falls hydratisiertes Magnesiumchlorid verwendet wird.
OCTSAKURA FINE TEK4583
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)SIGMAP4417-50TABKommerzielle Tabletten werden verwendet.
Kaliumferricyanid (Kaliumhexacyanoferrat(III))SIGMAP8131-100G
Kaliumferrocyanid (Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat)SIGMAP9387-100G
Natriumacetat wasserfreiSIGMAS2889-250GAnpassen der Molarität, falls hydratisiertes Natriumacetat verwendet wird.
NatriumchloridSIGMAS9888-2,5KG
Natriumphosphat (Natriumphosphat-Dihydrat)SIGMA71649-500G

Referenzen

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