Methodenartikel

Echtzeit-Bildgebung der Antwort auf wirtsinduzierten Stress in Aggregaten von Pseudomonas aeruginosa

173 Ansichten

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DOI:

10.3791/70682

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15. Mai 2026

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa-Aggregate zeigen eine erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika und Immunzellen. Die Rolle der Membranintegrität beim Überleben von Aggregaten ist derzeit wenig erforscht. Diese Studie demonstriert eine Methode zur Quantifizierung von Veränderungen in der Zellmembrandynamik innerhalb von P. aeruginosa-Aggregaten, um zu verstehen, wie die zelluläre Integrität die Gesamtwertigkeit der Aggregate beeinflussen kann.

Zusammenfassung

Chronische Infektionen wie die bei Mukoviszidose (CF) werden durch kleine, hochtolerante Pseudomonas aeruginosa-Aggregate aufrechterhalten, die trotz Immun- und therapeutischen Belastungen bestehen. Im Gegensatz zu klassischen Biofilmen stellen diese Aggregate eine eigenständige pathogene Einheit dar – mikroskopische, räumlich organisierte Gemeinschaften, die unter wirtsinduziertem Stress strukturelle Integrität und physiologische Homöostase erhalten. Die Mechanismen, die es ermöglichen, dass Aggregate unter diesen Bedingungen intakt bleiben, und ob diese homöostatischen Prozesse selektiv gestört werden können, sind jedoch weiterhin schlecht definiert. Ein zentrales Hindernis zur Schließung dieser Lücke war das Fehlen von Werkzeugen, die in Echtzeit die dynamischen, räumlich aufgelösten Prozesse erfassen können, die physiologischen Stress mit struktureller Stabilität und Zusammenbruch verknüpfen. Diese Studie präsentiert einen integrierten Bild- und Analyse-Workflow, um aggregierte Reaktionen auf wirtsrelevante Stressoren zu quantifizieren. Mit dem spannungsabhängigen Farbstoff DiBAC4(5) wurde die Membrandepolarisation als früher Indikator für physiologische Störungen in Aggregaten überwacht, die in synthetischem Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2) gebildet wurden. Die hochauflösende Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Aggregaten sowohl in stabilen als auch in stressbedingten Zuständen, während Bildsegmentierung und Voxel-basierte Analyse eine quantitative Abbildung der räumlichen Heterogenität in der Membranintegrität und der Aggregatzerlegung bei Einzelzellauflösung ermöglichen. Dieser Workflow schafft eine reproduzierbare und anpassungsfähige Plattform, um physiologischen Stress mit strukturellen Ergebnissen in mehrzelligen bakteriellen Aggregaten zu verknüpfen. Durch die quantitative Analyse der Prozesse, die die Aggregatintegrität erhalten – oder beeinträchtigen – ermöglichen, bietet dieser Ansatz eine entscheidende Grundlage zur Identifizierung und Zielsetzung der homöostatischen Mechanismen, die der aggregierten Resilienz zugrunde liegen, und fördert neue Strategien voran, um diesen klinisch signifikanten Modus der bakteriellen Persistenz zu stören.

Einleitung

Chronische bakterielle Infektionen werden oft nicht durch große, an der Oberfläche angeheftete Biofilme erhalten, sondern durch kleine, mehrzellige Aggregate, die sich in wirtsassoziierten Umgebungen bilden. Bei Mukoviszidose (CF) und anderen chronischen Atemwegserkrankungen existiert Pseudomonas aeruginosa meist als schwebende Aggregate, die in Schleim oder Sputum eingebettet sind, und nicht als klassische Biofilme, die an den Epitheloberflächen befestigt sind. Diese Aggregate repräsentieren einen eigenen Wachstumsmodus, der durch eine mikroskopische räumliche Organisation, ausgeprägte physiologische Heterogenität und außergewöhnliche Toleranz gegenüber immunen und antimikrobiellen Stressorengekennzeichnet ist: 1,2,3,4. Trotz ihrer klinischen Relevanz sind die Mechanismen, die die Aggregatstabilität steuern, die in diesem Protokoll als die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Membranintegrität und räumlichen Organisation unter solchen Belastungen definiert wird, weiterhin schlecht verstanden, wobei frühere Studien sich stärker auf Matrixkomponenten konzentrierten, die die Bildung von oberflächengebundenen Biofilmenunterstützen 5,6.

Ein großes Hindernis für die Untersuchung von Ereignissen, die zur Destabilisierung von Aggregaten beitragen, wie Veränderungen in der Membrandepolarisation und der Aggregatarchitektur, ist das Fehlen experimenteller Arbeitsabläufe, die dynamische physiologische und strukturelle Veränderungen in Echtzeit erfassen 7,8. Traditionelle Bulk-Assays und Endendbildgebungsmethoden können nicht klären, wie Stressreaktionen innerhalb von Aggregaten entstehen, wie diese Reaktionen räumlich verteilt sind oder wie physiologische Abschwächung wie Membrandepolarisation und Verlust der Ionenhomöostase zu frühen Anzeichen von zellulärem Stress und letztendlichem physischem Kollaps führt. Während konfokale Mikroskopie weit verbreitet auf oberflächengebundene Biofilme angewandt wurde, integrieren weniger Ansätze zeitaufgelöste Bildgebung mit quantitativer Analyse, die zelluläre Physiologie direkt mit der aggregierten Architektur und der Membranaktivität verknüpft.

Veränderungen des Potenzials der bakteriellen Membran liefern einen frühen und sensiblen Hinweis auf zellulären Stress und den Verlust der Homöostase. Spannungsempfindliche Farbstoffe wie Bis-(1,3-Dibutylbarbitursäure) Pentamethinoxonol (DiBAC4(5)) akkumulieren sich in depolarisierten Zellen und bieten eine zerstörungsfreie, fluoreszenzbasierte Anzeige der Membranintegrität. Obwohl DiBAC-Farbstoffe zur Beurteilung der Membrandepolarisation in planktonischen Kulturen und oberflächengebundenen Biofilmen 9,10 verwendet wurden, war ihre Anwendung auf mehrzellige Aggregate, insbesondere unter physiologisch relevanten Wachstumsbedingungen und Zeitrafferbildgebung, begrenzt.

Hier präsentieren wir einen integrierten Bildgebungs- und Analyse-Workflow, der eine Echtzeit-Visualisierung und Quantifizierung der Membrandepolarisation und des strukturellen Versagens in P. aeruginosa-Aggregaten ermöglicht. Aggregate werden in einem synthetischen Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2) gebildet, einem chemisch definierten Medium, das wichtige Nährstoff- und Ionenmerkmale der CF-Atemwege repapituliert und spontane Aggregatbildung ohne aufgesetzte Flächen oder Flussunterstützt. Unter diesen Bedingungen bildet P. aeruginosa suspendierte Aggregate von Größe und struktureller Heterogenität, vergleichbar mit denen, die in CF-Sputum- und Atemwegsproben beobachtet werden, und bietet eine physiologisch relevante Grundlage für die Untersuchung des Aggregatverhaltens13.

Mit Zeitraffer-konfokaler Laserscanningmikroskopie unter kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit erfasst dieser Workflow sowohl stabile Aggregatzustände als auch stressinduzierte Zustände, die durch erhöhte Membrandepolarisation und Verlust der zellulären Homöostase über längere Bildgebungsperioden gekennzeichnet sind. Durch die Kombination von DiBAC-basierter Membranpotenzialberichterstattung mit hochauflösender Z-Stack-Bildgebung ermöglicht diese Methode die Quantifizierung der DiBAC₄(5)-Fluoreszenz auf Einzelzellebene, wobei Werte im räumlichen Kontext einzelner Aggregate abgebildet und analysiert werden. Downstream-Bildsegmentierung und voxelbasierte Oberflächenanalyse ermöglichen eine parallele Quantifizierung von Veränderungen in der Aggregatarchitektur und der Membrandepolarisation.

Wichtig ist, dass dieses Protokoll zwar mit P. aeruginosa-Aggregaten aus SCFM2 demonstriert wird, der Workflow jedoch im Großen und Ganzen verallgemeinerbar ist. Die Bildgebungsstrategie, die farbstoffbasierte physiologische Anzeige und der analytische Rahmen können leicht an andere Bakterienarten, aggregatfördernde Medien und Stressoren angepasst werden, darunter antimikrobielle Wirkstoffe, Immuneffektoren oder Umweltstörungen. Daher bietet dieser Ansatz eine übertragbare und reproduzierbare Plattform, um die Stabilität bakterieller Gemeinschaften in verschiedenen experimentellen Kontexten zu hinterfragen.

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Protokoll

Alle Arbeiten mit P. aeruginosa müssen unter geeigneten BSL-2-Eindämmungsbedingungen und institutionellen Biosicherheitsgenehmigungen durchgeführt werden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bildung von Pseudomonas aeruginosa-Aggregaten im synthetischen Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2)

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Herstellung von P. aeruginosa-Kulturen und die Bildung von suspendierten mehrzelligen Aggregaten unter physiologisch relevanten Bedingungen, die die CF-Atemwegsumgebung nachahmen.

  1. Herstellung von Bakterienkulturen
    1. Am Tag vor dem Experiment impfen Sie Wildtyp-Pseudomonas aeruginosa PAO1, der das Plasmid pMRP9-1 (GFP)14 enthält, aus gefrorenen Glycerolbeständen in 5 ml Lysogeniebrühe (LB).
    2. Fügen Sie Carbenicillin (300 μg/mL) hinzu, um die Plasmidauswahl aufrechtzuerhalten.
    3. Pflanze Kulturen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min an.
  2. Rückverdünnung und Vorbereitung zur Aggregatbildung
    1. Am Tag des Experiments werden Übernachtkulturen 1:5 verdünnt (1 ml über Nacht: 4 ml LB). Antibiotika werden in diesem Stadium nicht wieder hinzugefügt; der Restübertrag ist minimal und beeinträchtigt das Wachstum nicht).
    2. Kulturen für ~2 Stunden bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) wachsen lassen, um die logarithmische Phase zu erreichen.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen befinden sich die Zellen typischerweise in der frühen exponentiellen Phase nach ~2 Stunden. Zusätzlich werden die Zellen anschließend vor der Impfung in SCFM2 gewaschen, um eventuelle Restverlagerungen von Antibiotika zu minimieren.
  3. Vorbereitung und Gleichgewicht von SCFM2
    1. Etwa 30 Minuten vor Ende der Rückverdünnungsphase wurde SCFM2 in sterile Röhren vorbereitet und auf 37 °C erwärmt.
    2. Für die Bildgebung in einer 4-Well-Glasboden-optischen Schale werden 500 μL SCFM2 pro Bohrloch zugewiesen. Bereiten Sie überschüssiges Volumen vor, um Pipettierungsfehler auszugleichen.
      HINWEIS: SCFM2 wird bei 4 °C gelagert. Vorwärmung minimiert Temperaturschocks und verbessert die Reproduzierbarkeit der Aggregatbildung.
  4. Waschen und Standardisierung des Inokulums
    1. Pelletkulturen durch Zentrifugation bei 4200 x g für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Wenn Drehzahlberechnungen erforderlich sind, beträgt der Rotorradius für den Drehschaufelrotor 172 mm.
    2. Entfernen Sie Supernatant und suspendieren Sie die Pellets in 3 ml sterilem PBS (pH 7,0) neu.
    3. Wiederhole die Waschschritte noch zweimal (insgesamt drei Waschen).
    4. Messen Sie OD₆₀₀ und berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um SCFM2 auf einen Anfangs-OD₆₀₀ von 0,05 zu inokulieren.
    5. Wirbeln kurzzeitig, um die Zellen zu homogenisieren und jede Quelle mit 500 μL SCFM2 zu inokulieren.
  5. Aggregatbildung unter statischen Bedingungen
    1. Inkubieren Sie SCFM2 statisch bei 37 °C für 4 Stunden, um die Aggregatbildung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Eine 4-Stunden-Inkubation liefert reproduzierbar suspendierte Aggregate mit Größen und Heterogenität, die mit denen in CF-Sputum- und Atemwegsproben vergleichbar sind, während die spätere Biofilmreifungminimiert wird 1,15.

2. Herstellung eines immunassoziierten Stressors (humane Neutrophilelastase)

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Herstellung eines vom Wirt abgeleiteten Stressors, der zur Induzierung von zellulärem Stress und Destabilisierung bakterieller Aggregate verwendet wird.

  1. Rekonstituierung und Speicherung der menschlichen Neutrophilelastase (HNE)
    1. Rekonstituiert menschliche Neutrophilelastase gemäß den Herstellerempfehlungen mit 50 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl und sterilem Wasser.
    2. Bereite eine 50 μg/L Stocklösung vor und sterilisiere mit einem 0,2-μm-Filter.
    3. Aliquot in 50 mL Volumen und bei −20 °C lagern.
    4. In der Nacht vor der Anwendung einen Aliquot bei 4 °C auftauen.
      HINWEIS: Aliquotierung minimiert die Frost-Tau-Zyklen, die die enzymatische Aktivität verringern und Variabilität einführen können. Aliquots sind etwa einen Monat lang bei 4 °C stabil.

3. Herstellung und Anwendung von DiBAC4(5) zur Meldung der Membrandepolarisation

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Herstellung und Verwendung eines spannungsempfindlichen Farbstoffs zur Visualisierung der Membrandepolarisation innerhalb von Aggregaten.

  1. Vorbereitung und Lagerung von DiBAC4(5)
    1. Beginnen Sie damit, eine Lagerlösung mit DiBAC4(5) vorzubereiten. DiBAC4(5)-Pulver in wasserfreiem DMSO auf 1 mg/mL rekonstituieren.
      HINWEIS: Die Rekonstitution von DiBAC4(5) in DMSO folgt den Standardempfehlungen des Herstellers.
    2. Aliquot in 100 μL Volumina und bei −20 °C geschützt vor Licht speichern.
    3. Verwenden Sie jedes Aliquot nicht mehr als zweimal.
      HINWEIS: DiBAC4(5) ist funktional äquivalent zu DiBAC4(3), wird aber hier ausgewählt, um GFP-Anregungs-/Emissionsspektren zu entsprechen. In diesem Protokoll wird DiBAC4(3) nur für eine zusätzliche Färbung verwendet, die im Ergebnisabschnitt besprochen wird. Der primäre Farbstoff, der während dieses Protokolls verwendet wird, ist DiBAC4(5).

4. Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Membrandepolarisation in P. aeruginosa-Aggregaten

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Aufnahme hochauflösender, zeitaufgelöster konfokaler Bilder, um dynamische physiologische und strukturelle Veränderungen in Aggregaten zu erfassen.

  1. Mikroskop- und Umweltkammervorbereitung
    1. Installieren Sie einen beheizten Mikroplatteneinsatz oder eine Umweltkammer auf der Konfokalmikroskop-Bühne.
    2. Schalten Sie mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung die Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsregelung ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein.
    3. Im Reiter Erwerbung finden Sie den Laser-Tab und schalten Sie etwa 1 Stunde vor der Nutzung die erforderlichen Laser ein, um eine angemessene Aufwärmung zu ermöglichen (Argonlaser für GFP; DPSS 561-10 für DiBAC4(5)) (ergänzende Abbildung 1A).
      HINWEIS: Stabile Umweltkontrolle reduziert die Fokusdrift und bewahrt die Aggregatintegrität während langen Zeitraffer-Experimenten.
  2. Anwendung des Immunstressors
    1. Nach 4 Stunden Aggregatbildung wird HNE zu experimentellen Bohrlöchern auf eine Endkonzentration von 20 μg/L16 gegeben.
    2. Lassen Sie Kontrollbrunnen unbehandelt.
    3. Übertragen Sie die 4-Well-Schale in die Mikroskopstufe.
      HINWEIS: HNE wurde bei physiologisch relevanten Konzentrationen (μg/L) hergestellt, basierend auf berichteten Konzentrationen im induzierten Sputum, und nicht als konzentrierter Bestand. Für diese Studie verwendete Konzentrationen finden sich bei McGarvey et al.16 unter IS (induzierter Sputum), NE-AAT (NE/a1-Anti-Trypsin-Komplex), HV (gesunder Freiwilliger).
  3. Identifikation von aggregierten Interessensgebieten
    1. Mit dem Reiter Locate und einem 20×-Objektiv schalten Sie das Transmitted Light ein, um aggregatreiche Bereiche mittels Brightfield-Bildgebung zu identifizieren (ergänzende Abbildung 1B).
    2. Während Sie weiterhin Brightfield Imaging verwenden, navigieren Sie zum Reiter Erwerbung und speichern Sie x-, y- und z-Koordinaten mit dem Positions-Modul (ergänzende Abbildung 1C).
    3. Wiederhole das für mehrere technische Replikationen pro Brunnen.
  4. Hochauflösende Z-Stack- und Zeitreihenerfassung
    1. Bewege dich in eine gespeicherte Position und wechsel zu einem 63× Öl-Immersions-Ziel.
    2. Tragen Sie Immersionsöl auf, bevor Sie die Schale positionieren.
    3. Im Reiter Erfassung konfigurieren Sie Kanäle mit Smart Setup (Ergänzende Abbildung 1D): GFP (488/509 nm) – Grün zuweisen, DiBAC4(5) (591/615 nm) – Rot zuweisen.
    4. Navigiere zur Live-Ansicht , dann mit dem Z-Stack-Modul , identifiziere den unteren Teil des Deckschilds, indem du den Feinfokus anpassst, und setze ihn dann als erste Z-Position mit dem Klick auf Zuerst setzen (ergänzende Abbildung 1E).
    5. Bewegen Sie sich nach oben, bis der Bereich 60 μm anzeigt, und stellen Sie die endgültige z-Position ein, indem Sie auf Zuletzt setzen (ergänzende Abbildung 1E) klicken.
    6. Schalte Live-View aus und aktiviere Definite Focus. Wählen Sie Find Surface und anschließend nur dann Fokus speichern , wenn der Status Reflex Found anzeigt (Ergänzende Abbildung 1F).
    7. Wiederholen Sie die Fokus-Kalibrierung für jede gespeicherte Position mit den Z-Stack - und Definite Focus-Modulen .
    8. Konfigurieren Sie die Zeitreihenaufnahme so, dass jede Position alle 3 Minuten für 6 Stunden abgebildet wird (ergänzende Abbildung 1G).
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, um DiBAC4(5)-Farbstoff aufzutauen, hinzuzufügen und zu inkubieren, und kann nach der Inkubationszeit wieder aufgenommen werden.
    9. Wählen Sie Experiment starten.
      HINWEIS: Drei-Minuten-Intervalle balancieren zeitliche Auflösung mit Phototoxizität und Photobleaching-Überlegungen aus.
  5. DiBAC4(5) Addition und Inkubation
    1. Fügen Sie jedem Bohrloch DiBAC4(5) zu einer Endkonzentration von 5 μg/mL9 hinzu.
    2. Inkubieren Sie 30 Minuten im Dunkeln, bevor Sie mit der Zeitraffer-Bildgebung beginnen.
      HINWEIS: Diese Inkubation ermöglicht eine Farbausgleichung und minimiert gleichzeitig die Hintergrundfluoreszenz.

5. Quantitative Bildanalyse der Aggregatstruktur und DiBAC4(5) Kolokalisierung

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt einen quantitativen Workflow, um Membrandepolarisation mit Aggregatarchitektur und Destabilisierung zu verknüpfen.

  1. Bildimport und Kanaltrennung
    1. Laden Sie Bilddateien (.czi oder äquivalent) in Imaris x64 Software Version 10.2.0 oder höher hoch.
    2. Verifizieren Sie die Voxel-Kalibrierung, indem Sie prüfen, ob die x-, y- und z-Pixelmaße (Voxelgröße) in den Bildmetadaten die konfokalen Aufnahmeparameter (Objektiv, Zoom, z-Schrittgröße) korrekt widerspiegeln. Eine falsche Kalibrierung führt zu Fehlern bei räumlichen und volumetrischen Messungen.
  2. Oberflächenrendering von bakteriellen Aggregaten und DiBAC4(5)-Signal
    1. Verwenden Sie das Surfaces-Modul , um P. aeruginosa-Aggregate zu rendern:
      1. Wählen Sie unter Segmentierungseinrichtung den GFP-Kanal aus (ergänzende Abbildung 2A).
      2. Aktivieren Sie Split Touching Objects (Region Growing) und passen Sie den Intensitätsschwellenwert an, um Aggregate vollständig zu erfassen (Ergänzende Abbildung 2B).
      3. Im Filter Seed Points-Modul ändern Sie den Filtertyp auf Anzahl der Voxel Img = 1 und setzen Sie auf 90 % (ergänzende Abbildung 2C).
      4. Nach der Verarbeitung des Renderings stellen Sie die Oberflächen auf 100 % (ergänzende Abbildung 2D).
    2. Schließen Sie das Rendering durch und weisen Sie bakteriellen Oberflächen grüne Färbung zu (ergänzende Abbildung 2E).
    3. Wiederholen Sie das Rendering für den DiBAC4(5)-Kanal und weisen Sie rote Färbung zu.
  3. Kolokalisierung und volumenbasierte Quantifizierung
    1. Wählen Sie das DiBAC4(5)-Oberflächenrendering (ergänzende Abbildung 3A) aus und bestimmen, an welchem Zeitpunkt(en) die Colokalisationsanalyse durchgeführt wird.
    2. Navigieren Sie zu Statistik > Detail-Reiter > spezifischen Werten (ergänzende Abbildung 3B).
    3. Definieren Sie Kolokalisierung, indem Sie Objekte mit einer kürzesten Entfernung zu bakteriellen Oberflächen von 0,00 auswählen (ergänzende Abbildung 3B).
    4. Finden Sie Bearbeiten und dann duplizieren Sie diese Objekte, um eine DiBAC-Oberfläche zu erzeugen, die mit Zellen überlappt (ergänzende Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass Sie diese Oberfläche umbenennen, um ihre überlappenden Eigenschaften zu zeigen.
    5. Im Reiter Detailliert unter Durchschnittswerten werden die summierten Volumenwerte zu jedem ausgewählten Zeitpunkt(en) aufgeschrieben für: (1) Gesamt-DiBAC4(5)-Signal (Ergänzende Abbildung 3D); (2) Kolokalisiertes DiBAC4(5)-Signal (ergänzende Abbildung 3E).
    6. Berechnen Sie die prozentuale Überschneidung als:
      figure-protocol-1
      HINWEIS: Die prozentuale Überlappung spiegelt den Anteil des zellassoziierten DiBAC₄(5)-Signals innerhalb von Aggregaten wider, was die Membrandepolarisation zu einem bestimmten Zeitpunkt widerspiegelt.
      HINWEIS: Obwohl er mit P. aeruginosa-Aggregaten in SCFM2 demonstriert und mit HNE belastet wurde, ist dieser Arbeitsablauf weitgehend an andere Bakterienarten, aggregatfördernde Medien, fluoreszierende Reporter und Stressoren wie antimikrobielle Wirkstoffe oder Umweltstörungen angepasst.

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Ergebnisse

Im oben beschriebenen Protokoll ist eine Methode zur Nachverfolgung von Veränderungen in der Membrandynamik von P. aeruginosa-Aggregaten bereitgestellt, modelliert in einer Lungenumgebung mit Mukoviszidose (Abbildung 1). Mit einem Wildtyp-PAO1-Stamm mit einem pMRP9-1 (GFP)-Plasmid (Abbildung 1A), HNE zur Simulation von Immunstress und DiBAC4(5)-Membranfarbstoff (Abbildung...

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Diskussion

Das Membranpotenzial dient als sensibles, frühes Messen von zellulärem Stress und gestörter Homöostase. Innerhalb mehrzelliger bakterieller Aggregate treten diese physiologischen Veränderungen vor und können eine anschließende strukturelle Destabilisierung verursachen. Hier präsentieren wir einen bildgebenden Workflow, der den langsam reagierenden, potentiell empfindlichen Farbstoff bis-(1,3-Dibutylbarbitursäure) Pentamethinoxonol (DiBAC4(5)) verwendet, um die Depolarisation i...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

S.E.D wird durch Startkapital des Department of Molecular Medicine der University of South Florida sowie durch Forschungsstipendien der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,3-Dibutylbarbitursäure) Pentamethinoxonol (DiBAC4(3))AAT Bioquest21411  lipophil, anionisches Molekül 
1,3-Dibutylbarbitursäure) Pentamethinoxonol (DiBAC4(5))AAT Bioquest21410  lipophil, anionisches Molekül 
Carbenicillin Forschungsprodukte international C46000-5.0zur Auswahl von GFP-Expressstämmen von PAO1 verwendet
Cellvis 4-Kammer 35mm GlasbodenschüsselFisherNC0600518Die Glasboden-Kammerschale ermöglicht die Beseitigung der suspendierten Zuschlagstoffe im Wachstumsmedium, während die Bildgebung & NBSP;
ZentrifugeBeckman Coulter Life Sciences B06320gekoppelt mit dem Beckman Coulter Life Sciences SX4400 Schwing-Schaufelrotor (Teile-Nr. B01425)
Konfokales Laserrastermikroskop (CLSM)ZeissLSM 880das CLSM-Modell, das für die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente verwendet wird, ist nicht mehr verfügbar, aber der LSM 900 ist eine aktualisierte äquivalente Option 
KulturröhrenGenesee21-130steril; Polypropylen & NBSP;
DAPIThermo Fisher62248verwendet für geplante zukünftige Anwendungen zur Färbung von Neutrophilen mit DiBAC4(5)
Einweg-Cuvettes Markentechnologie759086D1,5 ml, halbmikro
DMSOMillipore-Sigma276855-100MLverwendet für die Wiederaufstellung von DiBAC4(3,5)
DRAQ5Thermo Fisher65-0880-92verwendet für geplante zukünftige Anwendungen zur Färbung von Neutrophilen mit DiBAC4(3)
Umweltkammer für CLSMPECONLSM 880dieses System wurde ausschließlich für Zeiss-Produkte entwickelt und wird allgemein als "Incubation System S" bezeichnet; alle Komponenten können über Zeiss als Ergänzung zum LSM 880 (oder ähnlichem) System bestellt werden
Gentamycinsulfat FisherBP918-1zur Auswahl von RFPs verwendet, die Stämme von PA1633 ausdrücken
Glycerol Genesee18-205zum Einfrieren von Stämmen für die Langzeitlagerung bei -80 & NBSP verwendet; ° C
Humane Neutrophilelastase (HNE)Millipore-Sigma324681-50UGNach der Rekonstituierung ist sie für einen Monat stabil bei 4  ° C oder 1 Jahr bei 20 & NBSP; ° C
Imaris x64 SoftwareOxford Instruments Version 10.2.0
Immersion Oil Elektronenmikroskopie Scienes 16919-12nicht trocknend; standardisiert bei 37  ° C
Inkubator Benchmark ScientificH1001-MFähig zu zittern
Lysogenie-Brühe (LB)Genesee11-118Miller-Mix
mCherry Plasmid erhalten von einem Kollaborator 
PA1633 Transposon-Mutantenstamm erhalten von einem Kollaborator 
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher3002pH 7,0
NatriumacetatThermo FisherAM97403M; pH 5,5; RNase-frei
NatriumchloridFisher S271-500zur Rekonstruktion von HNE verwendet
Spektrophotometer VWR634-0882verwendet zur Messung der Zelldichte für die Inokulation von PAO1/PA1633 in SCFM2
Sterile .22µ m FilterGenesee25-244zur Reinigung von rekonstituiertem HNE verwendet
Sterile MikrozentrifugenröhrenGenesee24-272LR0,6 ml
Sterile SpritzeFisher14955459zur Reinigung von rekonstituiertem HNE verwendet
SX4400 Schwing-Schaufel-Rotor  Beckman Coulter Life Sciences B01425gekoppelt mit der Beckman Coulter Life Sciences Zentrifuge (Teilenummer B06320)
Synthetisches Mukoviszidose-Sputummedium (SCFM2)SyntheBiom10002-500Charge #: 001-CF2-0724
Ultra Pure WaterGenesee18-195verwendet für die Wiederaufbau von HNE
Wildtyp Pseudomonas aeruginosa PAO1 mit pMRP9-1 Plasmid Dieses pMRP9-1-Plasmid enthält GFP und exprimiert Carbenicillinresistenz 
ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging Software Zeisskompatibel mit dem LSM 880

Referenzen

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