Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Zusammenfassung

Die zelluläre Senezenz ist ein stabiler Zellzyklusstopp-Zustand, der mit charakteristischen Phänotypen assoziiert ist, darunter vergrößerte Zellmorphologie, veränderte sekretorische Signalübertragung und ausgeprägte lysosomale Umstrukturierung. Seneszente Zellen zeigen häufig eine Ausdehnung des sauren endolysosomalen Kompartiments, begleitet von Veränderungen der Luminalsäure und der Abbaukapazität, was eine Möglichkeit für einfache Live-Zell-Messungen der seneszenzgebundenen Organellenremodellierung schafft. Diese Arbeit beschreibt ein Lebendzell-Bildgebungsprotokoll, das LysoTracker Deep Red, einen acidotropen fluoreszierenden Farbstoff, verwendet, um einen indirekten, pH-abhängigen Proxy für das saure Organellenkompartiment als Korrelate der Altersbelastung zu liefern. Die Methode wird an humanen Lungenfibroblasten von IMR-90 demonstriert, die eine replikative Seneszenz über serielle Passage durchlaufen. Das Protokoll beschreibt Zellkultur und Passagenverfolgung, LysoTracker-Färbung, Fluoreszenzbildgebung sowie bildbasierte Quantifizierung der lysosomalen Signalintensität und signalpositiven Fläche pro Zelle. Senezenzassoziierte β-Galactosidase (SA-β-Gal) Färbung auf Parallelkulturen ist als optionaler Bestätigungsmarker und nicht als Referenzstandard enthalten. Repräsentative Ergebnisse zeigen ein höheres Signal für säureotrope fluoreszierende Farbstoffe und größere lyso-positive Regionen in Spät-Passage-Kulturen als bei früh-Passage-Kontrollen, was mit der Expansion des sauren Organellenkompartments während der Seneszenz übereinstimmt. Da die Anzeige vom Kompartimentvolumen, Protonengradienten und der Farbstoffverfügbarkeit abhängt, ist sie am besten als indirekter Korrelate der lysosomalen Remodellierung und nicht als direktes Maß für Lysosomenzahl oder Biogenese zu interpretieren. Das Protokoll ist einfach zu übernehmen und kann an andere Zelltypen oder seneszendauslösende Belastungen angepasst werden, wodurch es eine praktische, quantitative Ergänzung zu herkömmlichen Endpunkt-Assays bietet.

Einleitung

Die zelluläre Seneszenz ist ein dauerhaftes Zellzyklus-Stillstandsprogramm, das durch verschiedene Belastungen und altersbedingte Auslöser^{ausgelöst wird.} Alterszellen werden klassisch durch eine Konstellation von Markern identifiziert, da kein einzelner Marker vollständig spezifisch ist. Kennzeichen sind vergrößerte, abgeflachte Zellmorphologie, seneszenzassoziierte β-galaktosidase (SA-β-Gal) Aktivität, Bildung von DNA-Schadensfoci und ein pro-inflammatorisches sekretorisches Profil (SASP)^2,4,5. Unter diesen Merkmalen hat sich die lysosomale Remodellierung als herausragende und funktionell bedeutende Eigenschaft der Seneszenz ^6,7 ergeben. Seneszente Zellen zeigen tiefgreifende lysosomale Veränderungen, darunter eine dramatische Vergrößerung der lysosomalen Größe und Anzahl sowie veränderte Funktionen (oft mit partieller Neutralisierung des lysosomalen pH-Werts und der Ansammlung von nicht degradiertem Material)6,7,8,9. Diese lysosomale Expansion trägt zu einer erhöhten SA-β-Gal-Aktivität bei, einem etablierten Altersmarker, der eine erhöhte lysosomale β-Galaktosidase-Aktivität in seneszenten Zellen ^{widerspiegelt.} Tatsächlich nutzt die SA-β-Gal-Färbung dieses Phänomen aus, indem eine suboptimale pH-Inkubation (6,0) verwendet wird, um Farbstoff selektiv in seneszenten Lysosomen auszufällen, die das Enzym angesammelt haben und einen höheren pH-Wert als junge Zellen^{aufweisen (10,12,13}).

Lysosomen spielen zentrale Rollen bei der Proteinumschlagung und -signalisierung, und ihre Dysregulation gilt heute als Kennzeichen für Alterung und Alterung 1,2,4,6. Seneszente Zellen zeigen häufig eine lysosomale Dysfunktion, was sich in erhöhtem luminalem pH-Wert, veränderter Enzymaktivität und der Ansammlung von Lipofuscin (einem autofluoreszenten Pigment oxidierter Makromoleküle) zeigt. Die lysosomale Biogenese wird häufig durch das koordinierte lysosomale Expressions- und Regulation-Netzwerk (CLEAR) unter der Kontrolle des Transkriptionsfaktors EB (TFEB) und verwandter Faktoren ^6,7,15 hochreguliert oder verändert. Dieser Prozess kann die lysosomale Masse in seneszenten Zellen erhöhen, da sie sich an Stress anpassen, indem sie das abbauende Kompartiment ^6,7,10 erweitern. Umgekehrt können seneszente Zellen auch einen lysosomalen funktionellen Rückgang erleben (z. B. verminderte Säure), was Prozesse wie Autophagie beeinflussen und Resistenz gegen bestimmte Stressfaktoren, einschließlich ferroptotischer Zelltod ^6,8, verleihen kann. Die Messung des lysosomalen Gehalts und der Funktion ist daher zentral für das Verständnis und die Identifizierung von Alterung ^6,16.

LysoTracker Deep Red ist eine membranbeständige fluoreszierende Sonde, die sich selektiv in sauren Organellen durch protonierungsgesteuertes Fangen über die lysosomale Membran^16,17 ansammelt. Das resultierende Signal spiegelt das kombinierte Volumen des sauren Kompartiments, die Protonengradientenstärke und die lokale Farbstoffverfügbarkeit wider, anstatt der lysosomalen Masse, und kann sich bei Veränderungen des lysosomalen pH-Werts oder des Membranzustands verschieben, die unabhängig von der Gesamtzahl ^6,16 auftreten. Im Kontext der zellulären Seneszenz zeigen die Zellen erweiterte und intensiver markierte LysoTracker-positive Kompartimente im Vergleich zu präseneszenten Gegenstücken⁹, was mit der Expansion des sauren Organellenkompartments und der erhöhten lysosomalen Biogenese übereinstimmt, wie sie durch biochemische und ultrastrukturelle Studien berichtet wurde ^6,7,10. Dieser Live-Cell-Ansatz bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlicher Endpunkt-SA-β-Gal-Färbung: Er ermöglicht eine quantitative und räumlich aufgelöste Analyse einzelner Zellen, kann mit anderen fluoreszierenden Reportern kombiniert werden, benötigt keine Fixierung und erfasst Heterogenität, indem kontinuierliche Merkmale statt eines binären Endpunkts ^6,16 gemeldet werden. Während dieses Protokolls wird das LysoTracker-Signal als Anzeige des sauren Organellenkompartiments in lebenden Zellen verwendet, und zustandsabhängige Veränderungen werden entsprechend interpretiert, anstatt als absolutes Maß für die Lysosomenzahl ^6,16 zu behandeln.

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von LysoTracker Deep Red zur Profilierung der lysosomalen Veränderungen bei IMR-90-Fibroblasten, die eine replikative Seneszenz durchlaufen. IMR-90 ist eine normale humane diploide Fibroblastenlinie (weiblich, fetaler Lungenursprung), die in der Alterungsforschung weit verbreitet verwendet wird; wie andere primärähnliche Fibroblasten (z. B. WI-38) treten IMR-90-Zellen nach ~50–60 Populationsverdoppelungen (dem Hayflick-Limit) aufgrund von Telomerverkürzung und DNA-Schadenssignalisierung^18,19 in die Alterszeit ein. Das Protokoll beschreibt, wie IMR-90-Zellen kultiviert werden, um Seneszenz durch serielle Passaging-Phase zu induzieren, die Seneszenz durch Morphologie und SA-β-Gal-Färbung zu überprüfen und lebende Kulturen mit LysoTracker Deep Red für Fluoreszenzbildgebung 5,10,12,13 zu färben. Bildaufnahme und Analyse sind enthalten, mit quantitativen Anzeigen wie der Lysosomenzahl pro Zelle, der gesamten lysosomalen Fläche pro Zelle und der mittleren Fluoreszenzintensität. Experimentelle Kontrollen und Sicherheitsüberlegungen werden betont, darunter sorgfältiger Umgang mit Farbstoffen und Fixativen, die Minimierung der Fototoxizität während der Bildgebung sowie die Berücksichtigung zellulärer Autofluoreszenz in gealterten Zellen. Die Methode wird unter Verwendung der replikativen Seneszenz demonstriert, kann aber an andere Modelle angepasst werden, darunter medikamentinduzierte Senezenz (z. B. Doxorubicin- oder Etoposidbehandlung) oder stressinduzierte vorzeitige Seneszenz (SIPS) durch Oxidanten 2,3,4,19,20. In jedem Fall sollten LysoTracker-basierte Messungen mit geeigneten Kontrollen (proliferierende oder ruhende Zellen) verglichen und, wenn möglich, mit mindestens einem traditionellen Senezenzmarker (wie SA-β-Gal oder p16INK4a-Expression) kreuzvalidiert ^werden.

Lebendzellige lysosomale Profilierung schließt eine praktische Lücke bei Senezenzanalysen, indem sie eine reproduzierbare, einzelzellige Auflösungsmessung eines Schlüsselorganellenphänotyps – der lysosomalen Expansion – liefert, die direkt mit der Funktion der seneszenten Zellen verknüpft ist (z. B. erhöhte Abbaukapazität und sekretorische Aktivität)2,3,4,6 . Da die LysoTracker-Färbung mit Hochdurchsatzbildgebung und Durchflusszytometrie kompatibel ist, kann das Protokoll für Anwendungen wie das Arzneimittelscreening (z. B. Tests von Senolytika oder Modulatoren der lysosomalen ^Funktion) skaliert werden2,3,6. Als zukünftige Richtung sind perzellige lysosomale Merkmale, die durch dieses Protokoll erzeugt werden, für nachgelagerte Klassifikationsansätze geeignet, einschließlich maschineller Lernmodelle; Training und Validierung solcher Klassifikatoren liegen außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls. Insgesamt ermöglicht diese Methode (Abbildung 1) die Visualisierung und Quantifizierung der lysosomalen Dimension der Senezenzbiologie, gibt Einblicke darin, wie sich die lysosomale Biogenese und Morphologie während des Alters oder Stresses verändern, und bietet eine Plattform für Tests von Interventionen, die auf Lysosomen in seneszenten Zellen abzielen. Der Bildanalyse-Workflow, der zur Segmentierung von Kernen, zur Ableitung zellassoziierter Regionen, zur Schwellenwertung und zur Quantifizierung von LysoTracker-Funktionen sowie zur Reproduktion der hier präsentierten Pro-Well- und Pro-Zell-Analysen verwendet wird, ist als Open-Source-Begleitpaket (SenTrackLite v0.5.0) implementiert, als Supplementary File 1 bereitgestellt und mit einem persistenten DOI für Zitierung und Wiederverwendung²¹ archiviert.

Abbildung 1: Überblick über den lebendzelligen lysosomalen Senescenz-Assay. (A) Experimenteller Arbeitsablauf. Die Zellen werden lebend mit LysoTracker Deep Red und einem Kernfarbstoff gefärbt, mit einer Standard-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und optional parallel zur SA-β-Gal-Färbung zur Validierung verarbeitet. (B) Bildabgeleitete Messungen pro Zelle. Der nukleare Kanal wird verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren, und die kernverankerte Expansion definiert eine Zellregion pro Zelle, um lysosomassoziierte Messungen aus dem LysoTracker-Kanal zu extrahieren. Repräsentative Messungen pro Zell umfassen die lysosomale Fläche, die mittlere LysoTracker-Intensität und die Lysosomenanzahl. SA-β-Gal-Färbung kann als optionales Validierungslabel bei der Erstellung oder Bestätigung von Referenzdatensätzen verwendet werden. (C) Quantifizierung und Ausgaben. Zellpro-zell-lysosomale Messungen werden zu einem einzelnen Senezzenz-Wert pro Zell oder einer Wahrscheinlichkeit mit einem einfachen Bewertungsansatz kombiniert. Die Ergebnisse umfassen Werte pro Zell sowie Well- oder Condition-Zusammenfassungen der Senezenzbelastung, die über Senezenz-Induktions- oder senolytische Behandlungszustände hinweg verglichen werden können. Erstellt mit BioRender.com
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Protokoll

IMR-90-Zellen sind eine etablierte humane Fibroblastenzelllinie und stellen keine Forschung für menschliche Probanden dar. Es war keine ethische Zustimmung oder informierte Zustimmung erforderlich. Alle Verfahren wurden gemäß den Biosicherheitsrichtlinien der University at Albany, State University of New York durchgeführt, für die Arbeit mit menschenbasierten Zelllinien unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2)-Bedingungen.

1. Allgemeine Vorbereitung und Arbeitsablaufübersicht

1. Definieren Sie das experimentelle Ziel als einen lebendzelligen lysosomalen Profiling-Test mittels LysoTracker Deep Red-Färbung und einem lebenden nuklearen Farbstoff, um die lysosomale Remodellierung als kontinuierliche Messung der Altersbelastung in IMR-90-Zellen zu quantifizieren. Definieren Sie den primären biologischen Vergleich als eines der folgenden Designs:
   1. Seneszenz-Induktion vs. abgestimmte nicht-induzierte Kontrolle.
   2. Seneszenz-hohe vs. seneszenz-niedrige Bedingungen über eine Dosis oder Zeitreihe.
   3. Seneszenz-hohe Erkrankung, behandelt mit einem Senolytikum vs. Fahrzeug-behandelte Alterskontrolle – hohe Kontrolle.
   4. Senolytische Behandlungsreihen umfassen sowohl eine seneszenzniedrige Ausgangsgruppe als auch eine seneszenzhohe Gruppe.
2. Legen Sie für alle Experimente die minimale Kontrollstruktur fest.
   1. Beziehen Sie eine Kontrollgruppe mit geringer Seneszenz-Schicht, die auf Beschichtungsdichte, Färbungszeitpunkt und Bildaufnahmeeinstellungen abgestimmt ist.
   2. Beziehen Sie eine seneszenzhohe Gruppe ein, die durch einen definierten Seneszenz-Trigger oder durch späte Passage von replizierender Seneszenz erzeugt wird.
   3. Biologische Replikationen pro Zustand einbeziehen und Färbungen und Bildgebung mit identischem Timing über alle Bedingungen hinweg durchführen.
3. Definieren Sie Assay-Anzeigen als direkte bildbasierte Messgrößen der lysosomalen Umgestaltung:
   1. Messen Sie die mittlere LysoTracker-Intensität pro Zelle innerhalb der lysopositiven Maske unter Verwendung eines konstanten Intensitätsschwellenwerts als primärer Assay-Anzeige. Auf Einzelzellebene trennt diese Metrik Senezenz-niedrige von Senezenz-hohen Bedingungen mit der größten Effektgröße und ist unempfindlich gegenüber der Kerndichte auf Feldebene (Ergänzende Abbildung 1).
   2. Erfassen Sie Folgendes als sekundäre Messungen, die die Kompartimentexpansion dokumentieren, aber empfindlicher auf Segmentierungsentscheidungen oder feldnahe Kerndichte reagieren: Lysosom-angereicherte Fläche pro Zelle und integrierte LysoTracker-Intensität pro Kern auf Feldebene. Die integrierte Intensität pro Kern ist in gut bepflanzten Feldern informativ, wird jedoch instabil, wenn ein Feld nur wenige Kerne enthält, da die Normalisierung pro Kern von einzelnen Zellen dominiert wird.
   3. Erfassen Sie optionale Puncta-Metriken und Kennzahlen von Lysosomen, wenn die Bildauflösung Puncta-Diskriminierung unterstützt.
4. Verwenden Sie seneszenzassoziierte β-Galactosidase (SA-β-Gal) Färbung als optionalen Validierungsschritt, der je nach experimentellen Einschränkungen an parallelen Bohrungen oder abgeglichen Proben durchgeführt wird. Nutzen Sie diese Validierung, um zu bestätigen, dass späte Passage-Kulturen eine erhöhte SA-β-Gal-Positivität im Vergleich zu frühen Passage-Kulturen aufweisen.
5. Standardisieren Sie den Assay über Bedingungen hinweg, indem Sie die folgenden Variablen vor der Datenerhebung feststellen:
   1. LysoTracker Arbeitskonzentration (75 nM) und Färbungsdauer (30 Min).
   2. Kernfarbstoffidentität und Arbeitskonzentrationsbereich (z. B. Hoechst 33342 bei 1 μg/mL bis 2 μg/mL).
   3. Bildparameter, einschließlich Objektivvergrößerung, Belichtungszeit, Beleuchtungsintensität, Binning und Fokusstrategie.
   4. Plattenformat und Bildkonfiguration (Bildplatten mit klarem Boden oder Glasboden), einschließlich Nachbildung des Bohrlochlayouts.
   5. Schwellenwertauswahl und Intensitätsnormalisierung.
      1. Wenden Sie eine einzelne feste Intensitätsschwelle auf den LysoTracker-Kanal über alle Brunnen innerhalb eines Experiments an, um die lysopositive Maske zu definieren.
      2. Wählen Sie den Schwellenwert einmal während der Assay-Einrichtung mit einer Kalibrierungsmenge von Feldern aus, die den erwarteten Intensitätsbereich abdecken (z. B. zwei Senezenz-niedrige und zwei Senezenz-hohe Felder), und halten Sie ihn in allen Bohrlöchern dieser Sitzung konstant; Die Variation des Schwellenwerts pro Bohrloch führt zu einer zirkulären Abhängigkeit zwischen Messung und Ergebnis.
      3. Für Quervergleiche werden alle Bedingungen in einer einzigen Sitzung unter identischer Laserleistung, Belichtungs- und Gewinneinstellungen erfasst und diese Einstellungen in der Abbildung angegeben.
      4. Wenn absolute Intensitätsvergleiche über die Sitzungen hinweg erforderlich sind, sollten Sie einen fluoreszierenden Referenzstandard (z. B. eine Referenzkugelplatte oder einen festen Referenzbrunnen) einbauen und die gemessenen Intensitäten entsprechend normalisieren.
         HINWEIS: Vergleiche keine rohen Intensitätswerte über Sitzungen hinweg ohne identische Aufnahmeeinstellungen oder referenzbasierte Normalisierung.
   6. Kerndichte-Normalisierung.
      HINWEIS: Da seneszente Kulturen typischerweise eine geringere Proliferation und eine geringere Kerndichte bei vergleichbaren Aussaatzeiten aufweisen, können Feldmetriken auf Basis absoluter Pixelzahlen (z. B. totale lysopositive Fläche) von der Zellzahl pro Feld beeinflusst werden.
      1. Berichte sowohl rohe als auch pro-nukleus normalisierte Werte (Rohwert geteilt durch die Anzahl der Hoechst-segmentierten Kerne).
         HINWEIS: Die Normalisierung pro Kern steuert dichtebedingte Störungen und ist der geeignete Vergleich für die Interpretation pro Zelle. Für flächenbasierte Auswertungen dient der normalisierte Wert als primäre Metrik, während die unnormalisierte Gesamtsumme zur Vollständigkeit beibehalten wird.
6. Bilder unter Bedingungen aufnehmen, die die Live-Cell-Signalqualität erhalten und technische Variabilität minimieren. Halten Sie Platten im Frühen und späten Durchgang während der Färbung und des Transports vor Licht geschützt und minimieren Sie die Zeit außerhalb der kontrollierten Kulturbedingungen während der Bildgebung.
7. Speichern Sie Fluoreszenzbilder als Single-Plane, Single-Channel, verlustfreie TIFF-Dateien. Verwenden Sie ein konsistentes Benennungsschema, das die Paarung zwischen nuklearen und LysoTracker-Bildern bewahrt und die Rückverfolgbarkeit beim Plattieren, Brunnen, Konditionieren und Replizieren gewährleistet. Verwenden Sie einen gemeinsamen Basisnamen mit Kanalsuffixen (z. B. _Hoechst.tif und _Lyso.tif). Speichern Sie Bilder in einem dedizierten Ordner, der experimentell organisiert ist, mit Unterordnern bei Bedarf.
   HINWEIS: Ein praktischer Pausenpunkt ist nach der Ermittlung früher und später Passage-Kohorten und der Bestätigung, dass späte Passage-Kulturen ein verlangsamtes Wachstum und eine seneszenzähnliche Morphologie aufweisen.
8. (Optional) Sauerstoff als experimentelle Variable einbeziehen, indem man unter Umgebungs- und sauerstoffarmen Bedingungen abgestimmte IMR-90-Kohorten aufrechterhält. Behandle alle Gruppen identisch.

2. Zellkultur und Induktion der replikativen Seneszenz

1. Tauen Sie IMR-90 humane Lungenfibroblasten gemäß den Standard-Zellkulturpraktiken auf und erweitern Sie die Zellen in Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum. Füge Penicillin-Streptomycin mit 1 % hinzu, wenn es mit Laborpraxis und experimentellem Design übereinstimmt. Halten Sie die Zellen bei 37 °C bei 5 % CO₂.
2. Kulturen im logarithmischen Wachstum und Passage vor 70 % bis 80 % Konfluenz aufrechterhalten. Verwenden Sie konsistente Medienhandhabungs- und Fütterungspläne, um die Variabilität zwischen Versuchsläufen zu verringern. Ersetze das gesamte Kulturmedium alle 2 bis 3 Tage zwischen den Durchgängen.
   HINWEIS: Lassen Sie das Medium nicht länger als 72 Stunden unverändert bleiben, da Nährstoffmangel und die Ansammlung ausgeschiedener Faktoren stressbedingte Phänotypen fördern können, die die replikative Alterung beeinträchtigen.
3. Definieren Sie die Alters-Low-Baseline-Gruppe als aktiv proliferierende IMR-90-Kulturen, die unter Bedingungen erhalten bleiben, die das normale Wachstumsverhalten erhalten. Passen Sie die Beschichtungsdichte und -handhabung an alle Versuchsgruppen an.
4. Erzeugen Sie eine seneszenzhohe Gruppe mit einer der folgenden Ansätze, die auf experimentellen Zielen basieren.
   1. Replikative Seneszenz durch serielle Passaging mit Populationsverdoppelung induzieren, bis eine verlangsamte Proliferation und senezenzassoziierte Morphologie sichtbar sind.
      HINWEIS: Das Population Doublebling Level (PDL) und die Durchgangszahl sind unterschiedliche Maße und werden getrennt erfasst. PDL bezieht sich auf kumulative Nach-Tau-Verdopplungen und wird an jedem Abschnitt wie folgt berechnet:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (Zellen geerntet / Zellen ausgesaat)¹⁸,
      während die Passagenzahl die Anzahl der Subkulturen seit dem Auftauen zählt. Da Kulturen typischerweise 1:4 bei etwa 70–80 % Zusammenfluss aufgeteilt sind, trägt jeder Durchgang etwa zwei Populationsverdoppelungen bei, sodass Durchgangszahl und kumulative PDL nicht austauschbar sind.
      HINWEIS: Seneszenzhohe Kulturen werden typischerweise auf fortgeschrittenen Populationsverdoppelungsniveaus beobachtet, wenn die Vermehrung nachlässt und die mit der Seneszenz-assozierende Morphologie sichtbar wird. Genaue Schwellenwerte sollten empirisch für jede IMR-90-Charge bestimmt werden, da PDLs je nach Anbieter unterschiedlich sind.
   2. Stressinduzierte Seneszenz durch Anwendung eines definierten Altersauslösers und Ermöglichung eines passenden phänotypischen Entwicklungsfensters.
   3. Behandlungsinduzierte Seneszenz, indem Zellen der untersuchten Erkrankung ausgesetzt werden, obwohl das Ziel ist, zu testen, ob diese Erkrankung eine Senezenz auslöst.
5. Überprüfen Sie, dass der gewählte Ansatz einen seneszenzhohen Phänotyp erzeugt, indem mindestens eine orthogonale Anzeige auf parallelen Bohrlöchern durchgeführt wird. Führen Sie eine SA-β-Gal-Färbung als optionale Validierungsmethode durch und dokumentieren Sie den Anteil positiver Zellen pro Bedingung, wenn sie enthalten sind.
   1. Eine Kultur gilt als seneszenzhoch, wenn mindestens 50 % der Zellen nach 12 bis 16 Stunden Inkubation bei pH 6,0 eindeutige blaue perinukleäre SA-β-Gal-Färbung zeigen, während die abgestimmte Senezenz-niedrige Kontrollgruppe unter identischen Färbungsbedingungen^nicht mehr als 10 % positive Zellen zeigt.
   2. Werte außerhalb dieser Grenzen deuten auf eine unvollständige Seneszenzinduktion oder erhöhten Hintergrund hin und rechtfertigen eine Neuoptimierung vor der Bildnahme.
      HINWEIS: Pause nach der Etablierung von Altersschwächen und Senezenz-hohen Kohorten sowie der Bestätigung eines klaren phänotypischen Unterschieds durch Morphologie und optionale Validierungsfärbung.
6. Optional: Senolytische Behandlungsgestaltung
   1. Platten-Senezenz – niedrig und seneszenz-hoch – Bedingungen in Replikationsbrunnen und ermöglichen es den Zellen, sich vor der Behandlung zu binden und zu erholen.
   2. Behandeln Sie seneszenzhohe Bohrungen mit senolytischen Verbindungen und integrieren Sie eine vehicle-behandelte, senezenzhohe Kontrolle.
   3. Beziehen Sie eine seneszenzniedrige Gruppe ein, die mit demselben Vehikel und, wenn relevant, derselben Verbindungskonzentration(en) behandelt wird, um die nicht-seneszente Empfindlichkeit zu überwachen.
   4. Führen Sie nach der Behandlung bei allen Erkrankungen regelmäßig LysoTracker und nukleare Färbung durch.
7. Überwachen Sie Kulturen während des späten Durchlaufs/Behandlungsverlaufs und dokumentieren Sie Morphologie und Wachstumsmuster. Identifizieren Sie seneszente Kulturen durch verlangsamte Proliferation, vergrößerte und abgeflachte Morphologie sowie erhöhte zytoplasmatische Granularität. Sobald der Wachstumsstopp sichtbar ist, sollten Sie die Kultur als altersbedingte Kohorte für Färbung und Bildgebung aufrechterhalten, anstatt weiterzuführen.
8. Minimieren Sie störende Stressfaktoren während der Kulturpflege durch konsequente Medienvorbereitung, regelmäßige Fütterungspläne und regelmäßige Handhabungszeiten außerhalb des Inkubators. Behandeln Sie Temperaturschwankungen, verlängerte Zeit außerhalb kontrollierter CO₂ und inkonsistente Erwärmung in den Medien als Quellen vermeidbarer technischer Variabilität.
9. Optional: Halten Sie abgestimmte Kulturen unter Sauerstofftemperatur und niedrigem Sauerstoff. Kulturen unter 21 % O₂ und unter 5 % O₂ als separate Kohorten zu halten und jede Kohorte bei der routinemäßigen Kulturbehandlung unter ihrem zugewiesenen Sauerstoffzustand zu halten, wenn möglich. Begrenze die Exposition gegenüber Umgebungssauerstoff während der Übertragungen und der Bildvorbereitung für sauerstoffarme Kohorten.
   HINWEIS: Ein praktischer Pausenpunkt erfolgt nach der Definition und Stabilisierung von Early-Passage- und Late-Passage-Kohorten sowie der Bestätigung, dass Late-Passage-Kulturen ein konsistentes verlangsamtes Wachstum und seneszenzassoziierter Morphologie zeigen.

3. Lebendzellige lysosomale und nukleare Färbung mit LysoTracker Deep Red und einem nuklearen Farbstoff

1. Platten von IMR-90-Zellen für alle experimentellen Bedingungen in klaren Bildplatten oder Glasbodenplatten. Beziehen Sie eine Kontrollbedingung mit niedriger Senezenz und mindestens eine durch den ausgewählten Auslöser erzeugte Bedingung mit hoher Seneszenz-Bedingung ein und fügen für jede Bedingung biologische Replikate hinzu.
2. Samenzellen, um am Tag der Färbung eine subkonfluente Monoschicht zu erreichen. Erfassen Sie die Saatdichte und die Zeit zwischen Anplattierung und Färbung für jedes Experiment, um die Vergleichbarkeit von Lauf zu Lauf zu unterstützen.
3. Erwärme das Vollkulturmedium auf 37 °C. Bereite eine LysoTracker Deep Red Arbeitslösung bei 75 nM im erwärmten Medium vor und schütze sie vor Licht. Die Arbeitslösung wird hergestellt, indem der 1 mM LysoTracker Deep Red Schaft (vom Hersteller in DMSO geliefert) 1:13.333 in erwärmtem Komplettkulturmedium verdünnt wird (zum Beispiel 0,75 μL 1 mM Schaft pro 10 mL erwärmtes Medium).
   HINWEIS: Spätpassage- und stressinduzierte seneszente Zellen akkumulieren Lipofuscin und anderes unspezifisches autofluoreszierendes Material, das über breite Wellenlängenbereiche emittiert und zu einem scheinbaren LysoTracker-Signal in unverfärbten Kontrollen beitragen kann¹⁴. Um den Beitrag der Autofluoreszenz in einem gegebenen Experiment abzuschätzen, sollten Sie pro Bedingung mindestens einen unverfärbten Brunnen einbauen und unter identischen Bildaufnahmen aufnehmen. Subtrahieren Sie das mittlere Signal für ungefärbte Bohrlöcher von den Messungen oder geben Sie sowohl Roh- als auch Basiswerte ab.
   HINWEIS: In der Praxis ist das ungefärbte LysoTracker-Kanalsignal in IMR-90-Kulturen im Vergleich zum gefärbten seneszenten Signal gering (etwa 5 % bis 10 % des gefärbten seneszenten Mittelwerts im vorliegenden Datensatz), aber der Beitrag steigt mit der Passagenzahl und kann in tief seneszenten oder onkogen-induzierten seneszenten Kulturen erheblich werden (mehr als 20 %) ^6,14. Überprüfen Sie stets die Magnitude der Autofluoreszenzstärke, wenn Sie dieses Protokoll für einen neuen Zelltyp oder ein neues Senezenz-Induktionsmodell verwenden.
4. Bereiten Sie eine ausreichende LysoTracker-Arbeitslösung für alle Brunnen vor, die im Lauf verfärbt werden. Mische die Arbeitslösung durch sanfte Inversion und halte sie bis zur Anwendung vor Licht geschützt.
5. Saugen Sie aus jedem Brunnen abgebranntes Medium ab. Fügen Sie die LysoTracker-Arbeitslösung vorsichtig entlang der Wand des Brunnens hinzu, um eine Störung der Monoschicht zu vermeiden und ein gleichmäßiges Färbungsvolumen über die Brunnen hinweg zu gewährleisten.
6. Zellen mit LysoTracker 30 Minuten lang bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubieren. Halten Sie alle Versuchsgruppen unter derselben Inkubationsdauer und Temperatur.
7. Füge während der letzten 10 Minuten der LysoTracker-Inkubation einen lebenden nuklearen Farbstoff hinzu. Fügen Sie Hoechst 33342 direkt dem LysoTracker-haltigen Medium bei der vom Hersteller empfohlenen Arbeitskonzentration hinzu, zum Beispiel 1 μg/mL bis 2 μg/mL, und mischen Sie durch sanftes Schaukeln der Platte.
8. Entfernen Sie das Färbemedium am Ende der Inkubation. Spülen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
9. Fügen Sie unmittelbar nach der Spülung vorgewärmtes Phenol-Rot-freies Kulturmedium oder einen Bildpuffer hinzu. Gehen Sie direkt zur Live-Bildgebung über und halten Sie eine konstante Zeit zwischen dem Pufferaustausch und der Bildaufnahme in allen Bohrlöchern des Experiments aufrecht.
10. Schützen Sie die Platten vor Licht während der Übertragungen und der Bildbearbeitung. Minimieren Sie die Zeit außerhalb der kontrollierten Temperatur und CO₂-Bedingungen während der Handhabung und Bildaufnahme.
    VORSICHT: Handhabe fluoreszierende Farbstoffe mit Handschuhen und Augenschutz. Entsorge farbstoffhaltige Flüssigkeiten und kontaminierte Verbrauchsgüter gemäß institutionellen Chemikaliensicherheitsvorschriften.
    HINWEIS: Verwenden Sie nach Schritt 3.9 einen Pausenpunkt, wenn die Bildaufnahme mehrere Platten stufe. Halten Sie die Platten bei 37 °C vor Licht geschützt und nehmen Sie die Bildgebung so bald wie möglich wieder auf, um die Verfärbung zu minimieren.
    HINWEIS: Wenn das experimentelle Design Sauerstoff als Variable einschließt, halten Sie jede Kohorte während der Färbung und Inkubation unter ihrem zugewiesenen Sauerstoffzustand und zeichnen die Handhabungszeit außerhalb des zugewiesenen Zustands auf.

4. SA-β-Gal-Färbung zur Validierung (optional)

1. Verwenden Sie die SA-β-Gal-Färbung als optionalen Validierungsschritt, um zu bestätigen, dass die Senezenzhoch-Bedingung eine erhöhte SA-β-Gal-Aktivität im Vergleich zur Senezenz-niedrigen Kontrolle zeigt. Führen Sie eine Validierung an parallelen Bohrlöchern durch, die im gleichen Plattenformat und unter demselben Bearbeitungszeitraum wie die Bildbohrungen verarbeitet werden.
2. Vollständige Live-Imaging der Validierungsbohrlöcher vor der Fixierung. Wenn abgeglichene Vor- und Nachfixationsvergleiche desselben Feldes gewünscht werden (Abbildung 2), werden die Stufenkoordinaten bei der Aufnahme erfasst, jedes Feld nach Fixierung und Färbung manuell neu lokalisiert und die Kernposition und Zellmorphologie visuell überprüft, um sicherzustellen, dass abgestimmte Felder übereinstimmen, bevor sie in die nachgelagerte Analyse einbezogen werden.
3. Stellen Sie die Zellen mit der Fixationslösung fest, die im SA-β-Gal-Färbungsset bereitgestellt wird, das bei der empfohlenen 1x-Arbeitskonzentration mit 2 % Formaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd hergestellt wird. Inkubieren Sie 10 bis 15 Minuten bei Zimmertemperatur. Zum Vergleich: Die Fixationslösung enthält 2 % (w/v) Formaldehyd und 0,2 % (w/v) Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die SA-β-Gal-Färbelösung bei pH 6,0 enthält 1 mg/mL X-gal (5-Brom-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactopyranosid), das unmittelbar vor der Anwendung in Dimethylformamid gelöst ist, 40 mM Zitronensäure-/Natriumphosphatpuffer bei pH 6,0, 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl^₂12,13. Kommerzielle Bausätze, die diesen Spezifikationen entsprechen, können austauschbar verwendet werden, sofern der pH-Wert des Färbepuffers mit 6,0 verifiziert ist.
4. Entferne das Fixationsmittel und spüle zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus. Gib jedem Bohrloch eine SA-β-Gal-Färbelösung mit einem pH-Wert von 6,0 mit X-Gal-Substrat zu.
5. Versiegeln Sie die Platte, um die Verdunstung während der Brutzeit zu begrenzen. Stellen Sie den Teller für 12–16 Stunden in einen 37 °C, CO₂-freien Brutkasten.
6. Inspizieren Sie Brunnen mittels Hellfeldmikroskopie und dokumentieren Sie das Färbungsmuster. Erwache repräsentative Bilder für jede Erkrankung und gib bei der Validierung der Ergebnisse den Anteil der SA-β-Gal-positiven Zellen pro Bohrloch an.
   VORSICHT: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig und flüchtig. Bereiten Sie eine Fixationslösung in einer chemischen Abzugshaube vor und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Augenschutz und einen Laborkittel.
   HINWEIS: Wenn die SA-β-Gal-Färbung einen hohen Hintergrund in der Senezenz-niedrigen Kontrollphase oder eine schwache Färbung im Seneszenz-hohen Zustand zeigt, wird die Validierung nach Anpassung der Beschichtungsdichte, Fixierungsdauer, Inkubationsdauer und Temperaturkonsistenz wiederholt, wobei der Puffer-pH-Wert bei 6,0 gehalten wird.

Ergebnisse

Die Anwendung dieses Protokolls auf IMR-90-Fibroblasten unter senezenzniedrigen und seneszenzenshohen Bedingungen ergibt quantitative lysosomale Werte, die auf Einzelzellebene und, wenn gewünscht, auf Gesamtfeldebene zusammengefasst werden können.

Der repräsentative Datensatz, der in den Abbildungen und Tabellen dargestellt ist, stammt aus einem einzelnen biologischen Experiment, das IMR-90-Kulturen an Abschnitt 13 (P13; Senezenz-niedrig, ~PDL 26) und Passage ...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Live-Cell-Imaging-Workflow, der die Seneszenz mittels lysosomaler Remodellierung misst und quantitative Messungen der Senezenzbelastung pro Zell und Brunnen liefert. Mehrere Schritte sind besonders wichtig, um einen zuverlässigen Test zu erhalten. Erstens muss das biologische Modell selbst gut kontrolliert werden. Die Induktion der replikativen Seneszenz bei IMR-90-Fibroblasten erfordert eine sorgfältige Überwachung der Populationsverdopplungen und paral...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Well-Gewebekulturplatte (flach, TC-behandelt)	CellTreat Scientific Products	229124	Jede klare Mehrfachkulturplatte mit kompatiblem Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging (z. B. 6-, 12- oder 24-Well TC-behandelte Polystyrolplatten; Glasboden-Imaging-Platten können für höhere Auflösung bevorzugt werden).
Beta-Galaktosidase-Färbeset (Seneszenz-Assay)	Cell Signaling Technology	9860	Jedes kommerzielle SA-β-Galaktosidase-Kit mit verifiziertem Färbepuffer bei pH 6,0. Zur Referenz enthält die Fixierlösung 2% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS und die Färbelösung enthält 1 mg/ml X-gal in DMF, 40 mM Citrat/Phosphat pH 6,0, 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.
BioRender (Software für wissenschaftliche Illustration)	BioRender	N/A – Web-Anwendung	Zum Erstellen von schematischen Abbildungen (Abbildungen 1-3) verwendet. https://www.biorender.com
Kohlendioxidgas (CO2), komprimierte Flasche	Airgas (oder ähnlicher Lieferant)	N/A	Medizinisches CO2, das zur Aufrechterhaltung einer 5%igen Atmosphäre im Zellkulturinkubator und in der On-Stage-Imaging-Kammer verwendet wird.
Fötales Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviert	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Jedes Zellkultur-FBS, das bei 56 °C hitzeinaktiviert ist; wird zu 10 % v/v in vollständigem Kulturmedium verwendet.
Fluoreszenzmikroskop mit Live-Zell-Fähigkeit	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Jedes Breitfeld- oder konfokales Fluoreszenzmikroskop mit Live-Zell-Temperatur- und CO2-Kontrolle, Filtersätzen für fernrot (Excitation ~647 nm / Emission ~670 nm) und DAPI/Hoechst (Excitation ~405 nm / Emission ~460 nm) Kanäle und einem 20x-40x Objektiv mit ausreichender NA zur Auflösung lysosomaler Merkmale. Das EVOS M7000 Imaging System wurde in dieser Studie verwendet.
Hoechst 33342 Kernfärbung	Thermo Fisher Scientific	H3570	Zellpermeabler DNA-Farbstoff für Live-Zell-Kernfärbung (blaue Fluoreszenz, Excitation ~405 nm). Nicht austauschbar mit DAPI, das unter physiologischen Bedingungen nicht zellpermeabel ist.
Bildanalysesoftware	Python Software Foundation	N/A	Jede wissenschaftliche Berechnungsumgebung, die Kernsegmentierung, Kern-zu-Zellbereichserweiterung, Intensitätsschwellenwert und grundlegende Bildstatistiken unterstützt (z. B. Python mit scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). Die SenTrack-Pipeline (siehe Ergänzungsdatei S1) wurde für diese Studie entwickelt.
IMR-90 humane Lungenfibroblasten (Zellinie)	ATCC	CCL-186	Normale humane fötale Lungen-Diploid-Fibroblasten-Zellinie, die zur Modellierung der zellulären Seneszenz verwendet wird; jede ähnlich charakterisierte humane Fibroblastenlinie kann substituiert werden.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Acidotropes Fluoreszenzfarbstoff für Live-Zell-Färbung von sauren Organellen; wird als 1 mM Vorrat in DMSO geliefert. Die Arbeitskonzentration beträgt 75 nM in vorbereitetem Zellkulturmedium.  Fernrotemission (ex 647 nm / em 668 nm) minimiert die Überlappung mit der Lipofuszine-Autofluoreszenz, eliminiert sie aber nicht.
Minimum Essential Medium (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Basalkulturmedium für IMR-90-Fibroblasten; ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Jede Standardformulierung von Eagle's Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen und L-Glutamin kann substituiert werden.
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Antibiotisches Supplement für vollständiges Kulturmedium; wird zu 1 % v/v verwendet (Endkonzentration 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin). Jede Standard Pen-Strep-Lösung kann substituiert werden.
Phenolrot-freies Imagingmedium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	Phenolrotfreies DMEM oder HBSS, das für Live-Zell-Imaging verwendet wird, um die Hintergrundfluoreszenz während der Aufnahme zu reduzieren. FluoroBrite DMEM ist eine häufig verwendete Option; jedes phenolrotfreie Imaging-Puffermedium, das mit 10% FBS ergänzt wurde, kann substituiert werden.
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (1x)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Isotonischer Puffer für Zellwäsche und Reagenzverdünnung; jedes sterile 1x PBS bei pH 7,4 kann substituiert werden.
SenTrackLite v0.5.0 (Software)	Open-Source (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Open-Source-Einzeldatei-Python/Tkinter-Anwendung für lysosomale Seneszenz-Bildanalyse. Als Ergänzungsdatei S1 verteilt. Archiviert bei Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT-Lizenz. Quelle: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Stage-Top-Umgebungskammer	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	Umgebungskammer für Live-Zell-Imaging am Mikroskop mit Temperatur (37 °C) und CO2 (5%) Kontrolle. Das EVOS Onstage Incubator wurde in dieser Studie verwendet; jede gleichwertige Stage-Top-Inkubator kann substituiert werden.