Etablierung einer epithelial-endothelialen Kokultur der Lunge auf einem Chip zur Untersuchung bei gesunden und COPD-Erkrankungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll etabliert ein dynamisches Lungen-auf-einem-Chip-Kokultursystem, das menschliche primäre Atemwegepithel und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen für zwei Modelle kombiniert: gesunde und COPD-Modelle. Das System reproduziert Atemweg-Gefäß-Interaktionen unter Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche und -strömung und bietet Barrierebewertung, Zellphänotypisierung und RNA-Analyse.

Zusammenfassung

Zwei dynamische Lungen-auf-einem-Chip-Kokulturmodell wurden entwickelt, um die Atemweg-Gefäß-Schnittstelle durch Einbeziehung primärer Atemwegsepithelzellen und pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen nachzubilden. Ein Modell verwendet kommerziell verfügbare Zellen gesunder Spender, während das andere Zellen von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) verwendet, was einen direkten Vergleich gesunder und kranker Zustände unter identischen Kulturbedingungen ermöglicht. Beide Modelle unterstützen die epitheliale Differenzierung unter kontinuierlichen Perfusions- und Luft-Flüssigkeits-Schnittstellenbedingungen (ALI), was zu einer physiologisch relevanten Epithelbarriere führt, die von einer darunterliegenden Endothelschicht unterstützt wird. Der Arbeitsablauf umfasst die extrazelluläre Matrixbeschichtung, Zellaussaatung, ALI-Etablierung, Bewertung der Barrierefunktion, Zellphänotypisierung und zelltypspezifische RNA-Extraktion. Permeabilitätstests zeigten eine robuste Barrierenintegrität in beiden Systemen, während die Immunfluoreszenz eine kontinuierliche Lokalisierung von Zonula Occludens-1 (ZO-1) und dem vaskulären endothelialen Cadherin (VE-Cadherin) an Zellverbindungen bestätigte. Die Epitheldifferenzierung wurde durch β-Tubulin-IV-Färbung und Visualisierung des Ziliarschlags bestätigt. Hochwertige RNA wurde separat aus jedem Kompartiment gewonnen, was zelltypspezifische molekulare Analysen unterstützte. Das COPD-Modell wiederholte zentrale Merkmale der Krankheit, insbesondere eine erhöhte Schleimproduktion, ohne die Barrierenfunktion oder die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Die Verwendung von patientenabgeleiteten Epithel- und Endothelzellen bewahrt individuelle pathologische Merkmale und ermöglicht die Untersuchung interzellulärer Mechanismen bei COPD. Dieser Ansatz bietet eine physiologisch relevante Alternative zu statischen In-vitro- und Tiermodellen und unterstützt präklinische Studien zu inhalierten Arzneimitteln, Pathogenexposition und epithelial-endothelialen Interaktionen. Wichtig ist, dass die gesunden und COPD-Lungen-auf-einem-Chip-Modelle entweder in Kombination für direkte vergleichende Studien oder unabhängig für mechanistische Untersuchungen, therapeutische Tests und Arzneimittelentwicklung verwendet werden können. Das System kann auch an andere Atemwegserkrankungen mit veränderten Epithel- oder Endothelkompartimenten angepasst werden und bietet so eine vielseitige und translationale Plattform für die Atemforschung.

Einleitung

Die Wechselwirkung zwischen Atemwegsepithelzellen und pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Lungenhomöostase und die Koordination der Reaktionen auf Verletzungen, Infektionen und Entzündungen. Zusammen bilden diese Zelltypen eine funktionelle Barriere, die den Gasaustausch, die Immunüberwachung und die Gefäßdurchlässigkeit reguliert. Ihr dynamisches Übersprechen umfasst parakrine Signalübertragung, direkte Zell-Zell-Interaktionen und Reaktionen auf mechanische Reize, die alle entscheidend für die Lungenfunktion und die strukturelle Integrität^{sind 1}.

Bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), einer fortschreitenden Lungenerkrankung, die durch chronische Entzündungen, Atemwegsanordnung und Zerstörung der Alveolar-Kapillar-Schnittstelle gekennzeichnet ist, ist die Barrierfunktion sowohl des Atemwegepithels als auch des pulmonalen Gefäßendothels beeinträchtigt und begleitet von abweichenden Zytokinfreisetzungen und dysregulierten Gewebereparaturmechanismen ^2,3. Das Zusammenspiel zwischen den mikrovaskulären Endothelzellen der Atemwege und den pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen ist jedoch weiterhin wenig verstanden. Diese Einschränkung ist teilweise auf die Mängel bestehender In-vitro- und In-vivo-Modelle zurückzuführen. Obwohl Tiermodelle wichtige Erkenntnisse in die Atemphysiologie und -pathologie geliefert haben, ist ihre Relevanz durch interspezifische Unterschiede in Immunfunktion, Lungenarchitektur, zellulärer Signalübertragung und Arzneimittelstoffwechsel begrenzt, was die Übersetzung in die menschliche Biologie behindern kann.

Konventionelle In-vitro-Systeme, wie zweidimensionale (2D) Kulturen unsterblicher Epithelzelllinien der Atemwege, können wichtige Merkmale des Atemwegepithels nicht wiederholen, einschließlich der richtigen Differenzierung und biomechanischer Reaktionsfähigkeit. Obwohl dreidimensionale (3D) Luft-Flüssigkeit-Interface (ALI)-Monokulturen primärer Atemwegepithelzellen die physiologische Relevanz verbessern, bleiben sie statisch und haben keine Interaktionen mit anderen Zelltypen und mechanischen Reizen⁴. Die Lunge ist ein dynamisches Organ, das kontinuierlich Luftstrom, Scherspannung, extrazellulärer Matrixsteifigkeit und zyklischer Dehnung durch Atmung ausgesetzt ist. Diese Faktoren beeinflussen das zelluläre Verhalten und die Geweberemodellierung^{stark 5}. Daher reichen statische Modelle nicht aus, um Prozesse wie Leukozytenadhäsion, Immunzelltransport und Echtzeitreaktionen auf Arzneimittelexposition zu replizieren.

Um diese Einschränkungen zu beheben, sind Organ-on-a-Chip-Plattformen als fortschrittliche Systeme zur Modellierung komplexer zellulärer Interaktionen entstanden. Lunge-on-a-Chip-Modelle integrieren mikrofluidische Technologie mit menschengeleiteten Zellen, um wichtige strukturelle und mechanische Merkmale der Lungenmikroumgebung zu replizieren. Diese Plattformen ermöglichen die Kokultivierung von Atemwegsepithelzellen und pulmonalen Gefäßendothelzellen innerhalb einer dynamischen, dreidimensionalen Umgebung, die in vivo ^{Bedingungen enger} nachahmt. Die Integration physiologischer Atembewegungen, Flüssigkeitsfluss und Echtzeitüberwachung verbessert das Studium der Epithel-Endothel-Kommunikation unter normalen und kranken Bedingungen^7–9.

Trotz dieser Fortschritte verlassen sich die meisten bestehenden Lungen-auf-einem-Chip-System auf Zellen, die von gesunden Spendern¹⁰ stammen, was ihre Fähigkeit einschränkt, krankheitsspezifische Interaktionen zu modellieren. Darüber hinaus fehlt vielen Plattformen die Flexibilität, Patientenzellen zu integrieren oder die komplexe COPD-Mikroumgebung nachzubilden. Darüber hinaus bleiben detaillierte Protokolle zur Kokultivierung primärer Atemwegsepithel- und pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen – sei es aus kommerziellen Quellen oder von COPD-Patienten – unter Verwendung zelltypspezifischer extrazellulärer Matrix (ECM)-Beschichtungen begrenzt.

In dieser Studie wurde eine kommerziell erhältliche zweikanalige mikrofluidische Lungen-auf-einem-Chip-Plattform verwendet, um zwei Kokulturmodelle zu etablieren, die primäre Atemwegepithel und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen umfassen. Ein gesundes Modell wurde mit kommerziell erhältlichen Zellen erstellt, die von verschiedenen Spendern stammen, während ein COPD-Modell mit Atemwegsepithel- und Endothelzellen vom selben Patienten entwickelt wurde. Beide Modelle verwenden eine zelltypspezifische ECM-Beschichtung, um die in vivo Lungenmikroumgebung besser nachzuahmen. Diese Systeme ermöglichen die Untersuchung von Epithel-Endothel-Wechselwirkungen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die gesunden und COPD-Modelle können entweder in Kombination für direkte vergleichende Studien oder unabhängig für mechanistische Untersuchungen und therapeutische Tests verwendet werden.

Dieses Kokultursystem spiegelt die anatomische Organisation des Atemwegsepithels und der Lungengefäße wider, die als integrierte Epithel-Endothel-Einheit fungieren. Das Atemwegepithel ist eine pseudostratifizierte Schicht, die aus bakalen, sekretorischen und ciliierten Zellen besteht, die sich über einer vaskularisierten Bindegewebeschicht (lamina propria) befindet und durch eine Basalmembran vom Endothel getrennt ist. In diesem Modell nähert sich die ECM-Beschichtung (Kollagentyp I, Fibronektin und Laminin) der Zusammensetzung von Epithel- und Endothelbasalmembranen. Die poröse Membran, die die beiden Kanäle trennt, ähnelt das subepitheliale Bindegewebe, weist jedoch keine vaskuläre Komplexität auf. Mehrere Mechanismen tragen zur Epithel-Endothel-Kommunikation bei, darunter parakrine Signalübertragung, koordinierte Regulation der Permeabilität, Rekrutierung von Immunzellen und Reaktionen auf mechanische Reize wie ateminduzierte Dehnung, die den vaskulären Widerstand und die Mechanotransduktionswege beeinflussen.

Diese methodische Studie beschreibt die notwendigen Schritte, um ein vollständig differenziertes Atemwegsepithel zu etablieren, das unter Luft-Flüssig-Schnittstellenbedingungen (ALI) mit einem darunterliegenden pulmonalen mikrovaskulären Endothel kultiviert wird. Das System ermöglicht eine qualitative und funktionale Bewertung der Barrierenintegrität und erreicht reproduzierbare scheinbare Permeabilitätswerte (Papp) ≤ 1 × 10⁻⁶ cm/s. Zusätzlich werden Protokolle für die Zellphänotypisierung sowie für die Extraktion und Quantifizierung von RNA aus jedem Kompartiment bereitgestellt, was durchgehend hochwertige RNA (RNA-Integritätsnummer > 7) ergibt. Diese Methode ist nicht für quantitative mRNA-Analysen oder detaillierte Bewertungen der Schleimbildung gedacht, noch untersucht sie die Auswirkungen mechanischer Dehnung, obwohl solche Anwendungen mit diesem System möglich sind.

Protokoll

Die gesamte Verwendung primärer menschlicher Zellen wurde vom Lokalen Ethikkomitee UZ Leuven genehmigt (S51577/S57114/S70453). Kommerziell verfügbare primäre humane bronchiale Epithelzellen (HBEC) und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HPMEC) wurden von zwei nichtrauchenden Spendern gewonnen (ergänzende Tabellen 1, 2). Primärzellen des COPD-Modells wurden aus explantiertem Lungengewebe von drei COPD-Patienten mit Rauchvorgeschichte isoliert (ergänzende Tabelle 3), gemäß einem gut etablierten Protokoll (ethische Zulassung S51577) und in der BREATHE-Biobank gespeichert. Sowohl HBEC als auch HPMEC wurden vom selben COPD-Patienten gewonnen.

Um das gesunde Modell der Lunge auf einem Chip zu etablieren, wurden kommerzielle HBEC und HPMEC eingesetzt. Für das COPD-Modell wurden primäre bronchiale epitheliale und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen aus explantiertem Lungengewebe isoliert, das nach einer Lungentransplantation vom selben Patienten gewonnen wurde. Das in dieser Studie verwendete Lunge-on-a-Chip-System ist eine mikrofluidische Zweikanalplattform, die aus parallelen Atemwegs- (oben) und Gefäß- (unten) Mikrokanälen besteht, die durch eine poröse, extrazelluläre, matrixbeschichtete Membran getrennt sind (Abbildung 1). Dasselbe Protokoll wurde verwendet, um sowohl gesunde als auch COPD-Modelle zu erstellen. Die im Protokoll verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Kits sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Etablierung der Lungen-auf-einem-Chip-Kokulturmodell unter laminarer Strömung

1. Chipvorbereitung
   1. Setzen Sie die Chip-Halterung in eine 120-mm-quadratische Zellkulturschale mit den Ecken nach oben, um die korrekte Ausrichtung sicherzustellen, und legen Sie die Chips dann in die Wiebe. Stellen Sie sicher, dass alle Chips vor dem Aktivierungsschritt korrekt platziert sind (Abbildung 2).
   2. Die Aktivierungslösung wird hergestellt, indem das Aktivierungsreagenzpulver in seinem entsprechenden Puffer, beide vom Hersteller geliefert, gelöst werden, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erreichen.
   3. Aktivieren Sie die inneren Oberflächen der Chipkanäle, um die Befestigung der extrazellulären Matrix (ECM) zu fördern, indem Sie vorsichtig etwa 35 μL der Aktivierungslösung durch den unteren Kanaleinlass einführen. Pipetten, bis die Lösung am unteren Kanalausgang austritt. Wiederholen Sie das Verfahren, indem Sie etwa 50 μL der Lösung in den Einlass des oberen Kanals einführen.
      HINWEIS: Das Aktivierungsreagenzpulver ist lichtempfindlich. Bereite die Aktivierungslösung unmittelbar vor der Anwendung vor und entsorge alle restlichen Lösungen 1 Stunde nach der Wiederaufbau.
   4. Entfernen Sie jegliche überschüssige Aktivierungslösung von der Chipoberfläche durch sanfte Aspiration. Achten Sie darauf, die Aktivierungslösung nur von der Chipoberfläche zu entfernen – saugen Sie sie nicht aus den Kanälen.
      HINWEIS: Vor der UV-Aktivierung werden die Kanäle unter dem Mikroskop untersucht, um Blasen zu erkennen. Falls vorhanden, lösen Sie sie durch vorsichtiges Waschen mit einer Aktivierungslösung, bis alle Blasen entfernt sind.
   5. Belichte die Chips 10 Minuten lang einer UV-Lampe und wasche dann jeden Kanal zweimal mit 200 μL des entsprechenden Puffers.
   6. Pipettiere frische Aktivierungslösung in beide Kanäle wie oben beschrieben und setze die Chips für weitere 5 Minuten UV-Licht aus.
   7. Vollständig aspirieren Sie die Lösung aus beiden Kanälen, waschen Sie jeden Kanal zweimal mit 200 μL entsprechendem Puffer und waschen Sie dann jeden Kanal einmal mit 200 μL steriler, kaltphosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (DPBS -/-).
   8. Bereiten Sie eine ECM-Beschichtungslösung in DPBS (-/-) vor, die humanes Kollagen Typ I (100 μg/mL), humanes Fibronektin (50 μg/mL) und humanes Laminin (50 μg/mL) enthält. Verwenden Sie 100 μL Lösung als Referenzvolumen pro Chip.
   9. Fügen Sie 50 μL zum oberen Kanal und 35 μL zum unteren Kanal hinzu, während gleichzeitig der Abfluss durch die Auslassanschlüsse abgesaugt wird.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die Kanäle unter dem Mikroskop, um Blasen zu erkennen. Falls vorhanden, waschen Sie vorsichtig mit der ECM-Lösung, um sie zu entfernen.
   10. Hinterlassen Sie kleine Tröpfchen ECM-Lösung sowohl an Ein- als auch an Auslasskanälen, um während der nächtlichen (ON) Inkubation eine Verdunstung zu verhindern.
   11. Die Chips ON bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren. Am nächsten Tag aspirieren Sie die ECM-Lösung und waschen Sie beide Kanäle mit 200 μL vorgewärmtem DPBS (-/-) bei 37 °C.
2. Zellsäung und untergetauchte Kultur
   Expandieren Sie HBEC in T25 cm² Kolben, die mit humanem Kollagen Typ IV (150 μg/mL in DPBS (-/-)) beschichtet sind, unter Verwendung eines Epithelzell-Expansionsmediums der Atemwege, bis eine Konfluenz von 60 %–70 % erreicht ist.
   Parallel dazu expandieren Sie HPMEC in T75 cm² Kolben, die mit Gelatine beschichtet sind (2 mg/ml in DPBS (-/-)) unter Verwendung von Endothelzellwachstumsmedium (EC), bis eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreicht ist.
   Siehe Ergänzende Tabelle 4 zur Zusammensetzung der wichtigsten Reagenzien und Kulturmedien.
3. Aussaat von HPMEC
   1. Aspiriere das Medium. Wasche die Zellen mit 10 mL DPBS (-/-).
   2. Fügen Sie 3 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu (1X). Inkubiere 30 Sekunden bei Raumtemperatur (RT).
   3. Füge 12 ml EC Growth Medium hinzu (4× dem verwendeten Trypsin-Volumen), um Trypsin zu inaktivieren. Fügen Sie 5 ml EC-Wachstumsmedium hinzu, um eventuelle Restzellen zu sammeln (Endvolumen = 20 ml).
   4. Vollständige Zellablösung unter dem Mikroskop bestätigen.
   5. Zähle ~20 μL lebende Zellen mit Trypan-Blau.
   6. Zentrifugiere die verbleibende Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei RT in einem 50-mL konischen Rohr.
   7. Das Pellet in einem EC-Wachstumsmedium wieder suspendieren. Auf 7 × 10^{6 Zellen} /mL einstellen.
   8. Säe HPMEC (Durchgang 5) in den unteren Kanal (~20 μL; 1,4 × 105^Zellen /Kanal).
   9. Die Chips sofort invertieren und 2 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren (Abbildung 3).
   10. Chips in die ursprüngliche Ausrichtung zurückbringen.
   11. Waschen Sie mit 200 μL warmem (37°C) EC Wachstumsmedium.
   12. Überprüfen Sie die Befestigung unter dem Mikroskop. Verlängere die Inkubation bei Bedarf.
4. Setzung HBEC
   1. Aspiriere das Medium. Waschen Sie mit 5 ml warmem DPBS (-/-).
   2. Gib 1 ml Trypsin dazu. Inkubiere 5 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   3. Überwachen Sie die Abtrennung unter dem Mikroskop.
   4. Fügen Sie 1 ml definierten Trypsininhibitor (DTI) im Verhältnis 1:1 hinzu, um Trypsin zu inaktivieren.
   5. Fügen Sie 8 ml Epithelzell-Expansionsmedium hinzu (Endvolumen = 10 ml).
   6. Auf eine 50-mL-Röhre übertragen.
   7. Nehmen Sie ~20 μL für die Zellzählung mit Trypan-Blau.
   8. Zentrifugiere die verbleibende Zellsuspension bei 200 × g für 5 Minuten bei RT.
   9. Entsorge das Supernatant.
   10. Das Pellet in einem Medium der Epithelzelle der Atemwege wieder suspendieren. Einstellen auf 3,5 × 10^{6 Zellen} /mL.
   11. Ergänzen Sie das Expansionsmedium der Atemwegsepithelzellen mit 50 nM synthetischer, lichtstabiler Retinsäure und 10 ng/mL rekombinantem menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (rhEGF).
   12. Same HBEC (Durchgang 2) in den oberen Kanal (~35 μL; 1,2 × 10⁵ Zellen/Kanal).
   13. Inkubieren Sie 4 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ (Abbildung 4).
   14. Ersetze Medium in beiden Kanälen.
   15. Inkubieren Sie über Nacht (ON) unter statischen Bedingungen bei 37 °C mit 5 % CO₂.
       HINWEIS: Ab diesem Schritt verwenden Sie für alle Schritte nur noch entgastes Medium. Die Entgasung muss mit einer Steriflip-Einheit durchgeführt werden, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist, um das Risiko der Blasenbildung im Chip zu minimieren.
5. Verbindung zum Fluss
   1. Fügen Sie warmes (37°C) Epithel-Expansionsmedium der Atemwege, ergänzt mit synthetischer, lichtstabiler Retinoinsäure und RhEGF, zum oberen Einlassreservoir hinzu.
   2. Fügen Sie warmes (37°C) EC Wachstumsmedium in das untere Einlassreservoir hinzu.
   3. Füllen Sie jeden Einlassbehälter mit 3 mL Medium und jeden Auslaufbehälter mit 300 μL.
   4. Platziere die tragbaren Module in das Kulturmodul (Abbildung 5).
   5. Drücken Sie den Knopf, um mit dem Drehregler den "Prime"-Zyklus auszuwählen.
   6. Drücken Sie den Knopf, um den Zyklus zu starten .
   7. Lass den Zyklus laufen (~1 Min.).
   8. Inspizieren Sie den Boden jedes Moduls auf Tröpfchen an allen vier fluidischen Kanälen.
   9. Wiederhole den "Prime"-Zyklus, wenn keine Tröpfchen sichtbar sind.
   10. Wasche beide Chip-Kanäle einmal mit dem passenden Medium.
   11. Lassen Sie an jedem Ein- und Auslass einen Tropfentropfen, um die Bildung von Blasen zu verhindern.
   12. Halte den Chip in der dominanten Hand und das tragbare Modul in der anderen Hand.
   13. Schiebe den Chip in die Schienen, bis er vollständig sitzt.
   14. Setze die zusammengebaute Einheit in das Kulturmodul.
   15. Stellen Sie den Durchfluss für beide Kanäle mit dem Drehregler auf 30 μL/h ein.
   16. Halten Sie die Bedingungen der Flüssigkeit-Flüssigkeit-Grenzfläche (LLI) aufrecht.
   17. Bewahren Sie die Chips am Modul unter der Flüssigkeit-Flüssigkeit-Grenzfläche (LLI), um eine einheitliche Bildung von Epithel- und Endothelschichten zu ermöglichen
   18. Ersetze Medium alle 3 Tage. Aspirationsmedium aus Auslassreservoirs. Gib jedem Einlassbehälter 3 ml frisches Medium hinzu.
       HINWEIS: Beobachte unter dem Mikroskop auf Blasen. Falls vorhanden, trennen Sie den Chip ab, bündigen Sie die Kanäle mit Medium und verbinden Sie sie wieder.
6. Epithelzelldifferenzierung und Luftflüssigkeits-Schnittstellenkultur
   1. Überwachen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop.
   2. Bestätigen Sie die Bildung einer homogenen Epithelzellschicht ohne Lücken (typischerweise 3–5 Tage).
   3. Stellen Sie die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) her.
   4. Saugmedium aus den oberen Ein- und Auslassbehältern ab.
   5. Spülen Sie das Restmedium aus dem oberen Kanal, indem Sie die Durchflussrate mit dem Drehregler auf 600 μl erhöhen
   6. Saugmedium wird schnell aus den oberen Auslassreservoirs abgesaugt.
   7. Aspiratiere Medium aus den Reservoirs am unteren Einlass.
   8. Fügen Sie ein 3 ml epitheliales Differenzierungsmedium hinzu, ergänzt mit 10 ng/mL vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) und 1 μg/mL Vitamin C.
   9. Stellen Sie den oberen Kanal mit dem Drehregler auf "Air" ein.
   10. Stellen Sie den Durchfluss des unteren Kanals auf 30 μL/h ein.
   11. Halten Sie die ALI-Kultur 2 Wochen lang aufrecht.
   12. Beobachten Sie die Entwicklung der epithelialen Differenzierung unter dem Mikroskop.
   13. Bestätigen Sie die Bildung eines pseudostratifizierten Epithels. Überwachen Sie das Schlagen der Cilien und die Schleimbildung.
   14. Überwachen Sie die Morphologie der Endothelzellen an Ein- und Auslassregionen.

Abbildung 1: Mikrofluidische Lungen-auf-einem-Chip-Plattform. Querschnitt (links) und Draufsicht (rechts) des zweikanaligen mikrofluidischen Lungen-auf-einem-Chip-Geräts. Die schematischen Abbildungen dienen nur zu illustrativen Zwecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Positionierung des Chips in der Chip-Wiege. Repräsentatives Bild, das die korrekte Ausrichtung der Chip-Wiege und die Platzierung des Chips zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Endothelzell-Seedung im mikrofluidischen Chip. Repräsentative Brightfield-Bilder pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen unmittelbar nach der Aussaat (A) und nach 2 Stunden Inkubation (B). Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Auszaat der Apithelzellen der Atemwege im mikrofluidischen Chip.
Repräsentative Brightfield-Bilder von Epithelzellen der Atemwege unmittelbar nach der Aussaat (A) und nach 4 Stunden Inkubation (B). Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Konfiguration des mikrofluidischen Lungen-auf-einem-Chip-System.
Der obere Teil der Abbildung zeigt das tragbare Modul mit vier Reservoirs (zwei Einlässe und zwei Auslass), die für mittlere Zufuhr und Abwasserableitung genutzt werden. Das mikrofluidische Gerät ist mit einem Kulturmodul verbunden, das die Durchflussraten regelt, sowie mit einem Hubmodul, das Gas, Luft und Strom liefert. Die schematische Darstellung dient nur zu illustrativen Zwecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Bewertung der Barrierenintegrität

Die Barriereintegrität wurde auf zwei Arten bewertet: Erstens funktional durch Bewertung der Permeabilität für fluoreszenzmarkierte Dextran über die Zeit (vor ALI und nach 10 Tagen ALI), und zweitens qualitativ durch Immundetektion von Zonula Occludens-1 (ZO-1) im Bronchialepithel und Vaskulärem Endothelial-Cadherin (VE-Cadherin) im pulmonalen Gefäßendothel.

1. Barrierenfunktion
   1. Unter dem laminaren Fluss werden 1 ml epitheliales Differenzierungsmedium mit VEGF und Vitamin C ergänzt und mit 100 μg/mL fluoreszierend markiertem Dextran dem oberen Einlassreservoir des Atemwegs hinzugefügt. Gleichzeitig wird 1 ml Tracer-freies Medium in das untere Einlassreservoir des Gefäßkanals gegeben.
   2. Führen Sie das Medium, das den Tracer enthält, in den oberen Kanal ein. Mit dem Drehregler stellen Sie die Durchflussrate in beiden Kanälen für 3 Minuten auf 600 μL/h ein und saugen Sie dann das Medium aus den oberen und unteren Auslassbehältern an.
   3. Setze den Chip, der mit dem tragbaren Modul verbunden ist, zurück ins Kulturmodul. Mit dem Drehregler stellen Sie beide Kanäle auf eine Durchflussrate von 45 μL/h ein und halten Sie diese Durchflussrate für 3 Stunden aufrecht.
   4. Sammeln Sie 100 μL Medium aus den oberen und unteren Auslassreservoirs und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Plattenleser.
   5. Berechnen Sie die scheinbare Permeabilität (Papp) mit der Permeabilitätsgleichung:
      
      wobei SA die Oberfläche des Kokulturkanals (0,17 cm²) darstellt, Q_R und Q_D die Strömungsraten in den Dosierungs- bzw. Empfangskanälen (cm³/s) und C_R,0 und C_D,0 den zurückgewonnenen Konzentrationen im Dosierungs- bzw. Empfangskanal entsprechen.
      HINWEIS: Ein Papp-Wert unter 1 x 10^–6 cm/s weist auf eine starke Barriereintegrität hin, was die geringe Durchlässigkeit der Epithelschicht für den Tracer widerspiegelt. Diese Schwelle wird vom Systemhersteller als interne Qualitätskontrollmaßnahme festgelegt.
2. Immundetektion von engen und adhärenten Übergängen
   1. Nach zwei Wochen ALI entferne den Chip vorsichtig aus dem tragbaren Modul.
   2. Fixiere die Zellen, indem du 50 μL 4%-Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei RT zu beiden Kanälen hinzufügst.
      VORSICHT: PFA ist toxisch; Führen Sie alle Schritte in einer zertifizierten chemischen Abzughaube durch.
   3. Waschen Sie beide Kanäle zweimal mit 200 μL DPBS (-/-) und bewahren Sie die Chips bei 4 °C auf, bis sie gefärbt sind.
   4. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem 50 μL von 0,1 % Triton X-100 in DPBS (-/-) für 5 Minuten bei RT hinzugefügt werden. Dann blockiert man mit 50 μL 0,1 % Triton X-100 in DPBS (-/-) mit 10 % Ziegenserum pro Kanal für 1 Stunde bei RT.
   5. Inkubieren Sie den oberen (bronchialen epithelialen) Kanal mit 50 μL monoklonalem antihumanem ZO-1 Primärantikörper der Maus (1:100) und den unteren (pulmonalen endothelialen) Kanal mit 50 μL monoklonalem antihumanem VE-Cadherin-Primärantikörper des Kaninchens (1:600).
   6. Verdünnen Sie beide Antikörper in Antikörperlösung (0,1 % Triton X-100 in PBS (-/-) mit 1 % Ziegenserum) und inkubieren Sie ON bei 4°C unter statischen Bedingungen.
   7. Waschen Sie die Chips dreimal mit 200 μL DPBS (-/-). Anschließend wird jeder Kanal 1 Stunde lang bei RT mit 50 μL geeigneter, fluorophorkonjugierter sekundärer Antikörper in Antikörperlösung verdünnt (1:500) inkubiert: Ziegenanti-Maus-Sekundärantikörper im oberen Kanal und Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper im unteren Kanal.
   8. Waschen Sie beide Kanäle dreimal mit 200 μL DPBS (-/-). Führen Sie eine Kernfärbung mit 50 μL pro Kanal von 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI, 1 μg/mL in DPBS (-/-)) für 10 Minuten bei RT durch.
   9. Führen Sie eine Endwäsche mit 200 μL DPBS (-/-) durch und lagern Sie den Chip in DPBS (-/-) bei 4°C im Dunkeln bis zur Bildgebung.
   10. Fotografieren Sie die Chips auf Deckschichten (20x60 mm mit Dicke 0,16–0,19 mm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Drehscheibenmodul, einer hochempfindlichen Kamera und einem 20X-Objektiv (NA 0,8) ausgestattet ist. Verwenden Sie geeignete Bildaufnahme- und Analysesoftware für die Nachbearbeitung.

3. Phänotypisierung

1. Vorbereitung von Chip-Abschnitten
   1. Fixieren Sie die Chips mit 4 % PFA, wie in Abschnitt 2.2.2 beschrieben.
   2. Schneiden Sie das umgebende Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer Rasierklinge vom Chip ab.
   3. Füllen Sie beide Kanäle mit 50 μL 2 % niedrigschmelzendem Agarose in DPBS (-/-) und lassen Sie Agarose bei RT erstarren.
   4. Schneiden Sie den Chip quer in zwei Hälften mit einer Rasierklinge, legen Sie jede Hälfte in ein optimales Schneidetemperatur (OCT) Einbettmedium ein und lagern Sie bei −80 °C bis zum Schneiden.
2. Kryosektion
   1. Bereite einen Kryostat vor und schneide 200 μm Kryosektionen aus den Chip-Hälften.
   2. Sammeln Sie Chip-Abschnitte mit einer Pinzette in Brunnen einer 48-Wellen-Platte, die mit DPBS (-/-) gefüllt ist, und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Immunfärbung.
3. Immunfluoreszierende Färbung
   HINWEIS: Führen Sie jeden Schritt in der 48-Well-Platte durch und verwenden Sie 400 μL als Referenzvolumen.
   1. Permeabilisieren Sie die Zellen und blockieren die unspezifische Bindung, wie zuvor in Abschnitt 2.2.4 beschrieben.
   2. Inkubieren Sie jeden Abschnitt ON bei 4°C mit primären Antikörpern, die spezifisch für epitheliale ciliierte Zellen (β-Tubulin IV, 1:2000) oder für Endothelzellen (CD31, 1:25) sind, verdünnt in Antikörperlösung (0,1 % Triton X-100 in DPBS mit 1 % Ziegenserum).
   3. Waschen Sie Abschnitte dreimal mit DPBS (-/-).
   4. Inkubieren Sie Schnitte für 1 Stunde bei RT mit geeigneten fluorophorkonjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörpern (1:500) für β-Tubulin IV und CD31, verdünnt in Antikörperlösung, vor Licht geschützt.
   5. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit DPBS (-/-) und führen Sie eine nukleare Färbung mit DAPI (1 μg/mL in DPBS (-/-)) für 10 Minuten bei RT durch.
   6. Waschen Sie die Abschnitte einmal mit DPBS (-/-) vor der Montage.
   7. Setzen Sie mit einer Pinzette einen Abstandshalter auf jeden Objektträger und setzen Sie dann einen Abschnitt in die Mitte. Fügen Sie 1–2 Tropfen Montagemedium hinzu und legen Sie einen runden Deckmantel an.
   8. Lass sie bei RT im Dunkeln trocknen und versiegele dann die Deckdeckelkanten mit transparentem Nagellack.
   9. Lagere die Objektträger bei 4°C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme.
   10. Fotografieren Sie die Chipschnitte mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem Drehscheibenmodul, einer hochempfindlichen Kamera und einem 40X-Objektiv (NA 1.25). Verarbeiten Sie Bilder mit geeigneter Mikroskopiesoftware.

4. RNA-Extraktion und Quantifizierung

1. Sammlung von Zellen aus Chips unter laminarer Strömung
   1. Nach 2 Wochen ALI Kultur trennen Sie die Chips von den tragbaren Modulen und reinigen Sie beide Kanäle zweimal mit 200 μL DPBS (-/-), vorgewärmt bei 37 °C.
   2. Fügen Sie den Endothelzellen im unteren Kanal 35 μL 0,25 % Trypsin-EDTA (1X) hinzu und inkubieren Sie etwa 30 Sekunden bei RT.
   3. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die vollständige Ablösung zu bestätigen. Dann sammelt man die Zellsuspension in ein Rohr und zentrifugiert bei 900 × g für 5 Minuten bei RT.
   4. Das Zellpellet wird in 50 μL phenolbasiertem RNA-Isolationsreagenz erneut suspendiert und bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion gelagert.
   5. Fügen Sie 50 μL phenolbasiertes RNA-Isolationsreagenz direkt in den oberen Kanal hinzu, um die Epithelzellen zu lysieren, schließen Sie die Öffnungen mit Spitzen ab und inkubieren Sie 3-4 Minuten auf Eis.
   6. Vorsichtig pipettieren, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, Lysat in ein Rohr aufnehmen und es bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion aufbewahren.
   7. Untersuchen Sie beide Kanäle unter dem Mikroskop, um die vollständige Zellentnahme zu bestätigen.
2. RNA-Extraktion
   1. Chloroform hinzufügen (0,2 Volumen pro 1 Volumen phenolbasiertes RNA-Isolationsreagenz, das zur Lyse verwendet wird; 10 μL pro Probe), die Tuben gründlich durch Schütteln mischen und 2–3 Minuten auf Eis inkubieren.
   2. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um die Phasen zu trennen und die obere wässrige Phase vorsichtig in ein neues Rohr zu übertragen, ohne die Interphase zu stören. Dann fügen Sie 5 μg RNA-freies Glykogen als Träger zur wässrigen Phase hinzu.
   3. Isopropanol (0,5 Volumen pro 1 Volumen Lysereagens; 25 μL pro Probe) hinzufügen, Proben bei 4 °C für 10 Minuten inkubieren und bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
   4. Entsorge das Supernatant, während das RNA-Pellet erhalten bleibt.
3. Waschen und Wiedersuspension von RNA
   1. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 75 % Ethanol (1 Volumen pro 1 Volumen Lysereagenz; 50 μL pro Probe), vortexen Sie kurz und zentrifugieren Sie bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
   2. Entsorgen Sie das Überdachungsmittel und lassen Sie das Pellet 5–10 Minuten an der Luft trocknen.
   3. RNA in 30 μL RNase-freiem Wasser durch sanftes Pipetieren resuspendieren und RNA bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung speichern.
   4. Bewertung der RNA-Integrität und Quantifizierung mit einem mikrofluidischen Chip-basierten Nukleinsäuretrennsystem.

Ergebnisse

Etablierung der Lunge-auf-einem-Chip-Kokulturmodell

Die Brightfield-Bildgebung zeigte Zelladhäsion und -wachstum über die Zeit im Lungen-auf-einem-Chip-Kokultursystem. Bronchiale Atemwegepithelzellen proliferierten in einer untergetauchten Kultur an der Flüssigkeit-Flüssigkeit-Grenzfläche (LLI) und bildeten eine gleichmäßige Schicht entlang des oberen Kanals (Abbildung 6A), während pulmonale Gefäßendothelzellen sich ausdehnten und den gesamten unteren Kanal bedeckten und eine konfluente Monoschicht bildeten (Abbildung 6B).

Nachdem die Kokultur etabliert war, wurden Endothelzellen an den Ein- und Auslassbereichen des unteren Kanals überwacht, die die einzigen für mikroskopische Untersuchungen zugänglichen Bereiche sind. Wie in Abbildung 7 gezeigt, blieben Endothelzellen lebensfähig und wiesen eine verlängerte Morphologie auf, die mit der Flussrichtung ausgerichtet war. Nach 14 Tagen ALI-Kultur zeigte die Epithelschicht sowohl in gesunden als auch bei COPD-Modellen sichtbares Ziliarschlag (ergänzendes Video). Wie erwartet, zeigte das COPD-Modell eine deutlich erhöhte Schleimproduktion im Vergleich zum gesunden Modell (Abbildung 8) und wiederholt damit zentrale Merkmale der COPD-Pathologie.

Abbildung 6: Kokultivierung von Atemwegsepithel- und Endothelzellen im Mikrofluidikgerät.
Repräsentative Bilder primärer bronchialer Epithelzellen auf der oberen Oberfläche (A) und primärer pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen auf der unteren Oberfläche (B) der porösen Membran unter flüssig-flüssigen Schnittstellenbedingungen (LLI). Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Endothelzellen im unteren mikrofluidischen Kanal während der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.
Repräsentative Brightfield-Bilder, die pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen am Einlass (obere) und Ausgang (untere) des unteren Kanals während der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) zeigen. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Schleimansammlung im Atemweg.
Repräsentative Bilder, die die Schleimbildung nach 14 Tagen der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) in gesunden (A) und COPD (B) Kokulturmodellen zeigen. Die braune Schicht im Atemwegskompartiment stellt den angesammelten Schleim dar. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Quantitative Bewertung der Barrierenintegrität

Die funktionelle Bewertung der Barriereintegrität zeigte eine geringere scheinbare Permeabilität (Papp) sowohl in gesunden als auch bei COPD-Modellen im Vergleich zur positiven Kontrolle (ECM-beschichteter Chip ohne Zellen) (Abbildung 9).

In Abwesenheit von Zellen deuteten hohe Papp-Werte auf eine minimale Barrierenbildung hin. Im Gegensatz dazu durchquerte der fluoreszierende Dextran-Tracer bei Anwesenheit von Epithel- und Endothelschichten das ECM nicht, was zu einer deutlich verringerten Permeabilität und einem starken Barrierehinweis führte. Dieser Effekt wurde sowohl vor ALI als auch nach 10 Tagen ALI beobachtet, was zeigt, dass die Barrierenfunktion früh bei der Differenzierung etabliert wird.

Wie in Abbildung 10 gezeigt, lagen im gesunden Modell die mittleren Papp-Werte vor ALI bereits unter dem Schwellenwert, der auf robuste Barrierenintegrität hinweist (1 × 10⁻⁶ cm/s) und sanken während der ALI-Kultur weiter. Im COPD-Modell lagen die mittleren Papp-Werte ebenfalls im starken Barrierebereich vor ALI, und obwohl sie nach 10 Tagen ALI leicht erhöht waren, blieb die Barriereintegrität robust.

Abbildung 9: Bewertung der Barrierefunktion im Lungen-auf-einem-Chip-Modell.
Scheinbare Permeabilität (Papp) gemessen in ECM-beschichteten Chips ohne Zellen (positive Kontrolle für Leckage; schwarz) sowie in gesunden (rosa) und COPD-(grünen) Kokulturmodellen vor und nach 10 Tagen der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI). Jeder Punkt steht für einen einzelnen Chip. Das gesunde Modell umfasst Zellen von separaten Spendern, während das COPD-Modell Zellen verwendet, die von einem einzelnen Patienten abgeleitet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Vergleich der Barrierefunktion in gesunden und COPD-Modellen.
Scheinbare Permeabilität (Papp) gemessen vor und nach 10 Tagen der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) in gesunden (links) und COPD-(rechts) Kokulturmodellen. Jeder Punkt steht für einen einzelnen Chip. Die Werte sind Mittelwert ± SD. Das COPD-Modell umfasst Zellen von drei Patienten, während das gesunde Modell Zellen verschiedener Spender kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Immundetektion von engen und adhärenten Übergängen

Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte die strukturelle Organisation der junctionalen Proteine. ZO-1 zeigte eine kontinuierliche Lokalisierung entlang der Kanten der bronchialen Epithelzellen, was auf eine intakte Epithelbarriere hinweist (Abbildung 11A). Ähnlich zeigte die VE-Cadherin-Färbung eine einheitliche Verteilung an Endothelverbindungen, was mit einer konfluenten endothelialen Monoschicht übereinstimmt. Endothelzellen wiesen eine längliche Morphologie auf, die mit der Flussrichtung ausgerichtet war (Abbildung 11B).

Es wurden keine Unterschiede zwischen den gesunden und COPD-Modellen bei der Lokalisierung von Tight- und Adherens-Junction-Proteinen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit den funktionellen Barrierendaten überein und unterstützen das Vorhandensein einer physiologisch relevanten epithelial-endothelialen Grenzfläche mit erhaltener junctionaler Integrität in beiden Modellen.

Abbildung 11: Junctionale Proteinexpression im Lunge-on-a-Chip-Kokulturmodell.
Von oben erhaltene Immunfluoreszenzbilder nach 14 Tagen Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) zeigen ZO-1-Lokalisation im Atemwegeepithelkompartiment (A) und VE-Cadherin-Lokalisation im Endothelkompartiment (B). Die Kerne werden mit DAPI gefärbt. Der Pfeil zeigt die Strömungsrichtung an. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Phänotypisierung

Die immunfluoreszente Färbung von Chip-Kryosektionen zeigte β-Tubulin-IV-positive Zellen auf der apikalen Seite der Membran, was auf die Differenzierung der Atemwegepithel in ciliierte Zellen hinweist, ein charakteristisches Merkmal des reifen Bronchienepithels (Abbildung 12A). Die CD31-Färbung bestätigte das Vorhandensein einer konfluenten endothelialen Monoschicht entlang der Basalseite der Membran (Abbildung 12B). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Kokultursystem die Etablierung physiologisch relevanter epithelialer und endothelialer Phänotypen in beiden Modellen unterstützt.

Abbildung 12: Immunfluoreszenzbilder von Lungen-auf-einem-Chip-Querschnitt. Repräsentative immunfluoreszierende Färbung der Chip-Querschnitte nach 14 Tagen Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) zeigt β-Tubulin-IV-Expression im Atemwegepithelkompartiment (A) und CD31-Expression im Endothelkompartiment (B). Die Kerne werden mit DAPI gefärbt. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

RNA-Extraktion und Quantifizierung

RNA, die aus Atemwegepithelzellen isoliert wurde, zeigte Konzentrationen von 59 bis 135 ng/μL mit RNA-Integritätszahlen (RIN)¹¹ von 7,4–9,6, während RNA aus mikrovaskulären Endothelzellen in beiden Modellen zwischen 12 und 46 ng/μL mit RIN-Werten von 9,6–10 lag. Daten zeigten, dass beide Modelle ausreichende Mengen hochwertiger RNA erreichten, die für nachgelagerte molekulare Analysen geeignet sind.

Ergänzende Tabelle 1: Spenderinformationen für die Epithelzellen der bronchialen Atemwege. Die Tabelle zeigt die Epithelzellen der Bronchialwege, die im gesunden Modell verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Spenderinformationen für die pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen. Spenderinformationen für pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen, die im gesunden Modell verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Patienteninformationen. Die Tabelle stellt Informationen für Atemwegsepithelzellen und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen dar, die im COPD-Modell verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Überblick über die im Protokoll verwendeten Schlüsselreagenzien und Kulturmedien.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Ciliary Beating im Atemwegskanal (gesundes Modell).
Repräsentatives Video, das das Ziliar-Schlagen nach 14 Tagen Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Ciliary Beating im Atemwegskanal (COPD-Modell).
Repräsentatives Video, das das Ziliar-Schlagen nach 14 Tagen Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Studie präsentiert ein detailliertes Protokoll zur Etablierung eines Lungen-auf-einem-Chip-Kokultursystem, um sowohl ein gesundes Modell mit kommerziell verfügbaren bronchialen epithelialen und pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen als auch ein COPD-Modell mit patientenabgeleiteten Zellen aus explantierten Lungen zu erzeugen. In beiden Modellen sind die beiden Zelltypen durch eine poröse, dehnbare Membran getrennt, die mit zelltypspezifischer extrazellulärer Matrix (ECM) beschichtet ist, was eine Mikroumgebung ermöglicht, die der in vivo Lunge ähnlicher ist. Das Protokoll umfasst außerdem Methoden zur Bewertung der Barriereintegrität, der Zellphänotypisierung und der RNA-Extraktion aus jedem Kompartiment. Beide Modelle wurden erfolgreich unter dynamischen Perfusions- und Luft-Flüssigkeits-Interfacebedingungen (ALI) aufrechterhalten, was zu einer physiologisch relevanten epithelial-endothelialen Barriere mit einem vollständig differenzierten pseudostratifizierten Atemwegepithel führte. Endothelzellen, wie in vivo beobachtet, sind mit der Flussrichtung ausgerichtet, und hochwertige RNA wurden aus beiden Kompartimenten gewonnen.

Mehrere entscheidende Schritte sind unerlässlich, um dieses Kokultursystem erfolgreich zu etablieren. Eine präzise Aussaatung von Epithelzellen ist erforderlich, um eine gleichmäßige Abdeckung zu erreichen, da eine ungleichmäßige Verteilung zu einer unvollständigen Oberflächenabdeckung und einer beeinträchtigten Barrierenbildung führen kann. In solchen Fällen sollte das apikale Kompartiment sanft aspiriert und Epithelzellen neu ausgesät werden. Die Etablierung von ALI sollte erst erfolgen, wenn sowohl die epitheliale als auch die endotheliale Schicht kontinuierliche Monoschichten bilden, da eine vorzeitige ALI-Exposition zu einem Austritt von Gefäßmedium in das Atemwegskompartiment und zu einer beeinträchtigten Differenzierung führen kann. Wenn keine Konfluenz erreicht wird, sollte die Gründung der ALI verzögert werden.

Eine unvollständige Entfernung des apikalen Mediums oder eine inkonsistente ALI-Exposition kann zu einer heterogenen Epithelreifung führen. Das Restmedium im oberen Kanal kann entfernt werden, indem die Durchflussmenge für 3–4 Minuten auf 600 μL/h erhöht wird. Die Blasenbildung, die die Perfusion stört und die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt, kann aufgrund unzureichender Gleichgewichtsanpassung entstehen. Blasen können entfernt werden, indem man den Durchfluss vorübergehend auf 600 μl pro Stunde für 3–4 Minuten erhöht oder, falls persistent, den Chip abtrennt und manuell mit einer Pipette löst. Im COPD-Modell kann eine übermäßige Schleimproduktion den Atemweg blockieren und die Durchfluss beeinträchtigen; in solchen Fällen wird eine sanfte Wäsche mit DPBS empfohlen, gefolgt von der Wiederherstellung der ALI.

Die meisten bestehenden Kokultursysteme, die Atemwegsepithelzellen und pulmonale Endothelzellen kombinieren, basieren auf kommerziell erhältlichen Primärzellen und generischen ECM-Beschichtungen wie Kollagen oder Fibronectin ^10,12. Obwohl diese die Adhäsion unterstützen, reproduzieren sie nur teilweise die biochemischen und mechanischen Eigenschaften der Atemweg-Gefäß-Schnittstelle. Im Gegensatz dazu verwendet das derzeitige System zelltypspezifische ECM-Beschichtungen, die eine Mikroumgebung schaffen, die dem menschlichen Lungengewebe¹³ näher ähnelt.

Die Barrierenfunktion wird üblicherweise mit transepithelialem/transendothelialem elektrischem Widerstand (TEER) bewertet, wobei diese Methode jedoch durch die epitheliale Mehrschichtorganisation¹⁴ beeinflusst werden kann. In dieser Studie wurde die Dextran-Permeabilität zur Bewertung der funktionellen Integrität eingesetzt. Die beobachteten Papp-Werte lagen unterhalb der Schwelle für eine starke Barriereintegrität (1 × 10⁻⁶ cm/s), was auf eine robuste Epithel-Endothel-Grenzfläche hinweist. Das Atemwegepithel zeigte Differenzierungsmerkmale wie Ziliarschlag und Schleimbildung sowie kontinuierliche Lokalisierung von ZO-1 und VE-Cadherin an Zellverbindungen. Darüber hinaus wurde aus beiden Kompartimenten kontinuierlich hochwertige RNA gewonnen, was zelltypspezifische Downstream-Analysen ermöglichte.

Ein wesentlicher Fortschritt dieser Arbeit ist die Entwicklung eines COPD-Lungen-auf-einem-Chip-Modells, bei dem sowohl Epithel- als auch Endothelzellen vom selben Patienten stammen. Nach jüngster Kenntnis wurde eine solche patientenabgestimmte Kokultur bisher nicht berichtet. Frühere Studien bezogen COPD-abgeleitete Epithelzellen ^7,8 ein, stützten sich jedoch auf kommerziell gewonnene Endothelzellen, was die Untersuchung krankheitsspezifischer epithel-endothelialer Interaktionen einschränkte. Das vorliegende Modell überwindet diese Einschränkung, indem es patientenspezifische zelluläre Interaktionen bewahrt.

Das COPD-Modell wiederholte wichtige Krankheitsmerkmale, darunter eine erhöhte^{Schleimproduktion,} während gleichzeitig die Endothelausrichtung und die Integrität der junctionalen Substanz während des Flusses erhalten blieb. Wichtig ist, dass die Kokultivierung von von Patienten abgeleiteten Epithel- und Endothelzellen trotz erhöhter Schleimproduktion die Barrierefunktion oder Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigte. Das System blieb unter ALI-Bedingungen und kontinuierlicher Perfusion stabil, was seine Verwendung für Langzeitstudien unterstützte. Darüber hinaus ermöglicht die Plattform mechanische Dehnung, was ihre physiologische Bedeutung weiter erhöht.

Eine wichtige Stärke dieses Arbeitsablaufs ist die Fähigkeit, gesunde und COPD-Bedingungen innerhalb derselben Plattform unter vergleichbaren experimentellen Parametern zu bewerten. Dies ermöglicht eine direkte Beurteilung krankheitsassoziierter Unterschiede in der Epitheldifferenzierung, der Endothelfunktion und der Barriereintegrität. Die Modelle können je nach Forschungsfrage auch unabhängig voneinander verwendet werden. Das gesunde Modell eignet sich für mechanistische Studien und Signalwegmodulation, während das COPD-Modell eine Plattform für therapeutische Evaluation und Arzneimitteltests bietet. Die Fähigkeit, hochwertige RNA aus jedem Kompartiment separat zu extrahieren, ermöglicht zudem ein zelltypspezifisches molekulares Profiling. Die Verwendung von patientengematchten Zellen im COPD-Modell bewahrt krankheitsrelevante Interaktionen, die sonst bei der Kombination nicht verwandter Zellquellen verloren gehen würden.

Trotz dieser Vorteile sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Der Einsatz von Lunge-on-a-Chip-Systemen erfordert spezialisierte Ausrüstung und technisches Fachwissen, was die Zugänglichkeit einschränken kann. Darüber hinaus umfasst das Modell derzeit keine anderen relevanten Lungenzelltypen, wie Immun- oder Stromenzellen, die die Reaktionen auf Krankheitserreger und Medikamente beeinflussen könnten. Die Plattform kann jedoch angepasst werden, um zirkulierende Immunzellen einzubeziehen, was die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit Epithel- und Endothelkompartimenten ermöglicht. Der Zugang zu patientenabgeleitetem COPD-Material kann ebenfalls eingeschränkt sein, und die interpatientische Variabilität kann die Reproduzierbarkeit beeinflussen. Außerdem kann eine übermäßige Schleimproduktion die Durchfluss beeinträchtigen.

Die Auswirkungen zyklisch-mechanischer Dehnung wurden in dieser Studie nicht untersucht, stellen aber eine wichtige zukünftige Richtung dar. Die dehnbare Membran ermöglicht die Simulation von atembedingten mechanischen Kräften, die bekannt sind, die zelluläre Funktion, Reparatur und Homöostase^{beeinflussen 15,16}. Frühere Studien haben gezeigt, dass mechanische Belastung die Aufnahme und den Transport von Nanopartikeln über die epithelliale Barriere¹⁰ verbessern kann.

Zusammenfassend bieten die hier präsentierten gesunden und COPD-Lungen-auf-einem-Chip-Modell eine physiologisch relevante Plattform zur Untersuchung von epithelialen–endothelialen Interaktionen in Gesundheit und Krankheit. Die dynamische Natur des Systems ermöglicht eine präzise Steuerung der Flussbedingungen und unterstützt Anwendungen wie Arzneimitteltests und Studien zur Exposition von Krankheitserregern. Dieses Protokoll bietet eine robuste Alternative zu traditionellen In-vitro- und Tiermodellen und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Förderung der translationalen Atemwegsforschung dar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin-EDTA (1X)  (für Endothelzellen)	Gibco	25200-056	Zum enzymatischen Ablösen von pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen verwendet.
120 mm x 120 mm quadratische Zellkulturschale	VWR	688161	Zum Halten des Chip-Cradles während der Chip-Vorbereitung und -Handhabung.
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939A	Zum Beurteilen der RNA-Qualität und -Integrität.
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516	Zum Präzipitieren von RNA während der Extraktion.
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Invitrogen	D1306	Zum Färben von Zellkernen während der Immunfluoreszenz.
50 mL Konische Röhrchen	Cellstar	227261	Zum Sammeln von Zellen, Zentrifugieren und Bereiten von Zellsuspensionen.
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	Zum Beurteilen der RNA-Qualität mit dem Bioanalyzer.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Zum Verhindern von Pilzkontamination während der Zellkultur.
Automatischer Zellzähler	NanoEntek	EVE PLUS	Zum Bestimmen der Zellkonzentration und -lebensfähigkeit vor dem Aussäen.
Zellkultur-Multiwellplatten, 48 Wellen, steril	Falcon	353078	Zum Halten von Querschnitten während Färbeverfahren.
Zentrifuge	Hettich	320R	Zum Pelletieren von Zellen vor dem Aussäen.
Chip Cradle	Emulate	support@emulatebio.com	Zum Unterstützen und Halten von Chips während der Oberflächenaktivierung, Beschichtung und Zellaussaat.
Chloroform	Sigma-Aldrich	366927	Zur Phasentrennung während der RNA-Extraktion.
Cicero Spinning Disk Modul	CrestOptics S.p.A.		Zum Durchführen von Hochgeschwindigkeits-Konfokal-Fluoreszenz-Bildgebung.
Deckgläser	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	Zum Unterstützen von Chips während der Konfokal-Bildgebung. Beschreibung: 24 x 60 mm, #1.5
Kryostat	Thermo Fisher Scientific	NX70	Zum Sezieren OCT-eingebetteter Proben.
Kulturmodul (Zoë-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	Zum Steuern der Umweltbedingungen für die Zellkultur innerhalb des mikrofluidischen Systems.
Define Trypsin Inhibitor (DTI)	Thermo Fisher	R007100	Zum Neutralisieren der Trypsinaktivität nach dem Epithelzellenablösen.
Dextran Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	Als Fluoreszenztracer zur Beurteilung der Barrierepermeabilität verwendet.
Endothelzellen Wachstumsmedium MV2 kit	PromoCell	C-22022	Zur Erhaltung und Expansion von pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen.
ER-1  Oberflächenaktivierungsreagenz (lichtempfindliches Aktivierungsreagenzpulver)	Emulate	support@emulatebio.com	Zur Aktivierung von Chip-Oberflächen für die nachfolgende Beschichtung.
ER-2  Oberflächenaktivierungsreagenz (Puffer)	Emulate	support@emulatebio.com	Als Puffer während der Oberflächenaktivierung des Chips verwendet.
Ethanol absolut	Thermo Fisher Scientific	437433T	Zum Waschen von RNA-Pellets während der Extraktion.
Fluoreszenter Plattenreader	Agilent	BioTek Sinergy H1 Mikroplatten-Reader	Zum Messen der Fluoreszenzintensität für Permeabilitätsassays.
Gelatine aus Rinderhaut	Sigma-Aldrich	G9391	Zum Beschichten von Kulturoberflächen zur Förderung der Endothelzellenadhäsion.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (für ZO-1 und β-Tubulin IV)	Thermo Fisher	A11001	Zum Nachweis von Maus-Primärantikörpern mit grüner Fluoreszenz.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (für CD31)	Thermo Fisher	A11005	Zum Nachweis von Maus-Primärantikörpern mit roter Fluoreszenz.
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (für VE-Cadherin)	Thermo Fisher	A21429	Zum Nachweis von Kaninchen-Primärantikörpern mit orange-roter Fluoreszenz.
Hubmodul (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	Zum Bereitstellen von Gas und Strom für das Kulturmodul.
Humane Bronchiale Epithelzellen (HBEC)	Lonza	CC-2540S	Als Atemwegsepithelzellen verwendet, um das gesunde Co-Kulturmodell zu etablieren.
Humanes Kollagen  IV	Sigma	C5533	Zum Beschichten von T25-Kolben zur Förderung der Epithelzellen-Anhaftung.
Humanes Kollagen Typ I	Advanced Biomatrix	5007	Als Bestandteil der extrazellulären Matrix-Lösung für die Chip-Beschichtung verwendet.
Humanes Fibronektin	Sigma-Aldrich	F0895	Als Bestandteil der extrazellulären Matrix-Lösung für die Chip-Beschichtung verwendet.
Humanes Laminin	Sigma -Aldrich	L4544	Als Bestandteil der extrazellulären Matrix-Lösung für die Chip-Beschichtung verwendet.
Humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HPMEC)	PromoCell	C-12281	Als pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen verwendet, um das gesunde Co-Kulturmodell zu etablieren.
humanes rekombinantes epidermales Wachstumsfaktor (hrEGF)	PromoCell	C-60182	Zur Förderung der Epithelzellen-Proliferation verwendet.
Hydrocortison-Stammlösung	StemCell Technologies	7925	Als Zusatz in Kulturmedien verwendet, um die Differenzierung von Atemwegsepithelzellen zu unterstützen.
ImageJ	Fiji-Software	Version ImageJ 1.54p	Zum Verarbeiten und Analysieren erworbener Bilder.
Invertiertes Mikroskop für Zellkultur	Leica Microsystems	DMi1	Zum Überwachen der Zellmorphologie und Konfluenz während der Kultur.
iSpacer	SUNJin Lab	IS307	Zum Erstellen einer definierten Kammer für die Probenmontage während der Bildgebung. Dicke: 0,3 mm.
Kinetix-Kamera	Teledyne Photometrics		Zum Aufnehmen hochauflösender Fluoreszenzbilder.
Mikroskopkamera	Leica Microsystems	FLEXA CAM C1	Zum Aufnehmen von Bildern von Zellen während Kultur und Experimenten.
Mikroskop-Deckglas kreisförmig	Marienfeld	0111620