Duale lentivirale Transduktion zur Erzeugung mutanter neuronaler Stammzellen für die Gliomforschung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung mutanter muriner neuronaler Stammzellen (NSCs) für die Gliomforschung mittels sequentieller lentiviraler Transduktionen. Onkogene Mutationen werden zuerst in NSCs eingeführt, gefolgt von einem bicistronischen Lentivirus mit Reporter-Genen. Nach der doppelten Antibiotikaselektion ermöglichen mutierte NSCs eine Echtzeitbildgebung des Tumorwachstums und der Behandlungsreaktion.

Zusammenfassung

Gliome sind die am häufigsten auftretenden primären Hirntumoren bei Erwachsenen, und Mausmodellierungen deuten darauf hin, dass sie durch onkogene Mutationen in NSCs oder früh differenzierenden Vorläufern entstehen können. Orthotope Transplantationsmodelle, die von mutierten NSCs abgeleitet sind, haben daher das Potenzial, wertvolle präklinische Informationen über Gliompathogenese, Ergebnisse und Behandlungsreaktion zu liefern. Diese Modelle erfordern die Einführung einer onkogenen Mutation in NSCs, bevorzugt in Verbindung mit Reportern, um die Bestimmung der Transfektions- und Transduktionseffizienz zu unterstützen und das Tumorwachstum in vivo zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt eine auf zwei Transduktionen basierende Methodik zur Erzeugung mutierter NSCs, die für die Tumorüberwachung in vivo geeignet sind. Bei dieser Technik werden isolierte NSCs zunächst mit Lentiviren transduziert, die zusätzlich zu einem Blastizidin-resistenten Element ein interessierendes Gen (onkogene Mutation oder Green Fluorescent Protein [GFP]-Kontrolle) enthalten. Nach der Blastizidinselektion werden die Zellen sekundär mit einem bicistronischen lentiviralen Vektor transduziert, der Luziferase und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) exprimiert, sowie einem Puromycin-Resistenzelement. Nach der Puromycin-Selektion können Zellen für Proliferationstests, orthotopische Transplantationen oder andere nachgelagerte Anwendungen erweitert werden. Dieser Doppeltransduktionsansatz ermöglicht die Schätzung der Transduktionseffizienz in beiden Infektionsstadien sowie die Überwachung der Tumorbildung, des Wachstums und der Therapieansprache in vivo mittels nichtinvasiver biolumineszenter Bildgebung (BLI). Dieses System stellt ein nützliches Werkzeug für die Gliomforschung dar, da es die biologische Relevanz der Tumormodellierung von neuronalen Stammzellen bei Erwachsenen mit dem praktischen Nutzen der Echtzeitbildgebung verbindet und letztlich das Verständnis der Gliombiologie und die Weiterentwicklung neuer therapeutischer Ansätze verbessert.

Einleitung

Gliome sind die am häufigsten verbreitete Form primärer Hirntumore, die Erwachsene betreffen, und machen etwa 80 % aller bösartigen Hirnneoplasien in dieser Population^aus. Die Mehrheit davon sind hochgradige Gliome², die typischerweise sehr invasiv sind und trotz bedeutender Fortschritte in neurochirurgischen Techniken, Strahlentherapie und chemotherapeutischen Ansätzen^eine schlechte Prognose ^3,4 haben. Die hohe Sterblichkeitsrate bei Patienten, die an diesen Tumoren leiden, unterstreicht die Notwendigkeit fortlaufender Forschung zur Bildung und Entwicklung von Gliomen.

Die Gliomogenese im zentralen Nervensystem kann durch die Einführung onkogener Mutationen in NSCs 6,7,8,9 oder deren früh differenzierende Nachkommen 10,11,12 in Mausmodellierungsstudien ausgelöst werden. Bemerkenswert ist, dass diese Studien gezeigt haben, dass dieselben onkogenen Mutationen oft keine Tumore hervorbringen, wenn sie in differenziertere Zellen^{eingebracht werden. 13}, wodurch eine Zell-von-Ursprungs-Hierarchie etabliert wird, bei der eine erhöhte Linienrestriktion mit einer geringeren Anfälligkeit für Transformation^korreliert. Gentechnisch veränderte NSCs werden daher häufig verwendet, um biologisch relevante und vielseitige Gliommodelle zu erstellen, entweder mit transgenen Techniken oder orthotopischen Transplantationsmethoden¹⁵. Beide Ansätze ermöglichen die Untersuchung der de-novo-Tumorbildung in der natürlichen Gehirnumgebung aus einer nicht transformierten Zelle. Gentechnisch veränderte Modelle ermöglichen diese Untersuchung an Tieren mit intaktem Immunsystem, die oft die Histologie und zelluläre Heterogenität bei menschlichen Tumoren besser nachahmen¹⁶. Die Erstellung dieser Modelle ist jedoch arbeitsintensiv und kostenintensiv, und sie zeigen häufig lange Latenzzeiten und niedrige Tumorbildungsfrequenzen¹⁶. Im Gegensatz dazu sind orthotopische NSC-Modelle leichter manipulierbar und kosteneffizienter. Mutierte NSCs können aus primären oder unsterblichen Zellen von Mäusen oder Menschen erzeugt werden, je nach experimentellen Bedürfnissen, und sind auch für In-vitro geeignet. Experimente^16,17. Darüber hinaus bieten diese Modelle die Möglichkeit, die Entwicklungsstufe sowohl von NSCs als auch von Empfängermäusen sowie die räumliche Lokalisierung, von der NSCs abgeleitet und eingeführt werden, präzise anzupassen. Dies ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie Alter und spezifische Hirnregionen die durch bestimmte Mutationen ausgelöste Tumorentstehung beeinflussen¹⁷.

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Erzeugung mutanter Maus-NSCs aus der Primärkultur, die sowohl für in vitro als auch in vivo experimentelle Anwendungen geeignet sind (Abbildung 1). Das Protokoll besteht aus zwei unterschiedlichen Transduktionsphasen, die in einer bestimmten zeitlichen Sequenz auftreten. In der Anfangstransduktionsphase werden isolierte Maus-NSCs mit rekombinanten Lentiviren infiziert, die das Zielgenet-Konstrukt tragen, entweder eine onkogene Mutation oder eine grüne fluoreszierende Proteinkontrolle (GFP), zusammen mit einer Blastizidin-Resistenzkassette. Anschließend wird mit Blastizidin ein Antibiotika-Selektionsdruck ausübt, sodass nur die überlebenden transduzierten Zellen zu einem sekundären Transduktionsereignis übergehen können. Dieses sekundäre Ereignis verwendet ein bicistronisches lentivirales Konstrukt, das sowohl Glühwürmchen-Luciferase- als auch Reporter-Gene für das rote fluoreszierende Protein (RFP) codiert, gekoppelt mit Puromycin-Resistenzelementen für die nachfolgende Selektion. Nach der Selektion mit Puromycin werden die resultierenden dual transduzierten NSC-Populationen in vitro erweitert. vor weiteren Experimenten. Dieser sequentielle Transduktionsansatz bietet mehrere methodische Vorteile: (1) Er ermöglicht eine quantitative Bewertung der Transduktionseffizienz in jedem^{Schritt 18}, (2) er etabliert stabile Reporterzelllinien, die für die Längsverfolgung geeignet sind, und (3) er ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung von Tumorinitiation, Progressionskinetik und therapeutischen Reaktionen durch BLI-Methoden 18,19,20 . Sie kann auch mit primären oder unsterblichen NSCs^{21, 22, 23} verwendet werden.

Das hier vorgestellte Protokoll adressiert den dringenden Bedarf an einem standardisierten, effizienten und biologisch relevanten Ansatz zur Generierung von NSC-abgeleiteten Gliommodellen aus erwachsenen Tieren mit integrierten Bildgebungsfähigkeiten. Die resultierenden Modelle sollen Erkenntnisse liefern, die klinisch relevant in Bezug auf die Pathogenese des Glioms sind, die Identifikation neuartiger therapeutischer Ziele erleichtern und solide Grundlagen für die präklinische Bewertung neuer Behandlungsstrategien bieten.

Protokoll

Diese Studie wurde gemäß den ethischen Standards und regulatorischen Richtlinien durchgeführt, die von der Washington University in St. Louis festgelegt wurden. Für dieses Protokoll wurde der Kortex erwachsener Mäuse gemäß der zuvor beschriebenen Technik²⁴ des Brossier-Labors mikrodissektioniert und verwendet, um primäre Mäus-NSCs für eine spätere Expansion in nicht-adhärente Kultur gemäß dem etablierten Protokoll 24,25,26 zu isolieren. Alle in der Kultur verwendeten Reagenzien werden entweder steril zugeführt oder durch einen 0,2 μM-Membranfilter geleitet, um die Sterilität zu gewährleisten. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung neuronaler Stammzellen aus mikrodissektioniertem Gewebe

1. Bereiten Sie Dissoziationsmedien (DM) und Trypsin-Digestmedium (TDM) gemäß den in Abbildung 2 gezeigten Rezepten vor.
   1. Gib 200 μL Trypsin-Verdauungsmedium in 1,5-mL Mikrozentrifugenröhren und lasse es mindestens 20 Minuten vor der Anwendung auf Eis liegen. DM kann für spätere Schritte im Protokoll auf Raumtemperatur gelassen werden.
   2. Während die Röhren vorgekühlt sind, bereiten Sie das Basis-Neuralstammzellmedium (NSC; Rezept in Abbildung 2) vor und geben Sie NSC und Fetal Bovine Serum (FBS) bei 37 °C in ein Wasser- oder Perlenbad zum Vorwärmen. Geben Sie Aliquoten von Nahrungsergänzungsmitteln (B27, N2) und Wachstumsfaktoren (EGF, FGF) in einen Eisbehälter, damit sie langsam auftauen.
      HINWEIS: TDM muss jedes Mal frisch vor der Nutzung vorbereitet werden, obwohl NSC und DM zwischen den Nutzungen bei 4 °C gelagert werden können; Rezepte sind in Abbildung 2 dargestellt. Bestände von N2, B27, EGF und FGF sollten aliquotiert und bis zur Nutzung bei -20 °C gelagert werden; wiederholtes Auftauen von rekonstituierten Beständen zu vermeiden (siehe Materialtabelle für weitere Details zur Vorbereitung von Beständen von EGF und FGF).
2. Nachdem TDM-haltige Mikrozentrifugenröhren ausreichend gekühlt sind, wird das Gewebe wie zuvor^{beschrieben mikrodissektioniert 24}. Nach jeder Mikrodissektion wird das Gewebe in ein Mikrozentrifugenrohr gelegt. Setzen Sie den Schlauch wieder in Eis, bis alle Sektionen abgeschlossen sind, da eine Erwärmung des Gewebes den enzymatischen Verdauungsprozess früh einleiten und zu einer Überverdauung führen kann.
3. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 °C in einem Wasser- oder Perlenbad für 15 Minuten, um die enzymatische Verdauung einzuleiten. Während der Inkubation bereiten Sie 10 % FBS im NSC vor, indem Sie 0,5 ml FBS zu 4,5 ml NSC hinzufügen.
   1. Nach der Inkubation werden Proben vorsichtig 5–10 Mal mit einer 1-mL-Mikropipette gepipetten, um die Zellen weiter zu dissoziieren, und anschließend Trypsin neutralisiert, indem 200 μL 10 % FBS in NSC zu jeder Probe hinzugefügt werden. Pipette vorsichtig auf und ab zum Mischen.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, die empfohlene Brutzeit bei 37 °C einzuhalten. Eine Über-Trypsinisierung kann zum Zelltod führen, während eine Unter-Trypsinisierung die Dissoziation der Probe erschweren kann (siehe Tabelle 1, Punkte 1–2 für diese und andere Tipps zur Fehlerbehebung).
      HINWEIS: Entweder ein Wasserbad oder ein Perlenbad kann zur Inkubation von Proben verwendet werden; Letzteres kann das Risiko einer Kontamination²⁷ verringern, aber dies kann mit einem Risiko eines weniger effizienten Wärmetransfers²⁸ einhergehen.
4. Spinnen Sie die isolierten Primärzellen bei 630 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Aspirieren Sie das Überbeutungsmittel und achten Sie darauf, die Zellen am Boden des Brunnens nicht zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie dem Zellpellet 2,5 ml DM hinzufügen und anschließend 3–4 Mal sanft nach oben und unten auf- und runterpipetten. Wieder bei 630 × g für 5 Minuten bei 4 °C drehen und vorsichtig das Supernatant aspirieren.
5. Wiederhole Schritt 1.3, um eine zweite Wäsche durchzuführen. Während der Endwäsche geben Sie B27, N2, FGF und EGF dem vorgewärmten Basis-NSC-Medium, um ein vollständiges NSC-Medium zu erzeugen (Rezept in Abbildung 2).
6. Aspiriere das Supernatant. Geben Sie jedem Zellpellet 2 ml warmes, vollständiges NSC-Medium hinzu und suspendieren Sie es dann wieder, indem Sie es 3–4 Mal sanft auf und ab pipetten. Setzen Sie die resuspendierten Zellen in einen Brunnen einer 6-Wellen-Platte mit niedriger Befestigung und inkubieren Sie bei 37 °C.
   HINWEIS: Obwohl das Basis-NSC-Medium zwischen den Anwendungen bei 4 °C gelagert werden kann, können Ergänzungsmittel und Wachstumsfaktoren bei dieser Temperatur abgebaut werden. Daher sollten B27, N2, FGF und EGF dem NSC-Medium hinzugefügt werden, um unmittelbar vor der Nutzung ein vollständiges NSC-Medium zu schaffen.

2. Etablierung und Expansion der Neurosphärenkultur

1. Verabreichen Sie 0,5–1 ml frisches NSC-Fütterungsmedium (Rezept in Abbildung 2) in jedem Brunnen der NSC-Kulturen alle 3 Tage.
2. Überwachen Sie die Bildung der Neurosphäre. Wenn vollständig geformte kleine Kugeln sichtbar sind, ist die Kultur bereit für den Durchgang (typischerweise 5–10 Tage nach der ersten Plattierung).
   HINWEIS: Zellen wachsen am besten, wenn sie häufig durchgangen werden und sich noch in der logarithmischen Wachstumsphase befinden. Größere Neurosphären sind schwerer dissoziierbar und anfälliger für Zelltod während dieses Prozesses. Daher wird ein früheres und häufigeres Sterben empfohlen, um die Zellgesundheit zu fördern. Wenn sie passieren können, haben isolierte Neurosphären einen Durchmesser von ~100–200 μm mit dicht gepackten Zellen und glatten, klar definierten Rändern unter Hellfeldmikroskopie. Neurosphären zeigen keine unregelmäßigen Projektionen oder Dehnungen. Das Zentrum der Neurosphären ist etwas dunkler als die äußeren Ränder, aber nicht übermäßig; Übermäßig dunkle Kerne entstehen oft durch Nekrose zentraler Zellen aufgrund von Nährstoffmangel, wenn die Neurosphären überwuchert sind. Das Durchziehen überwucherter Neurosphären führt oft zu hohen Zelltoden, was nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigen kann. Siehe Tabelle 1, Punkte 3–4 für diese und weitere Tipps zur Fehlerbehebung.
3. Vorwärmen Sie das NSC-Medium, DM, 0,05 % Trypsin-EDTA und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C mit einem Wasser- oder Perlenbad. Legte B27, N2, FGF, EGF und FBS auf Eis, bis sie gebraucht werden.
4. Zum Durchgang werden gut gewachsene Neurosphären mit einer serologischen Pipette in ein 15-mL steriles konisches Rohr übertragen. Zentrifugiere bei 630 × g für 1 Minute bei 4 °C, um die Neurosphären zu beruhigen. Aspiratiere Supernatant und achte darauf, die gepelletierten Neurosphären nicht zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie in sterilem 1x PBS neu suspendieren, dann erneut bei 630 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren und das Überstandsmittel aspirieren.
5. Gib 1 ml 0,05 % Trypsin/EDTA zum Zellpellet. Pipette 3–5 Mal mit einer 1-mL-Mikropipette zum Mischen auf- und runter, dann 5–6 Minuten bei 37 °C in einem Wasser- oder Perlenbad inkubieren.
   1. Nach der Inkubation sollte man vorsichtig 5–10 Mal mit einer 1-mL-Mikropipette auf und ab pipetten, um die Neurosphären aufzubrechen. Neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 1 ml 10 % FBS in NSC-Medium; Pipette vorsichtig zum Rühren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Über-Trypsinisierung und/oder übermäßig kräftiges Pipetieren der Neurosphären, da dies die NSCs schädigen und die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen kann.
6. Fügen Sie 2,5 ml DM hinzu und zentrifugieren Sie bei 630 g × g für 5 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant. Wiederholen Sie den Waschschritt mit weiteren 2,5 ml DM, gefolgt von Zentrifugation und Aspiration des Supernatans, um Spuren von FBS im Medium zu entfernen.
7. Cellen in 1 ml frischem, vollständigem NSC-Medium wieder suspendieren. Filtern Sie die Zellsuspension, indem Sie einen 40 μm starken sterilen Filter in ein 50-mL Mikrozentrifugenrohr legen, dann die Zelllösung oben auf den Filter geben und die Schwerkraft die Lösung in das Rohr abfließen lässt. Alle verbleibenden nicht dissoziierten Zellen werden vom Filter eingefangen, während einzelne Zellen in die darunterliegende Lösung gelangen.
8. Aus den resuspendierten, gefilterten Zellzellen werden 10 μL für die Zellzählung genommen und mit 10 μL Trypanblau vermischt. Mit einem manuellen Hämozytometer werden 10 μL der Probe geladen und lebensfähige Zellen (d. h. Zellen, die nicht blau sind) gemäß Standardverfahren²⁹ gezählt. Alternativ kann ein automatisierter Zellzähler verwendet werden, der jedoch bei Anwesenheit von Zellresten oder Aggregaten weniger genau sein kann^(30,31).
   HINWEIS: Im Allgemeinen sollten weniger als 10–15 % der Gesamtzellzellen Anzeichen von Zelltod zeigen (z. B. Trypan-Blau nicht ausschließen können). Höhere Zelltodesraten können durch Übertrypsinisierung, übermäßige mechanische Belastung bei der Zelltrennung oder eine schlechte Gesamtgesundheit der Kultur vor der Trypsinisierung entstehen (siehe Tabelle 1, Punkte 1–3). Da dies nachgelagerte Anwendungen negativ beeinflussen kann, wird empfohlen, die Zellen neu zu platten (Schritt 2.9) und erneut zu erweitern (z. B. die Schritte 2.1–2.9 zu wiederholen), wenn hohe Zelltodesraten beobachtet werden, anstatt zur Transduktion fortzufahren.
9. Verdünne 5 x 10^{5 Zellen in} 2 mL frisches, vollständiges NSC-Medium und platte sie in einen Brunnen einer ultra-niedrig-anheftigen 6-Well-Platte. Geben Sie jedem Brunnen alle drei Tage 0,5–1 ml frisches NSC-Futter, um eine optimale Kulturgesundheit zu gewährleisten. Wenn vollständig gebildete, gesunde Kugeln sichtbar sind (siehe Tabelle 1, Punkt Nummer 4), ist die Kultur in Schritt 3 oder 4 einsatzbereit.
   HINWEIS: Zusätzliche NSCs können an diesem Punkt gespeichert werden, indem eine Million NSCs in 1 mL serumfreiem Zellgefriermedium in einem 1,5 mL Kryovial aufgehängt und bei -80 °C gelagert werden. NSCs können bei Bedarf auch weiter erweitert werden, indem zusätzliche Zellen in zusätzlichen Brunnen der 6-Well-Platte vernetzt oder in T-25-Kolben eingegliedert werden.

3. Blastizidin-Kill-Kurve in Elternzellen

HINWEIS: Sobald die durchgangenen NSCs gesunde Neurosphären bilden, sind die Zellen bereit für weitere Experimente. Vor der Transduktion ist es entscheidend, die optimale Konzentration des Selektionsantibiotikums (in diesem Fall Blasticidin) zu bestimmen. Dies muss empirisch durchgeführt werden, da verschiedene NSC-Populationen unterschiedlich anfällig für das Antibiotikum sein können. Wenn dies bereits für den angegebenen Zelltyp bestimmt wurde, springen Sie zu Schritt 4.

1. Vorwärmen Sie das Basis-NSC Medium, DM, 0,05 % Trypsin-EDTA und PBS bei 37 °C. Tauvorräte von B27, N2, FGF, EGF, FBS und Blasticidin auf. Vor Beginn oder während der folgenden Inkubationsschritte erstellen Sie ein frisches, vollständiges NSC-Medium und 10 % FBS im NSC-Medium wie oben beschrieben.
2. Verwenden Sie frisch expandierte Neurosphären (nach Kultur aus Stufe 2.9 oben), trypsinisieren und anschließend gemäß den Schritten 2.5–2.6 aufteilen, dann in 1 ml frischem NSC zum Zählen wieder suspendieren. Filtere die Zellen durch einen oben beschriebenen 40-μm-sterilen Filter, um undissoziierte Zellen zu entfernen, und zähle dann die Zellen wie in Schritt 2.8 beschrieben.
3. Resuspendieren Sie 25.000 lebensfähige Zellen in 2,5 mL Aliquot von frischem vollständigem NSC in 15 mL konischen Kapseln, wobei pro getesteter Antibiotikumkonzentration 1 Aliquot hergestellt wird. Planen Sie, mindestens 4–6 verschiedene Konzentrationen zu testen, wobei bei Bedarf weitere getestet werden können.
4. Fügen Sie jedem 2,5 mL Aliquot die passende Menge Blasticidin hinzu, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen (siehe Probenberechnungen in Tabelle 2). Platte 500 μL suspendierte Zellen (5.000 Zellen) pro Bohrloch in einer 24-Wellen-Ultra-Low-Attachment-Platte, wobei jede Konzentration vierfach plattiert ist.
   HINWEIS: Um die korrekte Endkonzentration zu erreichen, muss Blasticidin-Lager möglicherweise vor dem Zugabe zum Medium verdünnt werden. Blastizidin kann in NSC-Medium oder PBS verdünnt werden; für einen 1:1000 verdünnten Stock (10 mg/mL) geben Sie 1 ml unverdünntes (10 mg/mL) Blastizidin-Material zu 999 mL NSC oder PBS. Es wird empfohlen, dass die Forscher alle notwendigen Berechnungen durchführen, um die gewünschten Konzentrationen während der Erwärmung der Materialien in Schritt 3.1 zu erreichen; Beispielberechnungen in Tabelle 2 dargestellt.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C. Untersuchen Sie die Zellen sorgfältig mit einer Hellfeldmikroskopie alle 24 Stunden auf Veränderungen in der Morphologie und den Tod von Zellen/Neurosphären. Alle 3 Tage werden die Zellen durch Zugabe von 0,5–1 ml frischem NSC-Nährmedium mit der richtigen Konzentration von Blasticidin gefüttert.
6. Bestimmen Sie die geeignete Konzentration für die anschließende Blastizidinauswahl, indem Sie die niedrigste Blastizidinkonzentration bestimmen, die zwischen 72 und 120 Stunden nach der Beschichtung nicht transduzierte Zellen tötet.
   HINWEIS: Für adulte Musin-NSCs wurde 1000 ng/mL (1 mg/mL) Blasticidin als beste Konzentration für die Antibiotikaauswahl identifiziert (Abbildung 3). Weitere Schritte werden mit Blastizidin in dieser Konzentration durchgeführt. Es sei darauf hingewiesen, dass die optimale Blastizidinkonzentration je nach Zellpräparate erheblich variieren kann, typischerweise zwischen 0,5–10 μg/mL je nach Probentyp, Durchgangszahl und Kulturbedingungen^32,33; Empirische Kill-Kurven sind daher für jeden neuen Zelltyp essenziell und nicht optional. Siehe Tabelle 1, Punkt Nummer 5 für weitere Tipps zur Fehlerbehebung.

4. Erste lentivirale Transduktion

HINWEIS: Bevor mit der Transduktion fortgesetzt wird, ist es unerlässlich, die optimale Infektionsmultiplizität (MOI) zu kennen, um die lentiviralen Partikel (LVPs) zu transduzieren. Dies muss empirisch für verschiedene Zelltypen bestimmt werden; Die Methoden dafür wurden zuvor gut beschrieben:^34,35. In den dargestellten illustrativen Ergebnissen wurde ein MOI von 20 verwendet, basierend auf bisherigen Erfahrungen bei der Transduktion primärer Maus-NSCs.

1. Beginnen Sie mit expandierten, nicht transduzierten NSCs, die gesunde Neurosphären bilden (erzeugt nach der Zellexpansion in Schritt 2.9 oben). Spalten, resuspendieren, filtern und zählen Sie die Zellen gemäß den oben genannten Schritten 2.3–2.8 und bringen Sie dann Plattenzellen mit einer Dichte von 1,5 x 10^{6 Zellen pro} Bohrloch in zwei Wellen (eines für das onkogene Virus, eines für die Kontrolle) einer 6-Well-Platte mit ultra-niedriger Adhäsionsschicht. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten.
2. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zellen. NSCs sind auf eine Infektion vorbereitet, wenn sie kleine Klumpen bilden.
3. Vor der Infektion der Zellen tauen Sie das lentivirale Aliquot vorsichtig auf Eis auf, um ein allmähliches Auftauen zu ermöglichen. Es ist entscheidend, diesen Prozess nicht zu überstürzen.
   HINWEIS: Zur Veranschaulichung beschreibt dieses Protokoll die lentivirale Transduktion mit zwei repräsentativen Konstrukten: (1) einem Kontrollvektor, der GFP unter dem EF1-α-Promotor mit Blastizidinresistenz ausdrückt, und (2) einem experimentellen Vektor, der einen N-terminalen HA-markierten BRAF V600E-onkogenen Mutanten unter dem EF1-α-Promotor exprimiert, ebenfalls mit Blastizidinresistenz. Die Erzeugung von Lentiviren liegt außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls, wurde aber zuvor gut beschrieben^{mit 36,37}.
4. Nach dem Auftauen wird das Virus kurz vor der Infektion auf 37 °C erhitzt. Bestimme das Volumen des LVP, das zu jedem Brunnen hinzugefügt werden soll, mit der Formel MOI x Zellzahl/Virustiter. Mit einer Mikropipette, die auf das berechnete Volumen eingestellt ist, fügt man langsam LVPs tropfweise zu den kultivierten Zellen hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um sie zu verteilen, und achten Sie darauf, das Medium nicht in benachbarte Brunnen zu schwappen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 24 Stunden.
   HINWEIS: Sobald das virale Aliquot auf Zimmertemperatur aufgetaut ist, kann es nicht mehr eingefroren werden und muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. Sobald der Aliquot auf 37 °C erwärmt wurde, muss er innerhalb von 30 Minuten eingesetzt werden.
5. Nach dieser Inkubationszeit zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 630 × g für 5 Minuten bei 4 °C und aspirieren dann den Supernatant. Resuspendiere in 2 ml frischer, vollständiger NSC, ohne Virus oder Antibiotikum, und verplatte sie in einer frischen Mulde einer niedrig anheftenden 6-Well-Platte.
6. Am folgenden Tag wird die Transduktionseffizienz in den GFP-Kontrollzellen bewertet, indem der Anteil der fluoreszenzmarkierten Zellen/Klumpen zu den Gesamtzellen per Fluoreszenzmikroskopie in mehreren Feldern bestimmt wird. Die erwartete Reporter-Expression (GFP) sollte für eine erfolgreiche Transduktion über 80 % liegen.
   HINWEIS: Wenn eine suboptimale Transduktionseffizienz festgestellt wird, kann eine zweite Infektionsrunde durchgeführt werden (Wiederholung der Schritte 4.4–4.6). Wenn sich die Effizienz nicht verbessert, sollten Sie eine Neuoptimierung des MOI oder das Testen einer anderen Lentivirus-Präparation in Betracht ziehen. Siehe Tabelle 1, Punkt Nummer 6 für diese und weitere Tipps zur Fehlerbehebung.
7. Nachdem festgestellt wurde, dass die sich entwickelnden Neurosphären gesund erscheinen und Hinweise auf eine Infektion vorhanden sind (GFP positiv; ~80 %), fahren Sie mit der Zellspaltung gemäß den oben genannten Schritten 2.3–2.6 fort. Lassen Sie die Zellen in frischem 5 mL vollständigem NSC-Medium mit der entsprechenden Konzentration von Blastizidin (1000 ng/mL) erneut suspendieren und filtern Sie anschließend durch 40 μm sterile Filter, um Zellklumpen zu eliminieren. Zähle die Zellen und verplatte dann mit etwa 5 x 10^{4 Zellen} /mL in ultra-niedrig anheftenden T-25-Kolben.
   HINWEIS: Nach der ersten Zugabe eines Antibiotikums kann es zu einer hohen Zelltodrate kommen, da nicht transduzierte Zellen absterben; Das ist zu erwarten und sollte sich mit der fortlaufenden Auswahl verbessern.
8. Erweitern Sie die Zellen, indem Sie alle 3 Tage mit einem Nahrungsergänzungsmittel mit Blasticidin füttern. Wenn die Kultur vollständig geformt ist, sind gesunde Kugeln sichtbar, meist 5–10 Tage nach dem Teilen ist die Kultur in Schritt 5 oder 6 einsatzbereit.
   HINWEIS: Nach der weiteren Ausweitung der resistenten Klone können Zellen für Western Blotting (beschrieben in Schritt 7) gesammelt werden, um zu validieren, dass das nicht fluoreszierend markierte, HA-markierte onkogene Konstrukt angemessen exprimiert wird. Wenn Western-Blotting in diesem Schritt durchgeführt wird, wird dennoch empfohlen, die Expression nach der^{zweiten Transduktion} (Schritt 7) zu überprüfen, um eine angemessene fortlaufende Expression sicherzustellen.

5. Puromycin-Kill-Kurve bei blastizidinresistenten NSCs

HINWEIS: Die optimale Selektionskonzentration für die zweite Transduktion muss ebenfalls empirisch bestimmt werden. Transduzierte NSCs, die gegen Blastizidin resistent sind, werden in diesem Schritt verwendet, und die Zellen werden während der gesamten Phase unter Blastizidinselektion (1000 ng/mL) erhalten, da Transduktion und gleichzeitige Blastizidinselektion die Empfindlichkeit gegenüber Puromycin verändern können.

1. Vorwärmen Sie das Basis-NSC Medium, DM, 0,05 % Trypsin-EDTA und PBS bei 37 °C. Taubestände von B27, N2, FGF, EGF, FBS, Blasticidin und Puromycin auf. Vor Beginn oder während der folgenden Inkubationsschritte erstellen Sie ein frisches, vollständiges NSC-Medium und 10 % FBS im NSC-Medium wie oben beschrieben.
2. Mit blastizidinresistenten Neurosphären wird Trypsinisierung verwendet und anschließend gemäß den Schritten 2.5–2.7 gespalten, wobei sie in 1 ml frischem NSC resuspendiert werden, um zu zählen und zu filtern, um Klumpen zu entfernen. Zählen Sie die Zellen wie in Schritt 2.8 beschrieben und suspendieren Sie dann 25.000 lebensfähige Zellen in 2,5 mL Aliquoten frischen vollständigen NSC in 15 mL konischen Cellen, wobei pro Antibiotikakonzentration 1 Aliquot hergestellt wird. Planen Sie, mindestens 4–6 verschiedene Konzentrationen zu testen, wobei bei Bedarf weitere getestet werden können.
3. Fügen Sie Blasticidin hinzu, um die zuvor optimierte Konzentration zu erreichen (1000 ng/mL = 0,25 mL unverdünntes Material / 2,5 mL Aliquot). Dann wird jeder Tube die passende Menge Puromycin hinzugefügt, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen (siehe Probenberechnungen in Tabelle 2).
4. Platte 500 μL suspendierte Zellen (5.000 Zellen) pro Bohrloch in einer 24-Wellen-Ultra-Low-Attachment-Platte, wobei jede Konzentration vierfach plattiert ist.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C. Untersuchen Sie die Zellen sorgfältig mit einer Hellfeldmikroskopie alle 24 Stunden auf Veränderungen in der Morphologie und den Tod von Zellen/Neurosphären. Füttere die Zellen alle 3 Tage durch Zugabe von 0,25 ml frischem NSC-Futtermedium, ergänzt mit Blasticidin und der richtigen Konzentration von Puromycin.
6. Bestimmen Sie die geeignete Konzentration für die anschließende Puromycin-Auswahl, indem Sie die niedrigste Puromycinkonzentration bestimmen, die zwischen 72–120 Stunden nach der Plattierung Zellen abtötet.
   HINWEIS: Bei adulten Muskel-NSCs, die mit illustrativem GFP und/oder BRAF-V600E-Lentiviren transduziert wurden, wurde empirisch 100 ng/mL Puromycin als beste Konzentration für die Antibiotikaauswahl bestimmt (Abbildung 4). Für die Beispieltransduktionen wurden die folgenden Schritte mit 1000 ng/mL Blasticidin (aus Schritt 3 oben) und 100 ng/mL Puromycin (aus Schritt 5 oben) durchgeführt. Siehe Tabelle 1, Punkt Nummer 5 für Tipps zur Fehlerbehebung.

6. Zweite lentivirale Transduktion

HINWEIS: Zellen verbleiben während der zweiten Transduktionsphase in blastizidinhaltigen Medien, um sicherzustellen, dass das onkogene Konstrukt oder die GFP-Kontrolle, die in der ersten Transduktionsphase eingeführt wurde, in den Zellen erhalten bleibt.

1. Beginnen Sie das Verfahren mit aktiv proliferierenden, stabil transduzierten, blastizidinresistenten NSCs (erzeugt in Schritt 4). Beginnen Sie damit, die NSCs in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren (Schritte 2.3–2.7), um die Gleichmäßigkeit während der Beschichtung zu gewährleisten.
2. Plattenzellen mit einer Dichte von 1,5 x 10^{6 Zellen pro} Bohrloch in vollständigem NSC-Medium mit Blastizidin (1000 ng/mL, wie in Schritt 3 bestimmt) in eine 6-Well-Ultra-Low-Adhesion-Platte. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten.
3. Am folgenden Tag sind die Zellen bereit für die Transduktion, wenn sie kleine Klumpen bilden. Tauen Sie das Bicistronic-Lentivirus (mit Luciferase und RFP) auf Eis auf und erwärmen Sie es dann kurzzeitig auf 37 °C unmittelbar vor der Infektion. Bestimmen Sie das Volumen des LVP, das zu jedem Bohrloch hinzugefügt werden soll, unter Verwendung der Formel MOI x Zellzahl/Virustiter; hier wird ein MOI von 20 verwendet.
   1. Mit einer Mikropipette, die auf das berechnete Volumen eingestellt ist, fügt man langsam LVPs tropfweise zu den kultivierten Zellen hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um sie zu verteilen, und achten Sie darauf, das Medium nicht in benachbarte Brunnen zu schwappen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 24 Stunden.
4. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 630 × g für 5 Minuten bei 4 °C und verplatten sie in frischen, vollständigen NSC mit Blastizidin (1000 ng/mL, gemäß Schritt 3) neu.
5. Am folgenden Tag bewerten Sie die Effizienz des zweiten Transduktionsschritts, indem Sie den Anteil der RFP-positiven Zellen/Klumpen zu den Gesamtzellen per Fluoreszenzmikroskopie in mehreren Feldern bestimmen, mit einer optimalen Effizienz von ~60 %.
6. Wenn festgestellt wird, dass Neurosphären gesund erscheinen und der zweite Transduktionsschritt wirksam war (z. B. sind die meisten Zellklumpen RFP+), sind die Zellen bereit für die doppelte Selektion. Beginnen Sie damit, die NSCs in eine Einzelzellensuspension zu dissoziieren (Schritte 2.3–2.7), dann mit etwa 5 x 10^{4 Zellen} /mL in ultraniedrigen T-25-Kolben in vollständigen NSC-Behältern mit Blastizidin (1000 ng/mL) und Puromycin (100 ng/mL) neu zu platten.
   HINWEIS: Wie in Schritt 4.6 oben kann bei suboptimaler Transduktionseffizienz eine zweite Infektionsrunde (Wiederholung der Schritte 6.3–6.6) durchgeführt werden. Siehe Tabelle 1 für weitere Tipps zur Fehlerbehebung.
7. Füttere die Zellen alle 3 Tage mit einem Nahrungsergänzungsmittel, das Blasticidin und Puromycin enthält.
   HINWEIS: Eine sorgfältige Überwachung der Kulturen ist unerlässlich, um doppelresistente Klone zu identifizieren, die durch ihr Überleben unter beiden Selektionsdrücken gekennzeichnet sind. Wenn die Kugeln vollständig gebildet sind, sind gesunde Kugeln sichtbar, meist 5–10 Tage nach der Teilung ist die Kultur bereit für eine weitere Validierung (Schritt 7).

7. Validierung und Charakterisierung von doppelt transduzierten NSCs

HINWEIS: Bevor weitere Experimente in vitro oder in vivo durchgeführt werden, wird eine weitere Validierung empfohlen, um sicherzustellen, dass HA-markierte Konstrukte und Luziferase angemessen exprimiert werden.

1. Western-Blotting zur Validierung der Ausprägung des HA-getaggten Konstrukts
   1. Kultur-NSCs (GFP-Kontrolle und HA-markierte BRAF). V600E, im bereitgestellten Beispiel) in T-25 Ultra-Low-Adherence-Kolben bis zum Teilen bereit (gemäß Schritt 2.2).
      HINWEIS: Bevor zum nächsten Schritt übergegangen wird, wird empfohlen, die Kulturen auf die fortlaufende GFP-Expression (in GFP-Kontrollzellen) und die RFP-Expression (in allen Zellen) doppelt zu überprüfen.
   2. Entfernen Sie die Hälfte der Kultur und teilen Sie sie gemäß den Schritten 2.2–2.7, dann werden Sie in frischem, vollständigem NSC-Medium mit Blasticidin (1000 ng/mL) und Puromycin (100 ng/mL) neu plattiert, um die Kultur fortlaufend zu erweitern. Spinnen Sie die restlichen Neurosphären bei 630 × g bei 4 °C und aspirieren Sie dann den Supernatant.
   3. Anschließend wurden NSCs zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, bei 630 × g bei 4 °C gedreht und nach jeder Wäsche das Supernatant abgesaugt. Fügen Sie jeder Probe etwa 200 μL eiskalten RIPA-Lysepuffer mit Protease- und Phosphataseinhibitoren hinzu.
   4. Lassen Sie die Lysate 30 Minuten auf Eis inkubieren und sorgen Sie für intermittierendes Vortexen alle 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Geben Sie das Supernatant, das als klares Lysat bezeichnet wird, vorsichtig in ein frisches, vorgekühltes Rohr um. Bewahren Sie die Lysate bei -80 °C in einem Tiefkühler auf.
   5. Lysat kann dann für Western Blotting (zur Validierung von Konstrukten) gemäß den zuvor etablierten Protokollen³⁸ verwendet werden.
      HINWEIS: Wenn Sie sie nicht sofort verwenden, bewahren Sie Lysate bis zur Anwendung bei -80 °C auf. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen, um die Integrität der Probe zu erhalten (siehe Tabelle 1, Punkt Nr. 7).
2. Biolumineszenzintensität (BLI) zur Validierung der angemessenen Expression von Glühwürmchen-Luciferase
   HINWEIS: Dieses Protokoll validiert die Luciferase-Expression mittels BLI-Überwachung lebender Zellen mit spezieller Hardware und Software (siehe Materialtabelle für weitere Details). Bei Verwendung eines anderen Systems zur BLI-Erkennung und Quantifizierung kann die Methodik variieren.
   1. NSCs aufteilen und gemäß den oben genannten Schritten 2.2–2.8 quantifizieren, dann die Zellen in einem vollständigen NSC-Medium und einer Platte bei unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 2,5 x 10^{4 Zellen} , 1 x 10⁵ Zellen/Well) in einer 24-Well-Ultra-Low-Adherence-Platte (500 ml/Well) verdünnen, wobei jede Zellkonzentration vierfach plattiert ist. Die Zellen werden in einem vollständigen NSC-Medium mit Blasticidin (1000 ng/mL) und Puromycin (100 ng/mL) aufbewahrt.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass die durch Luziferase ausgeschiedene Lumineszenzintensität eines Bohrlochs während der Messung in benachbarte Bohrlöcher übergeht, sollten Sie das Plattieren von NSCs in benachbarten Bohrlöchern vermeiden.
   2. Schalten Sie das Bildgebungssystem mindestens 30 Minuten im Voraus ein, damit die ladegekoppelte Gerätekamera auf ihre optimale Betriebstemperatur (ca. -90 °C) abkühlen kann. Starten Sie die Quantifizierungssoftware und desinfizieren Sie die Bildaufnahmekammer mit 70 % Ethanol, sodass sie vor der Verwendung vollständig getrocknet ist.
      HINWEIS: Halten Sie die Temperatur der Bildaufnahmekammer bei 37 °C, um die Zelllebensfähigkeit während längerer Bildgebungssitzungen sicherzustellen.
   3. Tauen Sie die Standardaliquoten von D-Luziferin auf, um sicherzustellen, dass sie vor Lichteinwirkung geschützt sind. Gib eine Menge von 5 μL 15 mg/mL D-Luciferin-Arbeitslösung sanft zu jeder Zelle mit Brunnen, um eine Endkonzentration von 150 mg/mL zu erreichen. Drehen Sie die Platte leicht, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung sicherzustellen.
   4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 10 Minuten, um die Diffusion des Substrats in die Zellen zu erleichtern und so die maximale Lichtproduktion zu fördern.
   5. Positioniere die Platte im empfindlichen Biolumineszenzbildgebungssystem. Lege ein Gitter über die Platte. Wählen Sie den Lumineszenzbildbildmodus und beginnen Sie mit der Autobelichtung für die Belichtungszeit. Stelle das Binning auf mittlere Einstellung und stelle die Blende auf 1 ein, um die Lichtaufnahme zu optimieren.
      1. Stellen Sie das Sichtfeld für 24-Well-Platten auf 'D' ein und fixieren Sie die Bildgröße auf 1,5 cm. Erfassen Sie Bilder mit der Bildgebungssoftware. Wenn das Signal schwach erscheint, kann die Belichtungszeit manuell angepasst werden (siehe Fehlerbehebungstabelle Punkt Nr. 8).
   6. Führen Sie Hintergrundkorrekturen gegen die Kontrollbohrungen durch und quantifizieren Sie die relativen Lichteinheiten bei Bedarf für die spätere Analyse mit der Bildgebungssoftware.
      HINWEIS: Nach der Validierung von BLI können die Zellen orthotopisch in die Gehirne syngener oder immungeschwächter Mäuse gemäß den zuvor festgelegten Protokollen¹⁹ transplantiert werden.

Ergebnisse

Erwachsene NSCs wurden aus dem Kortex adulter C57BL/6-Mäuse isoliert und in nicht-adhärenter Kultur³⁹ gezüchtet, was zur Bildung primärer Neurosphären (20 – 250 μm) innerhalb von 7 bis 10 Tagen führte (Abbildung 1). Die Zellen wurden anschließend in vitro expandiert. Die Optimierung der Blastizidin-Auswahl wurde anschließend in untransduzierten NSCs durchgeführt (Schritt 3). Nach 24 Stunden Selektion führten Konzentr...

Diskussion

Diese zweistufige lentivirale Transduktionsmethode erzeugte erfolgreich gentechnisch veränderte NSCs, die für die onkologische Forschung geeignet sind. Hier wurde die effektive Integration der BRAF V600E onkogenen Mutation (gefunden in einer Teilmenge adulter hochgradiger Gliome und hier als Konzeptnachweis verwendet) oder GFP-Steuerung mit Dual-Reporter-Systemen für Biolumineszenzbildgebung (Luziferase) und Fluoreszenzmikroskopie-Detektion (RFP) demonstriert. Sukzessive Transdu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
β-Mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Nur innerhalb eines biologischen Sicherheitsschrankes verwenden. Bereiten Sie 50 mM Vorräte zu, indem Sie 35 mL BME zu 10 mL zuckerarmem DMEM hinzufügen, steril filtrieren und in 500 mL Aliquote für die Verwendung in der Medienzubereitung aufteilen.
Anti-Mouse IgG, HRP-gekoppelter Antikörper	Cell Signal Technology	7076	Verwendet bei 1:2000 Verdünnung in 1 % fettfreier Milch
B-27-Zusatz (50X),	Gibco	17504-044	Bei der ersten Verwendung auftauen und 1 ml Aliquote für die zukünftige Verwendung herstellen; Aliquote bei -20 °C lagern. Halten Sie die Nahrungsergänzungsmittel nach dem Auftauen auf Eis, bis sie zum Hinzufügen zum Medium bereit sind.
Blasticidin S HCl (10 mg/ml)	Gibco	A1113903	Stellen Sie Aliquote des 10 mg/ml-Stamms her; in 200 ml kleinen Röhrchen platzieren und bei -20 °C bis zur Verwendung lagern.
Bovines Serumalbumin (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Als 10% BSA Gewicht/Volumen in 1x PBS verwendet. BSA ist klebrig; achten Sie darauf, es richtig zu wiegen und ein angemessenes Volumen Verdünnungsmittel hinzuzufügen, um die genaue Lösung herzustellen.
Zellsieb (40 μm)	Midsci	40ICS	Vorsterilisiert und einzeln verpackt. Muss im biologischen Sicherheitsschrank geöffnet werden. Nicht mit bloßen Händen anfassen
D-Luciferin, Kaliumsalz	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Bereiten Sie eine 15 mg/ml Arbeitslösung (verdünnt in molekulargradigem Wasser) vor und sterilisieren Sie vor dem Gebrauch. Bereiten Sie jedes Mal einen frischen Vorrat vor und fügen Sie ihn direkt dem Medium hinzu, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 150 mg/ml zu erreichen (z. B. 5 ml Arbeitslösung pro 500 ml Kultur)
DMEM, zuckerarm	Gibco	11885-084	Verwendet zur Herstellung des NSC-Basismediums
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Corning	354001	Als steril lyophilisiertes Pulver geliefert; um einen 1000fachen Vorrat herzustellen, fügen Sie 4,95 ml PBS und 50 μl 10% BSA (in 1x PBS) zu 100 μg lyophilisiertem EGF-Pulver hinzu und pipettieren Sie, um zu kombinieren. Machen Sie 500 μl oder kleinere Aliquote in kleinen Röhrchen und lagern Sie sie bei -20°C bis zur Verwendung für vollständiges NSC-Medium und NSC-Fütterungszusatz. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Fibroblastenwachstumsfaktor, basisch (FGF)	R&D systems	233-FB	Als steril lyophilisiertes Pulver geliefert; um einen 1000fachen Vorrat herzustellen, fügen Sie 1,24 ml PBS und 12,5 μl 10% BSA (in 1x PBS) zu 25 μg lyophilisiertem FGF-Pulver hinzu und pipettieren Sie, um zu kombinieren. Machen Sie 500 μl oder kleinere Aliquote in kleinen Röhrchen und lagern Sie sie bei -20°C bis zur Verwendung für vollständiges NSC-Medium und NSC-Fütterungszusatz. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Glukose, 45%	Corning	25-037-CI	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
HA-Tag (C29F4) Kaninchen mAb	Cell Signal Technology	3724	Verwendet bei 1: 1000 Verdünnung in 3 % Rinderserumalbumin (Western Blotting, zur Überprüfung der HA-Tag-Expression)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
IVIS 50	PerkinElmer		Das Instrument sollte 30 Minuten vor der Verwendung eingeschaltet sein, damit sich die Kamera auf die optimale Temperatur abkühlen kann. Living Image Software (Version 4.3.1) wird für die Quantifizierung verwendet.
Lentivirus-Luciferase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP muss aliquotiert und im -80 °C Kühlschrank gelagert werden
L-Glutamin, 200 mM	Corning	25-005-CI	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
Molekular-Grade Wasser	Corning	46-000-CM	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
N-2-Zusatz (100x)	Gibco	17502-048	Bei der ersten Verwendung auftauen und 1 ml Aliquote für die zukünftige Verwendung herstellen; Aliquote bei -20 °C lagern. Halten Sie die Nahrungsergänzungsmittel nach dem Auftauen auf Eis, bis sie zum Hinzufügen zum Medium bereit sind.
Nestin (E5C7I) Kaninchen mAb	Cell Signal Technology	89529	Verwendet bei 1: 1000 Verdünnung in 3 % Rinderserumalbumin (Western Blotting, zur Überprüfung der NSC-Marker-Expression)
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Verwendet zur Herstellung des NSC-Basismediums
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	Als sterile Lösung geliefert; aliquotieren und bei -20°C bis zur Verwendung lagern.
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	Als sterile Lösung geliefert. Außerhalb des biologischen Sicherheitsschrankes nicht öffnen
Protease/Phosphatase-Inhibitor	Cell Signal Technology	5872S	Bei -20 °C lagern
Puromycin-Dihydrochlorid	Gibco	A1113803	Stellen Sie Aliquote des 10 mg/ml-Stamms her; in 200 ml kleinen Röhrchen platzieren und bei -20 °C bis zur Verwendung lagern.
RIPA-Lysis-Puffer, 10x	Millipore-Sigma	20-188	Bei -80 °C lagern und Aliquote von 1x in sterilem doppelt destilliertem Wasser herstellen
Serumfreies Zelleinfriermedium	Bambanker (Nippon Genetics)	CS-04-001/BB02	Verdünnen Sie die Zellen in 1 ml Einfriermedium pro Kryovial, um NSCs zu lagern. Nach der Zugabe von Einfriermedium zu den Zellen können die Zellen für die Langzeitlagerung bei -80 °C platziert werden; es ist keine langsame Abkühlung oder Lagerung in flüssigem N2 erforderlich.