Identifikation potenzieller Anti-TB-Kandidaten: Ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Synthese, MIC-Bestimmung und Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung potenzieller Anti-Tuberkulose-Medikamentenkandidaten durch phänotypisches Screening vor, das die chemische Synthese einer 4-Aminochinolin-Verbindung, die Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration gegen Mycobacterium tuberculosis und die Bewertung ihrer Zytotoxizität in Säugetierzelllinien umfasst.

Zusammenfassung

Tuberkulose (TB) bleibt weltweit eine der häufigsten Todesursachen durch einen einzelnen Infektionserreger, da steigende Arzneimittelresistenzraten die Entwicklung neuartiger Therapeutika zu einer globalen Gesundheitspriorität machen. Dieses Protokoll beschreibt einen phänotypischen Screening-Ansatz zur Identifizierung potenzieller Anti-TB-Medikamentenkandidaten in drei integrierten Stufen. Zunächst wird eine Verbindung aus der 4-Aminochinolin-Klasse über einen dreistufigen Weg synthetisiert und vollständig durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) charakterisiert. Zweitens wird die antimikrobielle Aktivität der Verbindung mittels des kolorimetrischen Resazurin-Reduktionsmikroplattentests (REMA) gegen Mycobacterium tuberculosis bewertet, der die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) mittels einer einfachen visuellen Farbveränderungsanzeige bestimmt. Drittens wird die Zytotoxizität der Verbindung in zwei Säugetierzelllinien, Vero (Afrikanische grüne Affenniere) und HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom), mittels MTT-Tests (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) und dem neutralen roten Aufnahmetest (NRU) untersucht. Diese beiden komplementären Assays messen unterschiedliche zelluläre Parameter und ermöglichen so eine Kreuzvalidierung der zytotoxischen Ergebnisse. Zusammen ermöglichen die MIC- und Zytotoxizitätsdaten die Berechnung eines Selektivitätsindex (SI), um das therapeutische Potenzial jeder Verbindung zu bewerten. Dieses Protokoll bietet einen reproduzierbaren Schritt-für-Schritt-Rahmen für die frühzeitige Erkennung und präklinische Diagnostik von Anti-TB-Effekten.

Einleitung

Tuberkulose (TB) wird überwiegend durch den Bazille Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht und ist eine infektiöse Atemwegserkrankung beim Menschen, die hauptsächlich die Lunge betrifft, obwohl auch extrapulmonale Varianten auftreten können. TB verbreitet sich über luftgetragene Mtb-Bazillen, die von Personen mit aktiver Krankheit^{freigesetzt werden}. Je nach Krankheitsverlauf kann eine mit TB infizierte Person sofort an aktiver Tuberkulose erkranken. In der Regel entwickelt jedoch eine neu infizierte Person eine latente Tuberkulose, bei der Mtb-Zellen mit geringer metabolischer Aktivität in Granulomen ^1,2 überleben. Eine Person mit latenter Tuberkulose kann schließlich die aktive Form der Krankheit entwickeln und^{klinische Symptome} zeigen. Derzeit wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung an einer latenten Tuberkuloseinfektion^leidet.

Trotz vieler Fortschritte bleibt TB weltweit ein ernsthaftes Problem der öffentlichen Gesundheit. Daten aus dem jüngsten Global Tuberculosis Report zeigen, dass 2024 10,7 Millionen Menschen an der Krankheit erkrankten. Im selben Jahr wurden weltweit 1,23 Millionen Todesfälle durch TB registriert, womit TB die häufigste Todesursache durch einen einzelnen Infektionsagent⁵ ist. Neben der Pathologie und komplexen Biologie des Mtb machen sozioökonomische Aspekte wie Armut und Mangelernährung sowie gesundheitsbedingte Faktoren wie Rauchen, Diabetes und HIV-Koinfektion die Krankheitskontrolle noch schwieriger⁵. Dies trägt zur langjährigen Dauerhaftigkeit von TB als globales Gesundheitsproblem bei.

Darüber hinaus haben die aktuellen TB-Behandlungen Einschränkungen, die den Kampf gegen die Krankheit erschweren. Gegen anfällige Mtb-Stämme besteht die Standardbehandlung aus einer Kombinationstherapie aus 4 Medikamenten: Isoniazid (INH), Rifampicin (RIF), Ethambutol (EMB) und Pyrazinamid (PZA). Diese Antibiotika werden mindestens 6 Monate verabreicht und erfordern während der gesamten Behandlung strenge Einhaltung. Dieses therapeutische Regime, obwohl es in den meisten Fällen wirksam ist und eine Erfolgsquote von etwa 85 % aufweist, steht dennoch vor vielen Herausforderungen ^5,6. Zu den größten Problemen gehören die Nebenwirkungen und die längere Dauer, die oft zu einer vorzeitigen Unterbrechung durch den Patienten führen. Dieses Absetzen sowie die falsche Verabreichung der Antibiotika begünstigen die Auswahl resistenter Mtb-Stämme, die toxischere, teurere und umfangreichere Therapien erfordern ^7,8.

Angesichts dieses Szenarios ist die Entwicklung neuer, wirksamer Anti-TB-Medikamente dringend. Dieses Protokoll beschreibt die frühen Phasen der Erforschung neuer Arzneimittelkandidaten mittels phänotypischem Screening. Um die Anwendung dieses Protokolls zu veranschaulichen, wählten wir eine aus LABIO-17 gewonnene 4-Aminochinolin-Verbindung zur Bewertung aus. LABIO-17 wurde zuvor von unserer Forschungsgruppe als Inhibitor des Enzyms Enoyl-ACP-Reduktase (InhA) in Mtb identifiziert, das dasselbe molekulare Ziel wie Isoniazid (INH)^9,10 ist. InhA ist an der Mykolsäure-Biosynthese bei M. tuberculosis beteiligt und für das Überleben des Bazillens unerlässlich, was seine Bedeutung als vielversprechendes molekulares Ziel^hervorhebt.

Protokoll

1. Chemische Synthese und Charakterisierung

HINWEIS: Die Synthese und Charakterisierung der chemischen Verbindung erfolgen wie zuvor beschrieben¹⁰. Alle Schritte von 1.1 bis 1.4 sollten in einer gut belüfteten Dampfhaube mit Nitrilhandschuhen durchgeführt werden.

1. Herstellung von Reagenzien
   1. Herstellung von MeOH/CH₃CN (1:1) mit 0,1 % Ameisensäure
      1. Messen Sie gleiche Mengen Methanol (MeOH) und Acetonitril (CH₃CN) ab, um eine 1:1 (v/v) Mischung (HPLC-Qualität) herzustellen.
      2. Kombinieren Sie die Lösungsmittel in einem sauberen, trockenen Behälter (z. B. einem Volumenkolben). Fügen Sie Ameisensäure hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1 % (v/v) zu erreichen (z. B. 1 ml Ameisensäure zu 1 L Lösungsmittelmischung hinzufügen).
      3. Gründlich durch sanftes Wirbeln oder Rühren vermischen. Lagere sie in einem dicht geschlossenen Behälter bei Zimmertemperatur, geschützt vor Licht.
   2. Herstellung von 1 % (v/v) Essigsäure in ultrareinem Wasser
      1. Spülen Sie die Mengflasche mit ultrareinem Wasser ab und stellen Sie sie dann auf die Werkbank. Fügen Sie ~80 % des endgültigen Ultrareinwasservolumens in die Flasche (d. h. 80 ml für eine 100 ml-Flasche; 800 ml für eine 1-Liter-Flasche).
      2. Mit einer kalibrierten Pipette wird Gletscheressigsäure hinzugefügt, um 1 % (v/v) zu erreichen: Für 100 ml Endvolumen → 1,0 ml Essigsäure hinzufügen; für 1 L Endvolumen → 10,0 ml Essigsäure hinzufügen.
      3. Gründlich durch Wirbel oder Rühren vermischen. Fülle die Flasche bis zum letzten Punkt mit ultrareinem Wasser auf und vermische es.
      4. Entgasen Sie die Lösung durch Sonikation mit einem Ultraschallreiniger (Tankfrequenz ~40 kHz), der für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur auf Entgasungsmodus eingestellt ist.
      5. Auf eine beschriftete Bernsteinflasche übergeben (Etikett: Gehalt, Konzentration, Lösungsmittelqualität, Datum, Vorbereitungsgerät). Dicht geschlossen bei Zimmertemperatur aufbewahren.
   3. Herstellung von Acetonitril: Methanol (1:1, v/v), HPLC-Qualität
      1. Messen Sie gleiche Volumina Acetonitril und Methanol: Für 100 mL Endvolumen → 50,0 mL Acetonitril + 50,0 mL Methanol; für 1 L Endvolumen → 500 mL Acetonitril + 500 mL Methanol.
      2. Kombinieren Sie die Lösungsmittel in einem sauberen Volumenkolben oder einer Flasche und mischen Sie sie durch Inversion oder Rühren. Filtern Sie das Gemisch durch einen 0,45-μm-Filter in einen sauberen Behälter, um Partikel zu entfernen.
      3. Entgasen Sie die Lösung durch Sonikation mit einem Ultraschallreiniger (Tankfrequenz ~40 kHz), der für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur auf Entgasungsmodus eingestellt ist.
      4. Auf eine beschriftete Bernsteinflasche übergeben (Etikett: Zusammensetzung, Lösungsmittelqualität, Datum, Vorbereitungsgerät). Lagern Sie sie fest geschlossen bei Zimmertemperatur, fern von Hitze und Licht.
   4. Herstellung von Hexan/Ethylacetat 7:3 (v/v)-Lösung für die Säulenchromatographie
      1. Messen Sie 70 % des Endvolumens in Hexan. Beispiel: Für 100 mL Endvolumen → 70 mL Hexan.
      2. Messen Sie 30 % des Endvolumens in Ethylacetat ab. Beispiel: Für 100 ml Endvolumen → 30 ml Ethylacetat.
      3. Kombinieren Sie beide Lösungsmittel in einem sauberen, trockenen Behälter (z. B. Volumenkolben oder -flasche).
      4. Gründlich umrühren oder umdrehen, bis es homogen ist. Beschriften Sie den Behälter mit Zusammensetzung, Datum, Lösungsmittelqualität und Vorbereiter.
   5. Herstellung von Hexan/Ethylacetat 1:1 (v/v)-Lösung für die Säulenchromatographie
      1. Messen Sie 50 % des Endvolumens in Hexan. Beispiel: Für 100 mL Endvolumen → 50 mL Hexan.
      2. Messen Sie 50 % des Endvolumens in Ethylacetat ab. Beispiel: Für 100 ml Endvolumen → 50 ml Ethylacetat.
      3. Kombinieren Sie beide Lösungsmittel in einem sauberen, trockenen Behälter (z. B. Volumenkolben oder -flasche). Gründlich umrühren oder umdrehen, bis es homogen ist.
      4. Beschriften Sie den Behälter mit Zusammensetzung, Datum, Lösungsmittelqualität und Vorbereiter.
   6. Herstellung einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung (NaHCO₃)
      1. Wiegen Sie eine überschüssige Menge Natriumbicarbonat (NaHCO₃) (ca. 15–20 g pro 100 ml Wasser).
      2. Geben Sie das Natriumbicarbonat zu einem sauberen Becher mit einem bekannten Volumen destilliertem Wasser (zum Beispiel 100 ml). Rühren Sie die Mischung kontinuierlich bei Raumtemperatur (20–25 °C) mit einem magnetischen Rührer oder einer Glasstange um.
      3. Rühren Sie weiter, bis kein fester Stoff mehr gelöst ist und eine kleine Menge ungelöstes Natriumbicarbonat am Boden zurückbleibt – dies zeigt, dass die Lösung gesättigt ist.
      4. Lassen Sie die Suspension 10–15 Minuten ruhen, damit der ungelöste Feststoff absinken kann. Filtern Sie die Mischung durch einen Papierfilter oder einen gesinterten Glastrichter, um das überschüssige, ungelöste Bicarbonat zu entfernen.
      5. Sammeln Sie das klare Filtrat, das die gesättigte Natriumbicarbonatlösung ist.
      6. Bewahren Sie die Lösung in einer fest verschlossenen Flasche auf, die korrekt mit dem Verbindungsnamen, der Konzentration (gesättigt), dem Herstellungsdatum und Ihren Initialen gekennzeichnet ist.
      7. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur und bereiten Sie sie bei Bedarf frisch vor, da_CO2 langsam entweichen und die Konzentration im Laufe der Zeit verändern kann.
2. Synthese von 6-Bromo-2-Methylchinolin-4-ol (3)
   1. Bereiten Sie eine Lösung mit 4-Bromanilin (1,2 g, 7,3 mmol) und wasserfreiem Magnesiumsulfat (1,08 g, 9,0 mmol) in Ethanol (15 mL) her.
   2. Fügen Sie der Lösung Gletscheressigsäure (0,33 mL) und Ethylacetoacetat (1,8 mL, 14,1 mmol) hinzu. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei 90 °C 16 Stunden lang um.
   3. Filtern Sie das Reaktionsgemisch durch Zellulose, 11 μm Retention, qualitatives Filterpapier, um das suspendierte Magnesiumsulfat zu entfernen.
   4. Verdampfen Sie das Ethanol mit einem rotierenden Verdampfer, um das Acrylat-Zwischenprodukt zu gewinnen.
   5. Erhitze das Zwischenprodukt mit einem geeigneten Ölbad mit einer hochleistungsfähigen synthetischen Wärmeübertragungsflüssigkeit (siehe Materialtabelle) (15 mL) bei 230–250 °C für 15 Minuten, um die Reaktion abzuschließen.
   6. Kühlen Sie die Mischung auf Zimmertemperatur ab. Filtern Sie das gebildete Niederschlagsmittel und waschen Sie es mit Hexan und Chloroform.
   7. Konzentrieren Sie das Endprodukt unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer, bis alle Restlösungsmittel entfernt sind (siehe Materialtabelle).
3. Synthese von 6-Brom-4-Chloro-2-Methylchinolin (4)
   1. Bereiten Sie eine Lösung aus 6-Brom-2-Methylchinolin-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) in Toluol (10 ml) her. Fügen Sie der Lösung Phosphor(V)-Oxychlorid (0,65 mL, 6,9 mmol) hinzu.
   2. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei 110 °C 2 Stunden lang um. Entfernen Sie das überschüssige Phosphor(V)-Oxychlorid mit einem Rotationsverdampfer.
   3. Kühlen Sie die Rückstände in einem Eisbad. Neutralisieren Sie das Reaktionsgemisch mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung.
   4. Extrahieren Sie das Produkt mit Ethylacetat (3 x 50 ml). Kombinieren Sie die organischen Phasen und trocknen Sie sie über wasserfreiem Natriumsulfat.
   5. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer, um einen festen Rückstand zu erhalten. Trocknen Sie den entstehenden Feststoff mit einem rotierenden Verdampfer, um das Rohölprodukt zu erhalten.
   6. Reinigen Sie die Verbindung durch Blitzchromatographie auf Siliziumgel (35–70 Mesh) unter Verwendung von Hexan: Ethylacetat (7:3) als Eluent.
4. Synthese von 6-Bromo-2-methyl-N-(4-(Piperidin-1-yl)phenyl)quinolin-4-amin (6)
   1. Bereiten Sie eine Reaktionsmischung vor, die 6-Brom-4-Chloro-2-Methylchinolin (0,53 g, 2 mmol), 4-(Piperidin-1-yl)anilin (0,57 g, 3 mmol), Pyridin (0,24 mL) und HCl 37 % (0,2 mL) in Isopropanol (20 mL) enthält.
   2. Rühren Sie die Reaktionsmischung 16 Stunden bei 85 °C um. Entferne das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.
   3. Behandeln Sie den Rückstand mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung.
   4. Filtern Sie den resultierenden Feststoff durch ein Cellulose-, 11 μm Retentionsfilterpapier und lösen Sie es in Chloroform (50 ml).
   5. Waschen Sie die Chloroformlösung mit Wasser (3 x 15 ml). Trockne die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat.
   6. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem rotierenden Verdampfer, um einen grünen Feststoff zu erhalten. Reinigen Sie das Produkt durch aufeinanderfolgende Waschen mit heißem Hexan (4 x 10 ml).
   7. Durchführung der Endreinigung durch Blitzchromatographie auf Siliziumgel (35–70 Mesh) unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (1:1) als Eluent.
5. Dünnschichtchromatographie (TLC)
   1. Überwachen Sie den Reaktionsfortschritt mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) auf TLC-Siliziumgelplatten 60 F254.
   2. Verwenden Sie Ausgangsmaterial 4 als Referenz, um die Reaktion zu überwachen und ihren Verbrauch zu bewerten.
6. Schmelzpunkt (m.p.)
   1. Füge eine Pfannenwenderspitze der Verbindung zum Schmelzpunktapparat hinzu. Erfassen Sie den Schmelzpunktbereich.
   2. Führen Sie keine Korrekturen auf die gemessenen Werte vor. Führe das Experiment im dreifachen Exemplar durch.
7. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
   1. Wiege 1–2 mg Verbindung 6. Bereiten Sie eine Serienlösung der Verbindung mit 1,0 mg/mL in Acetonitril/Methanol (1:1, v/v) vor.
   2. Verdünnen Sie die Serienlösung zur Analyse auf 0,5 mg/ml. Analysieren Sie die Proben mit einem HPLC-System (siehe Materialtabelle), das mit einer Doppelpumpe, einem automatischen Injektor und einem UV-Detektor ausgestattet ist.
   3. Erfassung und Verarbeitung von Daten mit Chromatographie-Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle).
   4. Setzen Sie die chromatographischen Bedingungen wie folgt ein: Verwenden Sie eine umgekehrte Phase C18-Säule, 5 μm (250 x 4,6 mm) (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Durchflussrate auf 1,5 mL/min ein und überwachen Sie die UV-Erkennung bei 254 nm. Die mobile Phase bei 100 % Wasser (0,1 % Essigsäure) von 0 bis 7 Minuten halten; Wenden Sie einen linearen Gradienten von 100 % Wasser (0,1 % Essigsäure) auf 90 % Acetonitril/Methanol (1:1, v/v) von 7 bis 15 Minuten an; Nach 5 Minuten wieder zu 100 % Wasser (0,1 % Essigsäure) zurückgehen und weitere 10 Minuten halten.
8. Kernmagnetresonanz (¹H, ¹³C)
   1. Wägen Sie 15–20 mg Verbindung 6 in ein NMR-Rohr. Füge DMSO-D₆ als Lösungsmittel hinzu.
   2. Erfassen Sie ¹H und ¹³C NMR-Spektren auf einem NMR-Spektrometer (siehe Materialtabelle) mit Standard-Pulssequenzen.
   3. Betreiben Sie das Instrument bei 400 MHz für 1H-Kerne und 100 MHz für ¹³C-Kerne. Verwenden Sie Tetramethylsilan (TMS) als interne Referenz.
   4. Chemische Verschiebungen (δ) in Teilen pro Million (ppm) ausdrücken. Verwenden Sie die aus dem Experiment gewonnene FID-Datei, um die NMR-Daten zu visualisieren und zu verarbeiten.
9. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)
   1. Wiege 1–2 mg Verbindung 6. Bereiten Sie die Probe in einer 1:1-Mischung aus MeOH/CH₃CN vor, die 0,1 % Ameisensäure enthält.
   2. Führen Sie die Analyse an einem hochauflösenden Orbitrap-Massenspektrometer durch (siehe Materialtabelle), das ein lineares Ionenfall-Massenspektrometer mit einem Orbitrap-Massenanalysator kombiniert.
   3. Die Probe wird durch direkte Infusion mit einer Durchflussrate von 10 μL/min im positiven Ionenmodus mittels Elektrosprayionisation (ESI) eingeführt.
   4. Bestimmen Sie die Elementzusammensetzung mit dem Elementzusammensetzungstool in der Massenspektrometrie-Datenanalyse-Software (siehe Materialtabelle).
10. Säulenchromatographie – Verbindung 4
    1. Bereiten Sie eine Silikagelsäule mit Siliziumgel 60 Å (70–230 Gitter, 0,063–0,200 mm) vor. Füllen Sie die Säule entsprechend mit dem Silikagel.
    2. Verwenden Sie Hexan/Ethylacetat (7:3, v/v) als mobile Phase. Lade das Rohöl-Compound 4 auf die Säule. Elutieren Sie die Verbindung und sammeln Sie Fraktionen.
    3. Überwachen Sie die Fraktionen mit TLC und kombinieren Sie diejenigen, die das reine Produkt enthalten.
11. Säulenchromatographie – Verbindung 6
    1. Bereiten Sie eine Silikagelsäule mit Siliziumgel 60 Å (70–230 Gitter, 0,063–0,200 mm) vor. Füllen Sie die Säule entsprechend mit dem Silikagel.
    2. Verwenden Sie Hexan/Ethylacetat (1:1, v/v) als mobile Phase. Lade das Rohöl-Compound 6 auf die Säule. Elutieren Sie die Verbindung und sammeln Sie Fraktionen.
    3. Überwachen Sie die Fraktionen mit TLC und kombinieren Sie diejenigen, die das reine Produkt enthalten.

Abbildung 1. Reagenzien und Zustände: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 H; ii = C₁₂H₁₀, C₁₂H₁₀O, 230-250 °C, 15 Min; iii = POCl₃, Toluen, 110 °C, 2 H; iv = Pyridin, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration

1. Versuchsdesign und Plattenanordnung
   1. Bewerten Sie die Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Wachstum von M. tuberculosis zu hemmen, indem Sie den kolorimetrischen Resazurin-Reduktionsmikroplatten-Test (REMA) verwenden, um die Minimum Inhibitory Concentration (MIC) zu bestimmen, wie zuvor beschrieben 11,12,13.
   2. Führen Sie drei unabhängige Experimente (drei biologische Replikate) für jede getestete Verbindung ohne technische Replikate durch (eine Reihe pro Verbindung und eine Platte pro Experiment).
   3. Bewerten Sie Verbindungen, die als positive Kontrollmittel wirken, zusammen mit Teststoffen, um sicherzustellen, dass die Testbedingungen Wachstumshemmung ermöglichen.
   4. Isoniazid (INH) und Rifampicin (RIF) werden als positive Kontrolle getestet.
   5. Weisen Sie die Zeilen A und B für Kontrollverbindungen (INH bzw. RIF) zu.
   6. Weisen Sie nachfolgende Zeilen für Testverbindungen zu (Verbindungen A bis F in Abbildung 2).
   7. Bereiten Sie die Kolonnen 1 bis 10 mit zweifachen seriellen Verdünnungen von Kontroll- und Testverbindungen vor, wobei jede Verbindung eine Reihe einnimmt, wobei die höhere Konzentration an Spalte 10 und die niedrigere Konzentration an Spalte 1 liegt.
   8. Säule 11 wird als Wirksamkeitskontrolle mit Wachstumsmedium und Bakterien bei einer endgültigen DMSO-Konzentration von 2,5 % vorbereitet, ohne dass Kontroll- oder Testmittel hinzugefügt werden.
   9. Säule 12 wird als Sterilitätskontrolle vorbereitet, indem man Kontroll- oder Testverbindungen bei höherer Konzentration der seriellen Verdünnung (wie Säule 10) in das Wachstumsmedium ohne bakterielle Zellen einsetzt.
   10. Siehe Abbildung 2 für eine repräsentative Anordnung einer MIC-Platte.
2. Herstellung von Reagenzien
   1. Zubereitung von Middlebrook 7H9-Brühe, ergänzt mit Oleinsäure, Albumin, Dextrose und Catalase (OADC).
      1. Zu einer 200-ml-Glasflasche mit 90 ml ultrareinem Wasser werden 0,47 g 7H9-Pulver, 0,24 ml 85 % Glycerol und 0,5 ml 10 % Tween-80 hinzugefügt.
      2. Autoklaven das Medium 10 Minuten bei 121 °C und 98,07 kPa.
      3. Lassen Sie das Medium abkühlen, bis es warm ist (ca. 45–50 °C).
      4. Fügen Sie 10 ml OADC hinzu (wir verwenden kommerziell erhältliches OADC; siehe Materialtabelle für Details).
      5. Lagern Sie bei 4 °C.
         HINWEIS: Bereiten Sie die passende Menge für das Experiment vor, unter Berücksichtigung der Anteile der Reagenzien.
   2. Zubereitung von Middlebrook 7H9 Brühe mit ADC
      1. Zu einer 200 ml Glasflasche mit 90 ml ultrareinem Wasser geben Sie 0,47 g 7H9-Pulver. Autoklaven das Medium 10 Minuten bei 121 °C und 98,07 kPa.
      2. Lassen Sie das Medium abkühlen, bis es warm ist (ca. 45–50 °C). Gib 10 ml ADC dazu. Lagern Sie bei 4 °C.
         HINWEIS: Bereiten Sie die passende Menge für das Experiment vor, wobei die Proportionen der Reagenzien erhalten bleiben.
   3. Herstellung von Compound-Stocklösungen
      1. Bereiten Sie eine Grundlösung jeder Verbindung mit 2 mg/mL in DMSO gelöst vor.
      2. Lagern Sie bei –20 °C.
         HINWEIS: Vor dem Experiment wird die maximale Testkonzentration anhand einer Löslichkeitsbewertung definiert. Um die Löslichkeitsgrenze zu bestimmen, werden die Lösungen visuell auf das Vorhandensein von Kristallen untersucht. Wenn Kristalle beobachtet werden, verdünnen Sie den Aliquot weiter auf die Hälfte der vorherigen Konzentration. Führen Sie diese Bewertung mit 5 % DMSO durch.
   4. Herstellung von zusammengesetzten Arbeitslösungen
      HINWEIS: Arbeitslösungen sollten zum Zeitpunkt des Experiments frisch vorbereitet werden, indem die Grundstoffverbindungen in 7H9-Brühe mit 10 % ADC ergänzt werden. Die endgültige DMSO-Konzentration in der Arbeitslösung sollte 5 % betragen, und die Verbindungskonzentration sollte doppelt so hoch wie die höchste beabsichtigte Testkonzentration sein. Bemerkenswert ist, dass die endgültige DMSO-Konzentration, der Bakterien während des Tests ausgesetzt sind, 2,5 % beträgt, da das Volumen nach der Zugabe der bakteriellen Suspension verdoppelt wird (siehe Abschnitt 2.3, Schritt 2.3.8).
      HINWEIS: DMSO 2,5 % werden von den in unserem Labor verwendeten Bakterienstämmen (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv und klinische Isolate) vertragen. Wenn Sie mit anderen Stämmen oder Bakterienarten arbeiten, führen Sie ein vorläufiges MIC-Experiment mit DMSO als Testverbindung durch, um die höchsten DMSO-Konzentrationen zu bestimmen, die ohne Wachstumshemmung verwendet werden können.
   5. Herstellung der Resazurin-Lösung
      1. Bereiten Sie eine 0,01%ige Resazurin-Lösung vor, indem Sie 1 mg Resazurin in 10 ml ultrareinem Wasser auflösen.
      2. Sterilisiere die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter.
         HINWEIS: Filtersterilisiertes Resazurin kann bei 4 °C 1 Woche¹⁴ gelagert werden. Bereiten Sie diese Lösung jedoch unmittelbar vor der Anwendung als Standardverfahren vor.
3. Herstellung von Mykobakterien
   1. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von M. tuberculosis in ein 50-mL-Zentrifugenrohr mit 10 ml 7H9-Brühe, ergänzt mit 10 % OADC, 0,2 % Glycerol und 0,05 % Tween-80.
   2. Inkubieren Sie mit ständigem Schütteln (100 U/min) bei 37 °C, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,6 bis 0,8 (ca. 3 bis 4 Wochen) erreicht.
      VORSICHT: M. tuberculosis H37Rv wird als Risikogruppe 3-Erreger eingestuft, der eine luftübertragene Übertragung bewirken kann und potenziell tödliche Krankheiten beim Menschen verursacht. Führen Sie alle Manipulationen in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank innerhalb eines Biosicherheits-Labors der Stufe 3 (BSL-3) unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durch.
   3. Homogenisieren Sie die Bakterienkultur, indem Sie mit sterilen Glasperlen (1 mm) für 3 Minuten vortexen.
   4. Lass die Suspension 15 Minuten ruhen, damit sich die Klumpen absetzen.
   5. Messen Sie den OD₆₀₀ des Supernatanten und lagern Sie Aliquoten bei −80 °C.
      HINWEIS: Für Experimente verdünnen Sie die bakterielle Suspension auf einen theoretischen OD₆₀₀ von 0,006 in frischer 7H9-Brühe, ergänzt mit 10 % ADC. Dosieren Sie während des Tests 100 μL pro Bohrloch in 96-Well-Platten.
4. Vorbereitung von 96-Well-Platten
   1. Fügen Sie 100 μL 7H9-Brühe mit 10 % ADC in Säule 12 hinzu.
   2. Fügen Sie 100 μL 7H9-Brühe, ergänzt mit 10 % ADC (mit 5 % DMSO), zu den Spalten 11 und 9 bis 1 hinzu.
   3. Fügen Sie 200 μL der Verbindung (hergestellt mit doppelter höchster Testkonzentration) in Spalte 10 hinzu (weist pro Verbindung eine Reihe zu).
   4. Fügen Sie 100 μL der Verbindungslösung in Säule 12 hinzu. Führen Sie eine zweifache serielle Verdünnung durch: Übertragen Sie 100 μL von Säule 10 auf Spalte 9 und mischen Sie gut durch Pipetieren.
   5. Setzen Sie die serielle Verdünnung von Spalte 9 bis Spalte 1 fort. Verwerfen Sie die letzten 100 μL aus Spalte 1.
   6. Fügen Sie 100 μL der bakteriellen Suspension (theoretischer OD₆₀₀ von 0,006) zu den Spalten 11 bis 1 hinzu.
   7. Decken Sie die Platte ab, versiegeln Sie sie mit Parafilm und inkubieren Sie 7 Tage bei 37 °C.
      HINWEIS: Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Anordnung einer MIC-Platte. Siehe diese Abbildung, um die Schritte 2.3.1 bis 2.3.9 zu interpretieren.
5. Hinzufügung von Resazurin und Datenanalyse
   1. Geben Sie 60 μL 0,01% Resazurin-Lösung in jede Mulde der Platte. Decken Sie die Platte ab, versiegeln Sie sie mit Parafilm und inkubieren Sie 48 Stunden bei 37 °C.
   2. Beobachten Sie den Farbwechsel von Blau (Wachstumshemmung) zu Rosa (Bakterienwachstum).
      HINWEIS: In einigen Experimenten führt eine unvollständige Farbveränderung zu einem lila Brunnen. Interpretiere dies als Bakterienwachstum.

Abbildung 2. Schematische Darstellung einer Brühe-Mikroverdünnungsplatte, die zur Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) verwendet wird. Zweifache serielle Verdünnungen der getesteten Verbindungen wurden über die Säulen 1–10 verteilt, die anschließenden Verdünnungen erfolgen nacheinander von Spalte 10 bis Spalte 1, wobei die höchste Verbindungskonzentration in Spalte 10 ist. Die Zeilen A und B entsprechen positiven Kontrollen, die die Referenzmedikamente Isoniazid bzw. Rifampicin enthalten. Die Zeilen C–H entsprechen den getesteten Verbindungen. Spalte 11 steht für die Viabilitätskontrolle (Medium mit 2,5 % DMSO und bakteriellem Inokulum), während Spalte 12 der Sterilitätskontrolle entspricht (Medium, das die Verbindungen ohne bakterielles Inokulum enthält). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzelllinien

HINWEIS: Alle Zellkulturmanipulationen werden unter sterilen Bedingungen in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.

1. Herstellung von Säugetierzelllinien
   1. Kultivierung von menschlichen Leberkarzinomen (HepG2) und Zelllinien des Afrikanischen Grünen Affen (Vero) in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
   2. Ergänzen Sie das Medium mit 1,8 g/L Natriumbicarbonat, 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,1 % Amphotericin B (als vollständiges Medium bezeichnet).
   3. Inkubieren Sie die Zellkulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %_CO2.
   4. Entnehmen Sie subkonfluente Zellen (70 %–80 %) durch Behandlung mit einer 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung für 5–10 Minuten.
   5. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen vollständigen Mediums hinzufügen. Die Zellsuspension wird in ein 15 mL konisches Rohr übertragen und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
   6. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in 10 mL frisches, vollständiges Medium.
   7. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozyometer mit Ausschluss von Trypan-Blau.
      HINWEIS: Für den Ausschluss von Trypan-Blau mischen Sie 10 μL Zellsuspension mit 10 μL 0,4 % Trypan-blauer Lösung und legen Sie es auf das Hämozytometer (oder Zählobjekt). Tote oder membrankompromittierte Zellen erscheinen blau, während lebensfähige Zellen unbefleckt bleiben. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit als % Lebensfähigkeit = (unverfärbte Zellen / Gesamtzellen) x 100. Setzen Sie die Aussaat nur dann auf, wenn die Lebensfähigkeit ≥ 90 % beträgt.
   8. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf die Ziel-Aussaatdichte. Säe 100 μL Zellsuspension in jede Mulde der Säulen 2 bis 12 einer 96-Bohrloch-Flachbodenplatte.
      Aussaatdichte: 4.000 Zellen/Brunnen für Vero-Zellen; 5.000 Zellen/Brunnen für HepG2-Zellen.
      HINWEIS: Optimieren Sie diese Dichten, um sicherzustellen, dass die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase bleiben und vor dem 48-Stunden-Endpunkt nicht 100 % Konfluenz erreichen.
   9. Füllen Sie Spalte 1 mit 100 μL vollständigen Mediums (ohne Zellen), um als Blank für Absorptionsmessungen zu dienen.
   10. Bereiten Sie für jede Zelllinie vier identische Platten vor: zwei für den MTT-Test und zwei für den NRU-Test.
   11. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO2_{, um eine} Zellbindung zu ermöglichen.
2. Verdünnung von Verbindungen und Zellbehandlung
   1. Bereiten Sie für jede Testverbindung Lagerlösungen in Dulbeccos Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) oder einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Dimethylsulfoxid) vor; DMSO).
      HINWEIS: Überprüfen Sie, ob die Verbindung im Zellkulturmedium löslich ist und dass die Lösungsmittelkonzentration vor dem Test ungiftig ist (z. B. <0,1 % v/v für DMSO).
   2. Entwerfen Sie das Plattenlayout so, dass es Rohstoffe, geeignete Bedienelemente und technische Nachbildungen enthält. Ein repräsentatives Layout zum Testen von bis zu 9 Verbindungen über 8 Konzentrationen hinweg ist in Abbildung 3 dargestellt.
   3. Bereite serielle Verdünnungen der Testverbindung(en) im vollständigen Medium vor, um den beabsichtigten Konzentrationsbereich abzudecken. Stellen Sie sicher, dass für alle Replikationsplatten ausreichend Volumen vorbereitet ist.
      HINWEIS: Wenn Sie ein Lösungsmittel (z. B. DMSO) verwenden, ergänzen Sie das Verdünnungsmedium so, dass die Endkonzentration des Lösungsmittels über die gesamte serielle Verdünnungsreihe konstant bleibt.
      HINWEIS: Lösungsmittelbehandelte Bohrlöcher (Vehikelkontrolle) dienen als funktionelle negative Kontrolle und definieren die 100%ige Zellviabilität, gegen die verbindungsbehandelte Bohrlöcher normalisiert werden. Zur Prüfvalidierung sollte eine zytotoxische Referenzverbindung (z. B. 0,1 % Triton X-100 oder 1 mM Natriumdodecylsulfat) in einer Konzentration verwendet werden, die nachweislich einen vollständigen Zelltod (0 % Lebensfähigkeit) verursacht. Die Absorptionswerte in diesen positiven Kontrollbrunnen sollten sich nicht signifikant von denen von Blankwells unterscheiden, was die Lebensfähigkeit von 0 % bestätigt.
   4. Nach der 24-stündigen Zellanheftungsphase wird die Platten unter einem invertierten Mikroskop visuell untersucht, um sicherzustellen, dass die Zellen anhaften, sich ausbreiten und etwa 70–80 % der Bohrlochoberfläche mit homogener Konfluenz bedecken. Entsorge Platten mit Kontamination oder unzureichender Befestigung.
   5. Aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig mit einer Pipettspitze und neigen Sie die Spitze zur Seite jedes Lochs, um die Zellmonoschicht nicht zu stören. Verarbeiten Sie Platten in Abschnitten, um Austrocknung zu verhindern.
   6. Fügen Sie sofort 100 μL der entsprechenden Testverbindungsverdünnungen oder Kontrollmedien zu den entsprechenden Bohrungen hinzu.
   7. Inkubieren Sie die behandelten Platten 48 Stunden bei 37 °C, 5 %_CO2.
3. MTT-Assay-Protokoll
   1. Bereiten Sie eine 0,5 mg/mL MTT-Lösung in serumfreiem DMEM vor. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Spritzenfilter und schützen Sie vor Licht.
   2. Nach der 48-stündigen Behandlung werden die Zellen visuell untersucht, um die erwarteten Behandlungseffekte zu bestätigen.
   3. Saugen Sie das Medium vorsichtig von den MTT-Platten ab. Fügen Sie jedem Bohrloch 50 μL der 0,5 mg/mL MTT-Arbeitslösung hinzu.
   4. Inkubieren Sie 3 Stunden bei 37 °C, 5 %_CO2, geschützt vor Licht.
      HINWEIS: Während 2–4 Stunden üblich sind, reicht eine 3-stündige Brutzeit typischerweise für Vero- und HepG2-Zellen aus. Optimiere bei Bedarf auf.
   5. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL 100 % DMSO hinzu, um die Formazankristalle aufzulösen. Legen Sie die Platten 15 Minuten lang auf einen Orbitalshaker bei 100 U/min, geschützt vor Licht. Kontrollbrunnen inspizieren, um eine vollständige Kristallauflösung sicherzustellen. Misse die Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplattenleser. Wenn verfügbar, stellen Sie eine Referenzwellenlänge von 630–690 nm ein.
4. Neutral Red Uptake (NRU) Assay-Protokoll
   1. Bereiten Sie eine 40 μg/mL Neutral Red (NR) Lösung in serumfreiem DMEM und Filter vor. Bereiten Sie die NR-Desorptionslösung vor: 1 % (v/v) Gletscheressigsäure, 49% (v/v) Ethanol und 50% (v/v) ultrareines Wasser.
      VORSICHT: Gletscheressigsäure ist korrosiv; Kontrolle in einer Abzughaube.
   2. Nach der 48-Stunden-Behandlung werden die Zellen visuell inspiziert. Saugen Sie das Medium vorsichtig von den NRU-Platten ab.
   3. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL der 40 μg/mL NR-Arbeitslösung hinzu. Inkubiere 2 Stunden bei 37 °C, 5 %_CO2.
      HINWEIS: Eine 2-stündige Inkubation reicht für die maximale Farbstoffaufnahme in diesen Zelllinien aus.
   4. Aspiratiere die NR-Arbeitslösung. Spülen Sie jede einzelne Person vorsichtig einmal gründlich mit 150 μL sterilem PBS ab.
   5. Fügen Sie jedem Bohrloch 150 μL der NR-Desorptionslösung hinzu. Auf einen Orbitalshaker bei 150 U/min für 15 Minuten legen, um den Farbstoff zu extrahieren.
   6. Kontrollbrunnen inspizieren, um eine vollständige Farbstoffextraktion sicherzustellen. Die Absorption bei 540 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen.
5. Datenanalyse
   1. Hintergrundsubtraktion durchführen, indem man die durchschnittliche Absorption der leeren Spalten berechnet und diesen Wert von allen Bohrlöchern abzieht.
   2. Führen Sie eine Lösungsmitteltoxizitätsprüfung durch, indem Sie Lösungsmittelkontrollbrunnen mit unbehandelten Kontrollen vergleichen. Wenn die Viabilität unter einer definierten Schwelle liegt (z. B. 80 %), betrachtet man die Zytotoxizität des Lösungsmittels.
   3. Berechnung der prozentualen Viabilität im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollbrunnen:
      % Viabilität = (Absorption des behandelten Guts / mittlere Absorption der Lösungsmittelkontrolle) x 100.
   4. Darstelle prozentuale Viabilität (y-Achse) gegen log₁₀ der Verbindungskonzentration (x-Achse). Verwenden Sie ein nichtlineares Regressionsmodell (sigmoidale Dosis-Antwort, variable Steigung), um CC₅₀ zu bestimmen.
   5. Berechnen Sie den Selectivitätsindex (SI), indem Sie CC₅₀ durch MIC teilen.

Abbildung 3. Beispiel für Plattendesign für MTT/NRU-Zellviabilitätstest, frühes Screening-Setup zur Untersuchung der Zytotoxizität von bis zu 9 Verbindungen. (A) Plattendesign. Spalte 1 wird als "leer" bezeichnet, ohne Zellen, und mit DPBS oder vollständigem Medium gefüllt. Die Säulen 2 und 12 werden mit Zellen ausgesät und mit vollständigem Medium ("unbehandelte Kontrolle") oder vollständigen Medien mit Lösungsmittel ("Lösungsmittelkontroll") behandelt. Die Säulen 3 bis 11 werden mit Zellen besät und mit seriellen Verdünnungen der getesteten Verbindungen behandelt, bis zu 9 Verbindungen mit einer Replikation pro getesteter Konzentration pro Verbindung. (B) Repräsentative Fotos einer Vero NRU-Platte (oben) und einer Vero MTT-Platte (unten) nach der 48-Stunden-Behandlung und den abschließenden Testschritten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Die Synthese ergab die Zielverbindung 6 als hellgrünen Feststoff (0,53 g, 67 % Ausbeute). Die Verbindung weist einen Schmelzpunkt von 227–229 °C und eine UHPLC-Reinheit von 99 % (t_R = 14,11 min) auf (Abbildung 4). Die chemische Struktur wurde durch Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) bestätigt. Das 1H-NMR-Spektrum (Abbildung 5) zeigte Signale, die der Piperidingruppe zwischen 1,50 und 3,13 ppm entsprachen. Die Methylgruppe an der 2-Position erschien als typisches Singlet mit 2,38 ppm. Der Wasserstoff an der 3-Position erschien als Singlet mit 6,56 ppm. Der Phenylring zeigte zwei Doublets mit 6,97 und 7,17 ppm bei einer Kopplungskonstante von 8,9 Hz. Die Wasserstoffe an den Positionen 7 und 8 erzeugten ein Multiplet mit 7,63–7,75 ppm, während der Wasserstoff an der Position 5 des Chinolinkerns ein Doppel mit 8,59 ppm (J = 2,0 Hz) erzeugte. Der Amin-Wasserstoff wurde als Singlet mit 8,66 ppm beobachtet. Das 13-C-NMR-Spektrum (Abbildung 6) zeigte ein Signal von 23,81 ppm, das der Methylgruppe an der 2-Position zugeordnet wurde, während Signale zwischen 24,85 und 49,70 ppm der Piperidin-Gruppe entsprachen. Der Kohlenstoff an der 3-Position lag bei 100,52 ppm. Verbleibende Signale im Downfield wurden dem Chinolinkern und den Phenylringkohlenstoffen zugeschrieben. HRMS bestätigte die Molekularformel der Verbindung 6 und zeigte ein [M+H]^+-Ion bei m/z 396,1063 (Calcd für C₂₁H₂₃BrN₃: 396,1070).

Abbildung 4. HPLC-Chromatogramm und UV-Spektren der Verbindung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) Spektren der Verbindung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6. ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) Spektren der Verbindung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die hemmende Aktivität der Verbindung gegen M. tuberculosis wurde durch die Bestimmung des MIC bewertet, definiert als die niedrigste Konzentration einer Verbindung, die sichtbares Bakterienwachstum vollständig verhindert. Im REMA-Test deutet das Fehlen einer Farbveränderung (verbleibendes Blau) auf Wachstumshemmung hin, während ein Wechsel zu Rosa auf bakterielles Wachstum hinweist. Isoniazid (INH) und Rifampicin (RIF) dienten als Drogenkontrolle. Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 dargestellt. Jede Platte enthielt eine Wachstumskontrolle (Säule 11, ohne Medikamente) und eine Sterilitätskontrolle (Spalte 12, ohne Mykobakterien). Die Verbindungen wurden serienweise von Säule 10 (höchste Konzentration) bis Säule 1 (niedrigste Konzentration) verdünnt. Wie in Abbildung 7 dargestellt, wird der MIC-Wert für die Verbindung in Reihe A (Isoniazid) in Spalte 4 beobachtet, während die MIC-Werte für die Verbindungen in den Reihen B (Rifampicin) und C (synthetisierte Verbindung) in Spalte 5 zu sehen sind. In unseren Händen betragen die MIC-Werte für INH 0,31 μg/mL für die H37Rv-Dehnung und 0,16 μg/mL für H37Ra, während wir für RIF 0,08 μg/mL für H37Rv und 0,01 μg/mL für die H37Ra-Dehnung erhalten.

Abbildung 7. Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) bei Mycobacterium tuberculosis mittels des Resazurin-Mikroplattentests (REMA). Zeilen A–C, Spalten 1–10: Zweifache serielle Verdünnungen von Isoniazid (Reihe A), Rifampicin (Reihe B) und der synthetisierten Verbindung (Reihe C). Spalte 11: Viabilitätskontrolle (Medium mit 2,5 % DMSO + Bakterien). Spalte 12: Sterilitätskontrolle (Medium + Verbindung). Eine blaue Farbe zeigt eine Hemmung des Bakterienwachstums an, während eine rosa Farbe die bakterielle Lebensfähigkeit durch die Reduktion von Resazurin zu Resorufin anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Eine repräsentative 96-Well-Platte für sowohl die NRU (Vero, oben) als auch MTT (Vero, unten) Assays ist in Abbildung 3B dargestellt. In der MTT-Platte ist ein klarer Farbgradient sichtbar, der von durchscheinend (keine lebensfähigen Zellen) bei hohen Verbindungskonzentrationen zu einem tiefvioletten (hohen Zellviabilität) bei niedrigen Konzentrationen wechselt. Ähnlich zeigt die NRU-Platte einen Übergang von durchscheinend zu tiefem Rosa, was auf die Aufnahme des neutralen roten Farbstoffs in die Lysosomen lebensfähiger Zellen hinweist.

Die Mikroskopie liefert eine visuelle Bestätigung des Assay-Status nach der 48-stündigen Inkubationszeit (Abbildung 8). Abbildung 8A vergleicht gesunde, unbehandelte Kontrollzellen (Vero und HepG2) mit Zellen, die mit einer zytotoxischen Konzentration der Verbindung behandelt wurden. Die behandelten Zellen erscheinen abgerundet, abgelöst und nicht lebensfähig. Abbildung 8B bietet einen kritischen visuellen Kontrollpunkt vor dem letzten Lösungsschritt. Sie zeigt die erwartete Bildung dunkelvioletter Formazankristalle in lebensfähigen Zellen (MTT-Test) und die Ansammlung von rotem Farbstoff in den Lysosomen (NRU-Assay) in beiden Zelltypen.

Die Rohabsorptionsdaten wurden auf die Fahrzeugsteuerung normalisiert und mittels nichtlinearer Regression analysiert, um Dosis-Antwort-Kurven zu erzeugen, wie in Protokollschritt 3.5 beschrieben. Für die Zielverbindung 6 (abgeleitet von LABIO-17) ergab diese Analyse im NRU-Test einen CC₅₀ von 12,2 μM (Vero) und 18,3 μM (HepG2) sowie einen CC_{von 50} >20 μM für beide Zelllinien im MTT-Test. Dies führte zu einem Selektivitätsindex (SI) von 30,5 bis >50, wie zuvor berichtet,¹⁰.

Abbildung 8. Repräsentative mikroskopische Bilder von Zytotoxizitätstests in Vero- und HepG2-Zellen. Alle Bilder wurden mit 100-facher Vergrößerung aufgenommen. (A) Vergleich der Zellmorphologie nach 48 Stunden Behandlung. Unbehandelte Kontrollbrunnen für Vero (oben) und HepG2 (unten) Zellen zeigen eine gesunde, konfluente Monoschicht. Im Gegensatz dazu wirken Zellen, die mit einer zytotoxischen Konzentration einer Verbindung behandelt wurden, abgerundet, geschrumpft und von der Plattenoberfläche gelöst. (B) Kritische visuelle Kontrollpunkte nach der Zugabe von Reagenzen und vor der Lösung. Im MTT-Test (linke Paneele für jede Zelllinie) enthalten lebensfähige Zellen sichtbare dunkelviolette Formazan-Kristalle. Im NRU-Test (rechte Panels für jede Zelllinie) zeigen lebensfähige Zellen eine Ansammlung von rotem Farbstoff in intakten Lysosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Ein phänotypischer Screening-Ansatz, der auf Ganzzellaktivität statt isolierter Enzyme setzt, ist eine effektive Strategie zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen M. tuberculosis. Hier beschrieben wir die ersten Schritte dieses Ansatzes, darunter die chemische Synthese einer Kandidatverbindung, die Bewertung ihrer inhibitorischen Aktivität mittels Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) und die Bewertung ihrer Zytotoxizität in Säugetierzellen (Vero und HepG2) mittels MTT- und NRU-Analysen.

Der synthetische Weg bestand aus drei Hauptschritten (Abbildung 1), die die Zielverbindung in hoher Reinheit mittels operationell einfacher Transformationen liefern. Mehrere kritische Schritte wurden als bestimmende Faktoren für Reproduzierbarkeit und Effizienz identifiziert. Die anfängliche Kondensation erfordert eine präzise stöchiometrische Kontrolle und anhaltenden Reflux, um eine vollständige Zwischenbildung zu gewährleisten. Eine unvollständige Lösungsmittelentfernung vor der thermischen Zyklierung kann sich negativ auf die Effizienz des Ringschlosses auswirken. Der Zyklisierungsschritt selbst erfordert eine strenge Temperaturkontrolle, da unzureichende Erhitzung zu einer unvollständigen Aromatisierung führt, während übermäßige oder langanhaltende Erhitzung die Bildung von Nebenprodukten fördern kann. Während der Chlorierung wird eine sorgfältige Kontrolle der Reaktionstemperatur und die schrittweise Zugabe von Phosphorylchlorid empfohlen, um Nebenreaktionen zu minimieren und eine selektive Aktivierung in der 4-Position sicherzustellen. Während der Methodenoptimierung verbesserten kleinere prozedurale Anpassungen die Robustheit. Bei unvollständiger Niederschlagung nach der Zyklierung verbesserte eine allmähliche Abkühlung statt schnelles Abschrecken die Rückgewinnung der Feststoffe. Wenn im nukleophilen Substitutionsschritt reduzierte Erträge beobachtet wurden, erwies sich eine Verlängerung der Reaktionszeit oder die Überprüfung der Aminreinheit als vorteilhaft.

Die Hauptbeschränkungen der Methode sind der Bedarf an Hochtemperatur-Zyklisierung und korrosiven chlorierenden Reagenzien wie Phosphorylchlorid, was eine spezielle Laborinfrastruktur und Sicherheit erfordert. Substituente elektronische Effekte können eine Reoptimierung für verschiedene Aniline oder Amine erfordern, was die breite Diversifizierung ohne Anpassung einschränkt. Der Conrad–Limpach-Ansatz ist jedoch operationell einfacher als Skraup-Synthesen (starke Oxidatoren) oder übergangsmetallkatalysierte Protokolle (spezialisierte Katalysatoren/inerte Atmosphären). Diese metallfreie Methode liefert effizient funktionalisierte Chinolin-Zwischenprodukte für die medizinische Chemie.

Das Protokoll zur Bestimmung des MIC ist ein kolorimetrischer Test, der auf einer Sichtprüfung basiert. Eine mögliche Herausforderung bei dieser Methode ist eine unvollständige Farbveränderung, die zu einem violetten Brunnen statt zu einem ausgeprägten Blau (Hemmung) oder Rosa (Wachstum) führt. Wenn dies eintritt, sollte es als ein Versagen bei der Hemmung des mykobakteriellen Wachstums interpretiert werden. Zusätzlich wird die maximale testbare Konzentration durch die Löslichkeit bestimmt, wenn die Verbindung durch serielle Verdünnung bewertet wird. Daher kann das Ergebnis in manchen Fällen nicht eindeutig sein, wenn bei der maximal löslichen Konzentration keine Hemmung beobachtet wird. Darüber hinaus ist es wichtig anzuerkennen, dass andere Labore bestimmte Schritte des Protokolls an ihre spezifischen Bedingungen anpassen können, was zu Variationen der erzielten Ergebnisse führen kann. Um den Durchsatz zu erhöhen, kann dieses Protokoll für Automatisierung angepasst werden. Die Implementierung von Flüssigkeitshandhabungssystemen für die Plattenvorbereitung mit 96 Wellen würde Pipettierungsfehler reduzieren und dadurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit verbessern.

Das Zytotoxizitätsbewertungsprotokoll verwendet zwei verschiedene Säugetierzelllinien (Vero und HepG2) sowie zwei komplementäre Viabilitätstests (MTT und NRU). Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend, um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Daten sicherzustellen, und jedes Labor sollte seine eigene Validierung durchführen. Zum Beispiel muss die anfängliche Zellaussaatdichte sorgfältig optimiert werden, da Überkonfluenz zu Kontakthemmung und veränderten Stoffwechselzuständen führen kann, was die Ergebnisse stört, während Unterbesetzung Zellen anfälliger für kleinere Beleidigungen machen kann, was möglicherweise die Toxizität¹⁵ überschätzt. Darüber hinaus ist die höchst getestete Konzentration oft durch die Löslichkeit der Verbindung begrenzt, und Niederschlagung kann zu ungenauen Ergebnissen führen. Außerdem ist das vorgeschlagene Plattenlayout (Abbildung 3A) für das primäre Screening konzipiert, wobei die Anzahl der getesteten Verbindungen maximiert wird, indem technische Replikationen verzichtet und Randeffekte zugunsten der Validierung durch unabhängige biologische Replikate ignoriert werden.

Eine zentrale Stärke dieses Protokolls ist die parallele Implementierung sowohl von MTT- als auch von NRU-Assays. Obwohl beide gut etabliert sind, messen sie unterschiedliche zelluläre Parameter. Der MTT-Test quantifiziert die metabolische Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen, was im Allgemeinen mit der Zelllebensfähigkeit^{korreliert 16}. Dieser Test ist jedoch anfällig für Interferenzen durch Verbindungen mit reduzierenden oder oxidierenden Eigenschaften oder solche, die die mitochondriale Atmung stören, was zu möglichen falschen Ergebnissen führen^{kann 15}. Das parallele Durchführen des NRU-Assays hilft, solche Artefakte zu beheben. Der NRU-Test misst die Fähigkeit lebensfähiger Zellen, die lysosomale Integrität und die für die Farbaufnahme erforderlichen pH-Gradienten^{aufrechtzuerhalten}. Abweichungen zwischen MTT- und NRU-Ergebnissen können spezifische Toxizitätsmechanismen wie mitochondriale Dysfunktion aufzeigen, was weitere Untersuchungen rechtfertigt.

Zusammenfassend skizziert dieses Protokoll die grundlegenden Schritte zur Identifizierung potenzieller antituberkulärer Medikamentenkandidaten. Verbindungen mit vielversprechender Selektivität und Potenz können anschließend zu komplexeren Infektionsmodellen wie in vivo-Studien weiterentwickelt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ZELLLINIEN
HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom)	ATCC	HB-8065	Zelllinie des menschlichen Leberkarzinoms
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (afrikanisches Grünaffen-Nierengewebe)	ATCC	CCL-81	Epithelien der Nieren von Primaten
CHEMIKALIEN – SYNTHESE
4-(Piperidin-1-yl)anilin	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Amin-Vorläufer für Verbindung 5/6
4-Bromanilin	Sigma-Aldrich	108-67-8	Ausgangsmaterial für die Chinolinsynthese
Essigsäure (Eisessig)	Sigma-Aldrich	695092	Reagenz bei der Synthese und bei der Herstellung der mobilen Phase
Acetonitril (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	34967	Komponente der mobilen Phase bei der HPLC und Lösungsmittel bei der NMR
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Lösungsmittel für die Produktextraktion
DMSO-d6 (deuteriert)	Sigma-Aldrich	175641	NMR-Lösungsmittel
Dowtherm A (Wärmeübertragungsflüssigkeit)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Hochsiedendes Lösungsmittel für thermische Zyklisierung (230–250 °C); früher als Dowtherm® A gelistet
Ethanol (absolut)	Sigma-Aldrich	459836	Reaktionslösung für den Conrad–Limpach-Schritt
Ethylacetat (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	270989	Komponente des Säulen-Eluats
Ethylacetoacetat	Sigma-Aldrich	E12806	β-Ketoester-Reagenz für die Bildung des Chinolinrings
Ameisensäure (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	F0507	0,1 % Zusatz in der mobilen Phase für HPLC und HRMS
Glasperlen (1 mm, steril)	Sigma-Aldrich	G8772	Zur Homogenisierung der M. tuberculosis-Kultur
HCl (Salzsäure, 37 %)	Sigma-Aldrich	320331	Säurekatalysator bei der nukleophilen Substitution
Hexan (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	34859	Nicht-polares Eluat für die Säulenchromatographie
Isopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Reaktionslösung für die Synthese von Verbindung 6
Magnesiumsulfat (MgSO4, wasserfrei)	Sigma-Aldrich	M7506	Trocknungsmittel und Reaktionskatalysator
Methanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	34860	HPLC-mobile Phase und NMR-Lösungsmittelkomponente
Phosphoroxychlorid (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Chlorierungsreagenz für Zwischenprodukt 4
Pyridin	Sigma-Aldrich	270970	Basiskatalysator bei der nukleophilen Substitution
Kieselgel (35–70 Maschenweite) für die Flash-Chromatographie	Macherey-Nagel	815349	Stationäre Phase für Flash-Chromatographie-Schritte
Kieselgel 60 Å (70–230 Maschenweite) für die Säulenchromatographie	Macherey-Nagel	815381	Stationäre Phase für die Säulenchromatographie
Natriumsulfat (Na2SO4, wasserfrei)	Sigma-Aldrich	239313	Trocknungsmittel für die organische Phase
TLC-Platten mit Kieselgel 60 F254	Merck	1.05554	Dünnschichtchromatographie-Überwachung
Toluol	Sigma-Aldrich	244511	Lösungsmittel für den Chlorierungsschritt
Ultrapure Wasser	Millipore / Äquivalent	N/A	Bei der Herstellung der mobilen Phase verwendet; früher als Milli-Q-Wasser im Text angegeben
AUSRÜSTUNG & INSTRUMENTE
0,22 µm Spritzenfilter	Millipore / jeder	SLGP033RS	Sterilisation der Resazurin-Lösung (2.1.4); Filtration der MTT-Arbeitslösung (3.3); Filtration der Neutral Red-Arbeitslösung (3.4)
0,45 µm Spritzenfilter	Millipore / jeder	SLHA033SS	Filtration der mobilen Phasenlösungen
15 ml Konustestrohr (steril)	Falcon / jeder	352097 oder Äquivalent	Sammlung und Zentrifugation der Zellsuspension nach der Trypsinisierung
96-Well-Platte (flach, Gewebekultur-behandelt)	Corning / jeder	3596	Zur Zytotoxizitäts- und MIC-Analyse
Aluminiumfolie	Jeder	—	Lichtschutz der Platten während der MTT- und NRU-Inkubation und Rüttelschritte
Autoklav	Jeder	—	Sterilisation des Mediums (121 °C, 98,07 kPa, 10 min)
Biosicherheitsschrank (Klasse II, zertifiziert)	Jeder (BSL-3-zertifiziert)	—	Erforderlich für M. tuberculosis-Manipulationen (BSL-3)
Zellzählkammer (automatisch) oder Hämozytometer	z. B. Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Zur Zellkonzentrations- und Lebensfähigkeitsbestimmung
Zentrifuge (mit einer maximalen Beschleunigung von 200 × g)	Jeder	—	Zellpelletierung
CO2-Inkubator (37 °C, 5 % CO2, befeuchtet)	Jeder	—	Inkubation der Zellkultur und -behandlung
Heizmantel	Fisotom	12M	Temperaturgesteuerter Heizmantel mit Dowtherm® A
HPLC-System (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Dualpumpe, automatischer Injektor, UV-Detektor; zur Reinheitsanalyse von Verbindung 6
Invertmikroskop (oder Äquivalent)	Jeder	—	Visuelle Inspektion der Zellen beim Anhaften (3.2), während des Behandlungs-Checkpoints (3.3, 3.4) und zur Verifizierung des Assay-Status
Magnetrührer / Heizplatte	Jeder	—	Lösungsvorbereitung und Reaktionsmischung
Massenspektrometer (LTQ Orbitrap Discovery)