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Halbautomatische Integration der Analyse von motorischer Gesundheitsspanne und Lebensdauer mittels der FlyTrDT-Pipeline in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/70697

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30. Oktober 2026

 ,  ,  ,  , 
1Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster dient als leistungsfähiges Modellorganismus für die Alternsforschung. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Erzeugung einer reproduzierbaren, populationsbasierten Messung sowohl der Lebensdauer als auch der funktionellen Gesundheitsspanne.

Zusammenfassung

Die Alterung zeichnet sich durch einen fortschreitenden Funktionsverlust und eine verkürzte Lebensdauer aus; diese beiden Parameter werden in experimentellen Studien häufig unabhängig voneinander bewertet. Bei Drosophila melanogaster werden Lebensdaueranalysen und Beweglichkeitstests basierend auf negativer Geotaxis häufig verwendet, um Alterung und Neurodegeneration zu untersuchen. Es fehlt jedoch an standardisierten Rahmenbedingungen, die die frühe motorische Leistungsfähigkeit quantitativ mit der Langzeitüberlebensrate verbinden. Hier beschreiben wir einen reproduzierbaren, halbautomatisierten Arbeitsablauf, der die Lebensdaueranalyse mit einer objektiven Quantifizierung der motorischen Gesundheitsspanne bei alternden Fliegen kombiniert.

Das Protokoll integriert kontrollierte Bedingungen für die Zucht von Fliegen, die Erfassung von Sterbefällen und video-basierte Assays zur negativen Geotaxis unter Verwendung standardisierter MP4-Aufnahmen (mindestens 1280 × 720 Auflösung, 30 Bilder/s). Die motorische Leistung wird mithilfe einer benutzerdefinierten, auf Python basierenden Pipeline quantifiziert, die in Python 3.12.1 mit OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 und Matplotlib 3.5.2 implementiert ist. Der Workflow führt eine Einzelbild-analyse der Schwerpunkterkennung durch und extrahiert die aktive Klettersteigung (Pixel/s) als kontinuierliches Maß der motorischen Funktion. Überlebenskurven werden analysiert, indem der Überlebensanteil berechnet und eine numerische Integration nach der Trapezregel durchgeführt wird, um die Fläche unter der Überlebenskurve (AUC) zu ermitteln. Die Normalisierung der frühen motorischen Leistung ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen funktionellem Leistungsabfall und Gesamtlebensdauer.

Der Workflow wurde bewertet, indem halbautomatische Messungen der Kletterneigung mit konventionellen manuellen Endpunktbewertungen bei Kontrollfliegen und Fliegen mit Amyloid-β-Expression verglichen wurden, wobei beide Methoden einen altersabhängigen motorischen Leistungsabfall erfassten. Repräsentative Datensätze zeigten reproduzierbare Lebensverlaufskurven bei Canton-S-Kontrollen sowie messbare frühe motorische Beeinträchtigungen im neurodegenerativen Modell. Diese Methode verringert Beobachter-Bias, verbessert die Reproduzierbarkeit und ist weiterhin kompatibel mit kostengünstigen Videoaufnahmesystemen. Der Workflow lässt sich leicht auf genetische Modelle, pharmakologische Interventionen und neurodegenerative Paradigmen anpassen und bietet eine skalierbare Plattform für die integrierte Phänotypisierung des Alterns in Drosophila.

Einleitung

Das Altern zeichnet sich nicht nur durch eine verkürzte Lebensspanne aus, sondern auch durch einen progressiven Rückgang der physiologischen und Verhaltensfunktion1. Bei neurodegenerativen Erkrankungen treten häufig frühzeitige Störungen der motorischen Koordination bereits vor signifikanter Mortalität auf und spiegeln eine zugrundeliegende neuronale Dysfunktion wider2,3. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich als leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung von Alterung und Neurodegeneration etabliert, dank ihrer kurzen Lebensdauer, der genetischen Zugänglichkeit und der gut etablierten Verhaltensassays4. Die Analyse der Lebensdauer bei Drosophila liefert eine robuste Messgröße für das Überleben des Organismus, während Negativ-Geotaxis-Assays weithin verwendet werden, um die motorische Funktion und den altersabhängigen motorischen Verfall zu bewerten5,6. Diese beiden Endpunkte werden jedoch häufig unabhängig voneinander analysiert, was die Möglichkeit einschränkt, frühe funktionelle Beeinträchtigungen quantitativ mit langfristigen Überlebensverläufen in Beziehung zu setzen. Eine integrierte Analyse von motorischer Gesundheitsspanne und Lebensspanne kann Einblicke in die Mechanismen liefern, ob Interventionen die Alterungsrate, den Krankheitsverlauf oder spezifische physiologische Systeme beeinflussen. Dieser Ansatz eignet sich besonders für genetische, pharmakologische und neurodegenerative Modelle, bei denen motorische Defizite der Mortalität vorausgehen und somit eine empfindliche Detektion funktioneller Einbußen ermöglichen, bevor sich überlebensrelevante Unterschiede zeigen.

Herkömmliche Assays zur negativen Geotaxis basieren auf Endpunktmessungen, beispielsweise dem Anteil der Fliegen, die innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls eine bestimmte Höhe erreichen. Obwohl diese Methode einfach und kostengünstig ist, kann die manuelle Auswertung Beobachterbias verursachen und feine Unterschiede in der motorischen Kinetik übersehen. Kontinuierliche, aus der Bewegungsbahn abgeleitete Messungen könnten die Empfindlichkeit zur Detektion subtiler motorischer Beeinträchtigungen im Vergleich zu herkömmlichen, auf Endpunkten basierenden Auswertungsmethoden verbessern. Ebenso erfordern Lebensdauerversuche eine sorgfältige Erfassung der Sterblichkeit und eine standardisierte Umwelt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen7. Es besteht weiterhin Bedarf an zugänglichen und reproduzierbaren Ansätzen, die funktionelle Gesundheitsspann-Metriken mit Überlebensdaten innerhalb derselben Kohorte kombinieren.

Hier beschreiben wir einen halbautomatisierten Arbeitsablauf, der standardisierte Lebensdaueranalysen mit einer videobasierten Quantifizierung der motorischen Leistung bei alternden Drosophila kombiniert. Mithilfe quelloffener computergestützter Werkzeuge erfolgt eine Einzelbild-Analyse zur Detektion des Schwerpunkts, um die Klettersteigung (Pixel/s) als kontinuierliches Maß der motorischen Funktion zu extrahieren. Die Überlebensdaten werden verarbeitet, indem der Überlebensanteil berechnet und eine numerische Integration nach der Trapezregel durchgeführt wird, um die Fläche unter der Überlebenskurve (AUC) zu ermitteln. Durch die Normalisierung der frühen motorischen Leistung und deren Integration mit der Überlebens-AUC ermöglicht dieses Protokoll einen direkten Vergleich zwischen funktionellem Verfall und Gesamtlebensdauer. Dieser Ansatz bietet einen objektiven, kostengünstigen Rahmen, um die motorische Gesundheitsspanne mit Langlebigkeitsparametern zu verknüpfen, und erlaubt eine umfassende Phänotypanalyse der Alterungsdynamik bei Drosophila.Abbildung 1).

Protokoll

Alle Experimente wurden unter Verwendung von Drosophila melanogaster durchgeführt und gemäß den Richtlinien des Institutslabors  durchgeführt. Eine ethische Genehmigung war nicht erforderlich, da die Studie Wirbellose umfasste. Alle Verfahren sind gemäß den institutionellen Leitlinien zur Tierpflege für die Forschung an Wirbellosen einzuhalten.

HINWEIS: Bewahren Sie die Versuchsnahrung bei 4 °C auf und verwenden Sie sie innerhalb von 1 Woche, vorausgesetzt, sie bleibt trocken. Halten Sie die Standardumweltbedingungen ein, indem Sie die Fliegen bei 25 °C unter einem 12:12 h Licht-Dunkel-Wechsel und einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 60 % inkubieren.

1. Herstellung von Standard-Futters für Fruchtfliegen

  1. Einfache Lebensmittelzubereitung
    1. 6 g Maisstärke, 5 g Hefe, 4 g D-Glukose, 3 g Saccharose, 1 g Hefeextrakt, 1 g Agar und 0,25 g Malzextrakt in einem Behälter mit 100 mL destilliertem Wasser vermengen.
    2. Den Inhalt mithilfe eines Spatels gründlich umrühren, bis sich eine gleichmäßige Suspension bildet.
    3. Die Mischung bei Volumina ≥500 mL für 12–15 min oder bei Volumina zwischen 100–400 mL für 5–10 min auf einem Induktionskochfeld auf etwa 85–100 °C erhitzen. Während des Erhitzens kontinuierlich umrühren.
    4. Die erhitzte Mischung gemäß den standardmäßigen Laborsterilisationsverfahren autoklavieren.
    5. Das autoklavierte Medium abkühlen lassen. Die Temperatur mit einem Thermometer überwachen, bis sie 50–55 °C erreicht.
    6. 600 µL Propionsäure und 100 mg Benzoesäure in 1 mL 100 %igem Ethanol zum abgekühlten Medium hinzufügen und gründlich mischen.
    7. ACHTUNG: Propionsäure und Ethanol müssen in einem gut belüfteten Bereich unter Verwendung von Handschuhen und Schutzbrille gehandhabt werden, da beide Chemikalien flüchtig sind und bei Inhalation oder Hautkontakt Reizungen verursachen können.
    8. Je 5 mL Nahrung in sterile Gefäße abfüllen, die 10 cm lang und 20 mm im Durchmesser sind.
    9. Die Gefäße mindestens 5–6 h bei Raumtemperatur offen stehen lassen. Mit Filterpapier abdecken, um eindringende Fliegen fernzuhalten. Dieser Schritt dient dazu, Variabilitäten bei der Lebensdauermessung aufgrund von Unterschieden in der Mediumzubereitung und Lagerbedingungen zu minimieren.
  2. Zubereitung von Medikamenten-Nahrung
    1. Eine kleine Menge Erwachsenennahrung gemäß den Schritten 1.1.1–1.1.5 herstellen.
    2. Die Nahrung auf 50–55 °C abkühlen lassen.
    3. Eine Stammlösung der Testsubstanz in der gewünschten Konzentration unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, wie destilliertem Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO), herstellen. Die Testsubstanz im ausgewählten Lösungsmittel auflösen, um eine konzentrierte Stammlösung zu erzeugen, und diese zur abgekühlten Nahrung (50–55 °C) hinzufügen, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen, wobei die Konzentration des Lösungsmittels in Behandlungs- und Kontrollgruppen identisch gehalten werden muss.
    4. Gründlich mischen, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen.
    5. Je 2 mL der Arzneimittel-haltigen Nahrung in jedes Versuchsgefäß geben, indem sie auf die Oberfläche der vorab erhärteten Grundnahrung aufgetragen wird.
    6. Kontrollgefäße herstellen, indem ein äquivalentes Volumen des Lösungsmittels allein (z. B. destilliertes Wasser oder DMSO in der gleichen Endkonzentration wie in den Behandlungsgruppen) zur auf die Grundnahrung aufgetragenen Nahrung hinzugefügt wird.
    7. Die aufgeschichtete Nahrung bei Raumtemperatur vollständig erstarren lassen, bevor die Fliegen eingesetzt werden.
      HINWEIS: Handhabung und Lagerung der Nahrung: Falls die Nahrung am Abend zubereitet wird, die Gefäße über Nacht bei Raumtemperatur mit Filterpapier abgedeckt stehen lassen und am folgenden Morgen Baumwollstopfen einsetzen. Gefäße vor der Verwendung stets waschen, dekontaminieren und autoklavieren. Baumwollbäusche vor dem Stopfen separat autoklavieren. Baumwollstopfen erst einsetzen, nachdem die Nahrung mindestens 5–6 h vollständig erstarrt ist.

2. Erzeugung von amyloid-β-exprimierenden D. melanogaster

  1. Sammlung und Validierung von Jungfahrerinnen
    1. Pflegen Sie die Stammlinie der Versuchstiere bei 25 °C unter einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus vor der Sammlung von Jungvirginen.
    2. Sammeln Sie frisch geschlüpfte weibliche Fliegen der Driver-Linie zweimal täglich, einmal morgens und einmal am späten Nachmittag, unter Verwendung einer kurzen Kohlendioxid-Betäubung.
    3. Die gesammelten Weibchen unverzüglich nach der Sammlung in frische, geschlechtsreine Gefäße überführen, um eine Paarung zu verhindern.
    4. Inkubieren Sie die Gefäße bei 25 °C für weitere 48 h zur Bestätigung bei Jungtierversuchen.
    5. Überprüfen Sie die Fläschchen täglich auf das Vorhandensein von Larven.
    6. Bestätigen Sie den Jungfräulichkeitsstatus, indem Sie das Fehlen von Eiern oder larvalen Nachkommen überprüfen.
    7. Behalten Sie nur Weibchen, die keine Anzeichen der Larvenproduktion zeigen, für genetische Kreuzungen.
  2. Anlage des genetischen Kreuzungsversuchs
    1. Sammeln Sie frisch geschlüpfte erwachsene UAS-APPE693G-Männchen unter Verwendung einer kurzen Kohlendioxid-Betäubung am Tag der Kreuzungsanlage.
    2. Kreuzungen durchführen, indem 20 jungfräuliche elav-GAL4-Weibchen mit 10 UAS-APPE693G-Männchen in ein Gefäß mit frischem Nährmedium gegeben werden.
    3. Inkubieren Sie die Reaktionsgefäße bei 25 °C unter kontrollierter Luftfeuchtigkeit und einem 12 h:12 h Licht-Dunkel-Wechsel.
    4. Lassen Sie die Fliegen 48 Stunden lang paaren und Eier ablegen.
    5. Überführen Sie die erwachsenen Tiere in frische Gefäße, falls zusätzliche Nachkommen benötigt werden.
    6. Entfernen Sie die Elterntiere nach der Eiablage, um Überbesiedlung und überlappende Generationen zu vermeiden.
    7. Lassen Sie die Nachkommen unter Standardbedingungen bis zur Eclose entwickeln.
    8. Verwenden Sie erwachsene F1-Fliegen, die Amyloid exprimierenβ in Neuronen für anschließende Lebensdauer- und Gesundheitsspanne-Experimente.
      HINWEIS: Der elav-GAL4-Treiber ermöglicht die pan-neuronale Expression des menschlichen Amyloid-Vorläuferproteins mit der E693G-Arktis-Mutation. Die Expression erfolgt während der gesamten Entwicklung und im Erwachsenenalter unter standardmäßigen Haltungsbedingungen. Für Alterungsexperimente sollten genetisch einheitliche Hintergründe und geeignete Kontrollen verwendet sowie konstante Temperaturbedingungen innerhalb jeder
      Experiment. Niedrigere Inkubationstemperaturen, wie 18 °C, kann während der Entwicklung verwendet werden, um
      verzögern die mit dem Transgen assoziierte Pathologie vor der Erwachsenenphase

3. Fliegensammlung

  1.  Flugensammlung für den Negativ-Geotaxis-Test
    1. Alle Fliegenstämme vor dem experimentellen Aufbau auf Standard-Fliegenmedium bei 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 60 % und einem 12-h:12-h-Licht-Dunkel-Zyklus aufziehen.
    2. Junge erwachsene männliche Fliegen innerhalb eines Zeitfensters von 2–3 Tagen unter kurzer Anwendung von Kohlendioxid-Anästhesie sammeln.
    3. Die männlichen Fliegen je nach experimentellen Bedingungen in Gefäße mit medikamentenhaltigem Futter oder Kontrollfutter überführen.
    4. Das Futter alle 3 Tage oder früher bei Verschlechterung der Futterqualität erneuern.
    5. Die Fliegen unter diesen Bedingungen bis zum vorgesehenen Alter für die Beurteilung der negativen Geotaxis aufbewahren.
      HINWEIS: Für den Negativ-Geotaxis-Test werden ausschließlich männliche Fliegen verwendet, um Variabilitäten aufgrund geschlechtsspezifischer Unterschiede in der motorischen Leistung und im Alterungsprozess zu vermeiden.
  2. Flugensammlung für den Lebensdauer-Test
    1. Kleine Gruppen von Fliegen kurzzeitig auf einer Betäubungsmatte anästhesieren.
    2. Männliche Fliegen mit einem weichen Pinsel identifizieren.
    3. Die Exposition gegenüber Kohlendioxid während der Sortierung minimieren, um langanhaltende physiologische Effekte zu vermeiden, die die Lebensdauermessungen verfälschen könnten.
    4. Abhängig vom experimentellen Design jeweils 10 männliche und 10 weibliche Fliegen im Verhältnis 1:1 in jedes frische Futtergefäß geben.
    5. Die Sortierung und Aufteilung innerhalb von 3–4 Minuten pro Probe abschließen.
    6. Sicherstellen, dass die gesamte Anästhesiezeit 9–10 Minuten nicht überschreitet.
    7. ACHTUNG: Die Anwendung von Kohlendioxid-Anästhesie muss unter Verwendung geeigneter Regler und ausreichender Laborbelüftung erfolgen, um die Exposition des Bedieners zu minimieren und eine übermäßige, durch Anästhesie verursachte physiologische Belastung der Fliegen zu verhindern.
    8. Die Schritte 3.2.1–3.2.6 wiederholen, bis für jede experimentelle Bedingung 4–6 Replikatgefäße angelegt sind.

4. Längenlebigkeitsversuch

  1. Fliegen-Umsetzung und -Pflege
    1. Pflegen Sie die Fliegen unter Standardbedingungen.
    2. Setzen Sie die Fliegen in regelmäßigen Abständen in frische Nährmittelgefäße um, um Überbevölkerung, Larvenkontamination und Nährmittelschäden zu vermeiden.
    3. Setzen Sie die Fliegen alle 3 Tage in frisches Nährmittel um.
    4. Nutzen Sie diese Umpflanzfrequenz, um Störungen der Fütterungsbedingungen durch verhinderte Larvenentwicklung im Gefäß zu minimieren.
    5. Führen Sie alle Umsetzungen ohne Anästhesie durch.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Anästhesie während Lebensdauerexperimenten, da diese akute Sterblichkeit hervorrufen kann, insbesondere bei alten Fliegen.
  2. Beurteilung der Mortalität während der Umsetzung
    1. Notieren Sie das Alter der Kohorte in Tagen bei jeder Umsetzung.
    2. Untersuchen Sie das alte Gefäß sorgfältig.
    3. Zählen und erfassen Sie die Anzahl der toten Fliegen, die im alten Gefäß verbleiben.
    4. Zählen und erfassen Sie die Anzahl der toten Fliegen, die in das neue Gefäß übertragen wurden.
    5. Erfassen Sie diese Werte getrennt, um Doppelzählungen zu vermeiden.
    6. Berechnen Sie die Gesamtanzahl der Todesfälle pro Umsetzung mit folgender Gleichung:
      Gesamttodesfälle = tote Fliegen im alten Gefäß + tote Fliegen, die ins neue Gefäß übertragen wurden.
    7. Bestimmen Sie die Anzahl der neuen Todesfälle seit der vorherigen Umsetzung, indem Sie die Anzahl der bei der vorherigen Umsetzung als „übertragen“ erfassten Fliegen von den Gesamttodesfällen der aktuellen Umsetzung subtrahieren.
    8. Verwenden Sie diese Berechnung, um sicherzustellen, dass Fliegen, die zwischen Gefäßen übertragen wurden, nicht mehrfach gezählt werden.
  3. Identifizierung lebender, aber inaktiver Fliegen
    1. Klopfen Sie vorsichtig an die Seite des Gefäßes, bevor Sie eine Fliege als tot werten, wenn alte Fliegen bewegungslos erscheinen oder auf dem Rücken liegen.
    2. Beobachten Sie, ob sich eine Bewegung zeigt.
    3. Werten Sie Fliegen, die nach Stimulation eine Bewegung zeigen, als lebend.
    4. Tragen Sie Fliegen, die nach Stimulation Bewegung zeigen, nicht als tot ein.
    5. Klopfen Sie das Gefäß vorsichtig an, um eventuell am Nährboden haftende lebende Fliegen im alten Gefäß zu lösen.
    6. Übertragen Sie die gelösten lebenden Fliegen in das neue Gefäß.
    7. Werten Sie gelöste lebende Fliegen nicht als tot.
      HINWEIS: Eine genaue Unterscheidung zwischen toten und inaktiven Fliegen ist in den späten Lebensphasen entscheidend. Vor der Feststellung des Todesstatus sollte stets eine sanfte mechanische Stimulation erfolgen.
  4. Kriterien für Zensur
    1. Werten Sie eine Fliege als rechtszensiert, wenn sie das Experiment vor dem natürlichen Tod verlässt, z. B. durch Entweichen aus dem Gefäß, Unfallverletzung oder Handhabungsprobleme.
    2. Tragen Sie zensierte Fliegen am Tag ihres Ausscheidens aus dem Experiment in einer separaten Spalte ein.
    3. Tragen Sie zensierte Fliegen nicht als tote Tiere ein.
    4. Schließen Sie zensierte Fliegen bei der Mortalitätsauswertung in der Überlebensanalyse aus.
    5. Wenden Sie Zensur sparsam an, da eine übermäßige Zensur experimentelle Verzerrungen hervorrufen kann.
      HINWEIS: Die Trennung von „toten“ und „übertragenen“ Fliegen während der Dateneingabe verhindert eine Inflation der Mortalitätszahlen und gewährleistet eine korrekte Rekonstruktion der Überlebenskurve.
  5. Fortsetzung des Assays
    1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1–4.4 während des gesamten Experiments.
    2. Setzen Sie den Assay fort, bis die letzte überlebende Fliege stirbt.

5. Experiment zur negativen Geotaxis

  1. Vorbereitung der Fliegen
    1. Sammeln Sie die Fliegen aus experimentellen Nährbodengefäßen ohne CO₂-Betäubung.
    2. Überführen Sie die Fliegen vorsichtig mithilfe eines kleinen Trichters in ein sauberes Kletterrohr, um Flucht zu verhindern.
    3. Lassen Sie die Fliegen 5 Minuten lang in der Versuchskammer akklimatisieren, bevor der Test beginnt.
    4. Führen Sie alle Klettertests zur gleichen Tageszeit durch, beispielsweise am Nachmittag, um zirkadiane Schwankungen zu minimieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie direktes Sonnenlicht während des Tests, da die Lichtintensität das Fortbewegungsverhalten beeinflussen kann.
  2. Einrichtung des Kletterrohrs
    1. Verwenden Sie ein transparentes, zylindrisches Kletterrohr mit einer Höhe von 12 cm und einem Durchmesser von 2 cm.
    2. Markieren Sie eine horizontale Linie in 10 cm Höhe vom Rohrboden aus.
    3. Stellen Sie das Rohr senkrecht vor einem einheitlichen weißen Hintergrund auf, um die Videoverfolgung zu erleichtern.
    4. Befestigen Sie ein Smartphone oder eine Digitalkamera auf einem stabilen Stativ.
    5. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Rohr im Bildausschnitt sichtbar ist.
  3. Durchführung des Tests
    1. Klopfen Sie das Rohr dreimal kräftig auf ein Schaumstoff- oder Mauspad, das auf einer festen Unterlage liegt, sodass alle Fliegen gleichzeitig nach unten fallen.
    2. Beginnen Sie unmittelbar mit der Videoaufnahme für 10–12 Sekunden bei etwa 30 Bildern pro Sekunde.
    3. Lassen Sie die Fliegen 10 Sekunden lang frei klettern.
    4. Nehmen Sie mindestens drei unabhängige Durchläufe pro Gefäß auf.
    5. Geben Sie zwischen den Durchläufen eine Ruhepause von 10 Minuten ein.
    6. Führen Sie den Test für jede experimentelle Bedingung durch, beispielsweise Kontrollgruppe, medikamentenbehandelte Gruppe und Lösungsmittelkontrolle.
    7. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die innerhalb von 10 Sekunden die 10-cm-Marke erreichen oder überschreiten.
    8. Notieren Sie E als Anzahl der Fliegen, die die 10-cm-Marke erreichen.
    9. Notieren Sie T als Gesamtanzahl der lebenden getesteten Fliegen.
    10. Berechnen Sie die prozentuale Kletteraktivität als (E/T) × 100.
    11. Mitteln Sie die Werte aus den drei Durchläufen.
    12. Geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SD an.
  4. Semi-automatisierte Analyse des Kletterverhaltens mithilfe eines Python-Skripts
    1. Videoaufnahme
      1. Nehmen Sie Negative-Geotaxis-Tests mit einer Smartphone-Kamera auf, die senkrecht zu einem transparenten Kletterrohr mit einer Höhe von 12 cm und einem Durchmesser von 2 cm positioniert ist. Nehmen Sie die Videos mit einem Smartphone oder einer Digitalkamera bei etwa 30 Bildern pro Sekunde und einer Mindestauflösung von 1280 × 720 Pixeln auf. Positionieren Sie die Kamera in einem festen Abstand von etwa 15–20 cm zum Kletterrohr und halten Sie die Aufnahmeposition bei allen Aufnahmen konstant. Verwenden Sie die bekannte Rohrlänge (12 cm) als interne räumliche Kalibrierungsreferenz für pixelbasierte Messungen.
      2. Stellen Sie das Rohr vor einen einheitlichen weißen Hintergrund.
      3. Nehmen Sie die Videos für 10–12 Sekunden auf.
      4. Halten Sie die Beleuchtungsbedingungen bei allen Aufnahmen konstant.
      5. Halten Sie den Kameraabstand bei allen Aufnahmen konstant.
      6. Halten Sie die Rohrposition bei allen Aufnahmen konstant.
      7. Minimieren Sie die Variabilität bei der Schwerpunkterkennung.
      8. Speichern Sie die aufgenommenen Videos im .mp4-Format.
      9. Übertragen Sie die aufgenommenen Videos auf einen Desktop-Computer zur Analyse.
    2. Videoverarbeitung basierend auf Python
      1. Analysieren Sie die Videos mithilfe eines benutzerdefinierten internen Python-Skripts, das als Zusatzdatei 1 bereitgestellt wird. Führen Sie alle Analysen mit Python 3.12.1 unter Verwendung von OpenCV (cv2) Version 4.9.0, NumPy Version 1.26.4, Pandas Version 2.2.0, Matplotlib Version 3.5.2 und Scikit-learn Version 1.4.2 durch.
        1. Geben Sie den Eingabevideopfad und das Ausgabeverzeichnis innerhalb von Zusatzdatei 1 an, bevor Sie das Skript aus einer Python-Umgebung oder einer Kommandozeilenschnittstelle ausführen.
        2. Führen Sie das Skript mit dem Befehl python climbing_analysis.py aus, nachdem die Variablen VIDEO_PATH und OUTPUT_CSV bearbeitet wurden.
      2. Verwenden Sie OpenCV oder cv2 für die Bildverarbeitung und Objekterkennung.
      3. Verwenden Sie NumPy für numerische Berechnungen.
      4. Verwenden Sie Pandas für den Datenausgang.
      5. Verwenden Sie Matplotlib für die Visualisierung.
      6. Verarbeiten Sie jedes Video bildweise.
      7. Lesen Sie das Video mithilfe der VideoCapture-Funktion von OpenCV ein.
      8. Verarbeiten Sie einzelne Bilder nacheinander.
      9. Konvertieren Sie die Bilder in Graustufen.
      10. Wenden Sie eine Gaußsche Weichzeichnung an, um Hintergrundrauschen zu reduzieren.
      11. Wenden Sie Otsus Schwellenwertmethode im binären Inversmodus an, um die Fliegen vom Hintergrund abzugrenzen.
      12. Führen Sie morphologische Öffnungs- und Schließungsoperationen durch, um kleine Artefakte zu entfernen und Lücken in Konturen zu schließen.
      13. Identifizieren Sie Konturen, die eine minimale Konturfläche von 60 Pixel2 überschreiten, um Hintergrundartefakte und kleine Rauschpartikel auszuschließen.
      14. Berechnen Sie die räumlichen Momente für jede gültige Kontur.
      15. Bestimmen Sie die Schwerpunktkoordinaten x und y für jede gültige Kontur.
      16. Mitteln Sie die Schwerpunktkoordinaten, wenn mehrere Fliegen in einem Bild erkannt werden.
      17. Ermitteln Sie eine einzige mittlere Kollektivposition pro Bild.
    3. Qualitätskontrolle
      1. Überprüfen Sie die erfolgreiche Segmentierung der Fliegen, indem Sie sicherstellen, dass die erkannten Konturen während der gesamten Aufnahme den sichtbaren Fliegen entsprechen.
      2. Stellen Sie einen ausreichenden Kontrast zwischen Fliegen und Hintergrund sicher, indem Sie einen einheitlichen weißen Hintergrund und stabile Beleuchtung verwenden.
      3. Schließen Sie Videos aus, die starke Reflexionen, Schatten, Rohrbewegungen, starke Überlappung der Fliegen oder unvollständige Sichtbarkeit des Rohrs enthalten.
      4. Erachten Sie Videos als ungeeignet für die Analyse, wenn die Schwerpunktnachverfolgung über erhebliche Teile der Aufnahme fehlschlägt oder wenn die Schwellenwertbildung zu anhaltenden Hintergrundartefakten führt.
    4. Extraktion der Kletterparameter
      1. Berechnen Sie die Kletterpunktzahl manuell, wie in Schritt 5.3.7 beschrieben.
      2. Berechnen Sie die Kletterhöhe in Pixeln als Differenz zwischen der anfänglichen und der endgültigen vertikalen Schwerpunktposition.
      3. Berechnen Sie die mittlere Geschwindigkeit in Pixeln pro Sekunde als Gesamtlänge der Trajektorie geteilt durch die Aufnahmedauer.
      4. Berechnen Sie die maximale Geschwindigkeit in Pixeln pro Sekunde als maximale momentane Verschiebung zwischen aufeinanderfolgenden Bildern.
      5. Berechnen Sie die Trajektorienlänge in Pixeln als kumulierte zurückgelegte Distanz über die Bilder hinweg.
      6. Berechnen Sie die Trajektorienfläche in Pixel2 als Fläche der konvexen Hülle, die alle Schwerpunktpositionen einschließt.
      7. Berechnen Sie die Anzahl der Richtungswechsel in horizontaler Richtung.
      8. Berechnen Sie die Anzahl der Stopps als Anzahl der Bilder, in denen die Schwerpunktverschiebung zwischen aufeinanderfolgenden Bildern unterhalb einer Stop-Entfernungsschwelle von 3 Pixeln bleibt.
      9. Tragen Sie die vertikale Position über der Zeit auf, um eine objektive Messung der aktiven Kletterleistung zu erhalten.
      10. Berechnen Sie die Klettersteigung in Pixeln pro Sekunde mithilfe eines gleitenden linearen Regressionsfensters von 1 Sekunde während der aktiven Kletterphase der Aufnahme.
      11. Verwenden Sie den Steigungswert als primären Motorikparameter zur Integration mit der Überlebensanalyse.
      12. Exportieren Sie die quantifizierten Lokomotionsparameter, einschließlich Kletterhöhe, mittlere Geschwindigkeit, maximale Geschwindigkeit, Trajektorienlänge, Trajektorienfläche, Anzahl der Richtungswechsel, Anzahl der Stopps und Klettersteigung, als .csv-Dateien. Speichern Sie die Visualisierungsplots der Steigung als .png-Bilddateien zur Qualitätskontrolle und für die nachfolgende Analyse.

6. Integration der frühen motorischen Gesundheit und Überlebensanalyse

  1. Exportieren Sie die Überlebensdaten als eine .csv-Datei mit Spalten für Gruppe, Tag und Anzahl lebender Fliegen.
  2. Berechnen Sie den Überlebensanteil für jede Gruppe zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Anzahl der lebenden Fliegen durch die initiale Kohortengröße dividieren.
  3. Berechnen Sie die Fläche unter der Überlebenskurve (AUC) mithilfe der numerischen Integration nach der Trapezregel aus dem Überlebensanteil in Abhängigkeit von der Zeit.
  4. Exportieren Sie die Daten zur motorischen Leistung als eine .csv-Datei mit der Klettersteigung am Tag 7 für jede Gruppe.
  5. Normalisieren Sie die motorische Leistung am Tag 7 gegenüber der Kontrollgruppe (Canton S), indem Sie den Steigungswert jeder Gruppe am Tag 7 durch die entsprechende Kontrollsteigung dividieren.
  6. Kombinieren Sie die normalisierten motorischen Werte des Tages 7 mit den entsprechenden Überlebens-AUC-Werten für jeden Genotyp.
  7. Führen Sie einen beschreibenden Vergleich der normalisierten motorischen Leistung am Tag 7 und der Überlebens-AUC durch, um die Beziehung zwischen frühem motorischem Rückgang und Überlebensergebnissen zu bewerten.
  8. Erstellen Sie eine grafische Darstellung der normalisierten motorischen Leistung am Tag 7 und der Überlebens-AUC-Werte (Supplementary File 2).
    HINWEIS: Führen Sie alle Analysen zur Integration von Überlebens- und Motorikdaten mit dem bereitgestellten benutzerdefinierten Python-Skript aus Supplementary File 2 durch. Verwenden Sie Pandas für die Datenverarbeitung und das Zusammenführen von Datensätzen, NumPy für die numerische Integration nach der Trapezregel und Matplotlib für die grafische Visualisierung.

7. Statistische Analyse

  1. Stellen Sie Bewegungs- und Überlebensmessungen als repräsentative Datensätze dar, die aus biologisch replizierten Gefäßen stammen.
  2. Geben Sie Bewegungsmessungen als Mittelwerte an, die über unabhängige Kletterversuche gemittelt wurden.
  3. Verwenden Sie eine grafische Darstellung der Klettersteigung (Pixel/s) und der AUC-Werte für das Überleben, um repräsentative Zusammenhänge zwischen motorischer Leistung und Überlebensergebnissen zu veranschaulichen.

Ergebnisse

Reproduzierbare Lebensdauerprofile unter standardisierten Haltungsbedingungen
Wenn die Fliegen unter kontrollierten Umweltbedingungen (25 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit, 12 h:12 h Licht-Dunkel-Wechsel) mit frisch zubereiteter standardisierter Nahrung gehalten wurden, zeigten die Kontrollkollektive in unabhängigen Experimenten konsistente Überlebensverläufe. Canton-S-Kontrollfliegen wiesen eine mittlere Lebensdauer von etwa 65–72 Tagen auf, wobei das maximale Überleben bis zu 75 Tage betrug (Abbildung 2). Lebensdauerexperimente wurden mit jeweils 2 biologischen Wiederholungen pro Bedingung durchgeführt, wobei jede 20 Fliegen enthielt. Repräsentative Überlebensverläufe, die unter standardisierten Umwelt- und Futterbedingungen erzielt wurden, zeigten reproduzierbare Lebensdauerprofile in den Kontrollkollektiven.

Im Gegensatz dazu zeigten pan-neuronale amyloid-β-exprimierende Fliegen eine verminderte Überlebensrate im Vergleich zu Canton S-Kontrollen, was mit zuvor beschriebenen neurodegenerativen Phänotypen in Drosophila-Modellen der Alzheimer-Krankheit übereinstimmt4,5,6.

Suboptimale Ergebnisse hinsichtlich der Lebensdauer können auftreten, wenn die Futterqualität abnimmt oder wenn die Behandlungsbedingungen uneinheitlich sind. Unter diesen Bedingungen wurden frühe Sterblichkeitsanstiege innerhalb der ersten 7–10 Tage sowie eine erhöhte Variabilität zwischen den Vials (>25 %) festgestellt, was auf eine beeinträchtigte experimentelle Reproduzierbarkeit und eine verminderte Konsistenz zwischen biologischen Wiederholungen hinweist.

Altersabhängiger motorischer Leistungsabfall, erfasst durch halbautomatisierte Kletteranalyse
Die herkömmliche manuelle Bewertung der negativen Geotaxis zeigte einen altersabhängigen Rückgang der motorischen Aktivität bei Amyloid-β-exprimierenden Fliegen im Vergleich zu Canton-S-Kontrollen (Abbildung 3). Am Tag 7 blieb die Kletterleistung zwischen den Gruppen weitgehend vergleichbar, während sich am Tag 28 bei den Amyloid-β-exprimierenden Fliegen eine verminderte Kletteraktivität gegenüber den Kontrollfliegen zeigte. Die Kontrollkollektive wiesen über alle Alterszeitpunkte hinweg eine relativ stabile Kletterleistung auf. Diese manuell erfassten Verhaltensmuster entsprachen einer Abnahme der Klettersteigungswerte aus der halbautomatisierten FlyTrDT-Pipeline und zeigten altersabhängige Trends, die jenen der herkömmlichen Endpunkt-Bewertung sowie des computergestützten Verfolgungsverfahrens ähnelten (Abbildung 4). Der beobachtete motorische Leistungsabfall bei Amyloid-β-exprimierenden Fliegen stimmt mit den bekannten altersabhängigen Verhaltensbeeinträchtigungen überein, die in Drosophila-Modellen der Neurodegeneration mittels herkömmlicher negativer Geotaxis-Tests beschrieben wurden6,7.

Die halbautomatisierte Kletteranalyse mittels FlyTrDT zeigte eine erhaltene frühe motorische Funktion bei Kontrollfliegen. Am Tag 7 wiesen die Kontrollfliegen eine durchschnittliche Klettersteigung von 86,64 Pixeln/s auf, was einer anhaltenden Aufwärtsbewegung während der aktiven Kletterphase entspricht (Abbildung 4). Bis zum Tag 28 näherte sich die Steigung dem Wert null an (−1,50 Pixel/s), was einer altersbedingten Verlangsamung entspricht.

Im Gegensatz dazu zeigten amyloid-β-exprimierende Fliegen eine frühe motorische Beeinträchtigung. Am Tag 7 war die Klettersteigung auf 34,25 Pixel/s reduziert, was nach Normalisierung etwa 39 % der Kontrollleistung entspricht. Bis zum Tag 28 sank die Klettersteigung deutlich auf −72,25 Pixel/s, was auf eine beeinträchtigte Aufwärtslokomotion hinweist.

Die steigungsbezogene Metrik erfasst den aktiven Kletterabschnitt und verringert den Einfluss der initialen Schreckreaktionslatenz, Plateauphasen und stochastischer Bewegungsartefakte. Positive Steigungen weisen auf eine netto aufwärts gerichtete Fortbewegung hin, nahezu nullwerte Steigungen zeigen eine geringe vertikale Verschiebung an, und negative Steigungen deuten auf eine netto abwärts gerichtete Verschiebung hin. Diese repräsentativen Trajektorien veranschaulichen den fortschreitenden motorischen Verfall bei amyloid-β-exprimierenden Fliegen im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrollen.

Unter optimalen Aufnahmebedingungen erzeugte die FlyTrDT-Pipeline kontinuierliche Schwerpunktbahnen mit stabiler Kontursegmentierung und konsistenten vertikalen Verschiebungsprofilen (Abbildung 4A). Eine verminderte motorische Leistung bei Fliegen mit Amyloid-β-Expression zeigte sich in weniger anhaltenden Aufwärtsbewegungen und geringeren Steigungswerten (Abbildung 4B–D). Videos, die mit übermäßiger Blendung, instabiler Röhrenpositionierung, inkonsistenter Beleuchtung oder unzureichendem Hintergrundkontrast aufgezeichnet wurden, wiesen diskontinuierliche Schwerpunktbahnen und intermittierende Verfolgungsartefakte auf und wurden während der Qualitätskontrolle ausgeschlossen.

Zusammenhang zwischen früher motorischer Leistung und Überlebensergebnissen
Um den Zusammenhang zwischen früher motorischer Leistung und Überlebensergebnissen zu untersuchen, wurden normalisierte Werte der Kletteranstiegsgeschwindigkeit am Tag 7 mit der Überlebens-AUC (Fläche unter der Kurve) über verschiedene Genotypen hinweg verglichen (Abbildung 5). Kontrollfliegen mit erhaltener früher motorischer Leistung (normalisierter Motorindex = 1,0) wiesen höhere Überlebens-AUC-Werte (48,2) auf, während Fliegen, die Amyloid-β exprimierten und eine verminderte frühe motorische Leistung aufwiesen (normalisierter Motorindex = 0,395), niedrigere Überlebens-AUC-Werte (24,65) zeigten. Repräsentative Bewegungsdatensätze wurden aus jeweils 2 biologischen Wiederholungsgefäßen pro Bedingung erzeugt. Diese repräsentativen Datensätze deuten auf einen Zusammenhang zwischen verminderter früher motorischer Leistung und verkürztem Überleben im Amyloid-β-Krankheitsmodell hin. Da lediglich zwei repräsentative Genotypen analysiert wurden, werden diese Ergebnisse beschreibend dargestellt und nicht als statistisch fundierte Vorhersagekorrelation.

Transgenerer Drosophila-Klettertest; Boxplot und Kaplan-Meier-Kurve für Alzheimer-Studie
Abbildung 1: Übersicht über den Arbeitsablauf der halbautomatischen FlyTrDT-Pipeline, die Metriken zur motorischen Gesundheitsspanne mit der Überlebensanalyse kombiniert. Der Arbeitsablauf umfasst standardisierte Haltung und Lebensdaueranalyse von Fliegen, manuelle und halbautomatische Beurteilung der negativen Geotaxis, extrahieren der Schwerpunkte pro Bild aus Klettervideos, Berechnung der Klettersteigung (Pixel/s), Analyse der Überlebensfläche unter der Kurve (AUC) sowie die Integration motorischer Leistung mit Überlebensergebnissen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Überlebensanalyse-Graph, der CS-Kontrolle- und Aβ-Gruppen vergleicht; Wahrscheinlichkeit über Tage
Abbildung 2: Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von Canton-S-Kontrollfliegen und Amyloid-β-exprimierenden Fliegen. Die Überlebenskurven veranschaulichen die Lebensdauerentwicklung unter standardisierten Umwelt- und Ernährungsbedingungen. Canton-S-Kontrollfliegen zeigten ein verlängertes Überleben im Vergleich zu pan-neuronal Amyloid-β-exprimierenden Fliegen, die eine verkürzte Lebensdauer über alle Alterszeitpunkte hinweg aufwiesen. Die Daten stellen repräsentative Überlebensverläufe dar, die aus jeweils 2 biologischen Wiederholungsgefäßen pro Bedingung gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse des Drosophila-Kletterassays; Boxplots vergleichen CS mit elav-Gal4/UAS-Aβ42 an den Tagen 7 und 28.
Abbildung 3: Manuelle Leistung im negativen Geotaxis-Test bei Kontrollfliegen und Amyloid-β-exprimierenden Fliegen am Tag 7 und Tag 28. Boxplots zeigen repräsentative Messungen der Kletteraktivität, ausgedrückt als Prozentsatz der Fliegen, die innerhalb von 10 s die 10-cm-Marke überqueren. Die Kontrollfliegen des Stamms Canton S (CS) wiesen über die verschiedenen Alterszeitpunkte hinweg eine relativ stabile Kletteraktivität auf, während Fliegen, die Amyloid-β exprimieren, bis zum Tag 28 eine verminderte Kletterleistung zeigten. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Probengläser-Messung. Die repräsentativen Datensätze wurden aus jeweils 2 biologischen Wiederholungen pro Bedingung gewonnen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse der Kletterhöhe; Diagramme A–D zeigen Steigungen in Pixel/Sekunde; Zeit-über-Höhe-Diagramme; Datentrends.
Abbildung 4: Halbautomatische Extraktion von Klettertrajektorien und der aktiven Klettersteigung bei Kontrollfliegen und Fliegen mit Amyloid-β-Expression. Repräsentative mittlere vertikale Positionstrajektorien wurden aus Videos zur negativen Geotaxis mithilfe der FlyTrDT-Tracking-Pipeline extrahiert. Die blauen Kurven zeigen die durchschnittliche vertikale Schwerpunktposition der detektierten Fliegen über die Zeit hinweg, framegenau, während die roten Segmente einen repräsentativen aktiven Kletterabschnitt darstellen, der mittels eines gleitenden linearen Regressionsfensters identifiziert wurde. Die Steigungswerte sind in Pixeln pro Sekunde (Pixel/s) angegeben. (A) Tag 7, Kontrollfliegen vom Typ Canton S. (B) Tag 7, Fliegen mit Amyloid-β-Expression. (C) Tag 28, Kontrollfliegen vom Typ Canton S. (D) Tag 28, Fliegen mit Amyloid-β-Expression. Die repräsentativen Trajektorien wurden aus jeweils 2 biologischen Wiederholungen pro Bedingung generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Grafik zur frühen motorischen Gesundheit im Vergleich zur Überlebensrate; die Achsen zeigen die normalisierte motorische Gesundheit am Tag 7 und die Überlebens-AUC.
Abbildung 5: Zusammenhang zwischen früher motorischer Leistung und Überlebensergebnissen in einem Drosophila-Modell der Amyloid-β-Toxizität. Die normalisierten Werte der Klettersteigung am Tag 7 wurden gegen die Überlebensfläche unter der Kurve (AUC) für Kontrollfliegen des Canton-S-Stamms (CS) und Amyloid-β-exprimierende (AD) Fliegen (n = 2) abgetragen. Im Vergleich zu Amyloid-β-exprimierenden Fliegen wiesen die Kontrollfliegen eine höhere frühe motorische Leistung und größere Überlebens-AUC-Werte auf. Diese repräsentativen Datensätze verdeutlichen einen Zusammenhang zwischen früher motorischer Leistungsfähigkeit und Überlebensergebnissen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusatzdatei 1: Python-basiertes FlyTrDT-Kletteranalyse-Skript zur halbautomatischen Quantifizierung der Lokomotion aus Negativ-Geotaxis-Videos. Das Skript führt eine Bildverarbeitung framegenau durch, detektiert Schwerpunkte, extrahiert Trajektorien und berechnet Klettermetriken, einschließlich Kletterneigung, Geschwindigkeit, Trajektorienlänge, Trajektorienfläche, Anzahl der Stopps und Anzahl der Richtungswechsel.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Python-Skript zur Integration von Daten zur motorischen Gesundheitsspanne und Lebensdauer. Das Skript führt die Berechnung des Überlebensanteils, die Trapez-Flächenunterderkurve-(AUC-)Analyse, die Normalisierung der Steigungs­werte des Kletterns am Tag 7, das Zusammenführen der Datensätze sowie die grafische Visualisierung der motorischen Leistung und Überlebensergebnisse durch.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Lebensspannanalyse mit der halbautomatischen Quantifizierung der motorischen Gesundheitsspanne bei Drosophila melanogaster verbindet. Eine zuverlässige Integration von Lebensspannen- und Lokomotionsmessungen hängt stark von der Konsistenz der Umweltbedingungen, der Futterqualität und standardisierten Handhabungsverfahren über biologische Wiederholungen hinweg ab7. Variabilität in der Trockenheit des Futters, verspätete Umsiedlungen oder inkonsistente Erfassung der Mortalität können vorzeitige Todesraten und eine erhöhte Variation zwischen den Gefäßen verursachen, wodurch die Rekonstruktion von Überlebenskurven sowie die anschließende Interpretation von Alterungsphänotypen beeinträchtigt werden kann.

Bei dem Negativ-Geotaxis-Assay sind konstante Lichtverhältnisse, eine einheitliche Kamerapositionierung und eine korrekte Ausrichtung der Röhren erforderlich, um eine zuverlässige Detektion des Schwerpunkts während der Videobearbeitung sicherzustellen. Eine übermäßige CO₂-Exposition während der Sortierung sollte minimiert werden, da die Anästhesie sowohl die Lebensdauer als auch die motorische Leistung beeinträchtigen kann. Werden wiederholte Verhaltensmessungen an derselben Kohorte durchgeführt, sollten die Assays stets zur gleichen Tageszeit erfolgen, um zirkadiane Schwankungen zu reduzieren. Unzureichender Hintergrundkontrast oder inkonsistente Beleuchtung können die Schwellwertbildung und die Konturdetektion während der automatisierten Analyse beeinträchtigen. Falls bei der Videobearbeitung eine Fragmentierung der Konturen oder instabile Schwerpunktbewegungen beobachtet werden, sollten der Hintergrundkontrast verbessert, Blendeffekte reduziert, die Kameraposition stabilisiert und eine gleichmäßige Beleuchtung über alle Aufnahmen hinweg gewährleistet werden. Anhaltende Artefakte bei der Schwellwertbildung können durch Anpassung des Aufnahmewinkels, Verringerung von Schatten oder durch die Sicherstellung, dass die gesamte Kletterröhre kontinuierlich vollständig im Bildrahmen sichtbar bleibt, minimiert werden. Eine übermäßige Ansammlung von Fliegen in der Röhre kann eine genaue Schätzung des Schwerpunkts beeinträchtigen und sollte durch die Aufrechterhaltung einheitlicher Kohortengrößen über alle Experimente hinweg minimiert werden.

Traditionelle Assays zur negativen Geotaxis messen typischerweise den Anteil der Fliegen, die innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls eine vordefinierte Höhe erreichen, und werden häufig zur Beurteilung des motorischen Leistungsabfalls im Alter sowie bei Neurodegeneration eingesetzt5,6. Im Gegensatz dazu extrahiert der hier vorgestellte halbautomatisierte Workflow eine aktive Kletterphase der Aufwärtsbewegung und berechnet die aktive Klettersteigung (Pixel/s) aus den zentroidbasierten Bewegungsbahnen pro Einzelbild. Da die Positionen der Zentroide in jedem Bild über alle detektierten Fliegen gemittelt werden, bleiben individuelle Bewegungsbahnen und die Verhaltensheterogenität zwischen einzelnen Fliegen unberücksichtigt. Dieser Ansatz verringert den Einfluss von Schreckreaktionsverzögerungen, vorübergehenden Pausen und Schwarmverhalten, die die manuelle Endpunktauswertung beeinflussen können. Im Unterschied zur herkömmlichen Endpunktauswertung liefert der hier beschriebene Workflow außerdem kontinuierliche Messungen der ansteigenden Steigung (Pixel/s), die einen quantitativen Vergleich des motorischen Abbaus zwischen verschiedenen Altersstufen und Genotypen ermöglichen. Ähnliche computergestützte Verfolgungsmethoden werden zunehmend eingesetzt, um Objektivität und Konsistenz in der Verhaltensanalyse von Drosophila mithilfe automatisierter Plattformen zur Lokomotionsquantifizierung zu verbessern8,9,10,11,12.

Mehrere zusätzliche Einschränkungen sollten berücksichtigt werden. Pixelbasierte Messungen der Klettersteigung (Pixel/s) hängen von einer konsistenten Kamera-Kalibrierung und einer einheitlichen Aufnahmegeometrie über verschiedene Experimente hinweg ab. Unterschiede in der Kameradistanz oder Auflösung können die absoluten Steigungswerte beeinflussen, weshalb eine Normalisierung auf interne Kontrollen erforderlich ist. Darüber hinaus wurde zwar ein qualitativer Zusammenhang zwischen frühem motorischem Abfall und verminderter Überlebensrate im hier dargestellten Amyloid-β-Modell beobachtet, eine umfassendere Validierung über zusätzliche Genotypen, Interventionen oder pharmakologische Behandlungen würde jedoch die Interpretation des Verhältnisses zwischen motorischer Leistung und Überlebensergebnissen stärken. Die hier dargestellten repräsentativen Datensätze dienen dazu, die Implementierung und Interpretation des Arbeitsablaufs zu veranschaulichen, und sollen kein allgemeines Vorhersagemodell für verschiedene Krankheitskontexte etablieren.

Trotz dieser Einschränkungen bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren und kostengünstigen Rahmen, um funktionelle Gesundheitsspannen-Metriken mit Überlebensergebnissen in Alterungsstudien zu verknüpfen. Die Methode lässt sich leicht an genetische Modifikationen, Wirkstoff-Screening-Paradigmen und Modelle der Neurodegeneration anpassen, bei denen ein funktioneller Rückgang vor dem Tod auftritt. Durch die Integration objektiver Quantifizierung der Klettersteigung (Pixel/s) mit standardisierter Überlebensanalyse ermöglicht dieser Ansatz eine umfassende Phänotypanalyse von Alterungstrajektorien bei Drosophila. Zukünftige Studien, die zusätzliche neurodegenerative Genotypen, pharmakologische Interventionen und longitudinale Verhaltensdatensätze einbeziehen, könnten die Nützlichkeit des Workflows für eine integrierte Gesundheitsspannen-Analyse weiter verbessern13,14.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgarHimedia GRM666Versuchsmittel zur Verfestigung
BenzoesäureHimediaGRM488Antimikrobielles Konservierungsmittel
Canton-SBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #1Wildtyp-Stamm als Referenz
KletterrohrIndividuell angefertigtNicht zutreffendTransparenter zylindrischer Behälter, 12 cm Höhe × 2 cm Durchmesser, aus transparentem Kunststoff oder Glas
MaisgrießLokaler Lieferant Nicht zutreffendZur Herstellung der Nahrung für Fliegen
Desktop-/Laptop-ComputerBeliebiger HerstellerVom Nutzer definiertMindestens Dual-Core-Prozessor, ≥8 GB RAM, mit Python 3.x kompatibles Betriebssystem
D-GlukoseHimediaMB037Baustein der Fliegenkost
elav-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC #458Pan-neuronaler GAL4-Treiber
MatplotlibOpen-Source-BibliothekVersion 3.5.2Datenvisualisierung und Diagrammerstellung
NumPyOpen-Source-BibliothekVersion 1.26.4Numerische Berechnungen
OpenCVOpen-Source-BibliothekVersion 4.9.0Videoverarbeitung
PandasOpen-Source-BibliothekVersion 2.2.0Datenverwaltung
PropionsäureHimediaGRM3658Antifungales Konservierungsmittel
PythonPython Software Foundation Version 3.12.1Analyseumgebung
Scikit-learnOpen-Source-BibliothekVersion 1.4.2Lineare Regressionsanalyse
Smartphone-Kamera / DigitalkameraBeliebiger HerstellerVom Nutzer definiertMindestens 30 Bilder/s Aufnahme, stabiler Fokus, senkrechte Ausrichtung, mindestens 1280 × 720 Auflösung
SaccharoseHimediaGRM601Baustein der Fliegenkost
UAS-APP.Aβ.E693GBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #33774Modell der humanen APP-Arctic-Mutation
HefeHimediaRM027Ernährungsergänzung

Referenzen

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