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Methodenartikel

Zervikale heterotopische Mausherztransplantation mit End-to-Side-Anastomose-Technik zur Untersuchung der Transplantationsimmunologie

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DOI:

10.3791/70704

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3. Juli 2026

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1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education; NHC Key Laboratory of Organ Transplantation; Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Division of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, 4Department of Clinical Medicine, Bengbu Medical College

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll präsentiert eine vereinfachte, end-zu-seitige Nahtanastomose-Technik für die Zervikalherztransplantation der Maus und bietet ein robustes und reproduzierbares Modell zur Untersuchung der Transplantationsimmunologie.

Zusammenfassung

Die heterotopische Herztransplantation im Maus ist ein entscheidendes präklinisches Modell in der Transplantationsforschung. Die zervikale heterotopische Herztransplantation bei Mäusen bietet deutliche Vorteile, darunter direkte visuelle und tastbare Überwachung der Transplantatlebensfähigkeit, reduzierte chirurgische Verletzungen und eine schnellere postoperative Genesung. Es ist daher zu einer zunehmend wertvollen Plattform für die Untersuchung der Transplantationsimmunologie geworden, besonders für Tiere mit schlechten physiologischen Bedingungen durch genetische Modifikation oder Medikamenteninduktion, und für Experimente, die eine sekundäre oder kombinierte Organtransplantation erfordern, wird der Gebärmutterhalsbereich oft zum einzigen praktikablen Ort. Konventionelle Zervikaltransplantationstechniken, sei es mit End-to-End-Naht oder manchettenbasierten Methoden, erfordern eine dauerhafte Ligatur der gemeinsamen Halsschlagader und der externen Jugularvene des Empfängers, was die zerebrale Durchfluss beeinträchtigen und fremde Materialien oder hämodynamische Störungen einführen kann. Um diese Einschränkungen zu beheben, beschreibt dieser Artikel eine verfeinerte Technik zur zervikalen Herztransplantation mit einer End-to-Seit-Gefäßanastomose. Die Methode erhält die arterie halsschlagader und die äußere Halsvene des Empfängers, erhält eine normale Gehirnperfusion und vermeidet Komplikationen im Zusammenhang mit der permanenten Gefäßligatur. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte von der Spenderherzentnahme bis zur Empfängeranastomose und postoperativer Versorgung. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine hohe chirurgische Erfolgsquote (96,7 %) und die Wirksamkeit des Modells bei der Untersuchung der Allotransplantat-Abstoßung. Diese Technik bietet ein physiologisch relevantes und technisch zugängliches Modell für Forscher in der Transplantationsimmunologie.

Einleitung

Im vergangenen halben Jahrhundert ist die Transplantationsimmunologie weiterhin ein zentraler Schwerpunkt für Immunologen und Transplantationsspezialisten geblieben. Heute wird die Transplantation von festen Organen weit verbreitet durchgeführt und stellt die wirksamste Behandlung für Organerkrankungen im Endstadium dar. Allerdings ist die Abstoßung des Transplantats nicht grundlegend behoben und stellt weiterhin eines der größten Hindernisse bei der Transplantation sowie eine der Hauptursachen für den Transplantationsverlust1 dar. Daher bleibt es eine bedeutende Herausforderung und ein zentrales Forschungsziel in diesem Fachgebiet zu überwinden oder abzumildern, Abstoßung zu vermeiden und gleichzeitig systemische Immunsuppression zu reduzieren oder zu vermeiden.

Gefäßtransplantationsmodelle für Tierorgane, insbesondere Mausmodelle, haben eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Transplantationsimmunologie gespielt und eine wesentliche wissenschaftliche Grundlage für die klinische Übersetzung gebildet2. Beispielsweise wurden viele heute klinisch eingesetzte Immunsuppressiva – wie Cyclosporin, Tacrolimus und Rapamycin – erstmals erfolgreich in den Maustransplantationsmodellen 3,4 validiert.

Das Modell der heterotopischen Herztransplantation (HT) der Maus ist eines der am weitesten verbreiteten präklinischen Modelle, bevorzugt aufgrund der Fülle verfügbarer genetischer Stämme und Forschungsreagenzien sowie seines relativ einfachen Verfahrens und der einfachen postoperativen Überwachung. Als solche dient es als wichtige Plattform zur Untersuchung akuter Abstoßungsmechanismen, zur Einleitung von Immuntoleranz und zur Bewertung neuer Immunsuppressiva in vivo 5,6.

Das erste murine heterotopische HT-Modell wurde 1973 von Corry et al.7 etabliert. In diesem Modell wird das Spenderherz in der Bauchhöhle des Empfängers platziert, wobei die Graftaorta und die Lungenarterie (PA) end-zu-seitlich an die abdominale Aorta des Empfängers und die untere Vena cava (IVC) angelegt sind. Diese Methode blieb jahrzehntelang die Standardtechnik für die abdominale HT. Getrieben durch den Bedarf, Allografts von Drittanbietern in Toleranzstudien unterzubringen, wurde ein zweiter Standort für HT untersucht. Dies führte zur Entwicklung von zervikalen HT-Modellen bei Mäusen, die weitere Vorteile bieten, wie eine direkte visuelle Bewertung der Transplantatlebensfähigkeit, weniger chirurgische Verletzungen und ein geringeres Risiko für postoperative Infektionen 5,8,9. 1991 beschrieben Chen et al.8 erstmals ein zervikales heterotopisches HT-Modell bei Mäusen, bei dem eine End-to-End-Manuelle Nahtanastomose der Spenderaorta und der PA an der gemeinsamen Halsschlagader (CCA) bzw. der externen Jugularvene (EJV) des Empfängers durchgeführt wurde. Dieses Modell fand jedoch keine breite Akzeptanz, da die erhebliche technische Herausforderung durch die starke Diskrepanz zwischen der Spenderaorta und der Empfänger-CCA verursacht wurde, was die vaskuläre Anastomose äußerst erschwerte.

Ebenfalls 1991 führten Matsuura et al.9 eine nicht-nahtgebundene Manschettentechnik für die vaskuläre Anastomose im zervikalen HT-Modell ein. Diese Methode vereinfacht das Verfahren, indem das technisch anspruchsvolle manuelle Gefäßnähen entfällt und so die Beherrschung erleichtert wird. In der Folge wurden zahlreiche technische Verbesserungen der Manschettentechnik berichtet: 10,11. Derzeit wird die Manschettenmethode bei zervikaler HT weit verbreitet eingesetzt, insbesondere von Forschern ohne Vorerfahrung mit mikrovaskulärem Nähten. Die Manschettentechnik führt jedoch künstliche Materialien ein, die lokale Entzündungen auslösen und immunologische Bewertungen beeinträchtigen können, während sie auch technische Herausforderungen in Gefäßen mit kleinem Kaliberdarstellen 5,6. Kürzlich schlugen Liao et al.12 eine manschettenfreie Sleeve-Technik bei zervikaler HT vor, bei der Spender- und Empfängergefäße direkt mit einer Sleeve-Methode anastomosiert werden. Indem künstliche Materialien vermieden und kleine Gefäße berücksichtigt werden, bietet dieser Ansatz eine physiologische und reproduzierbare Grundlage für eine sekundäre Herztransplantation.

Dennoch erfordern sowohl End-to-End-Nahttechniken als auch Nicht-Nahtmanschetten eine dauerhafte Ligatur des einseitigen CCA und EJV des Empfängers. Dies beeinträchtigt die einseitige zerebrale Blutversorgung des zentralen Nervensystems, was zu neurologischen Komplikationen wie Richtungsstörungen und Hemiplegieführen kann. Darüber hinaus können diese End-to-End-Ansätze zu veränderten Hämodynamiken führen, wie hochgeschwindigkeits arterielle Jets, und ein höheres Risiko für Thrombose und Stenose bergen, was dem langfristigen Überleben des Transplantats nachteilig ist. Darüber hinaus birgt die Manschettentechnik aufgrund der Manschette ein inhärentes Thromboserisiko.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir eine verfeinerte manuelle End-to-Seit-Nahttechnik eingeführt, bei der die aufsteigende Aorta und PA des Spenders an die CCA bzw. EJV des Empfängers anastomosiert werden. Diese Methode bewahrt die Integrität und Kontinuität der wichtigsten Halsgefäße des Empfängers, erhält so die normale Gehirndurchströmung und hält sich an das 3R-Prinzip (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) der Tierforschung. Mit dieser Technik erreichten wir eine chirurgische Erfolgsquote von etwa 96,7 % (29/30, mit nur einer Sterblichkeit durch Blutungen). Nach der Operation wurden bei keiner Empfängermäuse eine zerebrale Ischämie festgestellt. Diese Methode ähnelt stark den Standardmodellen des Bauches und ist besonders geeignet für Chirurgen mit Erfahrung in der vaskulären Naht, um zervikale HT-Modelle zu etablieren.

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Protokoll

Die Tierpflege entsprach internationalen Leitlinien, und alle Verfahren wurden am Institut für Organtransplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, durchgeführt. Die ethische Genehmigung für die Studie wurde vom Tierethikkomitee des Tongji-Krankenhauses eingeholt (Genehmigungsnummer: TJH-202310010). Die für die Studie verwendeten Instrumente sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Sterilisiere den Operationssaal mit einer ultravioletten Lampe für 30 Minuten. Desinfizieren Sie den Operationstisch mit 70 % Ethanol und autoklaven alle chirurgischen Instrumente (121 °C für 20 Minuten).
  2. Verwenden Sie erwachsene männliche C57BL/6- und BALB/c-Mäuse (20–25 g; 8–10 Wochen alt). Für die syngene Transplantation werden C57BL/6-Mäuse sowohl als Spender als auch als Empfänger verwendet. Für die allogene Transplantation werden BALB/c-Mäuse als Spender und C57BL/6-Mäuse als Empfänger verwendet.
  3. Verabreichen Sie der empfangenden Maus eine präoperative Analgesie mittels subkutaner Buprenorphininjektion (0,05 mg/kg) 1 Stunde vor der Operation.
    HINWEIS: Eine präoperative Analgesie wird an der Spendermaus nicht durchgeführt, da der Spender unmittelbar nach der Herzentnahme eingeschläfert wird.
  4. Bereiten Sie die Anästhesielösung mit Ketamin (20 mg/ml) und Xylazin (2 mg/ml) vor. Betäuben Sie die Maus mit vorbereiteter Ketamin-Anästhesie mittels intraperitonealer Injektion mit einem Dosisvolumen von 5 μL/g. Bestätigen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie, indem Sie langsame und regelmäßige Atmung, den Verlust des Aufrichtreflexes und das Fehlen eines Pedalreflexes beobachten.
  5. Rasieren Sie das Fell im Brust- und Bauchbereich. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur zu erhalten. Desinfizieren Sie die Operationsstelle durch Abwechseln von Povidon-Jod und 70 % Ethanol für drei Zyklen. Verlängern Sie den Hals des Empfängers, indem Sie die oberen Schneidezähne mit einem 6-0-Seidenfaden nach oben ziehen, um die Sichtbarkeit zu optimieren.
  6. Tragen Sie sterile chirurgische Handschuhe. Machen Sie eine ovale Öffnung, die etwas größer ist als die Schnittstelle an einem sterilen Vorhang. Dann benutze es, um die empfangende Maus zu bedecken.

2. Ernte des Spenderherzens

  1. Machen Sie einen mittleren Bauchschnitt, gefolgt von einem querförmigen (kreuzförmigen) Schnitt, um die Bauchhöhle vollständig freizulegen.
  2. Ziehe den Dünndarm vorsichtig nach links zurück mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit Kochsalzlösung befeuchtet wurde, um die Bauchaorta und die IVC freizulegen.
  3. Injizieren Sie 0,3 ml heparinisierte Kochsalzlösung (300 IU/mL) in die IVC und warten Sie 1 Minute auf die systemische Heparinisierung. Schneiden Sie die Bauchaorta und IVC, um den Spender zu entbluten.
  4. Schneiden Sie das Zwerchfell zusammen mit der vorderen Brustwand ein, um einen U-förmigen Schnitt durch den Brustkorb zu machen, wobei Sie mit einer Schere die Brusthöhle freilegen.
  5. Injizieren Sie 2 ml kalte Kochsalzlösung (4 °C) über die intrathorakale IVC ins Herz, um das Restblut auszuspülen.
    HINWEIS: Der Hauptzweck dieses Schrittes ist es, eine Unterkühlung auszulösen und das Herz zum schnellen Schlagen zu bewegen. Der zweite Zweck ist es, das Blut gründlich aus dem Herzen zu spülen, insbesondere aus den Koronararterien.
  6. Bedecken Sie das Herz mit einem Stück steriler Mullbinde, das in kalter Kochsalzlösung (4 °C) eingeweicht ist. Ein sanfter Abwärtstraktion auf dieser Kompresse ermöglicht eine optimale Belichtung der Aorta und des PA. Darüber hinaus sorgt das kalt salzhaltige Gaze dafür, dass die Unterkühlung des Transplantats während der anschließenden Dissektion unterkühlt wird.
  7. Identifizieren und isolieren Sie die intrathorakale IVC. Ligaiere sie mit einer 6-0-Seidennaht und transektiere sie distal zur Ligatur mit einer Mikroschere.
  8. Identifizieren und entfernen Sie den Thymus, um den Aortenbogen und die PA freizulegen. Identifizieren und isolieren Sie die obere Vena cava. Ligiere sie mit einer 6-0 Seidennaht. Transektiere es distal zur Ligatur.
  9. Identifizieren und isolieren Sie die aufsteigende Aorta. Schneiden Sie die Aorta proximal zur Innominatisarterie durch, um die Gefäßlänge zu maximieren.
  10. Identifizieren und isolieren Sie die PA. Schneide es direkt proximal zu seiner Bifurkation. Ligaiere alle Gefäße hinten zum Herzen (die Lungenvenen) mit einem 6-0 Silk. Schneiden Sie das Herz vorsichtig mit einer Mikroskopschere ab.
  11. Bewegen Sie das Herz vorsichtig und tauchen Sie es in kalter Kochsalzlösung (4 °C), die auf Eis gelegt wird, um sie bis zur Transplantation zu lagern.

3. Empfängerbetrieb

  1. Isolierung des Empfängerschiffs
    1. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt auf der rechten Seite des Halses, der sich vom oberen Rand der Mitte des rechten Schlüsselbeins bis zum unteren Rand des Unterkiefers erstreckt.
    2. Entfernen Sie den rechten Lappen der Untermandibulardrüse. Schneiden Sie den rechten Musculus sternocleidomastoideus durch, um eine ausreichende Tasche für die Implantation des Spenderherzens zu schaffen.
    3. Identifizieren und isolieren Sie das richtige EJV und das richtige CCA. Mobilisieren Sie die EJV, indem Sie ihre Zweigstellen kauterisieren. Isoliere dann das CCA von den umliegenden Geweben. Vermeiden Sie es, den begleitenden Vagusnerv beim Zerlegen des CCA zu beschädigen.
  2. Arterienanastomose
    1. Gleichzeitig werden EJV und CCA mit zwei mikrovaskulären Klemmen verschlossen, wobei eine Klemme an den Schädelenden beider Gefäße und die andere an den kaudalen Enden angebracht wird. Zuerst die Schädelklemme anlegen, gefolgt von der Kaudalklemme.
      HINWEIS: Die mikrovaskulären Klemmen werden vorzugsweise von der rechten Mausseite nach links eingeführt, wobei die Klemmen-Griffe auf der rechten Seite positioniert sind. Diese Ausrichtung erleichtert die anschließende Gefäßanastomose und hilft, die Kompression der Luftröhre zu reduzieren.
    2. Drehen Sie die Maus um 90° im Uhrzeigersinn. Machen Sie einen längsliegenden Schnitt in der CCA, wobei die Länge dem Durchmesser der aufsteigenden Spenderaorta entspricht. Spülen Sie das Lumen mit heparinisierter Kochsalzlösung, um eventuelle verbliebenen Blutgerinnsel gründlich zu entfernen.
    3. Um das anastomotische Fenster zu erzeugen, verwenden Sie eine 11-0-Naht. Führen Sie die Nadel durch die Gefäßwand in einer Entfernung, die ungefähr dem Durchmesser des Spendergefäßes entspricht, hebt die Gefäßwand vorsichtig mit der Naht an und entfernt dann einen kleinen Teil mit einer Mikroschere.
    4. Setzen Sie das Spenderherz in die Halswirttasche. Verankern Sie die aufsteigende Spenderaorta am Empfänger-CCA, indem Sie zwei 11-0-Nähte mit Nadeln an den proximalen und distalen Enden setzen. Legen Sie das Spenderherz auf die rechte Seite des Empfängers und bedecken Sie es mit nasser steriler Mullbinde.
    5. Mit der distalen Naht wird eine kontinuierliche Naht an den hinteren Wänden in distaler bis proximaler Richtung mit 6–8 Stichen durchgeführt.
    6. Nach Abschluss der Naht der hinteren Wand drehen Sie die Maus um 180°. Reflektiere das Spenderherz nach links des Empfängers und decke es mit feuchter, steriler Mull ab. Schließen Sie die Anastomose ab, indem Sie die vorderen Gefäßwände in proximaler bis distaler Richtung mit 6–8 Stichen nähen. Spülen Sie das Lumen mit Kochsalzlösung, bevor Sie den letzten Knoten binden, um Luftblasen zu entfernen.
  3. Venenanastomose
    1. Machen Sie einen Längschnitt am EJV, der dem Durchmesser des Spender-PA entspricht. Spülen Sie das Lumen mit heparinisierter Kochsalzlösung, um eventuelle verbliebenen Blutgerinnsel gründlich zu entfernen.
    2. Verankern Sie das Spender-PA am Empfänger-EJV, indem Sie zwei 11-0-Nähte mit Nadeln an den proximalen und distalen Enden setzen.
    3. Mit der proximalen Naht werden die hinteren Wände kontinuierlich in proximaler bis distaler Richtung mit 5–7 Stichen genäht.
    4. Fahren Sie mit derselben Naht fort, um die vorderen Wände von außen in distaler bis proximaler Richtung mit 5–7 Stichen zu schließen. Binden Sie die Naht an der proximalen Spitze fest. Spülen Sie das Lumen mit Kochsalzlösung, bevor Sie den letzten Knoten binden, um Luftblasen zu entfernen.
  4. Reperfusion
    1. Lösen Sie zuerst die distale Klemme, gefolgt von der proximalen Klemme, um die Reperfusion einzuleiten. Nach der Reperfusion sollte das Herztransplantat sofort rot werden. Normaler Rhythmus und Kontraktion erholen sich typischerweise innerhalb von 1–2 Minuten.
    2. Sobald die Hämostase bestätigt ist, wird das Herztransplantat vorsichtig in der subkutanen Tasche positioniert und darauf geachtet, dass keine Torsion der Gefäße vorliegt. Schließen Sie den Hautschnitt mit 5-0-Nähten.
  5. Postoperative Versorgung
    1. Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und setzen Sie sie in einen auf 34 °C eingestellten Säuglingsinkubator, um die Genesung zu erleichtern. Überwachen Sie die Maus alle 1–2 Stunden, bis sie spontan erwacht, und bringen Sie sie dann zurück in den Stallkäfig.
      HINWEIS: Wiederwärmen ist notwendig, um eine durch Unterkühlung verursachte Atemdepression zu verhindern und die Erholung von der Anästhesie zu erleichtern.
    2. Postoperative Analgesie durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) alle 12 Stunden für die ersten 48 Stunden nach der Operation verabreichen.
    3. Überwachen Sie täglich die Pulsationen des Herztransplantats und dokumentieren Sie den Überlebensstatus des Transplantats.

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Ergebnisse

Mit diesem modifizierten Modell wurden dreißig Fälle durchgeführt; Die Erfolgsquote der Operation lag bei 96,7 % (29/30). Nur eine Sterblichkeit trat aufgrund einer intraoperativen Blutung auf. Die übrigen 29 Fälle wurden zur Analyse der Operationszeiten und der Transplantationsergebnisse einbezogen. Nach der Operation wurden bei keinem Empfänger eine zerebrale Ischämie-bedingte Komplikation festgestellt. Die Ernte des Spenderherzens wurde in 6,4 ± 0,7 Minuten abgeschlossen, die Operatio...

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Diskussion

Das zervikale HT-Modell mit der End-to-Side-Anastomose-Technik bietet mehrere Vorteile. Im Vergleich zum End-to-End-Naht oder der Manschettenmethode erhält dieser Ansatz die Kontinuität von CCA und EJV vollständig, wodurch die normale zerebrale Hämodynamik erhalten bleibt und Komplikationen durch zerebrale Ischämie effektiv vermieden werden. Die End-to-Side-Anastomose vermeidet zudem technische Schwierigkeiten, die durch eine Diskrepanz der Durchmesser von Spender- und Empfängergefäßen e...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (81700571) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1mL SpritzeBecton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309628
11-0 Nähte mit NadelnJinhuan Medical Products Co., Ltd.H1101Für Gefäßanastomosen
3mL SpritzeBecton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309657
5-0 Nähte mit NadelnJinhuan Medical Products Co., Ltd.CR537Für Hautverschluss
6-0 SeidenfadenJinhuan Medical Products Co., Ltd.2650182
Blutstillendes KauterNingbo Shunye Medical Co., Ltd.BDD-YE-DT-1
BuprenorphinTianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., LtdH12020275Schmerzmittel
WattestäbchenFuqing Health & Integral Medical20230R
Gebogene MikropinzetteRWD life Science Co.F11031-11Chirurgisches Instrument
Gebogene Mikroschere66 Vision Tech Co., Ltd.54108BChirurgisches Instrument
GauzestämmeYubei Medical Materials Co., LTD21080274
Heparin-Natrium-InjektionNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
MikronadelhalterWorld Precision Instruments Co., Ltd.555408NTChirurgisches Instrument
MikrogefäßklemmeRoboz Surgical Instrument CoRS-5481T
MikrogefäßklemmapplikatorRoboz Surgical Instrument CoRS-5480
NadelhalterRWD life Science Co.F31025-13Abdominalverschluss
KochsalzlösungZhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd716092103
Gerade MikropinzetteRWD life Science Co.F11029-11Chirurgisches Instrument
Chirurgisches MikroskopLeicaM650
Chirurgische PlattformBenutzerdefiniert, magnetisch
GewebezangeRWD life Science Co.F12002-12Chirurgisches Instrument
GewebezangeRWD life Science Co.S12003-09Chirurgisches Instrument

Referenzen

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