Grüne Synthese von Gold- und Silbernanopartikeln mit Pflanzenextrakten, Pilzfiltraten und Bakterienkulturen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt reproduzierbare grüne Synthesemethoden zur Herstellung von Gold- und Silbernanopartikeln mit Pflanzenextrakten, Pilzfiltraten und Bakterienkulturen, gefolgt von Nanopartikelbestätigung mittels ultraviolett-sichtbarer Spektroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Die grüne Synthese von Metallnanopartikeln (NPs) mit biologischen Systemen bietet eine nachhaltige Alternative zu herkömmlichen chemischen Herstellungsmethoden. Dieses Protokoll bietet reproduzierbare experimentelle und analytische Verfahren zur Synthese von Gold- (Au) und Silber-(Ag)-NPs unter Verwendung von Bakterienkulturen, Pilzfiltraten und Pflanzenblattextrakten als Reduktions- und Stabilisierungsmittel. AgNPs wurden mit Extrakten aus Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera und Earliella sp. synthetisiert und wiesen charakteristische ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Absorptionsbänder zwischen 405 und 425 nm auf, die die NP-Bildung bestätigten. Ein Design-of-Experiments-Ansatz wurde angewandt, um den Einfluss von Umweltfaktoren wie Sauerstoffbedingungen, pH-Wert, Au-Konzentration, Zellkonzentration, Elektronenspendertyp und Temperatur auf die Synthese von AuNPs durch Shewanella oneidensis und Cupriavidus metallidurans zu bewerten. Unter idealen Bedingungen (0,2 mM Au und pH 5) produzierte S. oneidensis überwiegend kugelförmige AuNPs mit einer durchschnittlichen Größe von 43,6 ± 11,0 nm und einem charakteristischen Absorptionspeak bei 520 nm. NP-Bildung und -Morphologie wurden mittels UV-Vis-Spektroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser Workflow bietet eine reproduzierbare Plattform für die biogene NP-Synthese und unterstützt Anwendungen in Biosensing, Bioremediation und antimikrobiellen Technologien.

Einleitung

Metallische Nanopartikel (NPs) besitzen einzigartige physikochemische Eigenschaften, die mit ihrer hohen Oberfläche verbunden sind, einschließlich charakteristischer elektronischer, magnetischer und katalytischer Verhaltensweisen sowie hoher Reaktivität. Diese Eigenschaften haben ihre Anwendung in mehreren Bereichen gefördert, darunter Medikamente zur Krankheitsdiagnose und -abgabe ^1,2,3,4,5,6, Kosmetik für Sonnencreme-Formulierungen⁷, Elektronik für Transistoren und Solarzellen⁸, Umwelttechnik für Wasseraufbereitung ^2,9,10, und Landwirtschaft für Düngemittel und Pestizide^11,12. Die kontinuierliche Ausweitung der NP-Bewerbungen über Disziplinen hinweg spiegelt sich in der zunehmenden Zahl verwandter Publikationen wider, die in den letzten Jahren berichtet^{wurden: 13,14}.

Synthetische Methoden für metallische NPs ermöglichen eine präzise Kontrolle wichtiger Eigenschaften wie Partikelgröße, Morphologie und Stabilität, wodurch der Syntheseprozess ein entscheidender Faktor für die NP-Leistung ist. Konventionelle chemische Synthesemethoden wurden umfassend optimiert; Allerdings beinhalten sie häufig giftige Reagenzien, hohen Energieverbrauch und erhöhte Produktionskosten^{von 14,15}. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung grünerer und nachhaltigerer Alternativen gefördert. Grüne Syntheseansätze verwenden biologische Systeme wie Pflanzenextrakte ^16,17, Mikroorganismen einschließlich Pilze und Bakterien 18 sowie Algen¹⁹ als natürliche Reduktions- und Stabilisierungsmittel. Während dieser Prozesse werden Metallsalze auf nullvalente Formen reduziert, wodurch NPs auf umweltfreundlichen und kosteneffizienten Wegen entstehen. Darüber hinaus sind biologisch synthetisierte NPs oft biokompatibel, was ihren Einsatz in medizinischen, landwirtschaftlichen und ökologischen Anwendungen erleichtert ^8,14.

Die Auswahl eines geeigneten biologischen Weges für die NP-Synthese hängt von der beabsichtigten Anwendung sowie von der verfügbaren Infrastruktur und den betrieblichen Anforderungen ab. Pflanzenbasierte Synthese wird im Allgemeinen für eine schnelle und kostengünstige NP-Produktion bevorzugt, da sie nur minimale sterile Handhabung erfordert; Variabilität in der Extraktzusammensetzung kann jedoch die Reproduzierbarkeit^{beeinflussen 20,21}. Pilzvermittelte Synthese kann hohe NP-Erträge und extrazelluläre Enzyme liefern, die die NP-Stabilisierung und die nachgelagerte Verarbeitung verbessern, obwohl dieser Ansatz längere Kultivierungsperioden und kontrollierte Wachstumsbedingungen erfordert²². Im Gegensatz dazu ermöglichen bakterielle Systeme eine abstellbare Synthese unter definierten Stoffwechselbedingungen und eine schnelle Biomasseproduktion, was sie für mechanistische Studien und NP-assoziierte Anwendungen geeignet macht²². Die bakterielle Synthese erfordert jedoch oft strenge aseptische Handhabung, kontrollierte Bioreaktorbedingungen und zusätzliche nachgelagerte Verarbeitung, wenn intrazelluläre NPs geborgen werden^21,22.

Trotz der genannten Vorteile stehen grüne Synthesemethoden weiterhin vor Herausforderungen im Zusammenhang mit Reproduzierbarkeit und Standardisierung. Darüber hinaus bleiben detaillierte visuelle Schritt-für-Schritt-Protokolle für die grüne Synthese metallischer^{NPs begrenzt,} was die Fähigkeit der Forscher einschränkt, bestehende Methoden erfolgreich zu reproduzieren und umzusetzen. Ziel dieser Arbeit ist es, reproduzierbare grüne Syntheseprotokolle für Gold- (Au) und Silber-(Ag) NPs unter Verwendung von Pflanzenextrakten, Pilzfiltraten und Bakterienkulturen zu präsentieren. Insbesondere wurden wässrige Extrakte aus Psidium guayaquilensis und Acanthophora spicifera, extrazelluläre Pilzfiltrate von Earliella sp. sowie bakterielle Systeme mit Shewanella oneidensis und Cupriavidus metallidurans zur NP-Synthese verwendet. Die präsentierten Protokolle betonen kritische Schritte bei der Herstellung biologischer Extrakte, der NP-Synthese und der vorläufigen NP-Charakterisierung. Darüber hinaus integriert der Arbeitsablauf das Design von Experimenten, standardisierte Vorbereitungsverfahren und eine Inline-Charakterisierung, um eine reproduzierbare und optimierte biogene NP-Synthese zu unterstützen.

Protokoll

Die Forschung wurde gemäß den institutionellen Richtlinien der Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ecuador) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendete Pflanzen-, Algen- und Pilzbiomasse wurde aus zugänglichen Umgebungen gesammelt und betraf keine geschützten Arten oder Sperrgebiete. Nach institutionellen und nationalen Vorschriften waren keine spezifischen Genehmigungen für die Sammlung frei verfügbarer Biomasse unter diesen Bedingungen erforderlich. Siehe Abbildung 1 für den integrierten experimentellen Workflow, der für die grüne Synthese von AgNPs und AuNPs unter Verwendung von Pflanzen-, Algen-, Pilz- und bakteriellen biologischen Systemen verwendet wird.

Abbildung 1: Integrierter Workflow für die grüne Synthese von Silber (Ag) und Gold (Au) Nanopartikeln (NPs) mit biologischen Systemen. Schematisch des experimentellen Arbeitsablaufs für die grüne Synthese von AgNPs und AuNPs unter Verwendung von Pflanzen-, Algen-, Pilz- und Bakteriensystemen. Der Arbeitsablauf illustriert die biologische Quellenauswahl, die Herstellung von Extrakten oder Biomasse, die Reaktion mit Metallvorläufern (AgNO₃ oder HAuCl₄), Reaktionsbedingungen und die Bildung von NPs. Zu den biologischen Systemen gehören Psidium guayaquilensis Blattextrakt, Acanthophora spicifera Algenextrakt, Earliella sp. extrazelluläres Filtrat und Shewanella oneidensis MR-1 Bakterienkulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

HINWEIS: Befolgen Sie alle Sicherheitsrichtlinien für institutionelle Labore beim Umgang mit Chemikalien und biologischen Materialien. Konsultieren Sie vor der Verwendung Sicherheitsdatenblätter für alle Reagenzien.

1. Synthese von AgNPs mit P. guayaquilensis-Blättern

1. Blattsammlung
   1. Frische Blätter von P. guayaquilensis während der Trockenzeit in Guayaquil, Provinz Guayas, Ecuador (2°10′S, 80°0′W) sammeln.
      HINWEIS: Gutscheinexemplare dieser endemischen Art wurden im GUAY Herbarium, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Guayaquil, Ecuador, und im STEERE HERBARIUM des New York Botanical Garden (NYBG) in New York, USA, deponiert. Weitere Informationen sind verfügbar unter: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Herstellung von Blattextrakt
   1. Waschen Sie das frische Pflanzenmaterial gründlich mit destilliertem Wasser.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Oberflächenunreinheiten vollständig entfernt werden.
   2. Trocknen Sie die Blätter in einem Trockner mit Zwangsluft bei 40 °C.
      HINWEIS: Niedrige Trocknungstemperaturen minimieren den Abbau thermolabiler organischer Verbindungen, die an der Ag^+- Reduktion beteiligt sind.
   3. Mahlen Sie das getrocknete Material mit einer Handmühle, um ein feines Pulver zu erhalten.
   4. 10 g Pulvermaterial in 200 ml destilliertes Wasser aufhängen.
   5. Erhitze die Suspension bei 70°C bei kontinuierlichem Rühren für 1 Stunde.
   6. Lassen Sie den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlen (RT, ~28°C).
   7. Filtern Sie den Extrakt unter Vakuum mit hochwertigem Filterpapier (Klasse 1, Porengröße 11 μm, Durchmesser 110 mm).
      HINWEIS: Entfernen Sie alle festen Rückstände aus dem Pflanzenmaterial.
   8. Lagern Sie den gefilterten Extrakt bei 4°C in bernsteinfarbenen Flaschen bis zur weiteren Verwendung.
3. Herstellung phytogener AgNPs mit Blattextrakten
   HINWEIS: Während der Optimierungsexperimente variieren Sie pro Test einen Parameter, während die übrigen Parameter konstant gehalten werden. Bewertung der Silbernitratkonzentration (AgNO₃) (1–5 mM), Extraktfraktion (10%–50% v/v), Reaktionszeit (0,5–1 H) und Temperatur (25°C–80°C). Syntheseparameter mithilfe der Response-Surface-Methodik auf Basis eines zentralen zusammengesetzten DoE optimieren. Untersuchen Sie jeden Faktor auf fünf Stufen (-α, -1, 0, +1 und +α). Verwenden Sie die Wellenlänge des Oberflächenplasmonresonanz-(SPR)-Peaks (λ_SPR), der mit der NP-Größe korreliert, als Antwortvariable²⁴. Das experimentelle Design besteht aus 16 fakultätiellen Punkten, 8 axialen Punkten und 5 Mittelpunkt-Replikaten, was insgesamt zu 29 Experimenten führt.
   1. Bereite_{AgNO-3-Lösungen} vor, indem du die passende Masse von AgNO-3 in destilliertem Wasser auflösst, um Konzentrationen zwischen 1 und 5 mM zu erhalten.
      VORSICHT: AgNO₃ ist korrosiv und ein starkes Oxidationsmittel, das Haut- und Augenreizungen verursachen kann. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Augenschutz. Vermeiden Sie Lichteinwirkungen und entsorgen Sie ag-haltige Abfälle gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
   2. Mische die_{AgNO-3-Lösung} mit dem Pflanzenextrakt, um Extraktfraktionen zwischen 10 % und 50 % (v/v) zu erhalten.
   3. Erhitze und rühre das Reaktionsgemisch bei der gewählten Temperatur (25°C–80°C) für die gewünschte Reaktionszeit (0,5–1 H).
   4. Lass das Reaktionsgemisch 24 Stunden auf RT stehen.
   5. Zentrifugieren Sie das braune Reaktionsgemisch bei 1660 × g für 15 Minuten bei RT. Entsorgen Sie den Überstandsstoff und sammeln Sie die feste Fraktion.
   6. Trocknen Sie die wiedergewonnenen NPs im Ofen bei 60 °C.

2. Synthese von AgNPs mit A. spicifera-Algenextrakten

1. Algensammlung
   1. Sammeln Sie A. spicifera-Algen in Valdivia, Provinz Santa Elena, Ecuador (1°57′23,91′′S, 80°43′51,33′W).
2. Herstellung von Algenextrakt
   1. Bereiten Sie den Algenextrakt vor, indem Sie das in Schritt 1.2 beschriebene Verfahren befolgen. Ersetzen Sie die Pflanzenblätter durch A. spicifera-Algenbiomasse .
3. Herstellung von phykogenen AgNPs mit Algenextrakten
   HINWEIS: Führen Sie eine Serie von 12 Experimenten durch, indem Sie jeweils einen Parameter variieren, während die übrigen Parameter konstant bleiben. Bewerten Sie die_{AgNO-3-Konzentration} (1–5 mM), den Extraktanteil (5%–25% v/v), die Reaktionszeit (1–4 H) und die Temperatur (25°C–70°C).
   1. Bereiten Sie die_{AgNO-3-Lösungen} und den Algenextrakt wie in den Schritten 1.3.1 und 2.2 beschrieben vor.
   2. Mischen Sie die_{AgNO-3-Lösung} mit dem Algenextrakt, um einen Extraktanteil von 5 % bis 25 % (v/v) zu erhalten. Erhitze und rühre das Reaktionsgemisch bei der gewählten Temperatur (25°C–70°C) für die gewünschte Reaktionszeit (1–4 Stunden) um.
   3. Lass die Lösung 24 Stunden auf RT abkühlen. Sammeln Sie die Feststofffraktion nach der Zentrifugation und trocknen sie in einem Ofen, wie in den Schritten 1.3.5 und 1.3.6 beschrieben.

3. Synthese von AgNPs mit Earliella sp.

1. Kultursammlung und -pflege
   1. Übertragen aktiv wachsende Myzelfragmente von Earliella sp. auf Kartoffel-Dextrose-Agarplatten.
      HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete Pilzstamm wurde aus Umweltproben isoliert, die auf dem Campus des ESPOL in Ecuador gesammelt wurden. Das Isolat wurde taxonomisch anhand morphologischer Merkmale identifiziert und in der Kultursammlung des Biotechnologischen Forschungszentrums Ecuadors (CIBE, ESPOL) unter dem internen Code E2 aufbewahrt. Da dieser Stamm in einer institutionellen Sammlung aufbewahrt wird und nicht in einem internationalen Repository deponiert wurde, sind weder RRID noch externe Zugangsnummer verfügbar.
   2. Inkubieren Sie die Platten bei 28°C für 48 Stunden.
   3. Übertragen Sie ein Myzelfragment in Kartoffel-Dextrose-Brühe und brüten Sie die Kultur unter ständigem Rühren bei 150 U/min für 5 Tage aus.
      HINWEIS: Dieser Schritt fördert die Biomasseproduktion und die Sekretion extrazellulärer Metaboliten.
   4. Filtern Sie die Pilzkultur durch steriles Filterpapier, um die Myzelbiomasse von der extrazellulären Brühe zu trennen. Sammeln Sie das Filtrat für die anschließende NP-Synthese.
      HINWEIS: Die extrazelluläre Brühe enthält Biomoleküle, die während der AgNP-Synthese als Reduktions- und Stabilisierungsmittel fungieren.
2. Herstellung mykogener AgNPs
   HINWEIS: Erzeugen Sie 14 experimentelle Bedingungen, indem Sie pro Test einen Parameter variieren und dabei konstante Volumenverhältnisse zwischen Pilzbrühe und_{AgNO-3-Lösung} beibehalten. Bewerten Sie die_{AgNO-3-Konzentration} (1–10 mM), den pH-Wert (4–10 angepasst mit HCl oder NaOH), die Reaktionszeit (1–4 H) und die Temperatur (25°C–70°C).
   VORSICHT: Salzsäure (HCl) und Natriumhydroxid (NaOH) sind sehr korrosiv. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und führen Sie den pH-Wert langsam unter kontinuierlichem Rühren vor, um Spritzer und lokale Überhitzung zu vermeiden. Verwenden Sie 1 M Säure- oder Basenlösungen während der pH-Anpassung.
   1. Man mischt die pilzartige extrazelluläre Brühe mit einer AgNO-3-Lösung bei der gewünschten Konzentration (1–10 mM) mit einem Volumenverhältnis zwischen 2,5 % und 10 % (v/v), um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 50 ml zu erhalten. Passen Sie das Endreaktionsvolumen entsprechend dem getesteten Versuchszustand an.
   2. Rühren Sie das Reaktionsgemisch bei der gewählten Temperatur (25°C–70°C) für die gewünschte Reaktionszeit (1–4 Stunden) um. Lass die Lösung 24 Stunden auf RT abkühlen. Sammeln Sie die Feststofffraktion nach der Zentrifugation und trocknen sie in einem Ofen, wie in den Schritten 1.3.5 und 1.3.6 beschrieben.

4. Synthese von AuNPs unter Verwendung von C. metallidurans und S. oneidensis

1. Kultursammlung und -pflege
   1. Impfe gefrorene Zelllager, die in 20 % Glycerol bei −80°C entweder C. metallidurans CH34 oder S. oneidensis MR-1 erhalten sind, auf tryptische Sojaagarplatten unter aeroben Bedingungen. Inkubieren Sie die Platten bei 28°C für 24 Stunden.
   2. Wählen Sie aus jeder Platte eine einzelne Kolonie aus und inokulieren Sie sie unter aeroben Bedingungen in 250 ml tryptische Sojabrühe. Inkubieren Sie die Kultur bei 28 °C in einem Rotationsshaker, der mit 120 U/min arbeitet.
   3. Entnehmen Sie die Zellen in der stationären Phase nach 72 Stunden Inkubation, wenn die optische Dichte bei 610 nm (OD₆₁₀) etwa 1 erreicht. Zentrifugiere die Kulturen bei 10.000 × g für 10 Minuten bei ~20°C.
   4. Waschen Sie die gesammelten Pellets zweimal mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung. Konzentriere die gewaschenen Zellen auf einen OD_610-Wert von etwa 7.
   5. Erzeugen Sie anoxische konzentrierte Zelllager, indem Sie die Suspensionen entgasen und den Headspace mit_N2-Gas füllen.
2. Herstellung bakteriogener AuNPs
   HINWEIS: Verwenden Sie eine fraktioniert-faktorielle Matrix, um den Einfluss von Umweltfaktoren auf die AuNP-Synthese zu bewerten²⁵. Konstruiere die Matrix mit 7 Faktoren auf 2 Ebenen, die nach früheren Studien ausgewählt wurden^26,27. Ordne die Experimente in einer orthogonalen Matrix an und randomisiere die Reihenfolge der Versuche, um den Versuchs-Kombinations-Bias zu minimieren. Die resultierende experimentelle Reihenfolge wird präsentiert in Tabelle 1.
   1. Lösen Sie Goldchloridtrihydrat (HAuCl₄) in deionisiertem Wasser, um eine Lagerlösung mit 5 g L⁻¹ herzustellen.
      VORSICHT: HAuCl₄ ist giftig und ein starkes Oxidationsmittel. Führen Sie alle Lösungen in einer zertifizierten chemischen Abgashaube und tragen Sie dabei geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille. Vermeiden Sie Kontakt mit organischen Materialien und entsorgen Sie Abfälle gemäß institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle.
   2. Bereiten Sie die experimentellen Reaktoren vor, indem die Lagerlösung auf die Zielkonzentration in 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung verdünnt und der pH-Wert entsprechend den in Tabelle 1 aufgeführten experimentellen Bedingungen angepasst wird.
   3. Dosieren Sie 50 ml der vorbereiteten Metalllösung in saubere 120-mL-Serumflaschen. Verschließen Sie jede Flasche sofort mit einem Butylgummi-Stopfen.
   4. Sichern Sie den Stopper mit einer Aluminium-Crimp-Dichtung und einem Handcrimper. Sterilisieren Sie die versiegelten Serumflaschen durch Autoklaven bei 121°C für 21 Minuten.
   5. Lassen Sie die Flaschen auf RT abkühlen und inspizieren Sie jede Flasche visuell auf Niederschlag.
      HINWEIS: Entsorgen Sie alle Flaschen, die sichtbare Niederschlagsausfälle zeigen, und bereiten Sie Ersatzreaktoren vor.
   6. Etablierung anoxischer Bedingungen
      1. Verbinden Sie jede sterilisierte Serumflasche mit einem Gaskrümmersystem, das mit einer hochreinen Stickstoffquelle (N₂) und einer Vakuumpumpe ausgestattet ist.
      2. Erzeugen Sie einen anoxischen Headspace, indem Sie 21 aufeinanderfolgende Spülzyklen für jeden Reaktor durchführen, der laut Tabelle 1 anoxische Bedingungen erfordert. Während jedes Zyklus wird Vakuum aufgetragen und anschließend etwa 30 Sekunden lang Stickstoff nachgefüllt, bis der Innendruck auf ungefähr atmosphärischen Druck (~1 atm) zurückkehrt.
         HINWEIS: Eine direkte Überprüfung anoxischer Bedingungen ist nicht erforderlich; Jedoch kann eine Headspace-Gasanalyse, wie die Gaschromatographie, bei Bedarf zur Bestätigung der Sauerstoffentfernung verwendet werden.
         VORSICHT: Stickstoffgas kann Sauerstoff verdrängen und in geschlossenen Räumen eine Erstickungsgefahr darstellen. Sorgen Sie für ausreichende Laborbelüftung und überprüfen Sie vor der Nutzung sichere Gasleitungsanschlüsse.
      3. Halten Sie die Reaktoren nach dem letzten Reinigungszyklus unter einem leichten positiven_N2-Druck .
      4. Beschriften Sie die Reaktoren von 1 bis 8 gemäß der experimentellen Reihenfolge. Beschrifte zum Beispiel die fünfte experimentelle Bedingung als R5.
   7. Hinzufügung von Elektronendonoren und Inokulation
      1. Injizieren Sie das erforderliche Volumen steriler anoxischer flüssiger Elektronendonorlösung, wie Natriumlaktat, gemäß Tabelle 1 mit einer sterilen Spritze und Nadel in die flüssige Phase der vorgesehenen Reaktoren.
      2. Injizieren Sie das erforderliche Volumen des gasförmigen Elektronenspenders, wie H₂, mit einer gasdichten Spritze in den Kopfraum des vorgesehenen Reaktors.
      3. Inokulieren Sie alle biotischen Reaktoren, indem Sie aseptisch das erforderliche Volumen konzentrierter anoxischer mikrobieller Bestandskultur in die flüssige Phase injizieren.
         HINWEIS: Lagern Sie konzentrierte Stockkulturen vor der Impfung bei 4°C aufbewahrt, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
   8. Aufbau von Kontrollexperimenten
      1. Bereiten Sie eine abiotische Kontrolle vor, indem Sie alle in Schritt 4.2 beschriebenen Schritte befolgen und das mikrobielle Inokulum durch ein gleichwertiges Volumen sterilen anoxischen Kulturmediums oder Puffers ersetzen.
      2. Bereiten Sie eine abgestorbene Zellkontrolle vor, indem Sie alle in Schritt 4.2 beschriebenen Schritte mit einem durch Autoklaven sterilisierten Inokulum befolgen.
         HINWEIS: Verwenden Sie die Kontrollen, um abiotische Metallreduktion und Biosorption zu berücksichtigen. Bereite die Kontrolle der abgestorbenen Zellen vor, indem lebensfähige Zellbestände bei 121°C für 21 Minuten autoklaviert werden, um den Beitrag aktiver mikrobieller Mechanismen zu bewerten.
   9. Inkubations- und Reaktionszeit
      1. Stellen Sie alle Serumflaschen in temperaturkontrollierte Inkubatoren.
      2. Passen Sie die Inkubationstemperatur entsprechend den in Tabelle 1 angegebenen experimentellen Bedingungen an.
      3. Stellen Sie die Inkubatoren auf Rotations-Shakerplattformen und inkubieren Sie die Reaktoren bei 120 U/min.
      4. Lassen Sie die Reaktionen 72 Stunden dauern.
         HINWEIS: Pausieren Sie das Experiment nach der Inkubation und lagern Sie die Serumflaschen bei 4°C bis zur Probenverarbeitung.
         HINWEIS: Quantifizieren Sie optional Restlösungsmetalle nach der NP-Biosynthese mittels induktiv gekoppelter optischer Plasma-Emissionsspektroskopie, um die Effizienz der Metallentfernung zu bewerten und NP-Bildung von Restlösungsstoffen zu unterscheiden.
3. Replikation optimaler Bedingungen
   1. Identifizieren Sie den Reaktorzustand, der mit der maximalen Metallentfernung verbunden ist, nach der primären Siebung und Datenanalyse.
   2. Replizieren Sie den gewählten optimalen Zustand in drei unabhängigen Reaktorflaschen, um die Reproduzierbarkeit zu bestätigen.
   3. Durchführung der Vorbereitungs-, Reaktoraufbau- und Inkubationsprozeduren für die dreifachen Verifikationsexperimente gemäß den Schritten 4.1 und 4.2.
      HINWEIS: Nach Abschluss der Experimente werden alle gelösten Lösungen vorübergehend als wässriger Abfall gelagert und gekennzeichnet, bis sie von zertifizierten Abfallwirtschaftsunternehmen gemäß dem nationalen Organischen Umweltkodex und den institutionellen technischen Richtlinien entsorgt werden.

Reaktor / Bakterien	Temperatur (°C)	Atmosphäre	Elektronendonor	Optische Dichte (OD610)	pH	[Gold] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tabelle 1: Fraktionelles faktorielles experimentelles Design zur bakteriogenen AuNP-Synthese. Diese Tabelle fasst die experimentellen Bedingungen zusammen, die für die AuNP-Synthese mit S. oneidensis MR-1 (SOM) oder C. metallidurans CH34 (CMC) bewertet wurden. Variablen umfassten Inkubationstemperatur, Headspace-Atmosphäre, Elektronenspender, optische Dichte des Inokulums (OD₆₁₀), Lösungs-pH und anfängliche^Au-3+- Konzentration.

5. Charakterisierung von AgNPs und AuNPs

HINWEIS: Verwenden Sie ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie als zugängliche Methode, um die NP-Bildung durch Oberflächenplasmonresonanz zu bestätigen. Verwenden Sie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um NP-Morphologie und -Größe direkt zu bewerten. Zusätzliche physikochemische Charakterisierung kann mit komplementären Techniken wie dynamischer Lichtstreuung (DLS), Röntgenbeugung (XRD), Fourier-Transform-Infrarot-(FTIR)-Spektroskopie und energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS) durchgeführt werden, um Größenverteilung, Kristallinität, Oberflächenchemie und Elementzusammensetzung zu bewerten, wenn eine umfassendere Charakterisierung erforderlich ist^28,29.

1. UV-Vis-Spektroskopie
   1. Instrumentenaufbau
      1. Schalten Sie das UV-Vis-Spektrophotometer ein und lassen Sie das Instrument mindestens 15 Minuten aufwärmen, um die Signalstabilität zu gewährleisten.
      2. Wählen Sie den spektralen Scan-Modus und konfigurieren Sie den Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm mit einem Datenintervall von 1 nm.
2. Probenvorbereitung
   1. Sammeln Sie Aliquoten von frisch synthetisierten AgNP- oder AuNP-Suspensionen. Verdünnen Sie die Proben bei Bedarf mit destilliertem Wasser, um die Absorptionswerte im linearen Detektionsbereich zu halten.
3. UV-Vis-Messung von NPs
   1. Führen Sie eine Basiskorrektur mit destilliertem Wasser als Blanklösung durch.
   2. Übertragen Sie die vorbereitete Probe in eine Cuvette, legen Sie die Cuvette in den Probenhalter und zeichnen Sie das UV-Vis-Spektrum im Bereich von 300–800 nm auf.
   3. Identifizieren Sie das SPR-Band, das der NP-Bildung entspricht.
      HINWEIS: AgNPs zeigen typischerweise SPR-Bänder zwischen 405 und 425 nm, während AuNPs in der Regel SPR-Bänder zwischen 520 und 550 nm aufweisen.
4. Transmissionselektronenmikroskopie
   HINWEIS: Analysieren Sie die Morphologie und Größe des NP mit TEM, das mit 80 kV betrieben wird und mit einer hochauflösenden Digitalkamera ausgestattet ist.
   1. Transferiere 1,5 ml NP-Suspension in ein Zentrifugenrohr und zentrifugiere bei 5000 × g für 5 Minuten bei RT.
   2. Entsorge das Supernatant und behalte das Pellet.
   3. Geben Sie 1 ml Fixierungslösung mit 4 % Paraformaldehyd und 5 % Glutaraldehyd, hergestellt in 0,1 m Cacodylatpuffer, dem Pellet zu. Inkubiere die Probe 25 Stunden bei RT. Dann wird das Pellet über Nacht mit 0,1 M Natriumkakodylsäurepuffer gewaschen.
   4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 5000 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie das Überlagerungsmittel.
   5. Fügen Sie 1 ml 1 % (w/v) Osmiumtetroxid (OsO₄) hinzu, das in einem 0,1 M Natriumkakodyl-Puffer zur Fixierung für 3 Stunden vorbereitet wird.
      VORSICHT: OsO₄ ist hochgiftig und volatil. Führen Sie alle Lösungen ausschließlich in einer zertifizierten chemischen Abgashaube und tragen Sie dabei geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille.
   6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 5000 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie das Überlagerungsmittel.
   7. Dehydrieren Sie die Probe mit einer gradualen Ethanolserie. Füge 50 % Ethanol hinzu und inkubiere 15 Minuten. Wiederholen Sie das Verfahren nacheinander mit 70 % und 90 %. Vollständige Dehydrierung mit drei aufeinanderfolgenden Inkubationen in absolutem Ethanol für 30 Minuten pro Inkubation.
   8. Legen Sie die Kugel gemäß den Anweisungen des Herstellers in Epoxidharz bei RT ein.
   9. Bereiten Sie halbdünne Schnitte (~1 μm) vor und färben Sie die Schnitte mit Toluidinblau zur ersten Beobachtung.
   10. Schneiden Sie ultradünne Schnitte (~60 nm) mit einem Diamantmesser und färben Sie die Schnitte mit Uranylacetat gefolgt von Bleicitrat.
   11. Montiere die Abschnitte auf TEM-Gittern und lade sie in das Transmissionselektronenmikroskop.
   12. Erwache TEM-Bilder, um die NP-Morphologie und -Größe zu bewerten.

Ergebnisse

AgNPs wurden erfolgreich durch grüne und biosynthetische Wege mit verschiedenen biologischen Reduktionsmitteln synthetisiert, und für jede Methode wurden ideale Synthesebedingungen identifiziert. In der grünen Synthese, vermittelt durch P. guayaquilensis-Blattextrakt, bestanden die optimalen Bedingungen aus einer AgNO-3-Konzentration von 5 mM, einem Extrakt-zu-Metall-Lösungsverhältnis von 25 % (v/v), einer Reaktionstemperatur von 80°C und einer Rührzeit von 60 Minuten, gefolgt v...

Diskussion

Beim Vergleich der bewerteten Synthesewege hinsichtlich Machbarkeit, NP-Größenkontrolle, Betriebskosten, Reproduzierbarkeit und Gesamtprozesseffizienz zeigte die pflanzvermittelte Synthese mit P. guayaquilensis-Blattextrakt das günstigste Gleichgewicht unter den untersuchten AgNP-Synthesemethoden. Dieses Protokoll ermöglichte eine verbesserte Kontrolle über die NP-Größe durch systematische Optimierung und direkte mikroskopische Charakterisierung unter milden Bedingungen ohne lan...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Absolutes Ethanol	Merck	E7023	TEM Dehydrationsreihe
Aluminium Crimpverschlüsse	Dwk Wheaton	224178-01	Für Serumflaschen
Bernsteinfarbene Glasflaschen	Duran	2180154	Lichtgeschützte Lagerung
ATR-FTIR-Spektrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spektralbereich: 300–3600 cm-1
Autoklav	Yamato	SM300	Sterilisation bei 121 °C
Butylgummistopfen	Dwk Kimble	73827-21	Gasdichtes Versiegeln
Zentrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Tischzentrifuge
Chlorgoldsäuretrihydrat (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Goldvorläufer
Diamantmesser	Aurion	Dyatom 45	Ultradünne TEM-Schnittführung
Destilliertes oder deionisiertes Wasser	Methrom	N/A	Lösungsvorbereitung
Epoxydharz (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM-Einbettungsmittel
Filterpapier, qualitative Qualität 1	Merck Whatman	WHA1001110	Porengröße: 11 µm; Durchmesser: 110 mm
Fourier-Transform-Infrarot-Spektrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spektralbereich: 300–3600 cm-1
Gas-Manifold-System	Eigenbau	N/A	Für Spülzyklen
Gasdichte Spritze	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyd	VWR	219859510	5% Glutaraldehyd, 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	20% Stammerhaltung
Handcrimper	Biomed	USYGQ-20Z	Crimpverschluss von Serumflaschen
Handmühle/-schleifer	Corona	L10000	Zerkleinerung von Pflanzenbiomasse
Salzsäure (HCl)	Merck	320331	pH-Wert-Anpassung
Wasserstoff (H2) Gas	Linde	Industriequalität	Elektronendonor-Gas
ICP-OES-System	Varian	Vista-MPX	Metallquantifizierung
Inkubator	Memmert	SM 400	Temperaturgesteuerte Inkubation
Laborofen	Barnstead	M100	Trocknung von Nanopartikeln
Blei-Zitrat	Merck	7398	TEM-Färbung
Salpetersäure (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Säurereagenz
Stickstoff (N2) Gas	Linde	Industriequalität	Anoxotische Bedingungen
Osmiumtetroxid (OsO4)	Merck	201030	TEM-Fixierung
Paraformaldehyd	VWR	101176-014	5% Glutaraldehyd, 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer
Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)	Merck	110130	Pilzkultivierung
Kartoffel-Dextrose-Bouillon (PDB)	Merck	P6685	Mikrobiologisches Medium
Rotary-Shaker	JoanLab	OS-20Pro	Inkubation bei kontrollierter Agitation
Serumflaschen (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilikatglas
Silbernitrat (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS-Reagenz, ≥99,0%
Natrium-Cacodylat-Puffer	VWR	11650	5% Glutaraldehyd, 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer
Natriumchlorid (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0,9% Waschlösung
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH-Wert-Anpassung
Natriumlactat	Sigma-Aldrich	L7022	Elektronendonor/Kohlenstoffquelle
Sterile Spritzen und Nadeln	BD	Verschiedene	Sterile Flüssigkeitshandhabung
Rührendplatte	Biologix	01-310X	Erhitzen und Rühren
Toluidinblau	EMS	DcU-10	Färbung von Halbdünnschnitten
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Ausgestattet mit hochauflösender Digitalkamera
Schalentrockner mit Zwangsluftstrom	Handgemacht	N/A	Biomassetrocknung bei 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Mikrobiologisches Medium
Tryptic Soy Bouillon (TSB)	Carl Roth	X938.1	Mikrobiologisches Medium
Uranylacetat	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM-Färbung
UV–Vis-Spektrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis-Spektralanalyse
Vakuumpumpe	KNF oder gleichwertig	N 820 G	Für anoxotische Bedingungen
Biologische Materialien
Biologisches Material	Quelle	Identifikator	Kommentare/Beschreibung
Acanthophora spicifera	Lokale Sammlung	N/A	Marine Algenbiomasse
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Bakterienstamm
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Institutionelle Pilzsammlung
Psidium guayaquilensis	Lokale Sammlung	N/A	Wilde Pflanzenbiomasse
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Kultursammlungsstamm