Diese retrospektive Studie präsentiert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die frühe Blutentnahme nach der Aufnahme, die Messung von Serumzytokinen und Toll-ähnlichen Rezeptoren, die Genotypisierung entzündlicher Genpolymorphismen sowie die Bewertung des Infektionsrisikos bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung.
Forschungsartikel
Zytokine und entzündliche Genpolymorphismen, die mit nosokomialer Lungeninfektion nach spontaner intrazerebraler Blutung assoziiert sind
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nosokomiale Lungenentzündung ist eine häufige Komplikation nach spontaner intrazerebraler Blutung und kann die neurologische Genesung verschlechtern, den Krankenhausaufenthalt verlängern und die klinische Belastung erhöhen. Diese retrospektive klinische Laborstudie präsentiert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Bewertung der immungenetischen Profile von entzündlichen Biomarkern und Wirts, die mit einer nosokomialen Lungeninfektion nach primärer spontaner intrazerebraler Blutung assoziiert sind. Die Patienten werden danach klassifiziert, ob eine nosokomiale Lungeninfektion nach der Aufnahme auftritt. Peripheres venöses Blut wird in der frühen Zeit nach der Aufnahme unter standardisierten präanalytischen Bedingungen gesammelt. Das Serum wird getrennt, aliquotiert und für enzymgebundene Immunsorbent-Assay-Messungen von IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 und TLR9 gelagert. Parallel dazu wird genomische DNA aus antikoaguliertem Vollblut extrahiert und für die Polymorphismus-Polytypisierung ausgewählter zytokin- und toll-ähnlicher Rezeptor-bezogener Loci verwendet. Der Arbeitsablauf umfasst außerdem Qualitätskontrollverfahren für die Probenhandhabung, doppelte ELISA-Messungen, DNA-Reinheitsbewertung, Genotypaufrufe und wiederholte Genotypisierung. Die statistische Analyse umfasst den Vergleich klinischer Eigenschaften und Biomarker-Niveaus zwischen Gruppen, Hardy-Weinberg-Gleichgewichtstests, logistische Regressionsanalysen für Genotyp- und Allelassoziationen, Anpassung für relevante klinische Kovariaten und Korrektur der Falschentdeckungsrate für mehrere genetische Vergleiche. Dieser kombinierte klinische, inflammatoriske und immungenetische Workflow kann helfen, Infektionsrisikoprofile nach einer spontanen intrazerebralen Blutung zu charakterisieren, obwohl eine prospektive multizentrische Validierung vor der routinemäßigen klinischen Anwendung weiterhin erforderlich ist.
Einleitung
Die spontane intrazerebrale Blutung (ICH) ist ein schwerer Subtyp des Schlaganfalls, der durch einen nicht-traumatischen Riss der Gehirngefäße verursacht wird und weiterhin eine Hauptursache für neurologischen Tod und Behinderungen ist. Klinisch wird ICH üblicherweise als primär oder sekundär klassifiziert. Primäre ICH ist für die meisten Fälle verantwortlich und steht hauptsächlich im Zusammenhang mit der hypertensiven Arteriopathie oder zerebraler Amyloidangiopathie1. Im Gegensatz dazu ist sekundäre ICH mit strukturellen oder hämatologischen Ursachen verbunden, darunter Aneurysmen, arteriovenöse Malformationen, Moyamoya-Krankheit und Gerinnungsstörungen. Obwohl ICH einen geringeren Anteil aller Schlaganfallereignisse ausmacht als der ischämische Schlaganfall, führt er eine überproportional hohe kurzfristige Sterblichkeit und langfristige funktionelle Belastung(2,3,4,5).
Unter den wichtigsten Komplikationen im Krankenhaus nach ICH ist die nosokomiale Lungenentzündung besonders häufig und klinisch bedeutsam. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Lungeninfektion bei einem erheblichen Anteil der hospitalisierten Patienten nach Schlaganfall oder intrazerebraler Blutung auftreten kann und mit längeren Krankenhausaufenthalten, höherer medizinischer Belastung, schlechterer neurologischer Genesung und erhöhter Sterblichkeit assoziiert ist. Die klinische Bedeutung dieser Komplikation geht über das rein rein rein respiratorische Management hinaus. Verringertes Bewusstsein, eingeschränkte Schluck- und Hustenreflexe, Immobilisierung, mechanische Atemwegsunterstützung und invasive Entwässerungsverfahren können das Infektionsrisiko während der akuten Phase nach ICH erhöhen. Gleichzeitig kann eine Lungeninfektion die systemische Entzündung weiter verschlimmern, die Sauerstoffversorgung beeinträchtigen und die neurokritische Versorgung erschweren, wodurch sekundäre Verletzungsprozesse verstärkt werden.
Diese Beziehung ist biologisch plausibel, da ICH nicht nur ein fokales zerebrovaskuläres Ereignis ist, sondern auch ein Auslöser systemischer Immundysregulation. Eine akute Gehirnblutung kann entzündliche Kaskaden aktivieren, die angeborene Immunsignale verändern und das Gleichgewicht zwischen Neuroinflammation und peripherer Wirtsabwehr stören. In diesem Zusammenhang können einige Patienten auch unter ähnlicher klinischer Behandlung anfälliger für krankenhauserworbene Infektionen werden. Daher sollte eine Lungeninfektion nach ICH nicht ausschließlich als Folge von Bettkontakt oder unterstützender Versorgung betrachtet werden; Sie kann auch Unterschiede in der Aktivierung der Entzündung des Wirts und der Immunreaktion widerspiegeln.
Trotz der klinischen Relevanz dieser Komplikation bleiben praktische Ansätze zur frühen Risikostratifizierung begrenzt9. Bestehende klinische Risikostratifizierungsansätze für post-ICH-Lungeninfektionen basieren im Allgemeinen auf Variablen am Bett und Aufnahme, wie neurologische Schwere oder Alter, Schluckbeeinträchtigung, Begleiterkrankungen, invasive Verfahren und die Dauer der Geräteexposition. Diese Werkzeuge sind klinisch nützlich, da sie schnell in Notaufnahmen, Intensivstationen oder neurokritischen Einrichtungen eingesetzt werden können. Allerdings erklären klinische Variablen allein möglicherweise nicht vollständig, warum Patienten mit vergleichbarer neurologischer Schwere und ähnlicher Behandlungsexposition unterschiedliche Infektionsergebnisse zeigen. Entzündungsbiomarker und immungenetische Faktoren des Wirts können daher zusätzliche Informationen über die biologische Anfälligkeit liefern, insbesondere in der frühen Zeit nach der Aufnahme, wenn präventive Überwachung und Atemwegsmanagement getroffen werden.
Zytokine sind zentrale Vermittler von Immun- und Entzündungsreaktionen, und Toll-like-Rezeptor-(TLR)-Wege spielen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung von Krankheitserregern und der angeborenen Immunaktivierung. Serum-Zytokin- und TLR-Proteinmessungen können einen Überblick über die frühe systemische Entzündungsaktivierung liefern, während ausgewählte Immungen-Polymorphismen stabilere Unterschiede in der Zytokinproduktion, der Rezeptor-Signalübertragung oder der Entzündungsregulation widerspiegeln können. Im Vergleich zur klinischen Beurteilung allein kann ein kombinierter Biomarker- und Polymorphismus-Workflow sowohl den aktuellen entzündlichen Zustand als auch die zugrunde liegende Immunantwort jedes Patienten erfassen. Dieser Ansatz soll die klinische Beurteilung am Bett nicht ersetzen, sondern sie ergänzen, indem Labor- und wirtsgenetische Informationen hinzugefügt werden, die helfen können, Patienten zu identifizieren, die eine genauere Überwachung der Infektion nach einer spontanen ICH benötigen.
Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass Patienten mit spontaner ICH, die eine nosokomiale Lungeninfektion entwickeln, ein ausgeprägtes Entzündungsprofil sowie eine andere Verteilung ausgewählter immunbezogener genetischer Polymorphismen aufweisen als Patienten, die weiterhin frei von Infektion sind. Um diese Hypothese zu testen, analysierte die vorliegende retrospektive klinische Laborstudie frühe Serumzytokine nach der Aufnahme, Serumproteinwerte von TLR2, TLR4 und TLR9 sowie ausgewählte entzündliche Genpolymorphismen bei Patienten mit primärer spontaner ICH. Der Workflow verwendet peripheres Blut, das während akuter Krankenhausaufenthalte entnommen wurde, ELISA-basierte Proteinquantifizierung, PCR-RFLP-basierte Genotypisierung und statistische Vergleiche zwischen Patienten mit und ohne nosokomiale Lungeninfektion. Ziel war es, einen reproduzierbaren Rahmen zur Charakterisierung von entzündlichen und wirtsgenetischen Profilen im Zusammenhang mit Infektionsrisiko bereitzustellen und so die frühere Erkennung von Hochrisikopatienten im akuten Krankenhausbereich zu unterstützen.
Protokoll
Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des angeschlossenen Krankenhauses der Jiaxing-Universität, des ersten Krankenhauses von Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China (Genehmigungsnummer 2025-LP-599) genehmigt. Alle Verfahren, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt waren, wurden gemäß den institutionellen Anforderungen und den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Vor der Probenentnahme wurde eine schriftliche informierte Zustimmung zur Blutentnahme und Datennutzung von allen Teilnehmern und/oder deren gesetzlich bevollmächtigten Vertretern eingeholt.
Alle kommerziellen Bausätze, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Instrumente, Software, Hersteller, Katalognummern und wichtige Betriebsspezifikationen, die in diesem Workflow verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Studienumfang, Eignung und Patientengruppe
Diese Studie wurde als retrospektive klinische Kohortenanalyse mit einem einzigen Zentrum durchgeführt, bei der Patienten mit primärer spontaner intracerebraler Blutung (ICH) aufgenommen wurden, die zwischen Mai 2019 und September 2024 in das Notfall- und Intensivzentrum oder die Intensivstation des angeschlossenen Krankenhauses der Jiaxing-Universität, dem ersten Krankenhaus von Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China, aufgenommen wurden. Die Diagnose ICH wurde durch eine Schädel-Computertomographie oder Magnetresonanztomographie gemäß den chinesischen Leitlinien zur Diagnose und Behandlung von Zerebralblutungen (2019)10 bestätigt.
Die Patienten waren berechtigt, wenn sie bildgebend bestätigte primäre spontane ICH hatten, innerhalb von 3 Tagen nach Symptombeginn aufgenommen wurden und vollständige wichtige klinische Variablen sowie verfügbare periphere Blutproben zur Messung der entzündlichen Biomarker und genetische Analysen vorsahen. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie traumatische intrakranielle Blutungen, sekundäre ICH, eine Lungeninfektion vor der Aufnahme oder innerhalb von 48 Stunden nach der Aufnahme, Entlassung gegen ärztlichen Rat oder Tod innerhalb von 48 Stunden nach der Aufnahme, eine Vorgeschichte von Malignität oder Autoimmunerkrankungen oder unvollständige wichtige klinische, laborbasierte oder genotypische Aufzeichnungen aufwiesen. Nach dem Screening erfüllten 360 Patienten die Zulassungskriterien und wurden in die Endanalyse einbezogen. Unter ihnen entwickelten 180 Patienten während des Krankenhausaufenthalts eine nosokomiale Lungenentzündung, 180 Patienten nicht. Die Patienten wurden der Gruppe für Lungeninfektionen oder der Gruppe ohne Lungeninfektion zugeordnet, je nachdem, ob eine nosokomiale Lungeninfektion nach der Aufnahme auftrat.
Vor der endgültigen Gruppierung wurden bildgebende Diagnose, Aufnahmezeit, Infektionszeitpunkt, Verfügbarkeit von Blutproben sowie die Vollständigkeit der klinischen und Laborunterlagen überprüft. Dieser Schritt wurde eingesetzt, um Fehlklassifizierungen zu reduzieren und sicherzustellen, dass alle eingeschlossenen Fälle vollständige Daten für den klinischen Vergleich, die Messung entzündlicher Biomarker und die Genotypisierung enthielten.
Definition der nosokomialen Lungeninfektion
Die nosokomiale Lungeninfektion wurde auf der Grundlage radiologischer Evidenz in Kombination mit klinischen Kriterien11 definiert. Die radiologische Bestätigung erforderte eine neue oder fortschreitende Infiltration, Konsolidierung oder Schleifglasläsion auf der Röntgen- oder Computertomographie. Zusätzlich mussten mindestens zwei der folgenden Kriterien vorliegen: Körpertemperatur > 38 °C, eitrige Atemsekrete oder eine abnormale periphere Anzahl weißer Blutkörperchen mit weißen Blutkörperchen < 4 × 109/L oder > 10 × 109/L.
Lungeninfektionen, die vor der Aufnahme vorhanden oder innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Aufnahme diagnostiziert wurden, wurden nicht als nosokomiale Lungeninfektion klassifiziert. Die Infektionsklassifikation wurde anhand radiologischer Berichte, Körpertemperaturaufzeichnungen, Dokumentation von Atemsekreten, peripheren Blutbildergebnissen und klinischen Diagnoseunterlagen bestätigt.
Biosicherheit und Abfallentsorgung
Menschliches Blut, Serum und blutbasierte DNA wurden unter den Standardvorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe 2 behandelt. Das Laborpersonal trug Handschuhe, Labormäntel, Masken und Schutzbrillen während der Blutbehandlung, Serumaliquotierung, ELISA-Tests, DNA-Extraktion, PCR-Präparation, Gelelektrophorese, Restriktionsverdauung und UV-Visualisierung. Die Blutröhrchen wurden vor der Verarbeitung auf Leckage oder Bruch überprüft. Die Zentrifugation erfolgte mit verschlossenen Röhren oder, wo verfügbar, versiegelten Zentrifugenschaufeln.
Scharfe Gegenstände wurden sofort in genehmigte Behälter entsorgt. Blutkontaminierte Schläuche, Pipettenspitzen, Handschuhe, ELISA-Platten und andere Einwegverbrauchsmaterialien wurden als biologischer Laborabfall entsorgt. Flüssiger biologischer Abfall wurde gemäß institutionellen Verfahren vor der Entsorgung desinfiziert. Agarose-Gele, Polyacrylamid-Gele, Farbstoffreagenzien und elektrophorese-bezogene Materialien wurden gemäß institutionellen Anforderungen an chemische und Laborabfälle entsorgt.
PCR-Reagenzienpräparation, Hinzufügen von DNA-Vorlagen, verstärkter Produkthandhabung, Restriktionsverdauung und Gelelektrophorese wurden so weit wie möglich getrennt, um die Kontamination zu reduzieren. Aerosolresistente Pipettenspitzen wurden für PCR- und DNA-Handhabung verwendet. Die UV-Visualisierung erfolgte ausschließlich mit einem Schutzschild oder Gel-Dokumentationssystem, und direkte Exposition von Augen oder Haut gegenüber UV-Licht wurde vermieden.
Periphere Blutentnahme und Probenaufbereitung
Um die präanalytische Variation zu verringern, wurden um 08:00 Uhr am Morgen nach der Aufnahme 10 ml peripheres venöses Blut entnommen, nach einem nächtlichen Fasten von mindestens 12 Stunden. 5 ml Blut wurden in ein einfaches Vakuumröhrchen zur Serumpräparation entnommen, und die restlichen 5 ml wurden in ein heparinisiertes Rohr zur genomischen DNA-Extraktion entnommen.
Vor der Bearbeitung wurde jede Sonde auf Patientenkennung, Entnahmezeit, Tubentyp, Blutvolumen, Leckage, sichtbare Gerinnung und grobe Hämolyse überprüft. Proben mit falscher Markierung, unzureichendem Blutvolumen, Röhrenlecks oder sichtbarer Gerinnung im antikoagulierten Röhrchen wurden von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen. Das Blut im einfachen Röhrchen wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten gerinnt und dann bei 1.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Serumsupernatant wurde ohne Störung der Zellschicht in sterile Polypropylenröhren mit niedriger Proteinbindung übertragen, in 0,5 mL-Fraktionen aliquotiert und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert.
Proben mit sichtbarer moderater oder schwerer Hämolyse wurden von der ELISA-basierten Quantifizierung ausgeschlossen. Leicht hemolysierte Proben wurden aufgenommen und nicht für die primäre Zytokinanalyse verwendet. Proben mit sichtbarer Trübung, offensichtlicher Lipämie, unzureichendem Restvolumen oder wiederholter Frost-Tau-Exposition wurden vor den Tests markiert. Kein Serum-Aliquot durchlief mehr als einen Frost-Tau-Zyklus vor der Analyse.
Zytokinquantifizierung durch ELISA
Serumkonzentrationen von IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ und TNF-α wurden mit kommerziell erhältlichen menschlichen Sandwich-ELISA-Kits gemessen, die für Serumproben validiert wurden. Serumaliquoten wurden aufgetaut, vorsichtig gemischt und vor dem Laden auf Hämolyse, Trübung, Lipämie, unzureichendes Volumen und Frost-Tau-Vorgeschichte untersucht.
Standards, Blankwellen und Serumproben wurden doppelt geladen. Standardkurven wurden auf jeder Platte durch serielle Verdünnungen der Standardkonzentrationen und eine Blank-Steuerung gemäß den Bausätzen erzeugt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen, mit einer Referenzkorrektur bei 570 nm, unter Verwendung eines kalibrierten Mikroplattenlesers. Die Konzentrationen wurden mittels Anpassung der logistischen Kurve mit vier Parametern berechnet.
Assay-Ergebnisse wurden nur akzeptiert, wenn die Standardkurve ein angemessenes Konzentrations-Antwort-Muster zeigte, leere Bohrlöcher einen niedrigen Hintergrund zeigten und der doppelte Proben-Variationskoeffizient ≤ 10 % betrug. Proben mit doppelter CV > 10 % wurden aus dem ursprünglichen Serum-Aliquot erneut getestet, sobald genügend Volumen vorhanden war. Proben außerhalb des zuverlässigen Standardkurvenbereichs wurden gemäß den Kit-Anweisungen verdünnt oder wiederholt. Platten mit uneinheitlichen Normen, übermäßigem Hintergrund oder offensichtlichen Randeffekten wurden wiederholt.
Die niedrigeren analytischen Detektionsgrenzen für die Datenakzeptanz betrugen 2,0 pg/mL für IL-1β, 1,5 pg/mL für IL-6, 2,0 pg/mL für IL-10, 3,0 pg/mL für IL-17, 4,0 pg/mL für IFN-γ und 2,5 pg/mL für TNF-α. Die endgültigen Zytokinwerte wurden vor der statistischen Analyse mit Probenkennungen, Plattenkarten, doppelten Auslesedaten und Probenqualitätsnotizen abgeglichen.
Quantifizierung von Serum TLR2, TLR4 und TLR9 durch ELISA
Die Serumproteinwerte TLR2, TLR4 und TLR9 wurden mit kommerziell erhältlichen humanen ELISA-Kits gemessen, die für Serumproben validiert waren. Serumproben wurden aufgetaut, sanft gemischt und nach denselben Qualitätskriterien für die Zytokinmessung inspiziert.
Normen, Leerbrunnen und Serumproben wurden doppelt analysiert. Die Platten wurden bei 450 nm mit Referenzkorrektur bei 570 nm abgelesen, und die Konzentrationen wurden mittels vierparametriger logistischer Regression berechnet. Die Ergebnisse wurden akzeptiert, wenn die Standardkurve gültig war, leere Brunnen im erwarteten Hintergrundbereich lagen und das doppelte CV ≤ 10 % betrug. Proben, die diese doppelte CV-Schwelle überschritten, wurden erneut getestet, wenn genügend Proben vorhanden waren.
Die niedrigeren analytischen Detektionsgrenzen, die für die Akzeptanz des Ergebnisses verwendet wurden, betrugen 0,10 ng/mL für TLR2, 0,12 ng/mL für TLR4 und 0,15 ng/mL für TLR9. Die endgültigen TLR2-, TLR4- und TLR9-Werte wurden vor der statistischen Analyse mit Stichprobenkennungen, Plattenkarten, doppelten Ausleseaufzeichnungen und Stichprobenqualitätsnotizen überprüft.
Genomische DNA-Extraktion
Genomische DNA wurde aus heparin-antikoaguliertem Vollblut mit einem auf Siliziumdioxid basierenden Blut-DNA-Extraktionskit extrahiert. Vor der Entnahme wurden antikoagulierte Blutproben auf korrekte Markierung, ausreichendes Volumen, sichtbare Gerinnung, Leckage und Lagerzustand überprüft.
Die Reinheit und Konzentration der DNA wurden mittels Spektrophotometrie bewertet. Für die nachgelagerte PCR-Verstärkung wurden nur Proben mit einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,80 und 2,00 akzeptiert. Proben außerhalb dieses Bereichs wurden nach vorsichtigem Mischen neu vermessen. Wenn das abnormale Reinheitsverhältnis bestand, wurde die DNA-Entnahme wiederholt, wenn genügend Vollblut vorhanden war.
DNA wurde mit nukleasefreiem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 50 ng/μL verdünnt und bei -20 °C bis zur PCR-Amplifikation gespeichert. Vor der PCR-Einrichtung wurde jede DNA-Probe auf Konzentration, Reinheit, Probenkennung und Gefrier-Tau-Geschichte überprüft.
PCR-RFLP-Genotypisierung und Genotypaufruf
Die Genotypisierung erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktions-Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (PCR-RFLP) für IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 bis 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T und IFN-γ +2108 A/G. Locus-spezifische Primersequenzen, erwartete Amplicongrößen, Restriktionsenzyme und genotypspezifische Verdautungsmuster sind in Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.
Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem Endreaktionsvolumen von 25 μL mit 2,5 μL 10 × Puffer, 2,0 μL dNTP-Gemisch bei jeweils 2,5 mM, 1,0 μL Forward Primer bei 10 μM, 1,0 μL Reverse Primer bei 10 μM, 0,25 μL Taq-DNA-Polymerase bei 5 U/μL, 2,0 μL genomischer DNA bei 50 ng/μL, und 16,25 μL nukleasefreies Wasser. Die PCR-Mastermischung wurde in einem sauberen Pre-PCR-Bereich vorbereitet, und die DNA-Schablone wurde zuletzt hinzugefügt. Bei jedem PCR-Durchlauf wurde eine negative Kontrolle ohne Vorlage eingebaut.
Das thermische Profil bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Denaturationszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, einer Glühung bei 58–62 °C für 30 Sekunden je nach Primerpaar und einer Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 7 Minuten. PCR-Produkte wurden zuerst mit 1,5 % Agarosegel vor der Restriktionsverdauung bestätigt.
PCR-Verstärkung wurde nur akzeptiert, wenn das erwartete Ampliconband sichtbar war, und die Kontrolle ohne Vorlage zeigte keine Verstärkung. Reaktionen mit schwachen Bändern, unspezifischer Amplifikation, Primer-Dimer-Interferenz oder Kontamination in der negativen Kontrolle wurden aus der ursprünglichen DNA-Vorlage wiederholt.
PCR-Produkte wurden mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease bei 37 °C für 3 Stunden in einem Gesamtverdautungsvolumen von 15 μL gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Die verdauten Fragmente wurden bei den meisten Loci mit 2,5 % Agarosegel aufgelöst. Der TLR2-196 bis -174 ins/del-Locus wurde mit 8%-Polyacrylamid-Gel aufgelöst, um die Fragment-Diskriminierung zu verbessern.
Die Restriktionsverdauung wurde nur akzeptiert, wenn die Fragmentmuster dem erwarteten genotypspezifischen Verdauungsprofil entsprachen. Reaktionen mit unvollständiger Verdauung, verschmierten Bändern, unerwarteten Fragmentgrößen oder unklarer Trennung wurden wiederholt. Die Bänder wurden nach der Nukleinsäurefärbung unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht. Gel-Bilder wurden mit der Probenkennung, dem Locusnamen, dem Laufzeitdatum und der Gelnummer gespeichert.
Die Genotypzuweisung wurde unabhängig von zwei verblindeten Laborforschern durchgeführt. Dissonante oder mehrdeutige Genotyprufe wurden mit dem ursprünglichen Gelbild überprüft und bei Bedarf aus der PCR-Amplifikation wiederholt. Zehn Prozent der zufällig ausgewählten Proben wurden zur Qualitätskontrolle neu genotypisiert, und die Konkordanzrate betrug 99,2 %. Endgültige Genotypdaten wurden erst nach Überprüfung von Probenkennungen, Locusnamen, Genotypaufrufen und Qualitätskontrolldaten in den Analysedatensatz eingetragen.
Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit einer geeigneten Analysesoftware durchgeführt. Die klinischen, ELISA- und Genotypdatensätze wurden mithilfe von de-identifizierten Patientencodes zusammengeführt. Die Patientencodes wurden vor der Analyse auf Duplikationen, Fehlanpassungen und fehlende Werte überprüft. Es wurde eine Complete-Case-Strategie verwendet, da allen eingeschlossenen Patienten wichtige klinische, inflammatoriske und genotypische Daten zur Verfügung standen.
In einer geeigneten statistischen Analysesoftware wurde der Lungeninfektionsstatus als Gruppenvariable kodiert, wobei die Gruppe ohne Lungeninfektion als Referenzkategorie verwendet wurde. Kontinuierliche Variablen wurden zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität getestet. Normalverteilte kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt und mit dem unabhängigen Stichprobentest Student's t verglichen. Nicht-normalverteilte kontinuierliche Variablen wurden als Medianer mit Interquartilbereichen angegeben und mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Kategoriale Variablen wurden als Zählungen und Prozentsätze ausgedrückt und je nach Bedarf mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem Fisher-Exakt-Test verglichen.
Die Genotypverteilungen in der Gruppe ohne pulmonale Infektion wurden vor der Assoziationsanalyse auf das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht untersucht. Genotyp- und Allelhäufigkeiten wurden mit n (%) zusammengefasst. Odds Ratios und 95%-Konfidenzintervalle für das Lungeninfektionsrisiko wurden mittels multivariabler logistischer Regressionsmodelle geschätzt. Der Lungeninfektionsstatus wurde als abhängige Variable eingetragen. Genotyp-, Allel- oder Biomarkervariablen wurden als unabhängige Variablen angegeben, wie für jede Analyse angegeben.
Alter und Geschlecht wurden a priori in das primäre Modell eingegeben. BMI, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Herzerkrankungen, Leckage von Liquengruna, Verweilzeit des Abflusses und die Aufnahme-Glasgow-Koma-Skala-Kategorie wurden gleichzeitig in das vollständig angepasste Modell eingegeben, da diese Variablen klinisch relevant waren oder ein Ausgangsungleichgewicht zwischen den Gruppen zeigten. Die Multikollinearität wurde mit Varianzinflationsfaktoren (VIFs) bewertet, und VIFs <5,0 galten als akzeptabel.
Da mehrere Polymorphismen getestet wurden, wurde die Korrektur der Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate auf die genetischen Assoziationsanalysenangewandt 12. P-Werte aus den genetischen Assoziationstests wurden vom kleinsten bis zum größten eingestuft, und die korrigierte Signifikanz wurde nach dem Benjamini-Hochberg-Verfahren bestimmt. Alle Tests waren beidseitig, und P <0,05 galt als statistisch signifikant, sofern nach Mehrfachvergleichsanpassung nichts anderes angegeben wurde.
Die endgültigen Ergebnisse wurden vor der Erstellung des Manuskripts mit dem Quelldatensatz, ELISA-Qualitätskontrolldatensätzen, Genotypaufruf-Datensätzen und Tabellenwerten überprüft. Die Ergebnisse wurden als Assoziationen und nicht als kausale Effekte interpretiert, da die Studie ein retrospektives Beobachtungsdesign verwendete.
Ergebnisse
Klinische Indikatoren
Die klinischen Ausgangsmerkmale sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Insgesamt wurden 360 Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung in die Endanalyse eingeschlossen, darunter 180 Patienten, die während des Krankenhausaufenthalts eine nosokomiale Lungeninfektion entwickelten, und 180 Patienten, die dies nicht taten. Es gab keine signifikanten Altersunterschiede zwischen den Gruppen (62,4 Jahre ± 6,8 Jahre vs. 63,6 Jahre ± 7,0 Jahre, P > 0,05), Geschlechterverteilung (142/180, 78,9 % vs. 137/180, 76,1%, P > 0,05), Rauchvorgeschichte (94/180, 52,2% vs. 99/180, 55,0%, P > 0,05), Trinkhistorie (99/180, 55,0% vs. 106/180, 58,9%, P > 0,05), Diabetes mellitus (18/180, 10,0% vs. 21/180), P 0,05), Diabetes mellitus (18/180, 10,0% vs. 21/180), 11,7 %, P > 0,05), oder Bluthochdruck (21/180, 11,7 % gegenüber 24/180, 13,3 %, P > 0,05). Im Gegensatz dazu war der Body-Mass-Index in der Pulmonalinfektionsgruppe signifikant höher als in der Gruppe ohne Lungeninfektion (24,9 kg/m2 ± 1,9 kg/m2 gegenüber 23,8 kg/m2 ± 1,8 kg/m2, P < 0,001). Im Vergleich zur Gruppe ohne Lungeninfektion hatte die Gruppe mit Lungeninfektionen häufiger eine Vorgeschichte chronisch obstruktiver Lungenerkrankungen (45/180, 25,0 % vs. 22/180, 12,2 %, P < 0,001) sowie Herzerkrankungen (23/180, 12,8 % vs. 6/180, 3,3 %, P < 0,001), und hatten häufiger eine Leckage von Gehirnspinalflüssigkeit (135/180, 75,0 % vs. 99/180, 55,0 %, P < 0,001), und hatte eine Drain-Wohnzeit ≥ 3 Tagen (131/180, 72,8 % gegenüber 79/180, 43,9 %, P < 0,001). Außerdem hatte die Gruppe mit Lungeninfektionen einen höheren Anteil an Patienten mit einem Aufnahme-Glasgow-Koma-Skala-Wert <9 (142/180, 78,9 %) als die Kontrollgruppe (108/180, 60,0 %; P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten auf ein weniger günstiges klinisches Ausgangsprofil bei Patienten hin, die eine nosokomiale Lungeninfektion entwickelten.
| Charakteristik | Keine Lungenentzündung, n = 180 | Lungenentzündung, n = 180 | P-Wert |
| Alter, Jahre | 62.4 ± 6.8 | 63,6 ± 7,0 | >0,05 |
| Männlich, n (%) | 142 (78.9) | 137 (76.1) | >0,05 |
| BMI, kg/m² | 23.8 ± 1.8 | 24,9 ± 1,9 | <0,001 |
| Raucher, n (%) | 94 (52.2) | 99 (55.0) | >0,05 |
| Trinkgeschichte, n (%) | 99 (55.0) | 106 (58.9) | >0,05 |
| COPD-Geschichte, n (%) | 22 (12.2) | 45 (25.0) | <0,001 |
| Herzgeschichte, n (%) | 6 (3.3) | 23 (12.8) | <0,001 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 18 (10.0) | 21 (11.7) | >0,05 |
| Bluthochdruck, n (%) | 21 (11.7) | 24 (13.3) | >0,05 |
| Liquor-Leckage, n (%) | 99 (55.0) | 135 (75.0) | <0,001 |
| Entwässerungszeit < 3 Tagen, n (%) | 101 (56.1) | 49 (27.2) | <0,001 |
| Entwässerungszeit ≥ 3 Tage, n (%) | 79 (43.9) | 131 (72.8) | <0,001 |
| GCS bei der Zulassung ≥ 9, n (%) | 72 (40.0) | 38 (21.1) | <0,001 |
| GCS bei der Zulassung < 9, n (%) | 108 (60.0) | 142 (78.9) | <0,001 |
Tabelle 1: Klinische Ausgangsmerkmale von Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung, geschichtet nach nosokomialer Lungeninfektionsstatus. Die Tabelle fasst demografische Variablen, vaskuläre Risikofaktoren und wichtige klinische Merkmale der Aufnahme zusammen, darunter Alter, Geschlecht, Rauchvorgeschichte, Alkoholvorgeschichte, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Body-Mass-Index, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Herzerkrankungen, Licamarkalwasserleck, Verweildauer der Drainagen und Aufnahme auf der Glasgow Coma Scale-Kategorie. Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± SD dargestellt und wurden je nach Datenverteilung mit dem unabhängigen Stichprobentest Student's t Test oder dem Mann-Whitney U-Test verglichen. Kategoriale Variablen werden als n (%) dargestellt und je nach Bedarf mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Test verglichen. Alle P-Werte sind beidseitig. Abkürzungen: BMI, Body-Mass-Index; COPD, chronisch obstruktive Lungenerkrankung; Liquor und Rückenmarksflüssigkeit; GCS, Glasgow-Koma-Skala. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Serumzytokin und TLR2/TLR4/TLR9-Profile
Ergebnisse von Serumzytokinen und toll-ähnlichen Rezeptorproteinen sind in Abbildung 1(A–I) dargestellt. Blutproben wurden am Morgen nach der Aufnahme um 08:00 Uhr entnommen, während Lungeninfektionen, die innerhalb der ersten 48 Stunden diagnostiziert wurden, per Definition ausgeschlossen wurden. Dementsprechend stellten diese Messungen frühe Entzündungsprofile nach der Aufnahme im Zusammenhang mit der nachfolgenden nosokomialen pulmonalen Infektionsklassifikation dar. Im Vergleich zur Gruppe ohne Lungeninfektion zeigte die Gruppe mit Lungeninfektionen signifikant höhere Serumkonzentrationen von IL-1β (17,4 pg/mL ± 3,1 pg/mL gegenüber 33,2 pg/mL ± 2,4 pg/mL, P < 0,001), IL-6 (18,1 pg/mL ± 2,2 pg/mL gegenüber 33,8 pg/mL ± 2,5 pg/mL, P < 0,001), IL-10 (17,6 pg/mL ± 2,0 pg/mL vs 34,1 pg/mL ± 2,8 pg/mL, P < 0,001), IL-17 (22,9 pg/mL ± 2,8 pg/mL gegenüber 28,3 pg/mL ± 4,0 pg/mL, P < 0,001), IFN-γ (18,0 pg/mL ± 2,1 pg/mL gegenüber 33,0 pg/mL ± 2,7 pg/mL, P < 0,001) und TNF-α (19,2 pg/mL ± 2,3 pg/mL gegenüber 35,5 pg/mL ± 3,1 pg/mL, P < 0,001). Serumspiegel von TLR2 (1,94 ng/mL ± 0,29 ng/mL vs 2,71 ng/mL ± 0,36 ng/mL, P < 0,001), TLR4 (2,08 ng/mL ± 0,31 ng/mL gegenüber 3,06 ng/mL ± 0,42 ng/mL, P < 0,001) und TLR9 (1,89 ng/mL ± 0,27 ng/mL vs 2,63 ng/mL ± 0,35 ng/mL, P < 0,001) waren ebenfalls signifikant höher in der Gruppe mit Lungeninfektionen als in der Gruppe ohne Lungeninfektion. Insgesamt zeigten Patienten, die nosokomiale Lungeninfektionen entwickelten, breite Erhöhungen der seruminflammatorischen und angeborenen Immunmarker.
Abbildung 1: Serum-Zytokinkonzentrationen und Serumproteinwerte TLR2, TLR4 und TLR9 bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung mit oder ohne nosokomialer Lungeninfektion. (A) IL-1β, (B) IL-6, (C) IL-10, (D) IL-17, (E) IFN-γ, (F) TNF-α, (G) TLR2, (H) TLR4 und (I) TLR9. Die Daten werden als Mittelwert ± SD für die Gruppe ohne Lungeninfektion (n = 180) und für die Gruppe mit Lungeninfektion (n = 80) dargestellt. Gruppenvergleiche wurden mit dem unabhängigen Schüler-t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt, je nach Anwendung. *P < 0,05; **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Genpolymorphismus-Analysen
Genotyp- und Allelverteilungen wurden zwischen den Gruppen mit logistischen Regressionsmodellen verglichen, die auf Alter und Geschlecht angepasst waren. Sensitivitätsanalysen, zusätzlich unter Anpassung des Body-Mass-Index, chronisch obstruktiver Lungenerkrankungen, Herzerkrankungen, Leckage von Gehirnspinalflüssigkeit, der Verweildauer des Drains und der Glasgow-Koma-Kategorie, ergaben Berichten zufolge richtungskonsistente Befunde.
Die Ergebnisse des toll-ähnlichen Rezeptor-Polymorphismus sind in Tabelle 2 dargestellt. Signifikante Zusammenhänge mit dem Risiko für pulmonale Infektionen wurden für TLR2-196 bis 174 ins/del und TLR9 rs187084 beobachtet. Im Vergleich zum I/I-Genotyp war der D/D-Genotyp von TLR2-196 bis 174 ins/del mit einem erhöhten Risiko assoziiert (OR 1,93, 95%-KI 1,15–3,23, P = 0,017), und das D-Allel war ebenfalls mit einem höheren Risiko assoziiert (OR 1,57, 95%-KI 1,16–2,12, P = 0,004). Für TLR9 rs187084 waren sowohl der TC-Genotyp (OR 2,69, 95%-KI 1,59–4,46, P < 0,001) als auch der CC-Genotyp (OR 2,94, 95%-KI 1,64–5,27, P < 0,001) mit einem erhöhten Risiko für pulmonale Infektionen assoziiert, und das C-Allel war in der pulmonalen Infektionsgruppe ähnlich angereichert (OR 1,77, 95%-KI 1,32–2,38, P < 0,001). Für TLR2 rs3804099, TLR2 rs3804100, TLR4 rs10759932, TLR4 rs1927911, TLR4 rs11536889, TLR9 rs352140 oder TLR9 rs574836 wurden keine statistisch signifikanten Assoziationen beobachtet.
| TLR Locus | Genotyp / Allele | Keine Lungeninfektion, n (%) | Lungenentzündung, n (%) | Angepasster OR (95 % KI) | Pa |
| TLR2 −196 bis −174 ins/del | I/I | 57 (31.7) | 38 (21.1) | 1.00 (Referenz) | — |
| I/D | 53 (29.4) | 52 (28.9) | 1.47 (0.84–2.58) | 0.226 | |
| D/D | 70 (38.9) | 90 (50.0) | 1.93 (1.15–3.23) | 0.017 | |
| I | 167 (46.4) | 128 (35.6) | 1.00 (Referenz) | — | |
| D | 193 (53.6) | 232 (64.4) | 1.57 (1.16–2.12) | 0.004 | |
| TLR2 rs3804099 | TT | 94 (52.2) | 92 (51.1) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 75 (41.7) | 72 (40.0) | 0.98 (0.64–1.51) | 0.982 | |
| CC | 11 (6.1) | 16 (8.9) | 1.49 (0.65–3.37) | 0.456 | |
| T | 263 (73.1) | 256 (71.1) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 97 (26.9) | 104 (28.9) | 1.10 (0.80–1.53) | 0.618 | |
| TLR2 rs3804100 | TT | 99 (55.0) | 98 (54.4) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 61 (33.9) | 62 (34.4) | 1.03 (0.65–1.61) | 1 | |
| CC | 20 (11.2) | 20 (11.2) | 1.01 (0.51–1.99) | 0.885 | |
| T | 259 (71.9) | 258 (71.7) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 101 (28.1) | 102 (28.3) | 1.01 (0.73–1.40) | 1 | |
| TLR4 rs10759932 | TT | 104 (57.7) | 108 (60.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 61 (33.9) | 57 (31.7) | 0.90 (0.57–1.41) | 0.73 | |
| CC | 15 (8.3) | 15 (8.3) | 0.96 (0.45–2.07) | 0.922 | |
| T | 269 (74.7) | 273 (75.8) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 91 (25.3) | 87 (24.2) | 0.94 (0.67–1.32) | 0.796 | |
| TLR4 rs1927911 | GG | 99 (55.0) | 98 (54.4) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 61 (33.9) | 62 (34.4) | 1.03 (0.65–1.61) | 1 | |
| AA | 20 (11.2) | 20 (11.2) | 1.01 (0.51–1.99) | 0.885 | |
| G | 259 (71.9) | 258 (71.7) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 101 (28.1) | 102 (28.3) | 1.01 (0.73–1.40) | 1 | |
| TLR4 rs11536889 | GG | 92 (51.1) | 88 (48.9) | 1.00 (Referenz) | — |
| GC | 64 (35.6) | 67 (37.2) | 1.09 (0.70–1.72) | 0.781 | |
| CC | 24 (13.3) | 25 (13.9) | 1.09 (0.58–2.05) | 0.918 | |
| G | 248 (68.9) | 243 (67.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 112 (31.1) | 117 (32.5) | 1.07 (0.78–1.46) | 0.689 | |
| TLR9 rs187084 | TT | 66 (36.7) | 31 (17.2) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 72 (40.0) | 91 (50.6) | 2.69 (1.59–4.46) | < 0,001 | |
| CC | 42 (23.3) | 58 (32.2) | 2.94 (1.64–5.27) | < 0,001 | |
| T | 204 (56.7) | 153 (42.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 156 (43.3) | 207 (57.5) | 1.77 (1.32–2.38) | < 0,001 | |
| TLR9 rs352140 | GG | 27 (15.0) | 27 (15.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 102 (56.7) | 99 (55.0) | 0.97 (0.53–1.77) | 0.955 | |
| AA | 51 (28.3) | 54 (30.0) | 1.06 (0.55–2.04) | 0.997 | |
| G | 156 (43.3) | 153 (42.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 204 (56.7) | 207 (57.5) | 1.03 (0.77–1.39) | 0.88 | |
| TLR9 rs574836 | TT | 27 (15.0) | 26 (14.4) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 99 (55.0) | 101 (56.1) | 1.06 (0.58–1.94) | 0.974 | |
| CC | 54 (30.0) | 53 (29.4) | 1.02 (0.53–1.97) | 0.911 | |
| T | 153 (42.5) | 153 (42.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 207 (57.5) | 207 (57.5) | 1.00 (0.74–1.34) | 0.94 |
Tabelle 2: Genotyp- und Allelfrequenzen der TLR2-, TLR4- und TLR9-Polymorphismen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung. Die Tabelle zeigt Genotyp- und Allelverteilungen für TLR2-196 bis 174 ins/del, TLR2 rs3804099, TLR2 rs3804100, TLR4 rs10759932, TLR4 rs1927911, TLR4 rs11536889, TLR9 rs187084, TLR9 rs352140 und TLR9 rs574836. Genotyp- und Allelverteilungen werden als n (%) dargestellt. Odds Ratios (ORs) und 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mit logistischen Regressionsmodellen geschätzt, angepasst an Alter und Geschlecht, wobei Referenzkategorien als Ref. Alle P-Werte sind beidseitig. Abkürzungen: OR, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; Referenz, Referenz. aAlters- und Geschlechtsanpassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Die Ergebnisse des Interleukin-bezogenen Polymorphismus sind in Tabelle 3 detailliert dargestellt. Signifikante Assoziationen wurden für IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A und IL-10-819 T/C beobachtet. Für IL-1B +3954 C/T waren der TC-Genotyp (OR 2,52, 95%-KI 1,33–4,79, P = 0,007), TT-Genotyp (OR 2,30, 95%-KI 1,34–3,96, P = 0,003) und das T-Allel (OR 1,70, 95%-KI 1,24–2,32, P = 0,001) mit einem erhöhten Risiko für Lungeninfektionen assoziiert. Für IL-10-1082 G/A waren sowohl der GA-Genotyp (OR 2,60, 95%-KI 1,57–4,32, P < 0,001) als auch der AA-Genotyp (OR 2,05, 95%-KI 1,22–3,45, P = 0,009) mit erhöhtem Risiko assoziiert, ebenso wie das A-Allel (OR 1,66, 95%-KI 1,23–2,23, P = 0,001). Für IL-10-819 T/C waren der CC-Genotyp (OR 3,54, 95%-KI 1,72–7,29, P < 0,001) und das C-Allel (OR 1,39, 95%-KI 1,01–1,91, P = 0,043) mit einem erhöhten Lungeninfektionsrisiko assoziiert, während der TC-Genotyp einen OR unter 1,00 zeigte (OR 0,51, 95%-KI 0,31–0,82, P = 0,007). Es wurden keine signifikanten Zusammenhänge für IL-1B-511 C/T, IL-1B-31 C/T, IL-6-174 G/C, IL-6-1363 G/T, IL-6-1363 C/G, IL-8-251 A/T, IL-8 RS2227306, IL-8 RS1126647, IL-10-592 C/A, IL-17 RS2275913 oder IL-17 RS763780 gefunden.
| Gen-Locus | Genotyp / Allele | Keine Lungeninfektion, n (%) | Lungenentzündung, n (%) | Adjustierter OR (95 % KI) | P-Wert |
| IL-1B +3954 C/T | CC | 53 (29.4) | 27 (15.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 35 (19.4) | 45 (25.0) | 2.52 (1.33–4.79) | 0.007 | |
| TT | 92 (51.1) | 108 (60.0) | 2.30 (1.34–3.96) | 0.003 | |
| C | 141 (39.2) | 99 (27.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 219 (60.8) | 261 (72.5) | 1.70 (1.24–2.32) | 0.001 | |
| IL-1B −511 C/T | CC | 94 (52.2) | 92 (51.1) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 75 (41.7) | 75 (41.6) | 1.02 (0.66–1.57) | 0.991 | |
| TT | 11 (6.1) | 13 (7.2) | 1.21 (0.51–2.83) | 0.828 | |
| C | 263 (73.1) | 259 (71.9) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 97 (26.9) | 101 (28.1) | 1.06 (0.76–1.47) | 0.802 | |
| IL-1B −31 C/T | CC | 89 (49.4) | 82 (45.6) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 78 (43.3) | 77 (42.8) | 1.07 (0.69–1.66) | 0.841 | |
| TT | 13 (7.2) | 21 (11.6) | 1.75 (0.82–3.73) | 0.199 | |
| C | 256 (71.1) | 241 (66.9) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 104 (28.9) | 119 (33.1) | 1.22 (0.89–1.67) | 0.227 | |
| IL-6 −174 G/C | GG | 92 (51.1) | 88 (48.9) | 1.00 (Referenz) | — |
| GC | 75 (41.6) | 74 (41.1) | 1.03 (0.67–1.59) | 0.977 | |
| CC | 13 (7.2) | 18 (10.0) | 1.45 (0.67–3.13) | 0.454 | |
| G | 259 (71.9) | 250 (69.4) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 101 (28.1) | 110 (30.6) | 1.13 (0.82–1.56) | 0.512 | |
| IL-6 −1363 G/T | GG | 92 (51.1) | 85 (47.2) | 1.00 (Referenz) | — |
| GT | 78 (43.3) | 75 (41.7) | 1.04 (0.68–1.60) | 0.944 | |
| TT | 10 (5.6) | 20 (11.1) | 2.16 (0.96–4.89) | 0.091 | |
| G | 262 (72.8) | 245 (68.1) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 98 (27.2) | 115 (31.9) | 1.25 (0.91–1.73) | 0.191 | |
| IL-6 −1363 C/G | CC | 95 (52.7) | 93 (51.1) | 1.00 (Referenz) | — |
| GC | 75 (41.7) | 71 (40.0) | 0.97 (0.63–1.49) | 0.967 | |
| GG | 10 (5.6) | 16 (8.9) | 1.63 (0.71–3.79) | 0.345 | |
| C | 265 (73.6) | 257 (71.4) | 1.00 (Referenz) | — | |
| G | 95 (26.4) | 103 (28.6) | 1.12 (0.81–1.55) | 0.559 | |
| IL-8 −251 A/T | AA | 27 (15.0) | 26 (14.4) | 1.00 (Referenz) | — |
| AT | 107 (59.4) | 111 (61.7) | 1.08 (0.59–1.96) | 0.928 | |
| TT | 46 (25.6) | 43 (23.9) | 0.97 (0.49–1.92) | 0.93 | |
| A | 161 (44.7) | 163 (45.3) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 199 (55.3) | 197 (54.7) | 0.98 (0.73–1.31) | 0.94 | |
| IL-8 rs2227306 | CC | 27 (15.0) | 25 (13.9) | 1.00 (Referenz) | — |
| CT | 99 (55.0) | 104 (57.8) | 1.13 (0.62–2.09) | 0.685 | |
| TT | 54 (30.0) | 51 (28.3) | 1.02 (0.52–1.98) | 0.911 | |
| C | 153 (42.5) | 154 (42.8) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 207 (57.5) | 206 (57.2) | 0.99 (0.74–1.33) | 1 | |
| IL-8 rs1126647 | AA | 32 (17.8) | 36 (20.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| AT | 89 (49.4) | 81 (45.0) | 0.81 (0.46–1.42) | 0.552 | |
| TT | 59 (32.8) | 63 (35.0) | 0.95 (0.52–1.72) | 0.983 | |
| A | 153 (42.5) | 153 (42.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 207 (57.5) | 207 (57.5) | 1.00 (0.74–1.34) | 0.94 | |
| IL-10 −592 C/A | CC | 94 (52.2) | 92 (51.1) | 1.00 (Referenz) | — |
| CA | 75 (41.7) | 75 (41.6) | 1.02 (0.66–1.57) | 0.991 | |
| AA | 11 (6.1) | 13 (7.2) | 1.21 (0.51–2.83) | 0.828 | |
| C | 263 (73.1) | 259 (71.9) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 97 (26.9) | 101 (28.1) | 1.06 (0.76–1.47) | 0.802 | |
| IL-10 −1082 G/A | GG | 85 (47.2) | 50 (27.8) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 47 (26.1) | 72 (40.0) | 2.60 (1.57–4.32) | < 0,001 | |
| AA | 48 (26.7) | 58 (32.2) | 2.05 (1.22–3.45) | 0.009 | |
| G | 217 (60.3) | 172 (47.8) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 143 (39.7) | 188 (52.2) | 1.66 (1.23–2.23) | 0.001 | |
| IL-10 −819 T/C | TT | 94 (52.2) | 99 (55.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 75 (41.7) | 40 (22.2) | 0.51 (0.31–0.82) | 0.007 | |
| CC | 11 (6.1) | 41 (22.8) | 3.54 (1.72–7.29) | < 0,001 | |
| T | 263 (73.1) | 238 (66.1) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 97 (26.9) | 122 (33.9) | 1.39 (1.01–1.91) | 0.043 | |
| IL-17 rs2275913 | GG | 94 (52.2) | 99 (55.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 79 (43.9) | 72 (40.0) | 0.92 (0.60–1.42) | 0.801 | |
| AA | 7 (3.9) | 9 (5.0) | 1.22 (0.44–3.41) | 0.904 | |
| G | 267 (74.2) | 270 (75.0) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 93 (25.8) | 90 (25.0) | 0.96 (0.68–1.34) | 0.864 | |
| IL-17 rs763780 | TT | 110 (61.1) | 100 (55.6) | 1.00 (Referenz) | — |
| TC | 62 (34.4) | 70 (38.9) | 1.24 (0.80–1.92) | 0.388 | |
| CC | 8 (4.4) | 10 (4.4) | 1.38 (0.52–3.62) | 0.688 | |
| T | 263 (73.1) | 270 (75.0) | 1.00 (Referenz) | — | |
| C | 97 (26.9) | 90 (25.0) | 0.90 (0.65–1.26) | 0.61 |
Tabelle 3: Genotyp- und Allelhäufigkeiten interleukin-bezogener Polymorphismen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung. Die Tabelle zeigt Genotyp- und Allelverteilungen für IL-1B +3954 C/T, IL-1B-511 C/T, IL-1B-31 C/T, IL-6-174 G/C, IL-6-1363 G/T, IL-6-1363 C/G, IL-8-251 A/T, IL-8 RS2227306, IL-8 RS1126647, IL-10-592 C/A, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, IL-17 rs2275913 und IL-17 rs763780. Genotyp- und Allelverteilungen werden als n (%) dargestellt. Odds Ratios (ORs) und 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mit logistischen Regressionsmodellen geschätzt, angepasst an Alter und Geschlecht, wobei Referenzkategorien als Ref. Alle P-Werte sind beidseitig. Abkürzungen: IL, Interleukin; ODER, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; Referenz, Referenz. aAlters- und Geschlechtsanpassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Die Ergebnisse des IFN-γ-Polymorphismus sind in Tabelle 4 dargestellt. Signifikante Assoziationen wurden für +874 A/T beobachtet, aber nicht für +2108 A/G. Im Vergleich zum AA-Genotyp waren der AT-Genotyp (OR 1,83, 95%-KI 1,18–2,83, P = 0,009) und der TT-Genotyp (OR 2,97, 95%-KI 1,19–7,38, P = 0,029) bei +874 A/T mit einem erhöhten Risiko für pulmonale Infektionen assoziiert, und das T-Allel war ebenfalls mit einem höheren Risiko assoziiert (OR 1,57, 95%-KI 1,15–2,15, P = 0,006). Im Gegensatz dazu wurden keine signifikanten Assoziationen für die +2108 A/G-Variante identifiziert.
| Locus | Genotyp / Allel | Keine Lungeninfektion, n (%) | Lungenentzündung, n (%) | Angepasster OR (95 % KI) | Pa |
| +874 A/T | AA | 86 (47.8) | 58 (32.2) | 1.00 (Referenz) | — |
| AT | 86 (47.8) | 106 (58.9) | 1.83 (1.18–2.83) | 0.009 | |
| TT | 8 (4.4) | 16 (8.9) | 2.97 (1.19–7.38) | 0.029 | |
| A | 258 (71.7) | 222 (61.7) | 1.00 (Referenz) | — | |
| T | 102 (28.3) | 138 (38.3) | 1.57 (1.15–2.15) | 0.006 | |
| +2108 A/G | AA | 95 (52.8) | 90 (50.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| AG | 63 (35.0) | 66 (36.7) | 1.11 (0.71–1.73) | 0.746 | |
| GG | 22 (12.2) | 24 (13.3) | 1.15 (0.60–2.20) | 0.792 | |
| A | 253 (70.3) | 246 (68.3) | 1.00 (Referenz) | — | |
| G | 107 (29.7) | 114 (31.7) | 1.10 (0.80–1.50) | 0.628 |
Tabelle 4: Genotyp- und Allelhäufigkeiten von IFN-γ-Polymorphismen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung. Die Tabelle zeigt Genotyp- und Allelverteilungen für IFN-γ +874 A/T und IFN-γ +2108 A/G. Genotyp- und Allelverteilungen werden als n (%) dargestellt. Odds Ratios (ORs) und 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mit logistischen Regressionsmodellen geschätzt, angepasst an Alter und Geschlecht, wobei Referenzkategorien als Ref. Alle P-Werte sind beidseitig. Abkürzungen: IFN-γ, Interferon-Gamma; ODER, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; Referenz, Referenz. aAlters- und Geschlechtsanpassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Die Ergebnisse des TNF-α-Polymorphismus sind in Tabelle 5 dargestellt. Unter diesen Loci war -308 G/A signifikant mit dem Risiko für eine Lungeninfektion assoziiert, während -863 C/A und -238 G/A dies nicht waren. Im Vergleich zum GG-Genotyp waren der GA-Genotyp (OR 2,34, 95%-KI 1,42–3,88, P = 0,001) und der AA-Genotyp (OR 1,84, 95%-KI 1,10–3,07, P = 0,028) bei -308 G/A mit einem erhöhten Risiko assoziiert, und das A-Allel war ebenfalls mit einem höheren Risiko assoziiert (OR 1,55, 95%-KI 1,15–2,08, P = 0,004).
| Locus | Genotyp / Allele | Keine Lungeninfektion, n (%) | Lungenentzündung, n (%) | Adjustierter OR (95 % KI) | P-Wert |
| −308 G/A | GG | 85 (47.2) | 54 (30.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 47 (26.1) | 70 (38.9) | 2.34 (1.42–3.88) | 0.001 | |
| AA | 48 (26.7) | 56 (31.1) | 1.84 (1.10–3.07) | 0.028 | |
| G | 217 (60.3) | 178 (49.4) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 143 (39.7) | 182 (50.6) | 1.55 (1.15–2.08) | 0.004 | |
| −863 C/A | GG | 92 (51.1) | 85 (47.2) | 1.00 (Referenz) | — |
| GA | 78 (43.3) | 75 (41.7) | 1.04 (0.68–1.60) | 0.944 | |
| AA | 10 (5.6) | 20 (11.1) | 2.16 (0.96–4.89) | 0.091 | |
| G | 262 (72.8) | 245 (68.1) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 98 (27.2) | 115 (31.9) | 1.25 (0.91–1.73) | 0.191 | |
| −238 G/A | CC | 32 (17.8) | 36 (20.0) | 1.00 (Referenz) | — |
| CA | 89 (49.4) | 81 (45.0) | 0.81 (0.46–1.42) | 0.552 | |
| AA | 59 (32.8) | 63 (35.0) | 0.95 (0.52–1.72) | 0.983 | |
| C | 153 (42.5) | 153 (42.5) | 1.00 (Referenz) | — | |
| A | 207 (57.5) | 207 (57.5) | 1.00 (0.74–1.34) | 0.94 |
Tabelle 5: Genotyp- und Allelfrequenzen von TNF-α-Polymorphismen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung. Die Tabelle zeigt Genotyp- und Allelverteilungen für TNF-α-308 G/A, TNF-α-863 C/A und TNF-α-238 G/A. Genotyp- und Allelverteilungen werden als n (%) dargestellt. Odds Ratios (ORs) und 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mit logistischen Regressionsmodellen geschätzt, angepasst an Alter und Geschlecht, wobei Referenzkategorien als Ref. Alle P-Werte sind beidseitig. Abkürzungen: TNF-α, Tumornekrosefaktor Alpha; ODER, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; Referenz, Referenz. aAlters- und Geschlechtsanpassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusammen zeigten die Ergebnisse, dass Patienten, die nach spontaner intrazerebraler Blutung eine nosokomiale Lungeninfektion entwickelten, ein ungünstigeres klinisches Ausgangsprofil, höhere zirkulierende Zytokin- und Toll-ähnliche Rezeptorwerte sowie unterschiedliche Verteilungen mehrerer immunbezogener genetischer Polymorphismen aufwiesen. Die konsistenstesten positiven Assoziationen in dieser Kohorte wurden bei TLR2-196 bis 174 ins/del, TLR9 rs187084, IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, IFN-γ +874 A/T und TNF-α-308 G/A beobachtet.
DATENVERFÜGBARKEIT:
Alle Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind öffentlich im Figshare-Repository verfügbar. Der abgelagerte Datensatz enthält deidentifizierte klinische Daten, Serum-Zytokin- und Toll-ähnliche Rezeptormessungen sowie Genotypdaten entsprechend Abbildung 1(A–I), Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 und Tabelle 5. Der Datensatz ist verfügbar als: Yang, Lunyun; Zhou, Hui; Li, Wei; Shen, Weifeng (2026), Zytokine und entzündliche Genpolymorphismen, die mit nosokomialer Lungeninfektion nach spontaner intrazerebraler Blutung assoziiert sind, Figshare, Datensatz https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32101399.v1.
Ergänzende Tabelle 1: Primer-Sequenzen, erwartete PCR-Amplikongrößen, Restriktionsenzyme und genotypspezifische Verdauungsmuster für PCR-RFLP-Genotypisierung. Die Tabelle fasst die locusspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimer-Sequenzen, erwartete PCR-Produktgrößen, Restriktionsenzyme und erwartete Fragmentmuster für die in dieser Studie analysierten entzündlichen und angeborenen immunbezogenen Polymorphismen zusammen, darunter TLR2, TLR4, TLR9, IL-1β, IL-10, TNF-α und IFN-γ Loci. Diese Details unterstützen die Reproduzierbarkeit des PCR-RFLP-Workflows und liefern die Referenzinformationen, die für die Amplifikationsverifikation, die Interpretation der Restriktionsverdauung und das Genotypaufruf verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die spontane intrazerebrale Blutung (ICH) bleibt eine der schwersten Schlaganfallsubtypen und verursacht weiterhin erhebliche Frühsterblichkeits- und langfristige Erwerbsbelastungen13. In der klinischen Praxis sind Patienten mit ICH besonders anfällig für Komplikationen im Krankenhaus, da neurologische Verletzungen den Atemwegsschutz schwächen, die Wirksamkeit des Hustens verringern, die Mobilität einschränken und die Exposition gegenüber invasiven unterstützenden Verfahren erhöhen können. Unter diesen Komplikationen ist die nosokomiale Lungeninfektion besonders wichtig, da sie den Krankenhausaufenthalt verlängern, den Ressourcenverbrauch erhöhen und die neurologische Genesung durch eine beeinträchtigte Sauerstoffversorgung und systemischen entzündlichen Stress weiter beeinträchtigenkann. Diese klinischen Realitäten unterstreichen die Notwendigkeit, Patienten mit erhöhtem Infektionsrisiko frühzeitig zu identifizieren und eine gezieltere Überwachung während der akuten Versorgungsphasezu gewährleisten 15.
In der vorliegenden Studie hatten Patienten, die eine nosokomiale Lungenentzündung entwickelten, ein weniger günstiges klinisches Ausgangsprofil, darunter häufigere chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, Herzerkrankungen, Leckage von Gehirnspinalflüssigkeit, längere Verweildauer der Drainagen und niedrigere Glasgow-Koma-Skala-Werte. Dieses Muster ist klinisch plausibel, da eine verringerte kardiopulmonale Reserve die Toleranz gegenüber Atemstress schwächen kann, während beeinträchtigtes Bewusstsein und längere Gerätenexposition das Aspirationsrisiko erhöhen und die Atemwegsbesiedlung erleichternkönnen 16. Anstatt als isolierte Indikatoren zu fungieren, spiegeln diese Faktoren möglicherweise einen breiteren Verwundbarkeitszustand wider, in dem neurologische Schwere und Komorbiditätsbelastung und prozedurale Exposition gemeinsam die Wahrscheinlichkeit einer anschließenden Lungeninfektion beeinflussen17.
Über die klinischen Ausgangsmerkmale hinaus ergab diese Studie, dass Patienten, die später eine nosokomiale Lungeninfektion entwickelten, höhere Serumkonzentrationen von IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ und TNF-α sowie höhere Serumproteinwerte von TLR2, TLR4 und TLR9 aufwiesen. Dieses Muster deutet darauf hin, dass bei Patienten, die später eine Lungeninfektion erleiden, früh nach der Aufnahme ein stärker aktiviertes entzündliches und angeborenes immunbezogenes Profil vorhanden ist. Gleichzeitig sollten diese Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden. Da Blut am Morgen nach der Aufnahme entnommen wurde und die Infektion nach den ersten 48 Stunden des Krankenhausaufenthalts definiert wurde, können die beobachteten Biomarkerunterschiede nicht als direkter Hinweis auf Kausalität18 interpretiert werden. Sie könnten eine frühe entzündliche Aktivierung des Wirts widerspiegeln, die mit späterer Infektionsanfälligkeit assoziiert ist, aber sie können auch teilweise systemische Reaktionen auf hämorrhagische Schwere oder sich entwickelnde subklinische pathologische Prozesse erfassen19. Trotz dieser Einschränkung bleibt das Biomarkermuster klinisch relevant, da es die Möglichkeit unterstützt, dass eine entzündliche Profilierung zur früheren Risikoerkennung bei stationärenPatienten beiträgt.
Die genetischen Erkenntnisse fügen diesem Bild eine weitere Ebene der Heterogenität hinzu. In dieser Kohorte wurden signifikante Assoziationen für TLR2-196 bis 174 ins/del, TLR9 rs187084, IL-1B +3954 C/t, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, IFN-γ +874 A/T und TNF-α-308 G/A beobachtet. Frühere Studien haben gezeigt, dass Variationen in Zytokin-Genen und angeborenen Immunrezeptorgenen die entzündliche Reaktionsfähigkeit und die Wirtsverteidigung bei infektiösen und entzündlichen Erkrankungen beeinflussen können21. Ebenfalls Hinweise zu TLR2 und TLR9 deuten darauf hin, dass diese Rezeptoren zu interindividuellen Unterschieden in der Erregererkennung und der nachgelagerten Immunsignalgebungbeitragen können. Vergleichbare Beobachtungen wurden auch für interleukin-bezogene Loci berichtet, insbesondere dort, wo Promotor- oder Codingvariationen das Gleichgewicht zwischen proinflammatorischen und antiinflammatorischen Reaktionen verändern können23. Studien zu IFN-γ-Polymorphismen haben zudem gezeigt, dass locusspezifische Unterschiede die Infektionsanfälligkeit in bestimmten Populationen beeinflussen können24, während TNF-α-Promotorvariationen in früheren Assoziationsstudien mit veränderter Entzündungsintensität und infektionsbedingtem Risiko in Verbindung gebracht wurden25. Gleichzeitig waren nicht alle in der vorliegenden Studie untersuchten Loci mit dem Risiko für eine lungenartige Infektion assoziiert, was darauf hindeutet, dass der wirtsgenetische Beitrag in diesem Kontext selektiv und nicht generalisiert ist26.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Arbeit ist, dass sie einen reproduzierbaren klinischen Laborworkflow bietet, anstatt sich ausschließlich auf Risikofaktoren am Bett oder isolierte Biomarkertests zu verlassen. Bestehende rein klinische Ansätze sind praktikabel, da sie routinemäßig verfügbare Informationen wie neurologische Schwere wie Komorbiditäten, Schluckstörungen, invasive Verfahren und Geräteexposition verwenden. Klinische Variablen allein erfassen jedoch möglicherweise nicht vollständig die biologischen Unterschiede, die die Infektionsanfälligkeit bei Patienten mit ähnlichen klinischen Präsentationen beeinflussen. Nur Biomarker-Ansätze können die entzündliche Aktivierung beschreiben, können jedoch empfindlich gegenüber Probenahmezeit, Probenhandhabung, Hämolyse, Speicherbedingungen und Variationen im Assay sein. Die Genotypisierung liefert Informationen über einen relativ stabilen Hintergrund der Immunantwort des Wirts, aber genetische Daten allein können den aktuellen entzündlichen Zustand des Patienten nicht widerspiegeln. Der hier verwendete kombinierte Arbeitsablauf hat daher einen praktischen Vorteil: Er integriert klinische Verwundbarkeit, frühe Serum-Entzündungsaktivität und ausgewählte immungenetische Variation des Wirts innerhalb eines einzigen analytischen Rahmens.
Mehrere Protokollschritte sind besonders wichtig für die Zuverlässigkeit dieses Workflows. Die erste ist der Zeitpunkt der Blutentnahme. In dieser Studie wurde Blut zu einem festen frühen Zeitpunkt nach der Aufnahme entnommen, und Lungeninfektionen, die innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Aufnahme diagnostiziert wurden, wurden ausgeschlossen. Dieses Timing reduziert, schließt aber nicht aus, dass die gemessenen Biomarker lediglich eine etablierte Lungeninfektion widerspiegeln. Der zweite entscheidende Schritt ist die Probenhandhabung. Hämolyse, verzögerte Serumtrennung, wiederholte Frost-Tau-Zyklen, Lipämie und unzureichendes Restvolumen können die Zuverlässigkeit der ELISA beeinträchtigen und sollten vor der Analyse dokumentiert werden. Der dritte entscheidende Schritt ist die Akzeptanz der ELISA-Doppelgänger. Der Variationskoeffizient der doppelten Proben sollte innerhalb des vordefinierten Akzeptanzschwellenwerts bleiben, und Proben, die diesen Schwellenwert überschreiten, sollten erneut getestet werden, wenn genügend Serum vorhanden ist. Der vierte entscheidende Schritt ist die DNA-Qualitätskontrolle. Die Reinheit und Konzentration der DNA sollten vor der PCR-Amplifikation überprüft werden, da schlechte DNA-Qualität zu schwachen Bändern, unspezifischer Amplifikation oder Verdauungsfehlern führen kann. Der fünfte entscheidende Schritt ist das Genotyp-Aufruf. PCR-Amplifikation, Restriktionsverdauung, Gelband-Interpretation, unabhängige Genotypzuweisung und wiederholte Genotypisierung ausgewählter Proben sind alle notwendig, um Fehlklassifikationen zu vermeiden.
Häufige Fehlerbehebungspunkte sind ebenfalls wichtig für die zukünftige Nutzung dieses Workflows. Bei ELISA-Tests kann ein hoher Hintergrund auf unvollständige Waschung, kontaminierte Reagenzien, übermäßige Inkubation oder Plattenrandeffekte hinweisen. Ein schwaches Signal kann degradierte Proben, eine falsche Reagenzienpräparation oder eine unzureichende Probenkonzentration widerspiegeln. Inkonsistente Duplikate sollten eine Überprüfung der Pipettgenauigkeit, des Plattenlayouts, der Probenmischung und der Restprobenqualität erforderlich machen. Für die PCR-RFLP-Genotypisierung sollte die fehlgeschlagene Amplifikation zunächst auf DNA-Konzentration, Primerleistung, thermische Zyklenbedingungen und Kontamination in der No-Template-Kontrolle überprüft werden. Verschmieren oder unspezifische Bänder erfordern möglicherweise eine Optimierung der Glühtemperatur, der Schablenmenge oder der Gelkonzentration. Eine unvollständige Restriktionsverdauung kann durch unzureichende Enzymaktivität, falschen Puffer, unzureichende Inkubationszeit oder durch PCR übernommene Inhibitoren verursacht werden. Mehrdeutige Gelbänder sollten nicht direkt zugewiesen werden; sie sollten von zwei blinden Forschern überprüft und bei Bedarf aus der PCR-Amplifikation wiederholt werden.
Auch der Workflow hat technische Einschränkungen. ELISA-Messungen können durch präanalytische Variationen, Matrixeffekte, Lot-zu-Lot-Unterschiede in Bausätzen, Standardkurvenanpassung und begrenzten Dynamikumfang beeinflusst werden. Eine einzige frühe Blutprobe kann die vollständige zeitliche Entwicklung der Entzündungsreaktionen nach ICH nicht beschreiben. PCR-RFLP ist zugänglich und relativ kostengünstig, hat jedoch einen geringeren Durchsatz als sequenzierungsbasierte Methoden und ist auf klare Amplifikation, vollständige Restriktionsverdauung und interpretierbare Gelbänder angewiesen. Einige Polymorphismen erfordern auch alternative Genotypisierungsmethoden, wenn die erwarteten Fragmentgrößen zu nah beieinander liegen, um zuverlässig getrennt zu werden. Darüber hinaus stellen die ausgewählten Loci nur einen Teil des immungenetischen Hintergrunds dar, der für die Infektionsanfälligkeit relevant ist. Daher sollte der derzeitige Arbeitsablauf als strukturierter, reproduzierbarer Ansatz zur gezielten Bewertung von Biomarkern und Polymorphismen interpretiert werden, statt als umfassende immungenomische Plattform.
Zusammengenommen stützen die vorliegenden Ergebnisse eine geschichtete Interpretation der Infektionsanfälligkeit nach spontaner ICH. Basisverwundbarkeit, frühe Entzündungsaktivität und wirtsgenetischer Hintergrund scheinen nicht unabhängig voneinander zu wirken; vielmehr können sie komplementäre Risikodimensionen darstellen. Aus translationaler Sicht könnte die praktische Frührisikobewertung letztlich von einem kombinierten Rahmen profitieren, der klinische Eigenschaften mit Biomarker- und Genotypinformationen integriert, anstatt sich nur auf einen einzelnen Indikatortyp zu verlassen27. Obwohl die vorliegende Studie nicht dazu gedacht war, ein formales Vorhersagemodell zu erstellen oder zu validieren, bieten der standardisierte Workflow, explizite Stichprobenverarbeitungskontrollpunkte, ELISA-Akzeptanzkriterien, Genotypisierungs-Qualitätskontrollschritte und offene Datenstruktur eine Grundlage für die Reproduzierbarkeit in zukünftigen Kohorten28.
Mehrere Einschränkungen auf Studienebene sollten ebenfalls anerkannt werden. Erstens handelte es sich um eine retrospektive Studie mit nur einem Zentrum, was die Generalisierbarkeit einschränken und die Analyse anfällig für Selektionsverzerrungen und ungemessene Störungen macht. Zweitens, obwohl das Stichprobendesign eine zeitliche Lücke zwischen der Blutentnahme und der Ergebnisklassifikation feststellte, kann die Studie die prädiktiven Entzündungssignaturen dennoch nicht vollständig von früh entwickelnden Krankheitsprozessen trennen. Drittens wurden mehrere polymorphe Loci bewertet, und die Ergebnisse erfordern daher eine sorgfältige Interpretation, bis sie in unabhängigen Kohorten repliziert werden. Viertens wurden in der vorliegenden Studie keine externe Validierung und mechanistische Bestätigung durchgeführt. Diese Einschränkungen deuten darauf hin, dass die Studie als klinisch relevante Assoziationssignale und einen reproduzierbaren analytischen Arbeitsablauf verstanden werden sollte, anstatt als endgültigen mechanistischen Beweis.
Zusammenfassend wiesen Patienten mit spontaner ICH, die eine nosokomielle Lungeninfektion entwickelten, ein ungünstigeres klinisches Profil, höhere zirkulierende Zytokine-Spiegel, höhere Serumspiegel von TLR2, TLR4 und TLR9 sowie unterschiedliche Verteilungen mehrerer immunbezogener genetischer Polymorphismen. Der überarbeitete Arbeitsablauf klärt, wie frühe Blutentnahme, Probenqualitätskontrolle, Akzeptanz von ELISA-Duplikaten, DNA-Qualitätsbewertung, PCR-RFLP-Verifikation, Genotypaufrufe und statistische Analyse kombiniert werden können, um reproduzierbare Infektionsrisikoprofilierungen zu unterstützen. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für zukünftige multizentrische Studien, um klinisch anwendbare Strategien der frühen Risikostratifizierung nach spontaner ICH zu validieren.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk haben.
Danksagungen
Die Autoren danken dem klinischen Personal, das an der Patientenversorgung beteiligt ist, sowie den Personen, die bei der Literatursuche und Datenorganisation geholfen haben. Diese Studie wurde vom Jiaxing City Health Science and Technology Planning Project (Zuschussnummer JWKJ-25005).
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | ELISA-Kit für die quantitative Bestimmung von humanem TNF-α in Serum. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | 96-Well-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR2 in Serum- oder Plasmaproben. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | Colorimetrisches Sandwich-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR4 in Serum, Plasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | Colorimetrisches ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR9 in Serumproben. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | Mikroplatten-Reader für ELISA-optische Dichtemessung bei 450 nm mit Referenzkorrektur bei 570 nm. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | Silikamembran-basiertes Kit zur Extraktion genomischer DNA aus antikoaguliertem Vollblut. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Mikrovolumen-Spektrophotometer zur Bestimmung der DNA-Konzentration und A260/A280-Reinheitseinschätzung. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler, der für Endpunkt-PCR-Amplifikation in PCR-RFLP-Genotypisierung verwendet wird. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | Vorgemischtes PCR-Reagenz mit Taq DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl2 und Reaktionspuffer; verwendet für konventionelle PCR-Amplifikation. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | Alternative Enzymquelle für locus-spezifische PCR-Reaktionen, wenn separate PCR-Komponenten anstelle von 2X-Mastermix verwendet werden. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | Molekularbiologie-Grade-Wasser, das für PCR-Setup, DNA-Verdünnung und No-Template-Kontrollen verwendet wird. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Custom synthesis | Locus-spezifische Primer für PCR-RFLP-Genotypisierung; Primersequenzen sind in Supplementary Table S1 aufgeführt. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | Locus-spezifische Enzyme, die in Supplementary Table S1 aufgeführt sind | Restriktionsenzyme, die für die genotypspezifische Verdauung von PCR-Produkten verwendet werden. Das für jeden Locus ausgewählte Enzym sollte dem Verdauungsmuster entsprechen, das in Supplementary Table S1 aufgeführt ist. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | Agarose für die Herstellung von 1,5% und 2,5% Gelen, die zur Bestätigung von PCR-Produkten und zur Auflösung der meisten RFLP-Fragmente verwendet werden. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | DNA-Größenmarkierer für PCR-Amplikonen und Schätzung der RFLP-Fragmentgröße. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | Nukleotid-Gel-Färbung zur Visualisierung von DNA in Agarose- oder Acrylamid-Gelen; wird als weniger gefährliche Alternative zu Ethidiumbromid verwendet. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | Elektrophoresesystem für die Agarose-Gel-Trennung von PCR- und RFLP-Produkten. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | Vertikales Elektrophoresesystem für die 8%ige Polyacrylamid-Gel-Trennung, wenn eine höhere Auflösungsfähigkeit für Fragmentdiskriminierung erforderlich ist. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / equivalent laboratory system | Gel Doc XR+ oder gleichwertig | Bildgebungssystem zur Dokumentation gefärbter DNA-Banden nach Gelelektrophorese. UV-Abschirmung oder Blaulichtmodus verwenden, falls verfügbar. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge | 5424 R oder gleichwertig | Gekühlte Zentrifuge, die für die Serumtrennung bei 1.500 × g und 4 °C verwendet wird. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer | Forma 900 Series oder gleichwertig | Lagerung von Serum-Aliquots vor der ELISA-Analyse. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 25.0 | Statistische Software, die für deskriptive Statistiken, Normalverteilungstests, Gruppenvergleiche, logistische Regression und Export von Modellergebnissen verwendet wird. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel für Microsoft 365 | Verwendet für Datenprüfung, Plattenkartenorganisation, Überprüfung von Duplikatwerten und Vorbereitung zusammengeführter Analysedateien vor der SPSS-Analyse. |
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