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Forschungsartikel
Diese retrospektive Studie präsentiert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die frühe Blutentnahme nach der Aufnahme, die Messung von Serumzytokinen und Toll-ähnlichen Rezeptoren, die Genotypisierung entzündlicher Genpolymorphismen sowie die Bewertung des Infektionsrisikos bei Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung.
Nosokomiale Lungenentzündung ist eine häufige Komplikation nach spontaner intrazerebraler Blutung und kann die neurologische Genesung verschlechtern, den Krankenhausaufenthalt verlängern und die klinische Belastung erhöhen. Diese retrospektive klinische Laborstudie präsentiert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Bewertung der immungenetischen Profile von entzündlichen Biomarkern und Wirts, die mit einer nosokomialen Lungeninfektion nach primärer spontaner intrazerebraler Blutung assoziiert sind. Die Patienten werden danach klassifiziert, ob eine nosokomiale Lungeninfektion nach der Aufnahme auftritt. Peripheres venöses Blut wird in der frühen Zeit nach der Aufnahme unter standardisierten präanalytischen Bedingungen gesammelt. Das Serum wird getrennt, aliquotiert und für enzymgebundene Immunsorbent-Assay-Messungen von IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 und TLR9 gelagert. Parallel dazu wird genomische DNA aus antikoaguliertem Vollblut extrahiert und für die Polymorphismus-Polytypisierung ausgewählter zytokin- und toll-ähnlicher Rezeptor-bezogener Loci verwendet. Der Arbeitsablauf umfasst außerdem Qualitätskontrollverfahren für die Probenhandhabung, doppelte ELISA-Messungen, DNA-Reinheitsbewertung, Genotypaufrufe und wiederholte Genotypisierung. Die statistische Analyse umfasst den Vergleich klinischer Eigenschaften und Biomarker-Niveaus zwischen Gruppen, Hardy-Weinberg-Gleichgewichtstests, logistische Regressionsanalysen für Genotyp- und Allelassoziationen, Anpassung für relevante klinische Kovariaten und Korrektur der Falschentdeckungsrate für mehrere genetische Vergleiche. Dieser kombinierte klinische, inflammatoriske und immungenetische Workflow kann helfen, Infektionsrisikoprofile nach einer spontanen intrazerebralen Blutung zu charakterisieren, obwohl eine prospektive multizentrische Validierung vor der routinemäßigen klinischen Anwendung weiterhin erforderlich ist.
Die spontane intrazerebrale Blutung (ICH) ist ein schwerer Subtyp des Schlaganfalls, der durch einen nicht-traumatischen Riss der Gehirngefäße verursacht wird und weiterhin eine Hauptursache für neurologischen Tod und Behinderungen ist. Klinisch wird ICH üblicherweise als primär oder sekundär klassifiziert. Primäre ICH ist für die meisten Fälle verantwortlich und steht hauptsächlich im Zusammenhang mit der hypertensiven Arteriopathie oder zerebraler Amyloidangiopathie1. Im Gegensatz dazu ist sekundäre ICH mit strukturellen oder hämatologischen Ursachen verbunden, darunter Aneurysmen, arteriovenöse Malformationen, Moyamoya-Krankheit und Gerinnungsstörungen. Obwohl ICH einen geringeren Anteil aller Schlaganfallereignisse ausmacht als der ischämische Schlaganfall, führt er eine überproportional hohe kurzfristige Sterblichkeit und langfristige funktionelle Belastung(2,3,4,5).
Unter den wichtigsten Komplikationen im Krankenhaus nach ICH ist die nosokomiale Lungenentzündung besonders häufig und klinisch bedeutsam. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Lungeninfektion bei einem erheblichen Anteil der hospitalisierten Patienten nach Schlaganfall oder intrazerebraler Blutung auftreten kann und mit längeren Krankenhausaufenthalten, höherer medizinischer Belastung, schlechterer neurologischer Genesung und erhöhter Sterblichkeit assoziiert ist. Die klinische Bedeutung dieser Komplikation geht über das rein rein rein respiratorische Management hinaus. Verringertes Bewusstsein, eingeschränkte Schluck- und Hustenreflexe, Immobilisierung, mechanische Atemwegsunterstützung und invasive Entwässerungsverfahren können das Infektionsrisiko während der akuten Phase nach ICH erhöhen. Gleichzeitig kann eine Lungeninfektion die systemische Entzündung weiter verschlimmern, die Sauerstoffversorgung beeinträchtigen und die neurokritische Versorgung erschweren, wodurch sekundäre Verletzungsprozesse verstärkt werden.
Diese Beziehung ist biologisch plausibel, da ICH nicht nur ein fokales zerebrovaskuläres Ereignis ist, sondern auch ein Auslöser systemischer Immundysregulation. Eine akute Gehirnblutung kann entzündliche Kaskaden aktivieren, die angeborene Immunsignale verändern und das Gleichgewicht zwischen Neuroinflammation und peripherer Wirtsabwehr stören. In diesem Zusammenhang können einige Patienten auch unter ähnlicher klinischer Behandlung anfälliger für krankenhauserworbene Infektionen werden. Daher sollte eine Lungeninfektion nach ICH nicht ausschließlich als Folge von Bettkontakt oder unterstützender Versorgung betrachtet werden; Sie kann auch Unterschiede in der Aktivierung der Entzündung des Wirts und der Immunreaktion widerspiegeln.
Trotz der klinischen Relevanz dieser Komplikation bleiben praktische Ansätze zur frühen Risikostratifizierung begrenzt9. Bestehende klinische Risikostratifizierungsansätze für post-ICH-Lungeninfektionen basieren im Allgemeinen auf Variablen am Bett und Aufnahme, wie neurologische Schwere oder Alter, Schluckbeeinträchtigung, Begleiterkrankungen, invasive Verfahren und die Dauer der Geräteexposition. Diese Werkzeuge sind klinisch nützlich, da sie schnell in Notaufnahmen, Intensivstationen oder neurokritischen Einrichtungen eingesetzt werden können. Allerdings erklären klinische Variablen allein möglicherweise nicht vollständig, warum Patienten mit vergleichbarer neurologischer Schwere und ähnlicher Behandlungsexposition unterschiedliche Infektionsergebnisse zeigen. Entzündungsbiomarker und immungenetische Faktoren des Wirts können daher zusätzliche Informationen über die biologische Anfälligkeit liefern, insbesondere in der frühen Zeit nach der Aufnahme, wenn präventive Überwachung und Atemwegsmanagement getroffen werden.
Zytokine sind zentrale Vermittler von Immun- und Entzündungsreaktionen, und Toll-like-Rezeptor-(TLR)-Wege spielen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung von Krankheitserregern und der angeborenen Immunaktivierung. Serum-Zytokin- und TLR-Proteinmessungen können einen Überblick über die frühe systemische Entzündungsaktivierung liefern, während ausgewählte Immungen-Polymorphismen stabilere Unterschiede in der Zytokinproduktion, der Rezeptor-Signalübertragung oder der Entzündungsregulation widerspiegeln können. Im Vergleich zur klinischen Beurteilung allein kann ein kombinierter Biomarker- und Polymorphismus-Workflow sowohl den aktuellen entzündlichen Zustand als auch die zugrunde liegende Immunantwort jedes Patienten erfassen. Dieser Ansatz soll die klinische Beurteilung am Bett nicht ersetzen, sondern sie ergänzen, indem Labor- und wirtsgenetische Informationen hinzugefügt werden, die helfen können, Patienten zu identifizieren, die eine genauere Überwachung der Infektion nach einer spontanen ICH benötigen.
Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass Patienten mit spontaner ICH, die eine nosokomiale Lungeninfektion entwickeln, ein ausgeprägtes Entzündungsprofil sowie eine andere Verteilung ausgewählter immunbezogener genetischer Polymorphismen aufweisen als Patienten, die weiterhin frei von Infektion sind. Um diese Hypothese zu testen, analysierte die vorliegende retrospektive klinische Laborstudie frühe Serumzytokine nach der Aufnahme, Serumproteinwerte von TLR2, TLR4 und TLR9 sowie ausgewählte entzündliche Genpolymorphismen bei Patienten mit primärer spontaner ICH. Der Workflow verwendet peripheres Blut, das während akuter Krankenhausaufenthalte entnommen wurde, ELISA-basierte Proteinquantifizierung, PCR-RFLP-basierte Genotypisierung und statistische Vergleiche zwischen Patienten mit und ohne nosokomiale Lungeninfektion. Ziel war es, einen reproduzierbaren Rahmen zur Charakterisierung von entzündlichen und wirtsgenetischen Profilen im Zusammenhang mit Infektionsrisiko bereitzustellen und so die frühere Erkennung von Hochrisikopatienten im akuten Krankenhausbereich zu unterstützen.
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Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des angeschlossenen Krankenhauses der Jiaxing-Universität, des ersten Krankenhauses von Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China (Genehmigungsnummer 2025-LP-599) genehmigt. Alle Verfahren, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt waren, wurden gemäß den institutionellen Anforderungen und den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Vor der Probenentnahme wurde eine schriftliche informierte Zustimmung zur Blutentnahme und Datennutzung von allen Teilnehmern und/oder deren gesetzlich bevollmächtigten Vertretern eingeholt.
Alle kommerziellen Bausätze, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Instrumente, Software, Hersteller, Katalognummern und wichtige Betriebsspezifikationen, die in diesem Workflow verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Studienumfang, Eignung und Patientengruppe
Diese Studie wurde als retrospektive klinische Kohortenanalyse mit einem einzigen Zentrum durchgeführt, bei der Patienten mit primärer spontaner intracerebraler Blutung (ICH) aufgenommen wurden, die zwischen Mai 2019 und September 2024 in das Notfall- und Intensivzentrum oder die Intensivstation des angeschlossenen Krankenhauses der Jiaxing-Universität, dem ersten Krankenhaus von Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, China, aufgenommen wurden. Die Diagnose ICH wurde durch eine Schädel-Computertomographie oder Magnetresonanztomographie gemäß den chinesischen Leitlinien zur Diagnose und Behandlung von Zerebralblutungen (2019)10 bestätigt.
Die Patienten waren berechtigt, wenn sie bildgebend bestätigte primäre spontane ICH hatten, innerhalb von 3 Tagen nach Symptombeginn aufgenommen wurden und vollständige wichtige klinische Variablen sowie verfügbare periphere Blutproben zur Messung der entzündlichen Biomarker und genetische Analysen vorsahen. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie traumatische intrakranielle Blutungen, sekundäre ICH, eine Lungeninfektion vor der Aufnahme oder innerhalb von 48 Stunden nach der Aufnahme, Entlassung gegen ärztlichen Rat oder Tod innerhalb von 48 Stunden nach der Aufnahme, eine Vorgeschichte von Malignität oder Autoimmunerkrankungen oder unvollständige wichtige klinische, laborbasierte oder genotypische Aufzeichnungen aufwiesen. Nach dem Screening erfüllten 360 Patienten die Zulassungskriterien und wurden in die Endanalyse einbezogen. Unter ihnen entwickelten 180 Patienten während des Krankenhausaufenthalts eine nosokomiale Lungenentzündung, 180 Patienten nicht. Die Patienten wurden der Gruppe für Lungeninfektionen oder der Gruppe ohne Lungeninfektion zugeordnet, je nachdem, ob eine nosokomiale Lungeninfektion nach der Aufnahme auftrat.
Vor der endgültigen Gruppierung wurden bildgebende Diagnose, Aufnahmezeit, Infektionszeitpunkt, Verfügbarkeit von Blutproben sowie die Vollständigkeit der klinischen und Laborunterlagen überprüft. Dieser Schritt wurde eingesetzt, um Fehlklassifizierungen zu reduzieren und sicherzustellen, dass alle eingeschlossenen Fälle vollständige Daten für den klinischen Vergleich, die Messung entzündlicher Biomarker und die Genotypisierung enthielten.
Definition der nosokomialen Lungeninfektion
Die nosokomiale Lungeninfektion wurde auf der Grundlage radiologischer Evidenz in Kombination mit klinischen Kriterien11 definiert. Die radiologische Bestätigung erforderte eine neue oder fortschreitende Infiltration, Konsolidierung oder Schleifglasläsion auf der Röntgen- oder Computertomographie. Zusätzlich mussten mindestens zwei der folgenden Kriterien vorliegen: Körpertemperatur > 38 °C, eitrige Atemsekrete oder eine abnormale periphere Anzahl weißer Blutkörperchen mit weißen Blutkörperchen < 4 × 109/L oder > 10 × 109/L.
Lungeninfektionen, die vor der Aufnahme vorhanden oder innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Aufnahme diagnostiziert wurden, wurden nicht als nosokomiale Lungeninfektion klassifiziert. Die Infektionsklassifikation wurde anhand radiologischer Berichte, Körpertemperaturaufzeichnungen, Dokumentation von Atemsekreten, peripheren Blutbildergebnissen und klinischen Diagnoseunterlagen bestätigt.
Biosicherheit und Abfallentsorgung
Menschliches Blut, Serum und blutbasierte DNA wurden unter den Standardvorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe 2 behandelt. Das Laborpersonal trug Handschuhe, Labormäntel, Masken und Schutzbrillen während der Blutbehandlung, Serumaliquotierung, ELISA-Tests, DNA-Extraktion, PCR-Präparation, Gelelektrophorese, Restriktionsverdauung und UV-Visualisierung. Die Blutröhrchen wurden vor der Verarbeitung auf Leckage oder Bruch überprüft. Die Zentrifugation erfolgte mit verschlossenen Röhren oder, wo verfügbar, versiegelten Zentrifugenschaufeln.
Scharfe Gegenstände wurden sofort in genehmigte Behälter entsorgt. Blutkontaminierte Schläuche, Pipettenspitzen, Handschuhe, ELISA-Platten und andere Einwegverbrauchsmaterialien wurden als biologischer Laborabfall entsorgt. Flüssiger biologischer Abfall wurde gemäß institutionellen Verfahren vor der Entsorgung desinfiziert. Agarose-Gele, Polyacrylamid-Gele, Farbstoffreagenzien und elektrophorese-bezogene Materialien wurden gemäß institutionellen Anforderungen an chemische und Laborabfälle entsorgt.
PCR-Reagenzienpräparation, Hinzufügen von DNA-Vorlagen, verstärkter Produkthandhabung, Restriktionsverdauung und Gelelektrophorese wurden so weit wie möglich getrennt, um die Kontamination zu reduzieren. Aerosolresistente Pipettenspitzen wurden für PCR- und DNA-Handhabung verwendet. Die UV-Visualisierung erfolgte ausschließlich mit einem Schutzschild oder Gel-Dokumentationssystem, und direkte Exposition von Augen oder Haut gegenüber UV-Licht wurde vermieden.
Periphere Blutentnahme und Probenaufbereitung
Um die präanalytische Variation zu verringern, wurden um 08:00 Uhr am Morgen nach der Aufnahme 10 ml peripheres venöses Blut entnommen, nach einem nächtlichen Fasten von mindestens 12 Stunden. 5 ml Blut wurden in ein einfaches Vakuumröhrchen zur Serumpräparation entnommen, und die restlichen 5 ml wurden in ein heparinisiertes Rohr zur genomischen DNA-Extraktion entnommen.
Vor der Bearbeitung wurde jede Sonde auf Patientenkennung, Entnahmezeit, Tubentyp, Blutvolumen, Leckage, sichtbare Gerinnung und grobe Hämolyse überprüft. Proben mit falscher Markierung, unzureichendem Blutvolumen, Röhrenlecks oder sichtbarer Gerinnung im antikoagulierten Röhrchen wurden von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen. Das Blut im einfachen Röhrchen wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten gerinnt und dann bei 1.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Serumsupernatant wurde ohne Störung der Zellschicht in sterile Polypropylenröhren mit niedriger Proteinbindung übertragen, in 0,5 mL-Fraktionen aliquotiert und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert.
Proben mit sichtbarer moderater oder schwerer Hämolyse wurden von der ELISA-basierten Quantifizierung ausgeschlossen. Leicht hemolysierte Proben wurden aufgenommen und nicht für die primäre Zytokinanalyse verwendet. Proben mit sichtbarer Trübung, offensichtlicher Lipämie, unzureichendem Restvolumen oder wiederholter Frost-Tau-Exposition wurden vor den Tests markiert. Kein Serum-Aliquot durchlief mehr als einen Frost-Tau-Zyklus vor der Analyse.
Zytokinquantifizierung durch ELISA
Serumkonzentrationen von IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ und TNF-α wurden mit kommerziell erhältlichen menschlichen Sandwich-ELISA-Kits gemessen, die für Serumproben validiert wurden. Serumaliquoten wurden aufgetaut, vorsichtig gemischt und vor dem Laden auf Hämolyse, Trübung, Lipämie, unzureichendes Volumen und Frost-Tau-Vorgeschichte untersucht.
Standards, Blankwellen und Serumproben wurden doppelt geladen. Standardkurven wurden auf jeder Platte durch serielle Verdünnungen der Standardkonzentrationen und eine Blank-Steuerung gemäß den Bausätzen erzeugt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen, mit einer Referenzkorrektur bei 570 nm, unter Verwendung eines kalibrierten Mikroplattenlesers. Die Konzentrationen wurden mittels Anpassung der logistischen Kurve mit vier Parametern berechnet.
Assay-Ergebnisse wurden nur akzeptiert, wenn die Standardkurve ein angemessenes Konzentrations-Antwort-Muster zeigte, leere Bohrlöcher einen niedrigen Hintergrund zeigten und der doppelte Proben-Variationskoeffizient ≤ 10 % betrug. Proben mit doppelter CV > 10 % wurden aus dem ursprünglichen Serum-Aliquot erneut getestet, sobald genügend Volumen vorhanden war. Proben außerhalb des zuverlässigen Standardkurvenbereichs wurden gemäß den Kit-Anweisungen verdünnt oder wiederholt. Platten mit uneinheitlichen Normen, übermäßigem Hintergrund oder offensichtlichen Randeffekten wurden wiederholt.
Die niedrigeren analytischen Detektionsgrenzen für die Datenakzeptanz betrugen 2,0 pg/mL für IL-1β, 1,5 pg/mL für IL-6, 2,0 pg/mL für IL-10, 3,0 pg/mL für IL-17, 4,0 pg/mL für IFN-γ und 2,5 pg/mL für TNF-α. Die endgültigen Zytokinwerte wurden vor der statistischen Analyse mit Probenkennungen, Plattenkarten, doppelten Auslesedaten und Probenqualitätsnotizen abgeglichen.
Quantifizierung von Serum TLR2, TLR4 und TLR9 durch ELISA
Die Serumproteinwerte TLR2, TLR4 und TLR9 wurden mit kommerziell erhältlichen humanen ELISA-Kits gemessen, die für Serumproben validiert waren. Serumproben wurden aufgetaut, sanft gemischt und nach denselben Qualitätskriterien für die Zytokinmessung inspiziert.
Normen, Leerbrunnen und Serumproben wurden doppelt analysiert. Die Platten wurden bei 450 nm mit Referenzkorrektur bei 570 nm abgelesen, und die Konzentrationen wurden mittels vierparametriger logistischer Regression berechnet. Die Ergebnisse wurden akzeptiert, wenn die Standardkurve gültig war, leere Brunnen im erwarteten Hintergrundbereich lagen und das doppelte CV ≤ 10 % betrug. Proben, die diese doppelte CV-Schwelle überschritten, wurden erneut getestet, wenn genügend Proben vorhanden waren.
Die niedrigeren analytischen Detektionsgrenzen, die für die Akzeptanz des Ergebnisses verwendet wurden, betrugen 0,10 ng/mL für TLR2, 0,12 ng/mL für TLR4 und 0,15 ng/mL für TLR9. Die endgültigen TLR2-, TLR4- und TLR9-Werte wurden vor der statistischen Analyse mit Stichprobenkennungen, Plattenkarten, doppelten Ausleseaufzeichnungen und Stichprobenqualitätsnotizen überprüft.
Genomische DNA-Extraktion
Genomische DNA wurde aus heparin-antikoaguliertem Vollblut mit einem auf Siliziumdioxid basierenden Blut-DNA-Extraktionskit extrahiert. Vor der Entnahme wurden antikoagulierte Blutproben auf korrekte Markierung, ausreichendes Volumen, sichtbare Gerinnung, Leckage und Lagerzustand überprüft.
Die Reinheit und Konzentration der DNA wurden mittels Spektrophotometrie bewertet. Für die nachgelagerte PCR-Verstärkung wurden nur Proben mit einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,80 und 2,00 akzeptiert. Proben außerhalb dieses Bereichs wurden nach vorsichtigem Mischen neu vermessen. Wenn das abnormale Reinheitsverhältnis bestand, wurde die DNA-Entnahme wiederholt, wenn genügend Vollblut vorhanden war.
DNA wurde mit nukleasefreiem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 50 ng/μL verdünnt und bei -20 °C bis zur PCR-Amplifikation gespeichert. Vor der PCR-Einrichtung wurde jede DNA-Probe auf Konzentration, Reinheit, Probenkennung und Gefrier-Tau-Geschichte überprüft.
PCR-RFLP-Genotypisierung und Genotypaufruf
Die Genotypisierung erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktions-Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (PCR-RFLP) für IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 bis 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T und IFN-γ +2108 A/G. Locus-spezifische Primersequenzen, erwartete Amplicongrößen, Restriktionsenzyme und genotypspezifische Verdautungsmuster sind in Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.
Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem Endreaktionsvolumen von 25 μL mit 2,5 μL 10 × Puffer, 2,0 μL dNTP-Gemisch bei jeweils 2,5 mM, 1,0 μL Forward Primer bei 10 μM, 1,0 μL Reverse Primer bei 10 μM, 0,25 μL Taq-DNA-Polymerase bei 5 U/μL, 2,0 μL genomischer DNA bei 50 ng/μL, und 16,25 μL nukleasefreies Wasser. Die PCR-Mastermischung wurde in einem sauberen Pre-PCR-Bereich vorbereitet, und die DNA-Schablone wurde zuletzt hinzugefügt. Bei jedem PCR-Durchlauf wurde eine negative Kontrolle ohne Vorlage eingebaut.
Das thermische Profil bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Denaturationszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, einer Glühung bei 58–62 °C für 30 Sekunden je nach Primerpaar und einer Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 7 Minuten. PCR-Produkte wurden zuerst mit 1,5 % Agarosegel vor der Restriktionsverdauung bestätigt.
PCR-Verstärkung wurde nur akzeptiert, wenn das erwartete Ampliconband sichtbar war, und die Kontrolle ohne Vorlage zeigte keine Verstärkung. Reaktionen mit schwachen Bändern, unspezifischer Amplifikation, Primer-Dimer-Interferenz oder Kontamination in der negativen Kontrolle wurden aus der ursprünglichen DNA-Vorlage wiederholt.
PCR-Produkte wurden mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease bei 37 °C für 3 Stunden in einem Gesamtverdautungsvolumen von 15 μL gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Die verdauten Fragmente wurden bei den meisten Loci mit 2,5 % Agarosegel aufgelöst. Der TLR2-196 bis -174 ins/del-Locus wurde mit 8%-Polyacrylamid-Gel aufgelöst, um die Fragment-Diskriminierung zu verbessern.
Die Restriktionsverdauung wurde nur akzeptiert, wenn die Fragmentmuster dem erwarteten genotypspezifischen Verdauungsprofil entsprachen. Reaktionen mit unvollständiger Verdauung, verschmierten Bändern, unerwarteten Fragmentgrößen oder unklarer Trennung wurden wiederholt. Die Bänder wurden nach der Nukleinsäurefärbung unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht. Gel-Bilder wurden mit der Probenkennung, dem Locusnamen, dem Laufzeitdatum und der Gelnummer gespeichert.
Die Genotypzuweisung wurde unabhängig von zwei verblindeten Laborforschern durchgeführt. Dissonante oder mehrdeutige Genotyprufe wurden mit dem ursprünglichen Gelbild überprüft und bei Bedarf aus der PCR-Amplifikation wiederholt. Zehn Prozent der zufällig ausgewählten Proben wurden zur Qualitätskontrolle neu genotypisiert, und die Konkordanzrate betrug 99,2 %. Endgültige Genotypdaten wurden erst nach Überprüfung von Probenkennungen, Locusnamen, Genotypaufrufen und Qualitätskontrolldaten in den Analysedatensatz eingetragen.
Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit einer geeigneten Analysesoftware durchgeführt. Die klinischen, ELISA- und Genotypdatensätze wurden mithilfe von de-identifizierten Patientencodes zusammengeführt. Die Patientencodes wurden vor der Analyse auf Duplikationen, Fehlanpassungen und fehlende Werte überprüft. Es wurde eine Complete-Case-Strategie verwendet, da allen eingeschlossenen Patienten wichtige klinische, inflammatoriske und genotypische Daten zur Verfügung standen.
In einer geeigneten statistischen Analysesoftware wurde der Lungeninfektionsstatus als Gruppenvariable kodiert, wobei die Gruppe ohne Lungeninfektion als Referenzkategorie verwendet wurde. Kontinuierliche Variablen wurden zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität getestet. Normalverteilte kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt und mit dem unabhängigen Stichprobentest Student's t verglichen. Nicht-normalverteilte kontinuierliche Variablen wurden als Medianer mit Interquartilbereichen angegeben und mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Kategoriale Variablen wurden als Zählungen und Prozentsätze ausgedrückt und je nach Bedarf mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem Fisher-Exakt-Test verglichen.
Die Genotypverteilungen in der Gruppe ohne pulmonale Infektion wurden vor der Assoziationsanalyse auf das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht untersucht. Genotyp- und Allelhäufigkeiten wurden mit n (%) zusammengefasst. Odds Ratios und 95%-Konfidenzintervalle für das Lungeninfektionsrisiko wurden mittels multivariabler logistischer Regressionsmodelle geschätzt. Der Lungeninfektionsstatus wurde als abhängige Variable eingetragen. Genotyp-, Allel- oder Biomarkervariablen wurden als unabhängige Variablen angegeben, wie für jede Analyse angegeben.
Alter und Geschlecht wurden a priori in das primäre Modell eingegeben. BMI, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Herzerkrankungen, Leckage von Liquengruna, Verweilzeit des Abflusses und die Aufnahme-Glasgow-Koma-Skala-Kategorie wurden gleichzeitig in das vollständig angepasste Modell eingegeben, da diese Variablen klinisch relevant waren oder ein Ausgangsungleichgewicht zwischen den Gruppen zeigten. Die Multikollinearität wurde mit Varianzinflationsfaktoren (VIFs) bewertet, und VIFs <5,0 galten als akzeptabel.
Da mehrere Polymorphismen getestet wurden, wurde die Korrektur der Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate auf die genetischen Assoziationsanalysenangewandt 12. P-Werte aus den genetischen Assoziationstests wurden vom kleinsten bis zum größten eingestuft, und die korrigierte Signifikanz wurde nach dem Benjamini-Hochberg-Verfahren bestimmt. Alle Tests waren beidseitig, und P <0,05 galt als statistisch signifikant, sofern nach Mehrfachvergleichsanpassung nichts anderes angegeben wurde.
Die endgültigen Ergebnisse wurden vor der Erstellung des Manuskripts mit dem Quelldatensatz, ELISA-Qualitätskontrolldatensätzen, Genotypaufruf-Datensätzen und Tabellenwerten überprüft. Die Ergebnisse wurden als Assoziationen und nicht als kausale Effekte interpretiert, da die Studie ein retrospektives Beobachtungsdesign verwendete.
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Klinische Indikatoren
Die klinischen Ausgangsmerkmale sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Insgesamt wurden 360 Patienten mit spontaner intrazerebraler Blutung in die Endanalyse eingeschlossen, darunter 180 Patienten, die während des Krankenhausaufenthalts eine nosokomiale Lungeninfektion entwickelten, und 180 Patienten, die dies nicht taten. Es gab keine signifikanten Altersunterschiede zwischen den Gruppen (62,4 Jahre ± 6,8 Ja...
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Die spontane intrazerebrale Blutung (ICH) bleibt eine der schwersten Schlaganfallsubtypen und verursacht weiterhin erhebliche Frühsterblichkeits- und langfristige Erwerbsbelastungen13. In der klinischen Praxis sind Patienten mit ICH besonders anfällig für Komplikationen im Krankenhaus, da neurologische Verletzungen den Atemwegsschutz schwächen, die Wirksamkeit des Hustens verringern, die Mobilität einschränken und die Exposition gegenüber invasiven unterstützenden...
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk haben.
Die Autoren danken dem klinischen Personal, das an der Patientenversorgung beteiligt ist, sowie den Personen, die bei der Literatursuche und Datenorganisation geholfen haben. Diese Studie wurde vom Jiaxing City Health Science and Technology Planning Project (Zuschussnummer JWKJ-25005).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | ELISA-Kit für die quantitative Bestimmung von humanem TNF-α in Serum. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | 96-Well-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR2 in Serum- oder Plasmaproben. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | Colorimetrisches Sandwich-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR4 in Serum, Plasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | Colorimetrisches ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem TLR9 in Serumproben. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | Mikroplatten-Reader für ELISA-optische Dichtemessung bei 450 nm mit Referenzkorrektur bei 570 nm. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | Silikamembran-basiertes Kit zur Extraktion genomischer DNA aus antikoaguliertem Vollblut. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Mikrovolumen-Spektrophotometer zur Bestimmung der DNA-Konzentration und A260/A280-Reinheitseinschätzung. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler, der für Endpunkt-PCR-Amplifikation in PCR-RFLP-Genotypisierung verwendet wird. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | Vorgemischtes PCR-Reagenz mit Taq DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl2 und Reaktionspuffer; verwendet für konventionelle PCR-Amplifikation. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | Alternative Enzymquelle für locus-spezifische PCR-Reaktionen, wenn separate PCR-Komponenten anstelle von 2X-Mastermix verwendet werden. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | Molekularbiologie-Grade-Wasser, das für PCR-Setup, DNA-Verdünnung und No-Template-Kontrollen verwendet wird. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Custom synthesis | Locus-spezifische Primer für PCR-RFLP-Genotypisierung; Primersequenzen sind in Supplementary Table S1 aufgeführt. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | Locus-spezifische Enzyme, die in Supplementary Table S1 aufgeführt sind | Restriktionsenzyme, die für die genotypspezifische Verdauung von PCR-Produkten verwendet werden. Das für jeden Locus ausgewählte Enzym sollte dem Verdauungsmuster entsprechen, das in Supplementary Table S1 aufgeführt ist. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | Agarose für die Herstellung von 1,5% und 2,5% Gelen, die zur Bestätigung von PCR-Produkten und zur Auflösung der meisten RFLP-Fragmente verwendet werden. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | DNA-Größenmarkierer für PCR-Amplikonen und Schätzung der RFLP-Fragmentgröße. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | Nukleotid-Gel-Färbung zur Visualisierung von DNA in Agarose- oder Acrylamid-Gelen; wird als weniger gefährliche Alternative zu Ethidiumbromid verwendet. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | Elektrophoresesystem für die Agarose-Gel-Trennung von PCR- und RFLP-Produkten. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | Vertikales Elektrophoresesystem für die 8%ige Polyacrylamid-Gel-Trennung, wenn eine höhere Auflösungsfähigkeit für Fragmentdiskriminierung erforderlich ist. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / equivalent laboratory system | Gel Doc XR+ oder gleichwertig | Bildgebungssystem zur Dokumentation gefärbter DNA-Banden nach Gelelektrophorese. UV-Abschirmung oder Blaulichtmodus verwenden, falls verfügbar. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge | 5424 R oder gleichwertig | Gekühlte Zentrifuge, die für die Serumtrennung bei 1.500 × g und 4 °C verwendet wird. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer | Forma 900 Series oder gleichwertig | Lagerung von Serum-Aliquots vor der ELISA-Analyse. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 25.0 | Statistische Software, die für deskriptive Statistiken, Normalverteilungstests, Gruppenvergleiche, logistische Regression und Export von Modellergebnissen verwendet wird. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel für Microsoft 365 | Verwendet für Datenprüfung, Plattenkartenorganisation, Überprüfung von Duplikatwerten und Vorbereitung zusammengeführter Analysedateien vor der SPSS-Analyse. |
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