Methodenartikel

Mikrovaskuläre Perfusion überwacht durch Laser-Speckle-Kontrastbildgebung während der Nierenischämie-Reperfusionsverletzung bei Mäusen

DOI:

10.3791/70762

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27. Februar 2026

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1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystem wurde verwendet, um die Veränderungen im renalen mikrovaskulären Blutfluss während einer einseitigen Nierischämie-Reperfusion nach der Resektion der rechten Niere bei Mäusen zu überwachen.

Zusammenfassung

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Die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) ist eine nicht-invasive Technik zur Messung der oberflächlichen Blutperfusion über große Flächen. Mit seiner hohen raumzeitlichen Auflösung quantifiziert LSCI heterogene Blutflussveränderungen in verschiedenen Bereichen des abgebildeten Bereichs halb. Hier demonstrieren wir die Technik des LSCI zur Aufzeichnung des Blutflusses während einer einseitigen Nierenischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) bei Mäusen. Nach der rechten Nephrektomie wurden die Position der Maus und der Fokuspunkt des Ziels des LSCI-Systems angepasst, um sicherzustellen, dass die linke Niere im Sichtfeld war. LSCI-Scans wurden vor, während und nach der Ischämie der Niere durchgeführt. Darüber hinaus wurde durch die Auswahl von Interesseregionen (ROIs) gleichzeitig der Blutfluss in den Regionen überwacht. Die Methode des LSCI visualisiert die mikrovaskuläre Perfusion der Niere und ermöglicht eine Echtzeitkartierung des Blutflusses. Es kann verwendet werden, um den mikrovaskulären Blutfluss zu überwachen und die Wirkung einer Intervention auf die Reperfusionskinetik und räumliche Homogenität während meines Nieren-IRI oder ähnlicher Tiermodelle zu bewerten.

Einleitung

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Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) gehört zu den Hauptursachen für akute Nierenschäden (AKI), die mit hoher Morbidität und hoher Sterblichkeit bei Patienten assoziiertist 1,2. Die Veränderung der Nierenhämodynamik ist einer der entscheidenden Faktoren für IR-induzierte AKI1. Die durch IR-ausgelöste Mikrozirkulationsstörung ist eine Hauptursache für die Entstehung von Verletzungen, was zu Sauerstoffmangel und mitochondrialer Funktionsstörung der Zellenführt. Daher ist die Überwachung von Blutflussänderungen in Echtzeit eine effektive Methode, um eine erfolgreiche Ischämie oder Reperfusion der Niere sicherzustellen und den IRI-Grad in Tiermodellen der Erkrankung zu bewerten.

Es gibt mehrere Techniken zur Messung der mikrovaskulären Perfusion von Geweben, darunter Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF)5, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase (NADH) Autofluoreszenzbildgebung 6,7,8, Infrarotbildgebung 9 und Indokyanin-Grün-(ICG)-Angiographie10. Dazu zählen Infrarotbildgebung und NADH-Autofluoreszenzbildgebung indirekt die mikrovaskuläre Perfusion. LDF überwacht mit einer optischen Sonde nur den regionalen Blutfluss5, und das Scannen von LDF ist nicht schnell genug, um die Echtzeitveränderungen der mikrovaskulären Gewebeperfusion unter I/R-Bedingungen11 zu überwachen. Die ICG-Angiographie kann auch nierenblockierte Gefäßeidentifizieren 10, erfordert jedoch die Verabreichung eines Kontrastmittels, das seine Anwendung auf eine begrenzte Anzahl von Messungen beschränkt12. Die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) ist eine effiziente, nicht-invasive Methode zur Überwachung der Nierenmikroperfusion in Echtzeit13. Es wurde verwendet, um räumlich aufgelöste Informationen im Zusammenhang mit der Blutflussdynamik zu erzeugen. Wenn ein kohärenter Strahl auf eine raue Oberfläche gestrahlt wird, interferieren sich die reflektierten oder gestreuten Lichtwellen aufgrund winziger Wegunterschiede gegenseitig und bilden eine zufällige Verteilung von hellen und dunklen Flecken, die als "Speckle" bekannt sind. LSCI kartiert die Geschwindigkeit des Blutflusses in oberflächlichen Geweben, indem es den Grad der Unschärfe des "dynamischen Speckels" analysiert, der entsteht, wenn Laserlicht das Gewebe bestrahlt. In dieser Studie arbeitete das LSCI-System mit einer Laserwellenlänge von 785 nm und einer räumlichen Auflösung von 3 μm, einem Sichtfeld zwischen 6,3 mm × 4,7 mm und 42 mm × 31 mm sowie einer Bildverarbeitungsgeschwindigkeit von bis zu 120 Bildern pro Sekunde, was eine hochauflösende, Echtzeit-Kartierung der kortikalen mikrovaskulären Perfusion ermöglichte. Angesichts dieser Vorteile wurde LSCI in verschiedenen experimentellen und klinischen Kontexten zur Überwachung des Blutflusses eingesetzt, darunter Brandwunden16, Netzhautoperfusion17, zerebrale Durchblutung18, Speiseröhre19 und Darm20.

Es sollte beachtet werden, dass LSCI hauptsächlich die Perfusion in oberflächlichem Gewebe bewertet, relative statt absolute Flusswerte liefert und durch optische Eigenschaften und Bewegungsartefakte des Gewebes beeinflusst werden kann. Diese inhärenten Eigenschaften werden bei der Interpretation der Bilddaten berücksichtigt.

Diese Arbeit, bei der ein Modell mit einer rechten Nephrektomie verwendet wurde, um die Exposition und Bildgebung der kontralateralen Niere zu ermöglichen, überwachte die Veränderungen der mikrovaskulären Perfusion vor, während und nach der Ischämie in einem einseitigen nieren-I/R-Mausmodell mittels LSCI und zeigte die räumliche Heterogenität des Blutflusses auf der Nieroberfläche.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren entsprachen dem NIH-Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren sowie dem Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Shantou University Medical College genehmigt. Um geschlechts- und stammbasierte Unterschiede in den IRI-Effekten zu eliminieren, wurden in der Studie nur männliche C57BL/6N-Mäuse verwendet. Alle Mäuse wurden in Alter und Gewicht abgestimmt, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Eine Stichprobengröße von n = 5 wurde verwendet, was mit früheren methodischen Studien übereinstimmt, die LSCI für die technische Validierungverwendeten. Die Tiere erhielten eine humane Pflege und wurden nach den Experimenten mittelsCO2-Inhalation eingeschläfert. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Bevor der Eingriff beginnt, schalten Sie das Laser-Speckle-Kontrastbildsystem ein. Das in dieser Studie verwendete System arbeitet mit einem 785-nm-Laser. Stellen Sie den Arbeitsabstand auf etwa 15–20 cm über dem Operationsfeld ein. Das System berechnet den Blutfluss in Laser Speckle Perfusion Units (LSPU) basierend auf dem räumlichen Kontrastalgorithmus. Stellen Sie sicher, dass das Instrument vor der Weiterfahrt warm und stabil ist.

1. Tiervorbereitung und Laparotomie

  1. Sterilisieren Sie den Operationstisch vor jedem Eingriff. Bereiten Sie alle benötigten Materialien (sterilisierte Instrumente und Wattestäbchen, Mullbinde, vorverdünnte Anästhetikum, Heizpadde, Gefäßklemme, Kochsalzlösung, Enthaarungscreme, Wattebäusche, Nähte, Hautdesinfektionsmittel und Naht) auf den Operationstisch vor und legen Sie sie ab.
  2. Geben Sie der Maus 30 Minuten im Voraus Meloxicam (0,2 mg/kg Körpergewicht; subkutane Injektion) zur Linderung der Schmerzen.
  3. Gießen Sie eine bestimmte Menge sterilisierter Kochsalzlösung in einen sauberen Behälter. Dann nimm ein Stück Mull und schneide eine geeignete Öffnung in der Mitte aus.
  4. Betäuben Sie eine Maus durch intraperitoneale Injektion von 2,5 % Tribromoethanol (400 mg/kg Körpergewicht; zuvor in steriler Kochsalzlösung verdünnt).
    HINWEIS: Tribromoethanol wurde während der rechten Nephrektomie als Anästhetikum verwendet. Und 1 % Isofluran wurden während längerer Verfahren zur Überwachung des Blutflusses für die Anästhesie verwendet.
  5. Lege die Maus mit Klebeband auf das Heizkissen und benutze Enthaarungscreme, um die Haare aus dem Bauchbereich der Maus zu entfernen. Während der Operation verwenden Sie das Heizkissen, um die rektale Temperatur bei 37 °C ± 0,5 °C zu halten.
  6. Desinfizieren Sie die Haut im Operationsbereich zuerst mit 75 % Alkohol und anschließend mit Iodophor und einem Wattestäbchen.
  7. Benutze eine Pinzette, um die Zehe der Maus zu kneifen. Sobald die Maus keine Schmerzreaktion zeigt, machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches. Trennen Sie vorsichtig die Haut vom Peritoneum, schneiden Sie dann das Peritoneum auf und treten Sie in die Bauchhöhle ein.
  8. Setzen Sie einen Retraktor auf die Maus, um die Sichtbarkeit zu optimieren, und bedecken Sie das Operationsfeld mit Mull, während Sie die Lücke im Gaze mit der Bauchhöhle ausrichten und sie mit Kochsalzlösung befeuchten.

2. Rechte Nephrektomie

  1. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig auf eine Seite der Mullbinde zu drücken, wodurch die rechte Niere und das umliegende Gewebe freigelegt werden. Falten Sie die Mullbinde, um den Darm zu bedecken, und befeuchten Sie ihn mit normaler Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des Darms zu verhindern.
  2. Verwenden Sie eine schräge Pinzette, um den rechten Harnleiter anzuheben. Führen Sie zwei 6-0-Nahtfäden durch den Harnleiter und führen Sie eine Ligatur an zwei Positionen durch.
  3. Schneiden Sie den Harnleiter zwischen den beiden Ligaturen mit einer Mikroskopschere.
  4. Nachdem Sie die Wattebäusche mit normaler Kochsalzlösung befeuchtet haben, nehmen Sie die Wattebäusche mit einer feinen Pinzette auf, drücken Sie die Leber vorsichtig nach oben und fixieren Sie sie mit den Wattebäuschen, um die Nieren und die Blutgefäße auf ihrer rechten Seite freizulegen.
  5. Verwenden Sie eine schräge Pinzette, um die perinephrischen Fettpads entlang der rechten Niere stumpf zu trennen, bis die Nierenarterie und Vene vollständig freiliegen.
    HINWEIS: Trennen Sie gleichzeitig die Masse des Nebennierengewebes oberhalb der Niere.
  6. Schieben Sie vorsichtig eine geneigte Zange unter die Nierenarterie und Vene, um einen Kanal zu schaffen. Dann führst du eine 6-0 Seidennaht um die Gefäße, um sie miteinander zu verbinden.
  7. Schneiden Sie die verstopfte Nierenarterie und Vene in der Nähe der Niere durch. Entfernen Sie die Niere zusammen mit dem verbleibenden haftenden Gewebe.
  8. Entferne den Wattebäusch, mit dem die Leber gehalten wird.

3. Überwachung des nierenen Blutflusses mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) während der Ischämie-Reperfusion

  1. Schalten Sie das LSCI-System und die dedizierte Software des Instruments ein.
  2. Klicken Sie auf Originalbild und Vorschau, um das rohe, unbearbeitete Bild des Operationsfeldes anzusehen.
  3. Ändern Sie die Position der Mäuse, halten Sie die Anästhesie mit 1 % Isofluran, das mit 600 mL/min über einen Nasenkegel abgegeben wird, und passen die Vergrößerung der Kamera an, während das Originalbild betrachtet wird, um eine klare Sicht auf die Zielniere zu erhalten.
  4. Klicken Sie auf Simultananzeige, um das Echtzeitbild des Blutflusses anzuzeigen. Stellen Sie die Vergrößerung auf 2,5× und wählen Sie Automatische Blutflussanpassung , um das Bild zu optimieren. Dann sperren Sie die Blutflussparameter. Außerdem solltest du alle 5000 ms ein Bild des Bildes aufnehmen.
    HINWEIS: Feuchte Wattebäusche können verwendet werden, um die stabile Position der Niere zu gewährleisten und die umliegenden Organe sowie Gewebe von ihr fernzuhalten, wodurch der Unterschied zwischen Nierenbereich und Hintergrund verbessert wird.
  5. Stellen Sie die Größe der quadratischen Flächenparameter auf 112 ein und ordnen Sie die 5 quadratischen Flächen gleichmäßig in einer festen Orientierung in der Nierenansicht an. Klicken Sie auf die Echtzeit-Bildregistrierung und Aufzeichnung , um mit der Erfassung von Blutflussdaten zu beginnen.
    HINWEIS: Die Maschine zeichnet automatisch die Laser-Speckle-Perfusionseinheiten (LSPU) auf, die die Echtzeit-Blutflusseinheiten in den ROIs darstellen und für Analysen verwendet werden können. Während des Detektionsprozesses können atmungsbedingte Bewegungen oder Umweltveränderungen dazu führen, dass sich das Sichtfeld verschiebt. Wenn das System dies im Detektionsbereich anzeigt, sollte die aktuelle Aufzeichnung gestoppt werden. Klicken Sie dann auf Echtzeit-Bildregistrierung und nehmen Sie erneut auf.
  6. Nach der Aufzeichnung eines 30-minütigen Ausgangspunkts trennen Sie das Fettgewebe um die linken Nierengefäße. Verwenden Sie die hämostatische Pinzette, um eine Mikroklemme zu greifen und sie über die linke Nierenarterie und Vene in der Nähe des Hilums zu legen. Setzen Sie die Echtzeitüberwachung weitere 30 Minuten fort.
  7. Lösen Sie die Mikroklemme, um die Reperfusion einzuleiten. Überwachen und dokumentieren Sie die Echtzeit-Erholung des mikrovaskulären Blutflusses der Nieren.
  8. Sobald die Blutflussreperfusion mindestens 60 Minuten überwacht wurde, werden Sie mit der Überwachung beendet und den Bauchschnitt mit einer 7-0 Seidennaht nähen.

4. Postoperative Erholung und Pflege

  1. Verabreichen Sie Flüssigkeiten mit einer intraperitonealen Injektion von 1 ml Kochsalzlösung, um Dehydrierung nach der Operation zu verhindern.
  2. Lass die Mäuse auf dem Wärmepad. Überwachen Sie Mäuse sorgfältig, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen, aufmerksam erscheinen und sich wieder aufrichten können.

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Ergebnisse

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Dieser Artikel hatte zum Ziel, Veränderungen im nierendurchbluteten Zustand während IR-induzierter AKI zu erkennen. Daher verwendeten wir ein gängiges Mausmodell, das eine rechte Nephrektomie beinhaltet (Abbildung 1A) gefolgt von einem IR-Verfahren an der kontralateralen Niere (Abbildung 1B). Da eine Echtzeitüberwachung des Blutflusses während der IRI erforderlich war, wurden alle Manipulationen an den Mäusen während des gesamte...

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Diskussion

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Diese Arbeit beschreibt die Anwendung eines LSCI-Systems für die Echtzeit-hochauflösende Visualisierung der mikrovaskulären Blutflussdynamik der Nierene während der IRI bei Mäusen. Das Protokoll bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Endpunktmessungen oder Methoden mit begrenzter räumlicher Auflösung, wie LDF, da es eine zweidimensionale Perfusionskarte bereitstellt, die die regionale Heterogenität innerhalb der Nierenmikrozirkulation erfasst. Die Effizienz und Benutzer...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Innovative Team Research Program für Universitäten der Provinz Guangdong (2022KCXTD009) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absorberbehälter (für die Anästhesie)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd., China10-0210
Alkohol, medizinisch (75 %)HENGLIYA, Xinjiang, ChinaN/AHautdesinfektionsmittel
Anästhesie-VerdampferMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
WattestäbchenQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Chinahttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
EnthaarungscremeVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
MullbindeWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Chinahttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
HeizpolsterRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, ChinaHD-1902Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur
IodophorlösungTaixinkang, Jinxian, Chinahttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmHautdesinfektionsmittel
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd, ChinaR510-22-10Injektionsanästhetikum
Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI)-SystemHubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, ChinaSIM BFI HR PROMoorFLPI-2-Äquivalentsystem
MeloxicamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Chinahttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg pro kg Körpergewicht; Analgetikum
MikroklemmeShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd, ChinaW40140Gefäßklemme
Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Chinahttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Seidengeflochtener Naht (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Chinahttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlFür Gefäßligation
Seidengeflochtene Naht (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Chinahttps://www.weigaoholding.com/Für den Wundverschluss werden nicht absorbierbare chirurgische Nähte mit der gebogenen Nadel verwendet
Spritze (1 ml)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Chinahttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlMit 26-G-Nadel
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-100G2,5 % Lösung; Injizierbares Anästhetikum

Referenzen

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