Netzwerkpharmakologie und experimentelle Verifikation zur Untersuchung des Cinnamomi Cortex gegen steroidinduzierte Osteonekrose des Oberschenkelkopfes

Zusammenfassung

Diese Studie zielt darauf ab, die potenziellen Mechanismen des Cinnamomi Cortex bei der Behandlung der Osteonekrose des Oberschenkelkopfes zu erforschen, indem Netzwerkpharmakologie, Molekulardynamiksimulationen und Tierversuche integriert werden.

Zusammenfassung

Die durch Steroide induzierte Osteonekrose des Oberschenkelkopfes (SONFH) verursacht starke Schmerzen und eingeschränkte Mobilität und beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten erheblich. Cinnamomi Cortex (CC) hat sich als wirksam gegen diese Erkrankung erwiesen, doch sein Wirkmechanismus bleibt unklar. Diese Studie zielt darauf ab, die Wirkstoffe von CC zu identifizieren und deren Mechanismen bei SONFH zu erforschen. Aktive Bestandteile wurden mit den Datenbanken HERB 2.0, PubChem und SwissADME gescreent, und ihre entsprechenden Ziele wurden mit der Swiss Target Prediction-Datenbank vorhergesagt. Ziele für SONFH wurden identifiziert, indem Ziele aus GEO-, DisGeNET-, GeneCards- und OMIM-Datenbanken mit den zusammengesetzten Zielen überschnitten wurden. Ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) wurde mithilfe der STRING-Datenbank aufgebaut, und GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen wurden über die DAVID-Datenbank durchgeführt. Die vielversprechendsten Verbindungen zwischen Verbindungen und Ziel wurden durch molekulare Andockungen (MD) und Molekulardynamik-Simulationen validiert. Die Forscher identifizierten 563 potenzielle Ziele, darunter 61 SONFH-bezogene Ziele, wobei AKT1, HIF-1α und STAT3 als zentrale Knoten dienten. Die KEGG-Anreicherungsanalyse hob den HIF-1α-Signalweg als Schlüsselmechanismus hervor. Darüber hinaus zeigten Tierversuche, dass der aktive Anteil von CC strukturelle Schäden am Oberschenkelkopf in einem Mausmodell mit SONFH effektiv minderte. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CC SONFH verbessern kann, indem es die Hypoxie-Adaption koordiniert und Angiogenese sowie Osteogenese reguliert.

Einleitung

Die steroid-induzierte Osteonekrose des Oberschenkelkopfes (SONFH) ist eine kritische osteoartikuläre Erkrankung, die durch die Störung oder Verringerung der Blutversorgung zum Oberschenkelkopf durch verschiedene¹. Der Absterben von Knochenzellen und Knochenmarkkomponenten führt zu strukturellen Schäden im Oberschenkelkopf und zu funktionellen Beeinträchtigungen des Hüftgelenks². Klinisch zeigen Patienten typischerweise Hüftschmerzen und eingeschränkte Mobilität³. Ohne wirksame Behandlung werden 80 % der SONFH-Patienten zu einem Oberschenkelkopfkollaps überschreiten, der eine vollständige Hüftprothese^erfordert. Es belastet die Patienten stark psychisch und belastet sie finanziell^stark 5. Die klinische Praxis empfiehlt die Verwendung einer Kombination aus Antikoagulanzien, fibrinolytischen Medikamenten, Vasodilatatoren und lipidsenkenden Medikamenten zur Behandlung von SONFH, die zwar klinisches Potenzial gezeigt haben, aber die therapeutische Wirksamkeit im Allgemeinen begrenzt^{haben 6}.

Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) hat zunehmend ihren positiven Einfluss auf die Behandlung von SONFH⁷ gezeigt. Die TCM zeigt Potenzial für Symptomlinderung, Krankheitskontrolle sowie verbesserte Gelenkbeweglichkeit und Lebensqualität der Patienten⁸. Klinisch wurden CC und seine Komponenten intensiv zur Verbesserung von SONFH eingesetzt und zeigen eine bemerkenswerte Wirksamkeit⁹. Zahlreiche bioaktive Substanzen, die in CC vorkommen, haben eine Vielzahl biologischer Wirkungen, darunter entzündungshemmende, antioxidative, angiogenesefördernde und mikrozirkulationsfördernde Eigenschaften¹⁰. Frühere Forschungen zur Knochengewebetechnik und zum Stoffwechsel haben gezeigt, dass Cinnamaldehyd, ein wesentlicher aktiver Bestandteil von CC, Signalwege modulieren kann, die mit Knochenremodellierung¹¹ zusammenhängen. Die erste Studie zeigte, dass Yougui-Pillen (YGPs) therapeutisches Potenzial für SONFH haben, indem sie Angiogenese fördern und die Entzündungsreaktionen verstärken¹². Als das souveräne Medikament in YGPs kann CC Yang erwärmen, Qi nutzen und Meridiane entblocken, was positive therapeutische Effekte auf SONFH¹³ erzielt. Dennoch bleiben die genauen Mechanismen, die seiner Wirksamkeit zugrunde liegen, unklar. Die Klarstellung des Multi-Target-Regulierungsnetzwerks, das CC zur Verbesserung von SONFH nutzt, würde nicht nur helfen, dessen pharmakologische Natur zu verstehen, sondern auch seine sinnvolle klinische Anwendung und die Schaffung verwandter Verbesserungen fördern. Die Integration von Bioinformatik mit Netzwerkpharmakologie bietet einen effektiven Ansatz zur Aufklärung von Wirkungsmechanismen¹⁴.

Die Netzwerkpharmakologie kann bioaktive Bestandteile in Kräutern identifizieren und die Zusammenhänge zwischen diesen Wirkstoffkomponenten und Genzielen^vorhersagen. MD wird eingesetzt, um die Bindungsinteraktionen zwischen Kandidatenwirkstoffen und wichtigen therapeutischen Zielen zu validieren. Molekulare Dynamik nutzt die newtonsche Mechanik, um die Bindungsstabilität und Flexibilität von Ligandenrezeptoren durch Bewegungssimulation¹⁶ zu bewerten. Die Autoren untersuchten umfassend die potenziellen Effekte von CC auf SONFH mithilfe von Netzwerkpharmakologie, MD und molekularen Dynamiksimulationen. Die Ergebnisse dienen als Referenz für zukünftige tiefgehende Forschungen zur pharmakodynamischen Materialbasis und zum Mechanismus von CC zur Verbesserung von SONFH. Das Studienflussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Ethikkomitee für Tierversuche der Zhejiang Chinese Medicine University (IACUC-20240708-22) genehmigt und entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren, der von den National Institutes of Health herausgegeben wurde. In diesem Experiment wurden zwanzig 10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g verwendet. Diese Mäuse stammen aus dem Tierzentrum der Zhejiang Chinesischen Medizinischen Universität. Siehe die Materialtabelle für eine Liste aller Reagenzien, Geräte und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Screening von Wirkstoffen und Zielen von CC
Chemische Verbindungen von CC wurden mit dem Kraut 2.0¹⁷ mit dem Schlüsselwort "CC" identifiziert. Chemikalien ohne PubChem-ID oder mit derselben ID wurden herausgefiltert. Dann werden Duplikate zusammengeführt und entfernt, um die Zielstellen zu erhalten, die dem CC entsprechen. Führen Sie ein initiales Screening mit der PubChem-Datenbank¹⁸ basierend auf Lipinskis Fünferregel durch (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Die Autoren verwenden die PubChem-Datenbank, um die SMILS-Darstellung für jede chemische Verbindung zu bestimmen. Mit Hilfe der SwissADME-Datenbank wählen die Autoren Verbindungen mit der Einschränkung der "hohen" GI-Absorption und ≥2 "Ja"-Werten in Arzneimittelähnlichkeit²⁰ aus. Nutzen Sie die Swiss-Target Prediction Datenbank²¹ , um Zielproteine zu extrahieren, deren Wahrscheinlichkeit höher als null ist. Dann zusammenführen und Duplikate entfernen, um die Zielseiten zu erhalten, die dem CC entsprechen.

Zusammenstellung von Genzielen, die mit SONFH assoziiert sind
SONFH-bezogene Ziele wurden aus Datenbanken gewonnen: DisGeNET Datenbank²²; GeneCards-Datenbank²³; OMIM-Datenbank²⁴ und GEO-Datenbank²⁵. Die Autoren luden die SONFH-Gene aus den OIM- und DisGeNET-Datenbanken herunter und deduplizierten sie. Insgesamt wurden 233 krankheitsbezogene Ziele aus der GeneCards-Datenbank gewonnen, nachdem Duplikate entfernt wurden. Alle abgerufenen Ziele hatten Relevanzscores über 0 und wurden für spätere Analysen einbezogen. Der minimale Relevanzwert unter den abgerufenen Genen betrug 6,48. Differentiell exprimierte Gene (DEGs), die mit SONFH verwandt sind, wurden aus der GSE123568-Serie auf der GPL15207-Plattform in der GEO-Datenbank gewonnen. Batch-Effekte wurden mit dem Limma-Paket in R korrigiert, und differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden mit den Kriterien |logFC| identifiziert. > 1 und P < 0,05²⁶. Das ggplot2-Paket wurde verwendet, um ein Vulkandiagramm zur Visualisierung der Verteilung der DEGs zu erstellen, und eine Heatmap wurde erstellt, um die Ergebnisse darzustellen. Die SONFH-Krankheits-Zielbibliothek wurde durch das Entfernen von doppelten Zielen mit dem Venn-Paket in R eingerichtet.

Gründung des PPI-Netzwerks
Basierend auf den erwarteten Zielen der aktiven Komponenten von CC- und SONFH-bezogenen Zielen wurde von Venny 2.1.0²⁷ ein Venn-Diagramm erstellt. Mit dem Ziel, PPI-Daten zu erhalten, importierten die Autoren die Ziele in die STRING-Datenbank²⁸. Die Einschränkung des Screening-Kriteriums des Organismus war "Homo sapiens" mit dem Konfidenzindex ≥0,4. Die Autoren verwendeten Cytoscape 3.7.2, um die wichtigsten Ziele des PPI-Netzwerks festzulegen. Degree Centrality (DC) wurde verwendet, um PPI-Netzwerk-Schlüsselziele zu untersuchen. Der Parameterfilter ist mehr als doppelt so hoch wie der Medianwert. Um die wichtigsten Ziele weiter zu spezifizieren, wurde das Add-on zu Cytoscape verwendet.

Anreicherungsanalysen wurden mit Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Datenbanken durchgeführt
Die gemeinsamen Ziele von CC und SONFH wurden für GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen über die DAVID-Datenbank²⁹ analysiert. Um die Top 10 GO-Begriffe und die Top 20 KEGG-Pfade zu visualisieren, wurde Wei Sheng Xin³⁰ verwendet, um das Anreicherungs-Dot-Bubble-Diagramm zu zeichnen.

Netzwerkbau
Die molekularen Mechanismen von CC bei der Verbesserung von SONFH wurden durch die Herb-Compound-Target (H-C-T) und Compound-Target-Pathway (C-T-P) Netzwerke aufgeklärt. Die Software Cytoscape 3.10.3 illustrierte die Netzwerke. Das H-C-T-Netzwerk wurde unter Verwendung der aktiven Verbindungen von CC und deren gemeinsamen Zielen entwickelt. Dann benutze das Tool Netzwerk analysieren. Um das Verständnis der Beziehungen zwischen Signalwegen, Verbindungen und Zielen zu verbessern, wurden die Top 20 Signalwege zusammen mit ihren zugehörigen Zielen und Verbindungen von Network Tools in einem C-T-P-Netzwerk organisiert.

MD-Verifikation
Die Kernziele: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 und EGFR wurden aus der PPI-Analyse gewonnen. Das Ziel wurde von der Uniport-Datenbank³¹ mit der Einschränkung Mensch durchsucht und von der RCSB PDB-Datenbank³² überprüft. Humane Proteinstrukturen mit relativ hoher Auflösung wurden ausgewählt. Die Wirkstoffe wurden aus dem C-T-P-Netzwerk identifiziert. Ihre entsprechenden 3D-Strukturen wurden im mol2-Format aus der PubChem-Datenbank heruntergeladen. Jede Datei wurde in Chem3D geöffnet und die Energie minimiert. Anschließend nutzten die Autoren die AutoDockTools^33-Software , um die Dehydrierung, Hydrierung durchzuführen und Gasteiger-Ladungen des Rezeptorproteins zu berechnen. Sowohl Liganden als auch Rezeptoren wurden im PDBQT-Format aufbewahrt. Basierend auf der räumlichen Lage und der Bindungsfähigkeit bewerten die Autoren die Machbarkeit und Stabilität des Andockens. Über die AutoDock Vina wurden die Andockgitterbox und das Makromolekül vorhergesagt. In dieser Forschung durften alle rotierbaren Bindungen des Liganden frei rotieren, während die Rezeptoren als starr eingestellt wurden. Der Andockwert zeigt die Bindungsaffinität zwischen Rezeptor und Liganden an; Je niedriger der Punkt, desto höher die Bindungsaffinität. Gemäß diesem Prinzip wählen die Autoren die Konformationen mit der günstigsten Bindungsenergie aus, um Bindungsinteraktionen von Liganden mit Proteinen zu untersuchen. Die visuellen Ergebnisse wurden von PyMOL präsentiert.

Molekulardynamik-Simulation
Molekulardynamische Simulationen wurden mit GROMACS³⁴ und dem CHARMM36 Kraftfeld durchgeführt. Der Protein-Liganden-Komplex wurde in einer kubischen periodischen Simulationsbox mit einem Mindestabstand von 1,0 nm zur Lösungsdose zentriert, und das System wurde mit dem SPC216-Wassermodell gelöst. Das System wurde durch das Hinzufügen geeigneter Na⁺- und Cl⁻-Gegensätze neutralisiert. Die Energieminimierung erfolgte sequentiell mit dem steilsten Abstiegsalgorithmus, gefolgt von der konjugierten Gradientenmethode, um ungünstige atomare Kontakte zu entfernen. Langstrecken-elektrostatische Wechselwirkungen wurden mit der Partikelgitter-Ewald-(PME)-Methode berechnet, mit einer Grenzdistanz von 10 Å. Alle kovalenten Bindungen mit Wasserstoffatomen wurden mit dem LINCS-Algorithmus eingeschränkt. Die Temperatur wurde mit dem V-Rescale-Thermostat bei 300 K gehalten, und der Druck wurde mit dem Berendsen-Barostat mit isotroper Kopplung auf 1 bar geregelt. Positionsbeschränkungen wurden während der Gleichgewichtsphase mit einer Kraftkonstante von 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² auf den Liganden gelegt. Nach der Energieminimierung wurde das System mit 2 ns NVT- und 2 ns NPT-Simulationen ausgegliglibriert, gefolgt von einer 100-ns-Produktions-Molekulardynamik-Simulation mit einem 2-fs-Zeitschritt. Atomkoordinaten wurden alle 10 PS für eine anschließende Trajektorienanalyse aufgezeichnet.

Experimentelle Validierung in einem SONFH-Mausmodell
Tiere und das SONFH-Modell
Zwanzig weibliche C57BL/6J-Mäuse, 10 Wochen alt und mit einem Gewicht von 20 bis 22 g, wurden aus dem Tierzentrum der Zhejiang Chinese Medical University bezogen. Die Mäuse durchliefen eine siebentägige Eingewöhnungsphase in einer kontrollierten Umgebung und hatten uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Mäuse wurden zufällig den Gruppen zugeteilt (n = 5 pro Gruppe): der Kontrollgruppe, der SONFH-Gruppe, der SONFH + CC-Gruppe mit niedriger Dosis (CC-Low, 7,5 g/kg/d) und der SONFH + CC High-Dose-Gruppe (CC-High, 15 g/kg/d). Das SONFH-Modell wurde wie zuvor beschrieben etabliert. Kurz gesagt erhielten Mäuse in den Gruppen SONFH, SONFH + CC-Low und SONFH + CC-High am Tag 0 zwei intravenöse Injektionen von Lipopolysaccharid (LPS; 20 μg/kg). Anschließend wurden drei intramuskuläre Injektionen von Methylprednisolon (MPS; 40 mg/kg) alle 24 Stunden verabreicht, beginnend 24 Stunden nach den LPS-Injektionen. Mäuse in den Behandlungsgruppen erhielten täglich CC-Extrakt über orale Gavage für 6 Wochen, beginnend am Tag der letzten MPS-Injektion. Die Kontrollgruppenmäuse erhielten zu entsprechenden Zeitpunkten gleichwertige Mengen Kochsalzlösung.

Probenentnahme und -vorbereitung
Am Ende der sechswöchigen Behandlungsphase wurden die Mäuse eingeschläfert. Die beidseitigen Oberschenkelköpfe wurden sorgfältig seziert und entnommen. Für jedes Tier wurde der linke Oberschenkelkopf 48 Stunden lang bei 4 °C fixiert, um anschließende Entkalkung und Paraffineinbettung durchzuführen. Der rechte Oberschenkelkopf wurde fixiert und anschließend direkt für Mikro-CT-Scans ohne Entkalkung verwendet.

Histologische Analyse (ABH-Färbung)
Nach Entkalkung und Paraffineinbettung wurden die Oberschenkelkopfabschnitte mit einem Alcian Blue/Hematoxylin (ABH)-Protokoll gefärbt, um Veränderungen der Osteonekrose zu beurteilen. Kurzzeitig wurden die Abschnitte 30 Minuten lang in 1% Alcian Blue (pH 2,5) gefärbt, abgespült und anschließend mit Harris-Hämatoxylin gekonterfärbt. Nach der Austrocknung und Montage wurden die Objektträger unter einem Lichtmikroskop fotografiert. Die Quantifizierung der Osteonekrose wurde von zwei verblindeten Beobachtern mit der ImageJ-Software durchgeführt. Das Verhältnis der leeren Lacunen wurde berechnet als (Anzahl der leeren Lacunae/Gesamtzahl der Lacunae) × 100 % in drei zufällig ausgewählten Hochleistungsfeldern pro Stichprobe innerhalb der subchondralen Region. Das Verhältnis der pyknotischen Kerne wurde ähnlich bestimmt.

Mikro-Computertomographie (Micro-CT) Analyse
Die dreidimensionale Knochenmikrostruktur des Oberschenkelkopfes wurde mit einem hochauflösenden Mikro-CT-Scanner analysiert. Feste Proben wurden mit einer Auflösung von 10 μm (70 kV, 114 μA) abgetastet. Ein standardisiertes sphärisches Volumen von Interesse (VOI), das den primären Tragbereich umfasst, wurde rekonstruiert und mit CTAn-Software analysiert. Die folgenden morphometrischen Parameter wurden quantifiziert: Knochenvolumen/Gesamtvolumen (BV/TV), Trabekuläre Dicke (Tb.Th) und Trabekuläre Trennung (Tb.Sp).

Immunfluoreszenzfärbung (IF)
Zur Bewertung der Knochenmikroumgebung wurde eine Immunfluoreszenzfärbung an Paraffinschnitten durchgeführt. Nach Antigenentnahme und Blockierung wurden Schnitte über Nacht bei 4 °C mit folgenden primären Antikörpern inkubiert: Kaninchen-Anti-HIF-1α (1:200), Kaninchen-Anti-ALP (1:300) und Kaninchen-Anti-VEGF (1:150). Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einer Mischung fluorophor-konjugierter sekundärer Antikörper inkubiert: Alexa Fluor 488-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 555-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG. Die Kerne wurden mit DAPI kontrafärbt. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop unter konstanten Belichtungseinstellungen aufgenommen. Die relative Fluoreszenzintensität für jeden Marker wurde mit der ImageJ-Software über drei Felder pro Probe hinweg quantifiziert.

Statistische Analyse
Alle quantitativen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, wurde mit der GraphPad Prism-Software (Version 9.0) durchgeführt, um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu bestimmen. Ein P-Wert von weniger als 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Identifikation aktiver Komponenten und vorhergesagter Ziele von CC sowie Entwicklung des "H-C-T"-Netzwerks.
Um die Mechanismen der Schlüsselkomponenten und Ziele von CC bei der SONFH-Verbesserung zu untersuchen, nutzten die Autoren die HERB 2.0-Datenbank, um alle gescreenten CC-Komponenten zu identifizieren. Es wurden 85 wahrscheinliche bioaktive Verbindungen von den 209 möglichen Wirkstoffen von CC gefunden (ergänzende Tabelle 1). Mit der Swiss Target Prediction-Plattform und dem Eliminieren doppelter und ungültiger Einträge wurden 563 vermutete Ziele erhalten, die diesen CC-Komponenten entsprechen (Ergänzende Tabelle 2). Die Autoren haben die aktiven Komponenten und Ziele von CC identifiziert.

Die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die am Beginn und Fortschreiten von SONFH beteiligt sind, sowie potenzielle Biomarker-Ziele zu identifizieren. Die Analyse des GSE123568-Datensatzes in der GEO-Datenbank identifizierte DEGs, die mit SONFH assoziiert sind, darunter 207 hochregulierte und 216 herunterregulierte Gene. Das Vulkandiagramm der 425 DEGs ist in Abbildung 2A dargestellt, während die Ausdrucksmuster der obersten 60 DEGs, geordnet nach Ausdrucksniveau, als Heatmap in Abbildung 2B dargestellt werden, wobei die Farbintensität die log-transformierten Ausdruckswerte widerspiegelt. Die Datenbanken DisGeNET, OMIM und GeneCards lieferten 711 Ziele, die mit SONFH verknüpft sind. Kombiniert man die 425 DEGs aus der GEO-Datenbank, sind insgesamt 1136 Ziele mit SONFH verknüpft. Nach der Eliminierung der Duplikate wurden 1115 SONFH-bezogene Ziele bestätigt, wie in Abbildung 2C dargestellt. Die Autoren haben vorläufig eine Krankheitszielbibliothek für SONFH festgelegt.

Zur Identifizierung von Zielen und Primärkomponenten identifizierte eine Schnittanalyse zwischen den 563 Zielen von CC und den 1115 SONFH-bezogenen Zielen 61 gemeinsame Ziele (Abbildung 3A und ergänzende Tabelle 3), die in Cytoscape 3.10.3 integriert wurden, um das "H-C-T"-Netzwerk aufzubauen (Abbildung 3B). Dieses Netzwerk bestand aus 147 Knoten und 413 Kanten. Topologische Analysen zeigten, dass (s)-4-Nonanolid (Grad:16), Isohomogenol (Grad:15), Nerylacetat (Grad:14), Melilotocarpan A (Grad:14) und 3-Methoxycinnamaldehyd (Grad:13) die höchste Konnektivität mit Proteinzielen zeigten.

Entwicklung und topologische Bewertung des PPI-Netzwerks.
Um die Ziele von CC bei der Verbesserung von SONFH weiter zu untersuchen. Cytoscape 3.10.3 wurde verwendet, um das PPI-Netzwerk anzuzeigen, nachdem 61 identische Ziele in die STRING-Datenbank eingetragen wurden. Im Netzwerk gab es 463 Kanten und 60 Knoten. In Abbildung 4A wechseln die Knoten in Farbe und Größe von heller und kleiner zu dunkler und größer, was auf eine Zunahme des Grades von niedrig nach hoch hinweist. Das MCODE-Plug-in ermöglichte die Clusterung dieser Ziele in zwei Funktionsmodule (Abbildung 4A), von denen Cluster 1 23 Knoten und 216 Kanten mit einer Punktzahl von 19,636 enthielt. Um die Netzwerkarchitektur weiter zu charakterisieren, wurden DC, BC und CC als topologische Metriken verwendet. Mit den Medianwerten dieser Parameter als Grenzwerte identifizierten die Autoren 8 aktive Ziele (Abbildung 4B). Das CytoHubba-Plugin nutzte den MCC-Algorithmus, um Knoten zu bewerten und die Top 10 Gene zu identifizieren. (Abbildung 4C).

GO-Anreicherungsanalyse
Um die Mechanismen von CC bei der ONFH-Verbesserung weiter zu erforschen, wurde eine GO-Anreicherungsanalyse an 61 potenziellen Zielen durchgeführt, wobei BP, CC und MF verwendet wurden. Insgesamt wurden 435 GO-Terme bereichert, darunter 293 BP-Terme, 41 CC-Terme und 101 MF-Terme. Diese Ergebnisse sind in den ergänzenden Tabellen 4, 5 und 6 dargestellt . Abbildung 5A zeigt visuell die Top 10 angereicherten BP-, CC- und MF-Begriffe anhand eines Blasendiagramms. Die Ergebnisse zeigten, dass BP-Terme hauptsächlich mit der Signaltransduktion, der positiven Regulation der Transkription durch RNA-Polymerase II, der negativen Regulation des apoptotischen Prozesses, der positiven Regulation der DNA-Template-Transkription und der negativen Regulation der Transkription durch RNA-Polymerase II verbunden waren. Die Analyse zeigte, dass die MF-Terme hauptsächlich an der Proteinbindung, der Metallionenbindung und der identischen Proteinbindung beteiligt waren. Die Ergebnisse des CC zeigten, dass die Mehrheit der Ziele hauptsächlich im Zytoplasma, in der Membran und in der Plasmamembran lag.

KEGG-Analyse
Um Informationen über mögliche biochemische Mechanismen zu liefern, durch die CC SONFH verbessern könnte, wurde eine KEGG-Anreicherungsanalyse durchgeführt, um die biochemischen Mechanismen aufzuklären, durch die CC SONFH verbessern kann. Mit einem Screening-Kriterium von P < 0,05 und FDR < 0,05 wurden 48 KEGG-Anreicherungseinträge identifiziert (Ergänzende Tabelle 7). Die 20 wichtigsten signifikant angereicherten Wege, bestimmt durch Faltenanreicherung und Zählung, wurden mithilfe von Blasen- und Balkendiagrammen visualisiert (Tabelle 1, Abbildung 5B und 5C). Mit Cytoscape 3.10.3 wurde ein C-T-P-Netzwerk mit 167 Knoten und 589 Kanten konstruiert (Abbildung 5D). Die Auswirkungen von CC auf SONFH stehen hauptsächlich im Zusammenhang mit einer Kaposi-sarkomassoziierten Herpesvirus-Infektion, dem HIF-1-Signalweg sowie Lipid- und Arteriosklerose, wie durch funktionelle GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen angezeigt wird.

MD-Verifizierung
Um die potenziellen Wechselwirkungen zwischen aktiven Verbindungen und Schlüsselzielen zu bewerten, wurden die 10 Verbindungen aus dem C-T-P-Netzwerk, darunter Anethol, Melilotocarpan A, Nerylacetat, Caprylsäure, Isohomogenol, 3-Methoxycinnamaldehyd, (s)-4-Nonanolid, Myristicin, Borneol und Cinnamylacetat, mit den Schlüsselzielen AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC und EGFR angedockt. Die vollständigen Andockergebnisse für alle Verbindungs-Ziel-Paare sind in Ergänzungstabelle 8 zusammengefasst, und detaillierte Informationen zu den Verbindungen, Zielen und Andockparametern sind in Ergänzungstabelle 9 enthalten. Abbildung 6 zeigt eine Wärmekarte der Bindungsenergieverteilung.

Insgesamt zeigten mehrere Verbindungszielpaare relativ günstige Bindungsaffinitäten, wobei niedrigere Bindungsenergiewerte auf stabilere vorhergesagte Interaktionen hindeutet. Bemerkenswert ist, dass die Andockungsergebnisse eine klare Heterogenität in den Bindungsaffinitäten zwischen Verbindungen und Zielgruppen zeigten. Bestimmte Verbindungen, wie Melilotocarpan A, zeigten konstant relativ starke Bindungsaffinitäten über mehrere Ziele, während andere moderatere oder schwächere Wechselwirkungen aufwiesen, was darauf hindeutet, dass verschiedene Verbindungen ungleichmäßig zu den vorhergesagten pharmakologischen Effekten beitragen können.

Darüber hinaus wurde auch Variabilität zwischen den Zielen beobachtet. Beispielsweise zeigten bestimmte Ziele wie STAT3 und EGFR relativ moderate oder schwache Bindungsaffinitäten mit mehreren Verbindungen, wobei einige Werte nahe -5,0 kcal/mol lagen, verglichen mit Zielen wie AKT1 oder SRC. Dieses Muster deutet darauf hin, dass nicht alle Kernziele notwendigerweise als direkte, hochaffinitätsgebundene Partner der identifizierten Verbindungen fungieren, sondern stattdessen indirekte regulatorische Rollen innerhalb des Interaktionsnetzwerks übernehmen können. Solche Unterschiede könnten mit Unterschieden in der strukturellen Kompatibilität zwischen Liganden und Proteinbindungsstellen sowie den inhärenten Eigenschaften der Ziele zusammenhängen.

Unter den untersuchten Paaren zeigte AKT1 die niedrigste Bindungsenergie mit Melilotocarpan A (-9,6 kcal/mol), was auf eine potenziell günstige Wechselwirkung hindeutet. Abbildung 7 veranschaulicht den vorhergesagten Bindungsmodus dieses Komplexes. Konkret bildet SER205 von AKT1 Wasserstoffbrücken mit Melilotocarpan A, Anethole und Myristicin. Außerdem wurde vorhergesagt, dass Melilotocarpan A Wasserstoffbrücken mit GLY309 von HIF-1α, LEU438 und THR440 von STAT3, SER433 und ARG412 von ESR1 sowie ARG500 und GLU510 von SRC bildet.

Zur Identifizierung repräsentativer Kandidatenverbindungen wurde für jedes Ziel die niedrigste Bindungsenergie verwendet, und eine Bindungsenergieschwelle von ≤ -5,0 kcal/mol wurde festgelegt, um relativ stabile Wechselwirkungen anzuzeigen. Basierend auf diesen Kriterien wurden Melilotocarpan A, Anetol und Myristicin als potenzielle Schlüsselverbindungen identifiziert. Insgesamt zeigten die meisten aktiven Komponenten des CC potenzielle Wechselwirkungen mit den ausgewählten therapeutischen Zielen, wobei einige Verbindungen relativ stärkere Bindungstrends über mehrere Ziele hinweg zeigten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass MD ein vereinfachter rechnergestützter Ansatz ist, der vorläufige Vorhersagen potenzieller Wechselwirkungen liefert und möglicherweise die Flexibilität von Proteinen sowie komplexe biologische Umgebungen nicht vollständig berücksichtigt. Daher sollten diese Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, und die beobachteten Wechselwirkungen stellen keinen endgültigen Beweis für eine direkte Bindung dar.

Molekulardynamik-Simulation
Um die Stabilität der Komplexe weiter zu bewerten, wählten die Autoren die AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A und STAT3-melilotocarpan A-Komplexe für molekulardynamische Simulationen aus. Unter den vorhergesagten Zielen wurden STAT3 und HIF-1α für MD-Simulationen aufgrund ihrer zentralen Rolle im PPI-Netzwerk und ihrer biologischen Relevanz für die SONFH-Pathologie ausgewählt. STAT3 zeigte einen der höchsten Konnektivitätsgrade im PPI-Netzwerk, was auf eine potenzielle regulatorische Rolle in mehreren Signalwegen hinweist. HIF-1α wurde ausgewählt, weil die KEGG-Anreicherungsanalyse den HIF-1-Signalweg als einen der relevantesten Wege identifizierte, die mit Angiogenese und Hypoxieanpassung bei Osteonekrose assoziiert sind.

Gleichzeitig konzentrierten sich die Autoren auf AKT1 als repräsentatives Ziel, da die hohen Andocking-Werte und die direkte Relevanz für die pathologischen Merkmale von SONFH, insbesondere die durch Hypoxie induzierte Angiogenese und Knochenregeneration, relevant sind. Aufgrund von Rechenressourcenbeschränkungen wurden drei repräsentative Komplexe für detaillierte MD-Simulationen ausgewählt, was eine häufig angewandte Strategie in Netzwerkpharmakologie-basierten molekularen Simulationsstudien ist. Die Wurzelmittelquadratabweichung (RMSD) bewertet effektiv die Konformationsstabilität von Protein-Liganden-Komplexen, wobei niedrigere Werte auf eine größere strukturelle Stabilität hinweisen. Wie in Abbildung 8A dargestellt, vollendete der AKT1-melilotocarpan A-Komplex innerhalb der ersten 12 ns die Relaxation und erreichte anschließend ein stabiles Plateau, wobei nur eine vorübergehende Fluktuation um 50–55 ns beobachtet wurde, bevor sie schnell zum Gleichgewicht zurückkehrte. Die gesamte RMSD während der gesamten Simulation betrug etwa 0,369 nm. Abbildung 8B zeigt, dass der HIF1A-melilotocarpan A-Komplex innerhalb der ersten 16 ns eine Relaxation durchlief, gefolgt von der Aufrechterhaltung eines stabilen Plateaus. Eine kurze Schwankung trat zwischen 38 und 42 ns auf, danach wurde eine schnelle Wiederstabilisierung beobachtet. Die Gesamt-RMSD für diesen Komplex betrug 0,25 nm. In Abbildung 8C unterzog der STAT3-melilotocarpan A-Komplex innerhalb von 0,3 ns eine Relaxation und erreichte dann ein stabiles Plateau. Die kurze Schwankung lag zwischen 5 und 80 ns. Die Gesamtsimulation betrug etwa 0,21 nm. Wie in The AKT1-melilotocarpan A gezeigt, bewahrten HIF-1α-melilotocarpan A und STAT3-melilotocarpan Komplexe die Stabilität ohne nennenswerte Veränderungen, was auf eine relativ stabile Kombination hinweist.

Die Flexibilität der Aminosäurereste in den Proteinen wurde anhand der Root Mean Square Fluctuation (RMSF) bewertet. Abbildung 9A zeigt, dass die mittlere globale Restfluktuation etwa 0,17 nm betrug, was darauf hindeutet, dass die Stabilität hauptsächlich durch den strukturellen Kern und die Bindungstasche aufrechterhalten wurde. Die höhere Flexibilität beschränkte sich weitgehend auf intrinsisch mobile Bereiche wie Terminalsegmente und Schleifenregionen, nicht auf den Taschenkern. Es ist allgemein bekannt, dass diese Regionen von Natur aus flexibel sind. Abbildung 9B zeigt, dass etwa 94 % der Residuen RMSF-Werte unter 0,20 nm aufwiesen und nur etwa 6 % 0,30 nm, was darauf hindeutet, dass das gesamte Protein-Rückgrat und die internen Residuen innerhalb eines stabilen Bereichs schwanken. Abbildung 9C zeigt, dass der mittlere globale Rückstand etwa 0,17 nm betrug. In den Daten wurden keine Schwankungen von mehr als 0,15 nm festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Bindungstasche während der gesamten Simulation eine stabile Konformation behielt. Sowohl die AKT1-melilotocarpan A- als auch die HIF-1α-melilotocarpan A-Komplexe haben nachweislich starke und stabile Wechselwirkungen.

Wasserstoffbrücken sind entscheidend für die Förderung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Abbildung 10A zeigt, dass die AKT1-melilotokarpanischen A-Komplexe typischerweise eine Wasserstoffbrücke bildeten, wobei die Anzahl der Wasserstoffbrücken zwischen 0 und 2 variierte. Zwischen Melilotocarpan sind A und HIF-1α weniger als 0,35 nm voneinander entfernt. AKT1 interagiert häufig in der Nähe von Melilotocarpan A. Die HIF-1α-melilotocarpan A-Komplexe bilden Wasserstoffbrücken von 0 bis 2, hauptsächlich eine Wasserstoffbrücke, wie in Abbildung 10B dargestellt. In Abbildung 10 C beträgt die Anzahl der Wasserstoffbrücken des STAT3-melilotocarpanischen A-Komplexes null bis vier. Meistens sind A-Atome zwischen Melilotocarpan A und HIF-1α weniger als 0,35 nm voneinander entfernt. HIF-1α-melilotocarpanische A-Komplexe stellen 1–3 Paare enger Kontakte und manchmal sogar 7–9 Paare her. Dies deutet auf effektive Wasserstoffbrücken-Interaktionen zwischen dem kleinen Molekül und den Zielproteinen hin. Zusammenfassend zeigen sowohl die AKT1-melilotocarpan A- als auch die HIF-1α-melilotocarpan A-Komplexe Stabilität und Festigkeit.

CC hemmt die Entzündungsreaktion und Apoptose der SONFH-Mäuse
Die histologische Analyse mit ABH-Färbung zeigte ausgeprägte osteonekrotische Veränderungen in der SONFH-Gruppe, gekennzeichnet durch vermehrte leere Lacunen, pyknotische Kerne und gestörte trabekuläre Architektur, während diese pathologischen Merkmale nach der CC-Behandlung spürbar gelindert wurden (Abbildung 11A). Quantitative Analysen bestätigten, dass die Verhältnisse leerer Lacunen und pyknotischer Kerne in den CC-behandelten Gruppen im Vergleich zur SONFH-Gruppe signifikant reduziert waren (Abbildung 11B–C). Die Mikro-CT-Analyse zeigte einen schweren trabekulären Knochenverlust in der SONFH-Gruppe, der durch die Verabreichung von CC teilweise rückgängig gemacht wurde (Abbildung 11D). Konsequent erhöhte die CC-Behandlung BV/TV und TB signifikant. Während Tb.Sp relativ zur SONFH-Gruppe abnimmt (Abbildung 11E–G). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine erhöhte HIF-1α-Expression und reduzierte ALP-Werte in der SONFH-Gruppe, begleitet von veränderter VEGF-Expression. Die CC-Behandlung modulierte die Expression von HIF-1α und VEGF und verstärkte die ALP-Signale, was auf eine verbesserte Knochenmikroumgebung und osteogene Aktivität hinweist (Abbildung 11H).

DATENVERFÜGBARKEIT:
Die während der aktuellen Studie verwendeten oder analysierten Datensätze sind unter dem Link verfügbar: https://zenodo.org/records/19730455.

Abbildung 1: Flussdiagramm der Netzwerkpharmakologie-Studienstrategie zur CC-Verbesserung von SONFH. Abbildung 1 zeigt, dass die Studie potenzielle Ziele von Wirkstoffen aus CC aus der Datenbank identifiziert, wobei SONFH die Kernerkrankung ist. Nach der Kreuzung dieser mit krankheitsbezogenen Zielen wurden ein "Komponent–Ziel-Pfad"-Netzwerk und GO, KEGG-Begriffe konstruiert. Anschließend werden Molekularandocken und Molekulardynamiksimulationen eingesetzt, um die Bindungsaffinität zwischen Schlüsselkomponenten und Kernzielen zu bewerten, wobei die endgültige Bestätigung durch experimentelle Verifikation erfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Screening von sich kreuzenden Zielen, die mit SONFH assoziiert sind. (A) Vulkandiagramm, das die Verteilung unterschiedlich exprimierter Gene in Krankheitsproben darstellt. Rote Punkte stehen für hochregulierte Gene, blaue Punkte für herunterregulierte Gene, und graue Punkte für Gene, die keine signifikante differentielle Expression besitzen. (B) Heatmap, die die Expressionsmuster der 60 differenziell exprimierten Gene zeigt, mit Spalten, die den Proben entsprechen, und Zeilen, die den Genen entsprechen. (C) Venn-Diagramm, das die Überlappung krankheitsbezogener Ziele aus verschiedenen Datenbanken darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Screening von sich überschneidenden Zielen zwischen CC und SONFH. (A) Venn-Diagramm, das die Verteilung von 61 gemeinsamen Zielen zeigt, die zwischen den vorhergesagten Zielen von Wirkstoffen in CC (gelb) und SONFH-bezogenen Krankheitszielen (lila) geteilt werden. (B) Das Herb-Compound-Target (H-C-T) Netzwerk veranschaulicht die Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und ihren entsprechenden Zielen. Der blaue quadratische Knoten steht für die Krankheit, grüne quadratische Knoten für aktive Verbindungen und orange quadratische Knoten für gemeinsame Ziele. Kanten bezeichnen die Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und ihren Zielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Kandidat-Ziel-Identifikation durch PPI-Analyse. (A) PPI-Netzwerk clustert mit dem MCODE-Plugin. (B) Schematischer Workflow der topologischen Screening innerhalb des PPI-Netzwerks. (C) Schlüsselgene, die vom CytoHubba-Plugin aus dem PPI-Netzwerk extrahiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Ergebnisse der GO-Anreicherungsanalyse und KEGG-Signalanreicherungsanalyse für die 61 gemeinsamen Ziele. (A) Blasendiagramm, das die Top 10 GO-Anreicherungsanalysebegriffe für BP, CC und MF darstellt. (B) Bubble-Plot, das die Top 20 deutlich bereicherten KEGG-Pfade darstellt. (C) Verteilung der 20 wichtigsten angereicherten Signalwege basierend auf der KEGG-funktionalen Klassifikation. (D) Illustratives C-T-P-Netzwerk, das die möglichen Mechanismen darstellt, durch die CC die Osteonekrose des Oberschenkelkopfes verbessern kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Bindungsenergie-Wärmekarte der Wechselwirkungen zwischen den aktiven Verbindungen von CC und den Schlüsselzielen (kcal/mol). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Bindungsmodi von Schlüsselzielen mit spezifischen Wirkstoffen. AKT1-melilotocarpan A (A1), HIF-1α-melilotocarpan A (B1), STAT3-melilotocarpan A (C1), ESR1-melilotocarpan A (D1), CASP3-melilotocarpan A (E1), SRC-melilotocarpan A (F1), EGFR-melilotocarpan A (G1), AKT1-anethole (H1), AKT1-myristicin (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) und (H2) veranschaulichen jeweils ihre 2D-Bindungsmodi. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: RMSD der MD. (A) RMSD-Werte für AKT1-Melilotocarpan A-Komplexe. (B) Die RMSD-Werte der HIF-1α-Melilotocarpan A-Komplexe. (C) Die RMSD-Werte der STAT3-Melilotocarpan-A-Komplexe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: RMSF von MD. (A) Die RMSF-Werte der AKT1-Melilotocarpan-A-Komplexe. (B) Die RMSF-Werte der HIF-1α-Melilotocarpan A-Komplexe. (C) Die RMSF-Werte der STAT3-Melilotocarpan A-Komplexe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: H-Bindungen von MD. (A) Die H-Bindungswerte von AKT1-Melilotocarpan-A-Komplexen. (B) Die H-Bindungswerte von HIF1A-Melilotocarpan-A-Komplexen. (C) Die H-Bindungswerte von AKT1-Melilotocarpan A-Komplexen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 11: CC hemmt die entzündliche Antwort und Apoptose im Oberschenkelkopf und verbessert dadurch SONFH. (A) Repräsentative Oberschenkelkopfabschnitte, gefärbt mit ABH. Leere Lücken werden durch schwarze Pfeilspitzen angezeigt, und pyknotische Kerne durch Pfeile. (B–C) Quantitative Analyse des Verhältnisses der leeren Lacunen (B) und der Anzahl der pyknotischen Kerne (C). n = 5. (D) Repräsentative dreidimensionale Mikro-CT-Rekonstruktionen von Oberschenkelköpfen. (E–G) Quantifizierung von Mikro-CT-Parametern, einschließlich Knochenvolumenfraktion (BV/TV), trabekulärer Trennung (Tb.Sp) und trabekulärer Dicke (Tb.Th). (H) Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von HIF-1α, VEGF und ALP in Femurkopfabschnitten; Kerne wurden mit DAPI gegenfärbt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 5) präsentiert. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Begriff		Faltenanreicherung	P-Wert	Graf	Benutzer-IDs
Blasenkrebs		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
HIF-1-Signalweg		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
EGFR-Tyrosin-Kinase-Inhibitorresistenz		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
Adherens-Kreuzung		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
Endokrine Resistenz		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
ALTERS-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Proteoglykane bei Krebs		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
Relaxin-Signalweg		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-Infektion		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Schilddrüsenhormon-Signalweg		9.56	7.64E-05	7	NOS2,SRC,NOS3,MMP2,NOS1,MMP9,EGFR,VEGFA
Flüssigkeitsscherspannung und Arteriosklerose		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
Hepatitis B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
JAK-STAT-Signalweg		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
Humane Cytomegalovirus-Infektion		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Lipid- und Arteriosklerose		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
MikroRNAs bei Krebs		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
Chemische Karzinogenese – Rezeptoraktivierung		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
Bahnen bei Krebs		5.94	6,64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
Kalzium-Signalweg		5.90	0.00011	9	KAT2B,CREBBP,SRC,EP300,HIF1A,ESR1,MTOR
Humane Papillomavirus-Infektion		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

Tabelle 1: Die KEGG-Anreicherungsergebnisse der Top 20 angereicherten Pfade.

Ergänzende Tabelle 1: Grundlegende Informationen zu Wirkstoffen in CC.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Die Ziele von 85 aktiven Komponenten im CC.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Informationen zu 61 CC-SONFH gemeinsamen Zielen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Ergebnisse der Begriffe der biologischen Prozesskategorien aus der GO-Anreicherungsanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 5: Ergebnisse der Begriffe zur Kategorisierung zellulärer Komponenten aus der GO-Anreicherungsanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 6: Ergebnisse der Molekularfunktionskategorieterme aus der GO-Anreicherungsanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 7: Ergebnisse der Wege aus der KEGG-Anreicherungsanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 8: Molekulare Andockungs-Bindungsenergien (kcal/mol) von Verbindungs-Ziel-Paaren.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 9: Details zu Zielen und Komponenten für das molekulare Andocken.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie erhielten die Autoren 85 bioaktive Verbindungen aus CC aus mehreren Datenbanken und führten Screenings durch, darunter Anethol, Melilotocarpan A und Myristicin. Um Ziele zu identifizieren, kreuzten die Autoren 563 Medikamenten-CC-Ziele mit 1116 SONFH-bezogenen Zielen und erzielten letztlich 61 Ziele. Die Autoren importierten 61 gemeinsame Ziele in die STRING- und DAVID-Datenbanken, um ein PPI-Netzwerk aufzubauen und mögliche pharmakologische Signalwege zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten 10 Schlüsselziele im PPI-Netzwerk, darunter HIF-1α und STAT3. Ischämie und Hypoxie sind zwei der wichtigsten pathogenen Merkmale von SONFH, laut früherer Forschung³⁵. CC kann durch mehrere biologische Prozesse, darunter Angiogenese und transkriptionelle Regulation, positive Effekte bei SONFH ausüben. Dies könnte durch den HIF-1α-Signalweg, Flüssigkeitsscherstress und Arteriosklerose, Lipide und Arteriosklerose, den AGE-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen und andere Signalwege erreicht werden, so die KEGG-Anreicherungsanalyse. Dies deutet darauf hin, dass CC auf SONFH über diese Schlüsselziele und die zugehörigen Signalwege wirken könnte. Um weiter zu klären, ob die Komponenten von CC eng mit den Zielgruppen verknüpft sind, führten die Autoren basierend auf den oben genannten Ergebnissen der pharmakologischen Netzwerkforschung, nämlich der Screening-Ergebnisse der Wirkstoffe des Verschreibungsmittels und der Screening-Ergebnisse der Ziele im PPI-Netzwerk, molekulare Dynamiksimulationen des Melilotocarpan A-AKT1, Melilotocarpan A-HIF-1α durch. und STAT3-melilotokarpanische Komplexe. Dies zeigt, dass Melilotocarpan A stetig an AKT1, HIF-1α und STAT3 bindet, sodass CC tatsächlich positive Effekte haben kann, indem es auf diese Schlüsselziele wirkt. Insgesamt kann CC durch einen mehrkomponenten, multi-Ziel- und Multi-Signalweg-Mechanismus schützende Effekte auf die Lebensqualität bei SONFH-Patienten ausüben.

Die Forschungsgruppe konzentriert sich darauf, die Mechanismen aufzuklären, mit denen YGPs therapeutische Wirkung bei knochenbezogenen Erkrankungen ausüben. Die vorherigen Forschungen zeigten, dass YGPs die Knochenbildung fördern und die trabekuläre Mikroarchitektur im Oberschenkelkopf verbessern, indem sie β-Catenin aktivieren, um die Osteoklastogenese zu hemmen und die Osteogenese während des Kaninchen-SONFH³⁶ zu fördern. Darüber hinaus haben die Forscher festgestellt, dass YGPs therapeutische Effekte auf SONFH hauptsächlich durch die Linderung von Entzündungen und die Förderung der Angiogenese¹² ausüben. YGPs können nicht nur SONFH verbessern, sondern auch die Osteoporose verbessern. Durch die Hemmung des IL-17/NF-κB-Signalwegs und die Verringerung der Th17-Immunantworten verhindern YGPs erfolgreich den durch die Ovariektomie induzierten Knochenverlust³⁷. Durch Tierversuche bestätigten die Forscher, dass Cornus officinalis, einer der Bestandteile von YGPs, Effekte auf SONFH ausübt, indem es die Sekretion von entzündlichen Mediatoren und Knochenzellapoptose³⁸ hemmt. CC, das Yang erwärmen und Qi fördern und Meridiane entblocken kann, ist das Hauptkraut in YGPs und spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung von SONFH und der Linderung von Patientenleiden. Zusammenfassend spiegeln diese Studien den langjährigen Fokus auf die Aufklärung der Mechanismen von YGPs bei Osteonekrose wider und darauf, CC als Hauptkraut zu identifizieren, das mechanistisch untersucht werden sollte.

Unter den vorhergesagten Wirkstoffen zeigen Anethol, Myristicin und andere Wirkstoffe biologische Aktivität gegen knochenbezogene Krankheiten. Es wurde gezeigt, dass Anethole die Erhöhung von Knochenresorptionsmarkern hemmt. Anethole reduziert letztlich die Osteoklast-Differenzierung und die resorptive Funktion, indem es nachgelagerte Signalwege und wichtige regulatorische Faktoren^hemmt. Forschungen zeigen, dass Anethole entzündungshemmende Eigenschaften aufweist und die adipogene Differenzierung in menschlichen Knochenmark-mesenchymalen Stammzellen (hBMSCs) ^hemmt40. Myristicin hemmt Entzündungen und schützt die glatten Gefäßzellen, indem es die PI3K/Akt- und NF-κB-Signalwege⁴¹ unterdrückt. Die Ferroptose ist einer der Hauptmechanismen der SONFH-Pathogenese. Ferroptose ist eine Art programmierter Zelltod, die durch Lipidperoxidation verursacht wird, die von Eisen abhängig ist. Myristicin verhindert die Ferroptose und schützt so die Redoxhomöostase der Osteoblastenzellmembranen⁴². Der andere Wirkstoff von Borneol wurde bestätigt, dass er die Bildung von Aktinringen hemmt, ein Merkmal der resorbierenden Osteoklasten, das die Zellpolarisation widerspiegelt, innerhalb von 30 Minuten^{und 43} Minuten widerspiegelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Komponenten für die schützende Wirkung von CC in SONFH sehr wichtig sein könnten und eine weitere Untersuchung wert sind. Unter all diesen Inhaltsstoffen wurde Melilotocarpan A als repräsentativer Ligand ausgewählt, da es in der MD-Analyse die stabilsten Bindungsaffinitäten mit mehreren Kernzielen aufwies. Unter den bestbewerteten Verbindungen zeigte Melilotocarpan A durchgehend starke Bindungsinteraktionen mit mehreren Schlüsselproteinen im PPI-Netzwerk, was darauf hindeutet, dass es eine wichtige bioaktive Komponente des CC darstellen könnte.

Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des PPI-Netzwerks, dass insbesondere HIF-1α und STAT3 die Kernziele sein könnten. HIF-1α ist der zentrale Vermittler der zellulären Antwort auf Hypoxie. In SONFH-Experimenten verbessert die Aktivierung von HIF-1α die Angiogenese und Knochenreparatur, wodurch die Femurkopfnekrose⁴⁴ gelindert wird. Zusätzlich hat Forschung gezeigt, dass HIF-1α unter hypoxischen Bedingungen eine schützende Wirkung auf Knorpelgewebe haben kann⁴⁵. Die Hochregulierung von HIF-1α unterdrückt die Ferroptose und aktiviert STAT3, um die Differenzierung von Knochenmarkmonozyten zu Osteoklasten⁴⁶ zu beschleunigen. STAT3 ist ein Signaltransduktions- und Transkriptionsaktivator. HBMSCs fördern die Umwandlung von STAT3 in p-STAT3 und verbessern so die Chondrozytenproliferation, Migration und anti-apoptotische Effekte unter hypoxischen Bedingungen⁴⁷. STAT3 verstärkt die osteogene Differenzierung und anti-apoptotische Effekte von hBMSCs, während es deren Sekretion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) erhöht, um die mikrovaskuläre Regeneration der Knochen^{zu fördern 48}. AKT1 ist eine Proteinkinase, die als wichtiger Mediator der Angiogenese-Signalübertragung fungiert. AKT1 ist an der Kopplung von Knochenangiogenese und Osteogenese sowie an der Bildung trabekulärer Knochen^{beteiligt 49}. Insgesamt konvergieren diese Hub-Ziele auf Angiogenese, Hypoxie-Adaptation, Entzündung und Knochenremodellierung, was darauf hindeutet, dass CC durch die Modulation dieser Ziele und ihrer zugehörigen Signalwege schützende Effekte gegen SONFH ausüben kann.

Um den Mechanismus von CC bei der Verbesserung von SONFH zu erforschen, führten die Forscher GO-Analysen und KEGG-Anreicherungsanalysen durch. GO-Ergebnisse zeigen, dass die Zielgene hauptsächlich in biologischen Funktionen angereichert sind, wie etwa der Antwort auf Hypoxie, zellulärer Reaktion auf Lipopolysaccharid und der positiven Regulation der Angiogenese. Die KEGG-Anreicherungsanalyse deutete darauf hin, dass die pharmakologischen Effekte von CC bei SONFH überwiegend mit dem AGE-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen, dem HIF-1α-Signalweg, der Lipid- und Arteriosklerose sowie anderen Signalwegen verbunden sind. SONFH tritt auf, wenn der Blutfluss zum Oberschenkelkopf unterbrochen wird, was zu einem Mangel an Nährstoffversorgung für den Oberschenkelkopf führt und die Zellapoptose⁵⁰ auslöst. HIF-1 besteht aus HIF-1α und HIF-1β, wobei HIF-1α eine Schlüsselrolle in der transkriptionellen Antwort auf hypoxische und ischämische Umgebungen spielt⁴⁷. Frühere Studien haben gezeigt, dass HIF-1α durch die VEGF/AKT/mTOR-Signalkaskade Osteogenese und Angiogenese koordiniert und so die osteogene Differenzierung von fettabgeleiteten Stammzellen entscheidend verbessert. Nach Ischämie entwickelt sich eine Gewebehypoxie, die zu einer deutlichen Erhöhung von HIF-1α in den Zellen führt. was die VEGF-Expression erhöht und folglich die Gefäßreparatur und -regeneration^{fördert 51}. Hypoxie stört die mitochondriale Energieproduktion und erhöht die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Diese Veränderungen fördern die Osteoklastogenese, hemmen die Osteoblastenaktivität und induzieren letztlich die Apoptose der Osteozyten. Eine hohe HIF-1α-Expression verlagert den zellulären Energiestoffwechsel von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse, reduziert die ROS-Produktion und schwächt dadurch die Apoptose in Osteoblasten und Osteozyten^{ab 52,53}. Cancellous Bone unterstützt die hämatopoetische Funktion des Knochenmarks und speichert Mineralien wie Kalzium. Eine erhöhte Aktivität von HIF-1α kann direkt die Cancellose Knochenbildung^{erhöhen 54}. Zusätzlich erhält HIF-1α das Überleben der Chondrozyten und die Homöostase unter hypoxischen Bedingungen⁴⁵. Folglich ist der HIF-1α-Signalweg zu einem therapeutischen Ziel für ONFH geworden, mit potenzieller therapeutischer Anwendung für ONFH.

Im AGE-RAGE-Signalweg entstehen Advanced Glycation-Endprodukte (AGEs) durch die nicht-enzymatische kovalente Kreuzbindung von Kohlenhydraten mit Proteinen, Fetten oder anderen biologischen Makromolekülen⁵⁵. AGEs können Zellen und Gewebe durch entzündliche und oxidative Schäden schädigen. Über vier Signalwege werden Signale durch die AGE-RAGE-Wechselwirkung transduziert. Diese sind 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK und (4) NADPH-Oxidase-ROS⁵⁶. Am Ende gelangt das phosphorylierte NF-κB in den Kern, um die Expression von proinflammatorischen Zytokinen, Wachstumsfaktoren, profibrotischen Zytokinen und oxidativem Stress zu transkribieren. Die Studie hat gezeigt, dass AGE-RAGE die Osteoblastenapoptose über den MAPK-Signalweg und die Aktivierung von oxidativem Stress fördert und die osteogene Differenzierung hemmt, indem es die Niveaus der endoplasmatischen Retikulum-Stresssensoren sowie durch DNA-Methylierung/den Wnt-Weg⁵⁷ unterdrückt. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass AGEs und RAGEs an der vaskulären Verkalkung⁵⁸ beteiligt sind.

Im Lipid- und Atherosklerose-Signalweg aktivieren oxidierte Lipide PPARγ. Es ist ein Hauptregulator der Adipogenese, der osteogene Differenzierung^{hemmt 59}. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass Lipide die Differenzierung und Reifung von Osteoklasten und Osteoblasten beeinflussen und dadurch die Knochenhomöostase⁶⁰ stören. Mehrere grundlegende Studien haben die bedeutende Rolle der Apoptose in den physiologischen und pathologischen Mechanismen von SONFH gezeigt. Nachfolgende in vivo Tierversuche bestätigten zudem, dass der aktive Anteil von CC Apoptose und Entzündung bei SONFH effektiv unterdrückt und so das Fortschreiten der Krankheit mindert.

Im Einklang mit diesen Erkenntnissen deuten Netzwerkpharmakologie und experimentelle Analysen darauf hin, dass CC SONFH verbessern kann, indem es die Anpassung der Hypoxie, die Angiogenese reguliert und die Stoffwechselprozesse moduliert. Quantitative Mikro-CT-Analysen zeigten, dass die CC-Intervention signifikant die Knochenvolumenfraktion (BV/TV) wiederherstellte, die Trabekeltrennung (Tb.Sp, Tb.Th) reduzierte und die Wiederherstellung der Knochenmikrostruktur förderte. Die KEGG-Anreicherungsanalyse hob zudem den HIF-1α-Signalweg als einen Schlüsselmechanismus hervor, der diesen Effekten zugrunde liegt. Zusammen deuten diese Tierversuche darauf hin, dass CC SONFH lindern kann, indem es hypoxiebezogene und entzündungsbedingte biologische Prozesse reguliert und Angiogenese sowie Knochenremodellierung fördert – möglicherweise über Schlüsselwege wie den HIF-1α-Signalweg.

Obwohl einige wichtige vorläufige Ergebnisse erzielt wurden, weist diese Studie dennoch einige Einschränkungen auf. Die Autoren stützten sich ausschließlich auf moderne bioinformatische Methoden, darunter Netzwerkpharmakologie und MD, sowie einige Tierversuche, um die Rolle von CC im SONFH zu untersuchen. Daher müssen die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Vorhersagen in vivo und in vitro weiter überprüft werden. Diese Studie liefert vorläufige Hinweise auf die Mechanismen, durch die CC SONFH verbessert, die weitere experimentelle Validierung erfordern. Durch die Integration der Netzwerkpharmakologie mit MD kartierten die Autoren systematisch die bioaktiven Wirkstoffe, Schlüsselziele und angereicherten CC-Signalwege in SONFH. Abschließend untersuchte diese Studie die potenziellen schützenden Effekte von CC bei SONFH durch integrative Netzwerkpharmakologie und in vivo-Validierung . Die Ergebnisse zeigen, dass die Mechanismen hauptsächlich mit der Modulation des HIF-1-Signalwegs und der Förderung der osteogenen Regeneration verbunden waren. Wie in der entsprechenden Abbildung dargestellt, modulierte die CC-Besserung die Expression wichtiger Proteine, darunter HIF-1α, VEGF und ALP, dosisabhängig signifikant, was ihre Rolle bei der Koordination der Hypoxie-Anpassung, Angiogenese und osteogenen Aktivität weiter unterstützt. Diese Ergebnisse wurden durch Mikro-CT-Analysen bestätigt, die zeigte, dass die CC-Intervention effektiv die Knochenvolumenfraktion wiederherstellte und die trabekuläre Mikrostruktur verbesserte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4 % PFA	biosharp	BL539A
Absolutes Ethenol	Sinopharm Gruppe Co.Ltd	10009218
Alcian-Blau-Flecken-Set	Solarbio	G1563
ALP	Ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Research		Version 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Research		Version 1.5.7
Online-Plattform für Bioinformatik			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 Kraftfeld			Verwendet zur MD-Parametrisierung
CTD			https://ctdbase.org
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium		Version 3.10.3; Plugins: CytoHubba, CytoNCA
DAPI-Färbelösung	Beyotime Biotech Inc.	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Andockvisualisierung
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA-Entkalkung	Beyotime Biotech Inc.	C0167-3L
Endogene Peroxidase-Blockierungslösung	Beyotime Biotech Inc.	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Ziegen-Anti-Kaninchen IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Ziegenserum	Beyotime Biotech Inc.	C0265
GraphPad-Prisma	GraphPad (Dotmatik)		Version 10; Statistische Analyse und Grafikzeichnung
GROMACS	GROMACS		Version 2022; CHARMM36 Kraftfeld
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	Hangzhou Huaan	HA721997
Hochauflösende Mikro-CT-Geräte	Bruker	SkyScan
Lipinski-Regelfilter			MW ≤ 500; miLogP ≤ 5; HBD ≤ 5; HBA ≤ 10
Lipopolysaccharid	Sigma-Aldrich	L4516
Methylprednisolon	Sinopharm Gruppe Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Neutraler Balsam	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Paraffin	Sinopharm Gruppe Co.Ltd	C416770020
Partikelgitter Ewald (PME)			Langstreckenelektrostatik
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Dinger		Proteinvisualisierung und -vorbereitung
R	CRAN		Version 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Schweizer Institut		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Schweizer Institut		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P-Wassermodell			Verwendung für die Solvation
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Verwendet für Datenverarbeitung, molekulares Andocken und MD-Simulationen
Xylen	Sinopharm Gruppe Co.Ltd	10023418