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Isolierung, Synthese und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-modifizierten, makrophagenmembranbeschichteten Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) Nanopartikeln

DOI:

10.3791/70791

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May 29th, 2026

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1Department of Cardiology, Anqing Petrochemical Hospital of Nanjing Drum Tower Hospital Group, 2Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-komodifizierten makrophagenmembranbeschichteten Poly(Milch-Co-Glykolsäure)-Nanopartikeln für gezielte Anwendungen der Arzneimittelabgabe.

Abstract

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Arteriosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung und ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Die gezielte Verabreichung von entzündungshemmenden Mitteln an atherosklerotischen Stellen bleibt eine erhebliche Herausforderung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-ko-modifizierten makrophagenmembranbeschichteten, colchicingeladenen Poly(Milch-Co-Glykolsäure)-Nanopartikeln (MMM/COL NPs). Das Protokoll umfasst Makrophagenmodifikation mittels Plasmidtransfektion und Endothelin-1-Stimulation, Membranisolierung, NP-Herstellung und Membranbeschichtung. Die resultierenden MMM/COL-NPs werden mittels physikochemischer Charakterisierung, Proteinexpressionsanalyse sowie in vitro- und in-vivo-Tests bewertet. Die funktionelle Validierung umfasst die Bewertung der zellulären Assoziation mit aktivierten Endothelzellen, der Makrophageaufnahme, entzündungshemmenden Effekten in Schaumstoffzellen und der Biodistribution in einem Maus-Atherosklerose-Modell. Zusätzlich werden wichtige experimentelle Parameter und Qualitätskontrollschritte hervorgehoben, um Reproduzierbarkeit und Konsistenz in verschiedenen Laboren sicherzustellen. Dieses Protokoll bietet einen robusten und skalierbaren Ansatz zur Erzeugung biomimetischer NPs für gezielte Anwendungen der Arzneimittelabgabe in der Atheroskleroseforschung.

Introduction

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Arteriosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch arterielle Lumenstenose und instabile Plaque-Ruptur zu tödlichen kardiovaskulären Ereignissen und Schlaganfall führt und eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung verursacht. Die Downregulation der Entzündungsreaktionen an der atherosklerotischen Stelle ist ein zentrales therapeutisches Ziel 4,5. Colchicin, ein starkes entzündungshemmendes Medikament, hat vielversprechende Folgen bei der Reduzierung unerwünschter....

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Protocol

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Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Nanjing Drum Tower Hospital genehmigt und folgten den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die von den National Institutes of Health festgelegt wurden.

1. Modifikation der RAW-264.7-Makrophagen

  1. Bereite RAW 264,7 Zellen vor, vervollständige Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin–Streptomycin, CD47 Überexpressionsplasmid, Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz, Endothelin-1 (ET-1), phosphatg....

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Results

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DLS-Messungen wurden mit einem Zetasizer Nano ZS-System bei 25°C und einem Rückstreuwinkel von 173° durchgeführt. Die Proben wurden 20-fach in deionisiertem Wasser verdünnt (Endkonzentration ca. 0,1 mg/mL) und vor der Messung 2 Minuten lang ausgegliglibriert. Jede Probe wurde dreifach gemessen, und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. DLS und TEM zeigen eine Zunahme der NP-Größe nach der Membranbeschichtung und bestätigen die Bildung einer Kern-Schalen-Struktur (

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Discussion

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Dieses Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Konstruktion und Anwendung von CD47- und Integrin-α4/β1-ko-modifizierten makrophagenmembranbeschichteten NPs für eine gezielte Atherosklerose-Therapie. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems umfassen die aktive Zielerfassung über die Integrin-α4/β1–VCAM-1-Interaktion und eine reduzierte Makrophagenaufnahme, die mit CD47-vermittelter Signalübertragung verbunden ist, wie durch in vitro Aufnahmetests (Abbildung 3

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Dr. Jinxuan Zhao und Dr. Dr. Jiaqi Yu für ihre wissenschaftlichen Ratschläge sowie dem Personal von PROMAB für ihre technische Unterstützung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)Thermo Fisher Scientific (USA)A1310Viabilitätsfarbe zur Flusszytometrie-Unterscheidung von lebend/toten
Alexa Fluor 488-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgGThermo Fisher Scientific (USA)A-11008Sekundärer Antikörper für CD68-Immunfluoreszenzfärbung
Anti-Maus-CD47-AntikörperAbcam (USA)ab214453Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der CD47-Expression
Anti-Maus-Integrin & Alpha; 4-Antikörper (B-2)Santa Cruz Biotechnologie (USA)SC-376334Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Verifikation von Integrin & Alpha; 4 Ausdruck
Anti-Maus-Integrin & Beta; 1 Antikörper (A-4)Santa Cruz Biotechnologie (USA)SC-374429Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Verifikation von Integrin & Beta; 1-Ausdruck
ApoE-/- MäuseDas Jackson-Labor (USA)N/AVerwendung für das Arteriosklerose-Modell in vivo
BCA-TestkitThermo Fisher Scientific (USA)23225Verwendet zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Schwarze SilikonplatteN/AN/AZur Montage der Aorta für ex-vivo-Bildgebung verwendet
CD47-Plasmid (pcDNA3.1(+))Generay Biotech (China)G0177361-1Enthält das Maus-Cd47-Gen zur Überexpression
ColchicinSigma-Aldrich (USA)C9754Therapeutische Nutzlast in Nanopartikeln
Konfokales LaserscanningmikroskopLeica MicrosystemsTCS SP8Verwendet für Fluoreszenzbildgebung und Kolokalisationsanalyse
Citratpuffer (pH 6,0)Thermo Fisher Scientific (USA)N/AVerwendet zur Antigenabfindung bei der Immunfluoreszenzfärbung
Dialyserohr (MWCO 3.500 DA)Sigma-Aldrich (USA)PURD35030Verwendet zur Nanopartikelreinigung
Dimethylsulfoxidid (DMSO)Sigma-Aldrich (USA)D2447Lösungsmittel zur Herstellung von Nanopartikeln
DiI (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat)Beyotime (China)C1036Fluoreszierende Markierung des Nanopartikelkerns
DiO (3,3&prim;-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat)Beyotime (China)C1038Fluoreszierende Markierung der Makrophagenmembran
DiRBeyotime (China)Y239280Verwendet für die Fluoreszenzbildgebung in vivo
DAPIThermo Fisher Scientific (USA)D3571Kern-Gegenfarbe für die Fluoreszenzbildgebung
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (USA)11965092Zellkulturmedium
Dynamischer Lichtstreuungsanalysator (Zetasizer Nano ZS)Malvern Panalytical (UK)N/AVerwendet für dynamische Lichtstreuung (DLS)-Messungen der Nanopartikelgröße, PDI und Zetapotenzials
ELISA-KitR& D Systems (USA)Das hängt vom Zielzytokin abZur Quantifizierung von entzündlichen Zytokinen verwendet
Endothelin-1 (ET-1)Sigma-Aldrich (USA)E7764Wird verwendet, um Integrin & Alpha zu stimulieren; 4/Β 1-Ausdruck
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)10091148Ergänzungsmittel für Zellkulturmedium
DurchflusszytometerBD Biosciences (USA)FACSCaliburVerwendet zur Aufnahme von Fluoreszenzsignalen
Software zur Durchflusszytometrieanalyse (FlowJo v10.8.1)BD Biosciences (USA)N/AVerwendung für die Analyse von Durchflusszytometriedaten
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVECs)FuHeng Biotechnologies (China)FH1122Verwendet für In-vitro-Targeting-Assays
Bildanalyse-Software (ImageJ)National Institutes of Health (USA)N/AVerwendung für quantitative Bildanalysen
In-vivo-BildgebungssystemPerkinElmer (USA)IVIS Lumina IIIVerwendet für die Ganzkörper-Fluoreszenzbildgebung
Isopropanol (60 %)Sigma-Aldrich (USA)34863Verwendet zur Differenzierung während der Oil Red O-Färbung
Lipofektamin 3000Thermo Fisher Scientific (USA)L3000001Transfektionsreagenz
Magnetischer Rührer und RührstangeN/AN/AVerwendet zur Herstellung von Nanopartikeln
Masson' s Trichrome Beiz-KitAbcam (USA)ab150686Verwendet zur Kollagenfärbung
Mini-ExtruderAvantipolare Lipide (USA)610000Verwendung für die Membranextrudion
Murine RAW 264.7 ZelllinieFuHeng Biotechnologies (China)FH0328Quelle der Makrophagen
Glatte Muskelzelllinie der MausFuHeng Biotechnologies (China)FH-Y063Verwendung für die Sicherheitsbewertung
Oil Red OSigma-Aldrich (USA)O0625Verwendet zur Lipidfärbung
Opti-MEMThermo Fisher Scientific (USA)31985062Reduziertes Serummedium für Transfektion
Oxidiertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (Ox-LDL)Yiyuan Biotechnologies (China)YB-002Verwendet zur Induzierung der Bildung von Schaumstoffzellen
Penicillin– StreptomycinThermo Fisher Scientific (USA)15140122Antibiotikumpräparat zur Zellkultur
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Sigma-Aldrich (USA)78830Proteaseinhibitor
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific (USA)10010023Wasch- und Verdünnungspuffer
Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) (PLGA, 50:50; MW 90.000)Dalian Meilun Biotechnologie (China)MB5649-1Polymer zur Herstellung von Nanopartikeln
Polycarbonat-Membranfilter (200 nm, 400 nm)Whatman (UK)800282Verwendung für Extrusion
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-Aldrich (USA)P9333Komponente des Lysispuffers
P3000-ReagenzThermo Fisher Scientific (USA)L3000001Transfektionsverstärker
Rotierendes MikrotomLeica Biosystems (Deutschland)RM2235Verwendung für Paraffinschnitte
SpritzenpumpeHarvard-Apparat (USA)70-3007Verwendet zur kontrollierten Nanopartikelbildung
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)Thermo Fisher Scientific (USA)Talos F200SVerwendung für die Nanopartikelbildgebung
Tris-HClSigma-Aldrich (USA)T2663Pufferkomponente
Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α)R& D Systems (USA)410-MTZur Aktivierung von Endothelzellen verwendet
Ultrareines WasserMilli-Q (Merck, USA)ZMQSV0T01Verwendet für die Herstellung und Dialyse von Nanopartikeln

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Macrophage MembranePoly Lactic Glycolic AcidNanoparticle SynthesisMembrane CoatingCD47 ModificationIntegrin Alpha4 Beta1Plasmid TransfectionProtein Expression AnalysisTargeted Drug DeliveryAtherosclerosis Model

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