Isolierung, Synthese und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-modifizierten, makrophagenmembranbeschichteten Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) Nanopartikeln

Summary

Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-komodifizierten makrophagenmembranbeschichteten Poly(Milch-Co-Glykolsäure)-Nanopartikeln für gezielte Anwendungen der Arzneimittelabgabe.

Abstract

Arteriosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung und ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Die gezielte Verabreichung von entzündungshemmenden Mitteln an atherosklerotischen Stellen bleibt eine erhebliche Herausforderung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung und Charakterisierung von CD47- und Integrin-α4/β1-ko-modifizierten makrophagenmembranbeschichteten, colchicingeladenen Poly(Milch-Co-Glykolsäure)-Nanopartikeln (MMM/COL NPs). Das Protokoll umfasst Makrophagenmodifikation mittels Plasmidtransfektion und Endothelin-1-Stimulation, Membranisolierung, NP-Herstellung und Membranbeschichtung. Die resultierenden MMM/COL-NPs werden mittels physikochemischer Charakterisierung, Proteinexpressionsanalyse sowie in vitro- und in-vivo-Tests bewertet. Die funktionelle Validierung umfasst die Bewertung der zellulären Assoziation mit aktivierten Endothelzellen, der Makrophageaufnahme, entzündungshemmenden Effekten in Schaumstoffzellen und der Biodistribution in einem Maus-Atherosklerose-Modell. Zusätzlich werden wichtige experimentelle Parameter und Qualitätskontrollschritte hervorgehoben, um Reproduzierbarkeit und Konsistenz in verschiedenen Laboren sicherzustellen. Dieses Protokoll bietet einen robusten und skalierbaren Ansatz zur Erzeugung biomimetischer NPs für gezielte Anwendungen der Arzneimittelabgabe in der Atheroskleroseforschung.

Introduction

Arteriosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch arterielle Lumenstenose und instabile Plaque-Ruptur zu tödlichen kardiovaskulären Ereignissen und Schlaganfall führt und eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung verursacht. Die Downregulation der Entzündungsreaktionen an der atherosklerotischen Stelle ist ein zentrales therapeutisches Ziel ^4,5. Colchicin, ein starkes entzündungshemmendes Medikament, hat vielversprechende Folgen bei der Reduzierung unerwünschter kardiovaskulärer Ereignisse^{gezeigt 6,7}. Sein klinischer Nutzen ist jedoch durch ein enges therapeutisches Zeitfenster und systemische Nebenwirkungen begrenzt, was gezielte Abgabesysteme erfordert, um die Ansammlung an der Plaquestelle zu verbessern und gleichzeitig die Toxizität⁸ zu minimieren.

Zellmembranbeschichtete Nanopartikel (NPs) haben sich als leistungsstarke Plattform für gezielte Arzneimittelabgabe etabliert, die die natürlichen biologischen Funktionen der Quellzellen^nutzt. Unter den Zelltypen, die an Atherosklerose beteiligt sind, spielen Makrophagen eine zentrale Rolle 12,13,14. Integrin α4/β1, das auf Makrophagen exprimiert wird, vermittelt die Rekrutierung zu atherosklerotischen Plaques, indem es an das Gefäßzelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) bindet, das an aktivierten Endothelzellen (ECs) exprimiert wird. CD47, ein "Iss mich nicht"-Signal, ermöglicht die Ausweichung der Phagozytose durch das mononukleäre Phagozytensystem^15,16. Indem man Makrophagenmembranen so konstruiert, dass sie diese Proteine im Vergleich zu natürlichen Makrophagenmembranen überexprimieren, können NPs mit verbesserter Zielsetzung durch Integrin-α4/β1–VCAM-1-Interaktion und reduzierte Phagozytose durch CD47-vermittelte Signalisierung⁶ erzeugt werden. Die duale Modifikationsstrategie verbessert native membranbeschichtete NPs und ligandenbasierte Zielsysteme, indem sie gleichzeitig die Zielerfassung auf aktivierte ECs verbessert und die phagozytische Clearance reduziert. Im Gegensatz zu native Makrophagenmembranen, die nur Ausgangswerte dieser Proteine exprimieren, bietet unsere entwickelte Membran eine verbesserte Funktionalität, ohne synthetische Zielliganden einzuführen, die Immunogenität auslösen könnten.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung von colchicingeladenen Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) NPs (COL NPs), die mit CD47- und Integrin-α4/β1-komodifizierten Makrophagenmembranmembranen beschichtet sind, wodurch modifizierte makrophagenmembranbeschichtete NPs (MMM/COL NPs) erzeugt werden. Wir beschreiben Methoden zur genetischen und pharmakologischen Modifikation von RAW 264.7 Makrophagen, zur Isolierung modifizierter Membranen, zur Herstellung und Beschichtung von PLGA-NPs sowie umfassende in vitro und in vivo funktionelle Assays. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren Rahmen zur Vorbereitung und Bewertung biomimetischer NPs für gezielte Anwendungen der Arzneimittelabgabe in der Arterioskleroseforschung.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Nanjing Drum Tower Hospital genehmigt und folgten den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die von den National Institutes of Health festgelegt wurden.

1. Modifikation der RAW-264.7-Makrophagen

1. Bereite RAW 264,7 Zellen vor, vervollständige Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin–Streptomycin, CD47 Überexpressionsplasmid, Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz, Endothelin-1 (ET-1), phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und sterilen Gewebekulturvorräten.
2. Kultivieren Sie RAW-264,7 Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C mit 5 % CO₂ und erhalten Sie die Zellen, bis sie etwa 4–5 × 10⁵ Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte erreichen.
3. Durchführung der CD47-Modifikation
   1. Plasmid-DNA-Lösung wird hergestellt, indem man 2,5 μg Plasmid-DNA mit 5 μL P3000-Reagenz in 125 μL Opti-MEM-serumfreiem Medium mischt.
   2. Bereiten Sie Transfektionsreagenzlösung vor, indem Sie 3,75 μL Transfektionsreagenz in 125 μL serumfreiem Medium verdünnen.
   3. Verwenden Sie diese Bände für ein 6-Well-Plattenformat. Skalieren Sie alle Komponenten proportional für andere Formate, wobei ein DNA:P3000-Verhältnis von 1:2 (μg:μL) und ein DNA:Transfektions-Reagenzverhältnis von 1:1,5 (μg:μL) beibehalten wird.
      HINWEIS: Zum Beispiel verwenden Sie 10 μg DNA, 20 μL P3000 und 15 μL Transfektionsreagenz für 10 cm große Schalen.
   4. Kombinieren Sie die DNA-Lösung mit der Transfektionsreagenzlösung und inkubieren Sie 15 Minuten bei 25 °C.
   5. Fügen Sie die Transfektionskomplexe den Zellen in antibiotikafreiem DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS bei etwa 2–2,5 × 10^{6 Zellen pro} 10 cm Schüssel.
   6. Ersetzen Sie das Medium 6 Stunden nach der Transfektion durch ein frisches, vollständiges Medium mit Antibiotika.
4. Führen Sie eine Integrin-α4/β1-Modifikation durch
   1. Stimuliere transfizierte oder nicht-transfizierte Zellen mit 100 nM ET-1 in serumfreiem Medium für 24 Stunden, um die Integrin-α4/β1-Expression hochzuregulieren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Modifikationseffizienz durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Western-Blot-Analyse für CD47, Integrin α4 und Integrin β1.

2. Isolierung der modifizierten Makrophagenmembran (MMM)

1. Ernte die modifizierten RAW-264.7-Zellen mit einem Zellschraper.
2. Zentrifugiere die Zellen bei 900 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
3. Wasche das Zellpellet dreimal mit kaltem 1× PBS.
4. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 2 mL vorgekühltem hypotonen Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) und inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang auf Eis.
5. Die Suspension 2 Minuten in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann 5 Minuten in einem 37°C-Wasserbad auftauen. Wiederholen Sie den Frost-Tau-Zyklus fünfmal, um die Zellen vollständig zu lysieren.
   VORSICHT: Flüssigstickstoff kann schwere kryogene Verbrennungen verursachen. Behandle mit geeigneten isolierten Handschuhen und Gesichtsschutz.
6. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 850 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um Kerne und ungebrochene Zellen zu entfernen.
7. Zentrifugieren Sie das gesammelte Supernatant bei 15.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C. Um eine höhere Membranreinheit zu erreichen, wird das nach 15.000 × g erzeugte Supernatant in Ultrazentrifugenröhren übertragen und bei 100.000 × g 1 Stunde bei 4°C mit einer Ultrazentrifuge zentrifugiert.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Ultrazentrifugenröhren richtig ausbalanciert und für Hochgeschwindigkeitszentrifugation ausgelegt sind, um ein Rotorungleichgewicht oder einen Ausfall zu verhindern.
   HINWEIS: Ultrazentrifugation führt zu gereinigten Plasmamembranen mit reduzierter intrazellulärer Organellenkontamination.
8. Sammeln Sie das Pellet mit MMM-Fragmenten und suspendieren Sie es in 300 μL 1× PBS oder Lysepuffer, um eine Proteinkonzentration von etwa 1–2 mg/ml zu erhalten.
9. Bestimmen Sie die Membranproteinkonzentration mit einem BCA-Proteinquantifizierungs-Assay-Kit.
   HINWEIS: Isolierte Membranen können bei −80°C für spätere Nutzung gelagert werden.

3. Herstellung von colchicinhaltigen PLGA NPs (COL NPs)

1. 10 mg PLGA (50:50, MW 90.000) und 1 mg Colchicin in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen.
   VORSICHT: DMSO kann die Haut durchdringen und die Aufnahme anderer Substanzen verbessern. Tragen Sie beim Umgang geeignete persönliche Schutzausrüstung (Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille). Sammeln Sie DMSO-haltige Lösungen als organische Lösungsmittelabfälle und entsorgen Sie sie über lizenzierte Entsorgungsdienste für gefährliche Abfälle. Colchicin ist toxisch und potenziell teratogen. Sammeln Sie alle mit Colchicin kontaminierten Materialien (Lösungen, Handschuhe und Tuben) als gefährliche pharmazeutische Abfälle und entsorgen Sie sie über lizenzierte Entsorgungsdienste für gefährliche Abfälle gemäß institutionellen und lokalen Vorschriften.
2. Rühren Sie die Lösung bei 500 U/min mit einem magnetischen Rührer mit einem 10 mm teflonbeschichteten Rührstab bei 25 °C um.
3. Fügen Sie 4 ml ultrareines Wasser tropfweise mit etwa 1 ml/min mit einer Spritzenpumpe mit einer 5-ml-Spritze und einer 26-G-Nadel bei 25 °C hinzu.
4. Rühre die Mischung 3 Stunden lang weiter, um die NP-Bildung zu ermöglichen.
5. Übertragen Sie die NP-Suspension in einen Dialysebeutel (MWCO 3.500 Da).
6. Dialyse mit 2 L destilliertem Wasser bei 4 °C und sanftem Rühren bei 200 U/min.
7. Dialyse 24 Stunden weiter und ersetze den Dialysepuffer komplett bei 6, 12 und 24 Stunden, um freies Colchicin und DMSO zu entfernen.
   VORSICHT: Sammeln Sie alle organischen Lösungsmittel und Reagenzien, einschließlich der Dialyse, als organische chemische Abfälle. Entsorgen Sie es nicht in den Abfluss. Befolgen Sie institutionelle Protokolle zur Entsorgung gefährlicher Abfälle.
8. Sammeln Sie die dialysierte COL NP-Suspension und lagern Sie sie bei 4°C.
   HINWEIS: COL NPs können für den kurzfristigen Gebrauch (bis zu 3 Tage) bei 4°C gelagert werden. Für die fluoreszierende Markierung fügen Sie 0,1 % (W/W) des 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat-(DiI)-Farbstoffs in die PLGA-Lösung während Schritt 3.1 ein.
9. Überprüfen Sie die Entfernung von DMSO und kostenlosem Colchicin
   1. Sammeln Sie das endgültige Dialysat (den Puffer nach der letzten Änderung bei 24 Stunden) und analysieren Sie es mit ultraviolett-sichtbarer (UV-sichtbarer) Spektrophotometrie.
   2. Scanne das Dialysat von 200 bis 400 nm und vergleiche es mit einer Kontrollprobe (frischer Dialysepuffer).
   3. Bestätigen Sie, dass bei etwa 210 nm (charakteristisch für DMSO) oder bei 345 nm (charakteristisch für Colchicin) kein Absorptionspeak vorhanden ist, was auf eine erfolgreiche Entfernung von Restlösungsmittel und freiem Arzneimittel hinweist.
   4. Alternativ können Sie die Rest-DMSO-Konzentration mit einem DMSO-Testkit gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmen. Stellen Sie sicher, dass der Rest-DMSO unter 0,1 % (v/v) liegt, um Zytotoxizität bei nachgelagerten Assays zu vermeiden.

4. Herstellung von membranbeschichteten NPs (MMM/COL NPs)

1. Sonikieren Sie die isolierte MMM-Suspension (ab Schritt 2.7) für 20 Minuten mit einem Wasserbad-Sonikator bei 40 kHz und 110 W. Halten Sie das Probenvolumen bei 1 mL in einem 1,5-mL-Rohr und die Temperatur unter 25°C mit Eisbad bei Bedarf.
2. Pressen Sie die sonizierte Membransuspension durch einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 400 nm mit einem Mini-Extruder, um Membranvesikel zu bilden.
3. Mischen Sie die COL NPs (ab Schritt 3.5) mit den MMM-Vesikeln bei einem Membranprotein-zu-PLGA-Massenverhältnis von 1:1.
   1. Verwenden Sie eine Membransuspension mit 10 mg Protein für 10 mg PLGA, wie durch einen Proteinquantifizierungstest bestimmt.
   2. Sanft die COL NPs mit den MMM-Vesikeln 15 Mal mit einer 1-mL-Pipette auf und ab mischen.
4. Ko-Extrudieren Sie die Mischung durch einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 200 nm und wiederholen Sie die Extrusion für 15 Durchgänge.
5. Sammeln Sie die resultierende Suspension mit MMM/COL NPs auf und lagern Sie sie bei 4°C für sofortige Gebrauch.

5. Charakterisierung von NPs

1. Messung des hydrodynamischen Durchmessers, des Polydispersitätsindex (PDI) und des Zeta-Potenzials mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) unter folgenden Bedingungen: Temperatur, 25°C; Rückstreuwinkel, 173°; Gleichgewichtszeit, 2 Minuten; und drei Replikationsmessungen pro Probe.
2. Verdünnen Sie die Proben 20-fach in deionisiertem Wasser (Endkonzentration ca. 0,1 mg/mL).
   HINWEIS: Verdünnung minimiert mehrere Streueffekte.
3. Visualisieren Sie die Kern-Schalen-Struktur von MMM/COL NPs mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
   1. Geben Sie 5 μL NP-Suspension (ca. 0,1 mg/mL) auf ein glühfähiges, kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (300 Mesh).
   2. Lass die Probe 2 Minuten bei 25 °C adsorbieren.
   3. Entferne überschüssige Flüssigkeit, indem du vorsichtig mit Filterpapier den Rand des Gitters berührst.
   4. Trage 5 μL 1%ige Uranylacetatlösung auf das Gitter auf und inkubiere 1 Minute bei 25°C.
   5. Entfernen Sie überschüssige Flecken mit Filterpapier.
   6. Lassen Sie das Gitter mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung vollständig an der Luft trocknen.
      VORSICHT: Uranylacetat ist giftig und radioaktiv. Behandeln Sie mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz) und entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Materialien.
4. Beschriften Sie die Membran während Schritt 2 mit 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanin-Perchlorat-(DiO)-Farbstoff oder durch Markierung intakter Zellen vor der Membranisolierung und beschriften Sie den PLGA-Kern mit DiI.
5. Analyse der Kolokalisierung von DiO- (grün) und DiI-(roten) Signalen mittels konfokaler Laserrastermikroskopie (CLSM).
   1. Stellen Sie Anregungs-/Emissionsparameter wie folgt ein: DiO (grün), Anregung 488 nm, Emission 550 nm; DiI (rot), Anregung 561 nm, Emission 620 nm.
   2. Verwenden Sie ein 60× Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur, 1,4).
   3. Stell das Lochloch auf 1 Airy-Einheit ein.
   4. Passen Sie die Detektorverstärkung an, um eine Pixelsättigung zu vermeiden.
   5. Aufnahme von Bildern mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixeln und 2× Zeilenmittelwert.
   6. Halten Sie die Laserleistung unter 5 %, um Photobleaching zu minimieren.
6. Analysieren Sie das Vorhandensein von CD47, Integrin α4 und Integrin β1 auf der MMM/COL NP-OBERFLÄCHE MITTELS WESTLICHER BLOT-ANALYSE.
7. Bestimmen Sie die Medikamentenladung und -freisetzung
   1. Lysieren Sie ein 100 μL Volumen NPs in DMSO und messen Sie die Colchicin-Absorption bei 345 nm, um die Arzneimittelbelastung und die Verkapselungseffizienz zu bestimmen.
   2. Geben Sie 1 ml MMM/COL NP-Suspension (mit etwa 100 μg Colchicin) in einen Dialysebeutel (MWCO, 3.500 Da).
   3. Verschließen Sie den Beutel und tauchen Sie ihn in 50 ml PBS (pH 7,4) mit 20 % FBS in einem 100 ml Glasbecher.
   4. Halten Sie das Freigabemedium bei 37 °C bei konstantem Rühren bei 100 U/min mit einem magnetischen Rührer mit einem 20 mm Teflon-beschichteten Rührstab.
   5. Halte die Senkenbedingungen während des gesamten Experiments aufrecht.
      HINWEIS: Die Colchicinlöslichkeit in PBS mit 20 % FBS beträgt >1 mg/mL; Die maximale Colchicinkonzentration im Freisetzungsmedium beträgt <10 % der Sättigung.
   6. Zu vorgegebenen Zeitpunkten (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 und 62 H) werden 500 μL Freigabemedium entnommen.
   7. Ersetzen Sie das entnommene Volumen durch ein gleiches Volumen frisches, vorgewärmtes PBS (37°C), das 20 % FBS enthält.
   8. Missen Sie die Colchicinkonzentration in den entnommenen Proben mittels UV-Vis-Spektrophotometrie bei 345 nm.
   9. Führen Sie alle Messungen in dreifacher Ausführung durch.

6. In-vitro funktionelle Assays

1. Säen menschliche Nabelvenendothelzellen (HUVECs). Stimulieren Sie die Zellen mit 10 ng/mL Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) für 24 Stunden, um VCAM-1 hochzuregulieren.
2. Zelluläre Assoziation von MMM/DiI-NPs mit HUVECs
   1. Inkubieren Sie die Zellen mit DiI-markierten MMM/COL NPs (MMM/DiI NPs) bei einer Konzentration von 50 μg/mL (basierend auf PLGA-Kernmasse) für 4 Stunden bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre.
   2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS. Zentrifugiere die Zellen nach jedem Waschen mit 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
   3. Lassen Sie die gewaschenen Zellen in PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) erneut suspendieren. Stellen Sie die Endzellkonzentration auf 1 × 10^{6 Zellen} /ml an.
   4. Stellen Sie die Instrumentparameter für die Durchflusszytometrie oder CLSM ein. DiI-Fluoreszenz durch Anregung bei 549 nm und Emission bei 565 nm (PE-Kanal) detektieren.
   5. Sammeln Sie Daten aus den Proben. Erfassen Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe für die Durchflusszytometrie oder erfassen Sie repräsentative Felder für CLSM.
   6. Wählen Sie fünf repräsentative Felder pro Probe aus verschiedenen Regionen aus, ohne Kanten, mit einer 60× Ölimmersionslinse. Stellen Sie sicher, dass die Zellen intakt und nicht überlappend sind.
   7. Blenden Sie die Proben vor der Bildaufnahme. Wähle Felder aus, indem du die Bühne zufällig verschiebst, anstatt manuell bestimmte Bereiche auszuwählen.
   8. Wenden Sie identische Schwellenwerte und Analyseparameter auf alle Proben unter verblindeten Bedingungen an.
   9. Zellreste mit FSC-A/SSC-A-Gating ausschließen. Wählen Sie Singletzellen mit FSC-A/FSC-H Gating aus.
   10. Wählen Sie lebende Zellen mit Viability-Farbstofffärbung aus. Fügen Sie 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) bei 1 μg/mL hinzu, inkubieren Sie 5 Minuten bei 4°C im Dunkeln und verwenden Sie es für Live-Cell Gateing.
   11. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität, um die zelluläre Assoziation zu quantifizieren. Verwenden Sie die mittlere Fluoreszenzintensität als Quantifizierungsmetrik. Führen Sie Datenanalysen mit der FlowJo (v10.8.1) Durchflusszytometrie-Analysesoftware durch.
3. Zelluläre Aufnahme von MMM/DiI NPs durch RAW-264.7-Makrophagen
   1. Inkubieren Sie DiI-markierte MMM/COL NPs (MMM/DiI NPs) mit unveränderten RAW-264,7-Makrophagen bei einer Konzentration von 50 μg/mL (basierend auf PLGA-Kernmasse) für 4 Stunden bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre.
   2. Bereiten Sie die Zellen für die Analyse vor, wie in den Schritten 6.2.2–6.2.3 beschrieben.
   3. Stellen Sie die Instrumentparameter für die DiI-Detektion mit Anregung bei 549 nm und Emission bei 565 nm (PE-Kanal) ein.
   4. Sammeln Sie Daten aus den Proben. Erhalte mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe.
   5. Zellreste mit FSC-A/SSC-A-Gating ausschließen. Wählen Sie Singletzellen mit FSC-A/FSC-H Gating aus.
   6. Wählen Sie lebende Zellen mit Viability-Farbstofffärbung aus. Fügen Sie 7-AAD bei 1 μg/mL hinzu, inkubieren Sie 5 Minuten bei 4 °C im Dunkeln und verwenden Sie es für Live-Cell-Gating.
   7. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität, um die zelluläre Aufnahme zu quantifizieren. Verwenden Sie die mittlere Fluoreszenzintensität als Quantifizierungsmetrik. Führen Sie Datenanalysen mit einer Durchflusszytometrie-Software durch.
4. Schaumstoffzell-Assay
   1. Differenzieren Sie RAW-264,7-Zellen in Schaumzellen durch Inkubation mit oxidiertem niedrigdichtem Lipoprotein (OxLDL) bei 50 μg/mL für 48 Stunden. Überprüfen Sie die Bildung von Schaumzellen durch Oil Red O-Färbung, die durch intrazelluläre Lipidansammlung angezeigt wird.
   2. Schaumstoffzellen mit freiem Colchicin, COL NPs oder MMM/COL NPs bei einer äquivalenten Colchicinkonzentration von 1 μM behandeln. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Wählen Sie diese Konzentration basierend auf vorläufigen Dosis-Wirkungs-Experimenten zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit und entzündungshemmenden Wirksamkeit.
   3. Messung der entzündlichen Zytokinspiegel mit einem enzymgebundenen Immunsorbent-Test (ELISA).
      1. Sammeln Sie Zellkultur-Supernatanten unmittelbar nach der Behandlung (24 Stunden nach der Behandlung).
      2. Zentrifugieren Sie die Platten bei 300 × g für 5 Minuten bei 4°C, um Zellreste zu entfernen.
      3. Geben Sie die klaren Überbeulen in saubere Röhrchen und lagern sie bei −80°C bis zur Analyse.
      4. Missen Sie TNF-α und Interleukin-6-Spiegel mit ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      5. Alle Messungen werden in dreifachen Bohrlöchern durchgeführt und das Experiment dreimal unabhängig voneinander wiederholt.
      6. Berichte die Zytokinkonzentrationen als Absolutwerte (pg/mL) ohne zusätzliche Normalisierung, da die Zellaussaatdichte und Behandlungsbedingungen in allen Gruppen einheitlich sind.

7. Therapeutische Anwendung in vivo in einem Arteriosklerosemodell

HINWEIS: Alle Tierverfahren müssen vom zuständigen Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt werden.

1. Etablierung des Tiermodells
   1. Etablierung eines anfälligen atherosklerotischen Plaque-Modells bei 8 Wochen alten männlichen Apolipoprotein-E-Knockout-Mäusen (ApoE⁻/⁻) (C57BL/6-Hintergrund).
   2. Füttere Mäuse eine fettreiche Ernährung mit 15 % Fett und 0,25 % Cholesterin ad libitum für eine Woche vor der Operation und dann 4 Wochen nach der Operation.
   3. Betäuben Mäuse mit Isofluran (2 %–3 % zur Einleitung und 1,5 %–2 % zur Erhaltung) und verabreichen Buprenorphin (0,1 mg/kg, subkutan) zur Analgesie während der Halsschlagaderverengungsoperation.
   4. Verengen Sie die linke Halsschlagader mit einer 0,3 mm großen Nadel, die neben der Arterie platziert wird. Binden Sie eine 6-0 Seidenligatur um sowohl die Arterie als auch die Nadel und entfernen Sie dann die Nadel, um eine partielle Verengung zu erzeugen.
   5. Bestätigen Sie die Bildung anfälliger Plaques 4 Wochen nach der Operation durch histologische Untersuchung.
   6. Führen Sie Hämatoxylin und Eosin (H&E), Oil Red O und Masson's Trichrom-Färbung durch, um die Plaquemorphologie, die Lipidablagerung und den Kollagengehalt zu bewerten.
   7. Definiere anfällige Plaques anhand der Plaquefläche > 40 % der Gefäßquerschnittsfläche, faseriger Kappendicke < 120 μm, Lipidkernfläche > 40 % der gesamten Plaquefläche und erheblicher CD68-positiver Makrophageninfiltration.
2. Injizieren Sie 100 μL DiI-markierte MMM/COL NPs intravenös über die Schwanzvene in einer Dosis von 2 mg/kg (basierend auf PLGA-Kernmasse).
   1. Bildmäuse 1 Tag nach der Injektion mit einem in vivo Bildgebungssystem zur Beurteilung der ganzkörperbiologischen Verteilung.
      1. Mäuse betäuben mit Isofluran (3 % für die Induktion und 1,5 %–2 % für die Erhaltung, mit Sauerstoffflussraten von 1 bzw. 0,5 L/min). Überwachen Sie die Anästhesietiefe anhand der Atemfrequenz und des Zehenkneifreflexes.
      2. Stellen Sie Mäuse auf Rücken auf eine 37°C beheizte Bühne, um die Körpertemperatur während der Bildnahme aufrechtzuerhalten.
      3. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder mit DiI-Einstellungen (Anregung 549 nm und Emission 565 nm) mit einem CY3- oder TRITC-Filterset. Verwenden Sie den Autobelichtungsmodus (typischerweise 50–200 ms) und Epifluoreszenzaufnahme.
      4. Gleiche Brightfield-Bilder zur anatomischen Referenz mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixeln aufnehmen.
   2. Entnehmen Sie wichtige Organe und Halsschlagader für ex-vivo Fluoreszenzbildgebung.
      1. Betäuben Mäuse mit Isofluran (3 % zur Einleitung und 2,5 % bis 3 % zur Erhaltung).
      2. Perfundieren Mäuse mit 20 ml eiskaltem PBS (pH 7,4) über eine linke ventrikuläre Punktion mit einer Durchflussrate von 5 mL/min, um Restblut und ungebundene NPs zu entfernen.
      3. Organe (Herz, Aorta, Leber, Milz, Niere und Lunge) unmittelbar nach der Perfusion 24 Stunden nach der Injektion entnehmen.
      4. Spülen Sie die entnommenen Organe in eiskalten PBS, um Oberflächenblut zu entfernen.
      5. Öffne die Aorta längs und befestige sie flach (Endothelseite nach oben) mit Edelstahlstiften auf eine schwarze Silikonplatte.
      6. Bewahren Sie Gewebe in eiskalten PBS auf und führen Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Ernte ex vivo Fluoreszenzbildgebung durch. Entfernen Sie überschüssiges PBS unmittelbar vor der Bildgebung von der Gewebeoberfläche.
3. Durchführung von Dosierung und Behandlung
   1. Bestimmen Sie die Colchicin-Dosis aus der vorläufigen Dosis-Wirkungs-Studie (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/Gruppe). Wählen Sie 0,05 mg/kg Colchicin als therapeutische Dosis.
   2. Verabreichen Sie 100 μL per Schwanzvenen-Injektion, entsprechend einer NP-Dosis von 2 mg/kg (PLGA-Kernmasse) und einer Colchicin-Dosis von 0,05 mg/kg. Einmal täglich für 14 aufeinanderfolgende Tage injizieren.
   3. Randomisieren Sie Mäuse in Behandlungsgruppen (PBS, freies Colchicin und MMM/COL NPs) mit einem Zufallszahlengenerator. Alle Quantifizierungen werden von zwei Beobachtern durchgeführt, die auf Behandlungsgruppen blind sind.
   4. Wenden Sie humane Endpunkte an, darunter >20 % Körpergewichtsverlust, eingeschränkte Mobilität oder Anzeichen von Belastung.
4. Endpunktanalyse durchführen
   1. Erschläfere die Mäuse 24 Stunden nach der letzten Injektion. Entnehmen Sie Halsschlagadern und Aorten. Beurteilen Sie die Plaquebelastung anhand der Öl-Rot-O-Verfärbung der Aorten.
   2. Quantifizieren der Plaque-Fläche
      1. Quantifizieren Sie die Plaquefläche als Oil Red O-positiver Flächenanteil der gesamten Aortenlumenfläche in Querschnitten (fünf Schnitte pro Maus) mit Bildanalysesoftware.
      2. Öffnen Sie das Bild in der Bildanalysesoftware ImageJ.
      3. Klicken Sie auf Bild → Geben Sie → 8-Bit ein, um das Bild in Graustufen umzuwandeln.
      4. Klicken Sie auf Bild → → Schwellenwert anpassen. Wählen Sie die Otsu-Methode und wenden Sie den Schwellenwert an, um Oil Red O-positive Regionen zu identifizieren.
      5. Wenden Sie dieselben Schwellenwerte auf alle Beispielbilder an und notieren Sie die Schwellenwerte zur Verifikation.
      6. Klicken Sie auf Analysieren → Messungen festlegen und wählen Sie Fläche.
      7. Klicken Sie auf Analysieren → Maß, um die ausgewählten Bereiche zu quantifizieren.
      8. Exportiere die quantifizierten Daten.
   3. Bewertung der Plaquestabilität
      1. Bewerten Sie die Stabilität der Plaque durch histologische Färbung der Karotisquerschnitte mit H&E, Oil Red O und Massons trichromer Färbung. Quantifizieren Sie Kollagen als den trichrom-positiven blauen Flächenanteil der Plaquefläche des Masson.
      2. Paraffin-eingebettete Schnittprofile mit einer Dicke von 5 μm und optimale Schneidtemperatur-eingebettete gefrorene Schnittprofile mit einer Dicke von 8 μm vorbereiten.
      3. Führen Sie eine H&E-Färbung durch Deparaffinisierung und Rehydratisierung von Schnitten durch, gefolgt von einer Hämatoxylin-Färbung für 5 Minuten und einer 2-minütigen Eosinfärbung bei Raumtemperatur (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Führen Sie eine Oil Red O-Färbung auf gefrorenen Abschnitten durch, indem Sie mit Oil Red O Arbeitslösung 15 Minuten bei RT inkubieren. Differenzieren Sie die Schnitte in 60 % Isopropanol für 2 Sekunden und spülen Sie mit destilliertem Wasser.
      5. Führen Sie Massons Trichromfärbung gemäß den Anweisungen des Kits durch, indem Sie Abschnitte mit Weigerts Eisenhämatoxylin für 10 Minuten, Ponceau-Acid-Fuchsin für 5 Minuten, 5 Minuten mit Phosphomolybdicsäure und 5 Minuten Anilinblau bei RT inkubieren.
      6. Öffnen Sie histologische Bilder in einer Bildanalyse-Software.
      7. Wenden Sie Farbschwellenwerte an, um kollagenpositive Bereiche zu identifizieren. Führen Sie automatische Schwellenwerte durch und wenden Sie dieselben Parameter auf alle Beispielbilder an.
      8. Notieren Sie Schwellenwerte zur Verifizierung.
      9. Definieren Sie die gesamte Plaquefläche als Summe aller Plaqueflächen innerhalb der vaskulären Intima.
      10. Messen Sie die Plaque-Fläche, indem Sie die Plaquegrenzen manuell nachzeichnen oder automatische Schwellensegmentierung verwenden, um alle Plaqueregionen zu identifizieren.
      11. Misse die kollagenpositive Fläche.
      12. Berechnen Sie den Kollagengehalt als kollagenpositive Fläche geteilt durch die gesamte Plaquefläche × 100 %.
   4. Makrophagengehalt bewerten
      1. Führen Sie eine CD68-Immunfluoreszenzfärbung durch, um den Makrophagengehalt zu beurteilen. Quantifizieren Sie den Makrophagengehalt als den CD68-positiven Flächenanteil der Plaquefläche.
      2. Bereite Gewebeschnitte (5 μm Dicke für paraffineingebettete Schnitte) vor. Führen Sie eine Antigenentnahme mit Citratpuffer (pH 6,0) unter hohem Druck für 2 Minuten durch.
      3. Blocke Abschnitte mit 5 % BSA für 30 Minuten bei RT.
      4. Inkubieren Sie Schnitte mit Kaninchen-Antimaus-CD68 monoklonalem Primärantikörper (Klon D4B9C, Verdünnung 1:200 in 1 % BSA) über Nacht bei 4°C.
      5. Inkubieren Sie Schnitte mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-IgG-Sekundärantikörper (Verdünnung 1:500) für 1 Stunde bei RT.
      6. Gegenfärbungskerne mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) für 5 Minuten.
      7. Offene Fluoreszenzbilder in einer Bildanalyse-Software.
      8. Identifizieren Sie CD68-positive Regionen mittels Schwellenwert. Führen Sie automatische Schwellenwerte durch und wenden Sie dieselben Parameter auf alle Beispielbilder an.
      9. Notieren Sie Schwellenwerte zur Verifizierung.
      10. Messung der CD68-positiven Fläche.
      11. Berechnen Sie den Makrophagengehalt als CD68-positive Fläche geteilt durch die gesamte Plaquefläche × 100 %.

Results

DLS-Messungen wurden mit einem Zetasizer Nano ZS-System bei 25°C und einem Rückstreuwinkel von 173° durchgeführt. Die Proben wurden 20-fach in deionisiertem Wasser verdünnt (Endkonzentration ca. 0,1 mg/mL) und vor der Messung 2 Minuten lang ausgegliglibriert. Jede Probe wurde dreifach gemessen, und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. DLS und TEM zeigen eine Zunahme der NP-Größe nach der Membranbeschichtung und bestätigen die Bildung einer Kern-Schalen-Struktur (

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Konstruktion und Anwendung von CD47- und Integrin-α4/β1-ko-modifizierten makrophagenmembranbeschichteten NPs für eine gezielte Atherosklerose-Therapie. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems umfassen die aktive Zielerfassung über die Integrin-α4/β1–VCAM-1-Interaktion und eine reduzierte Makrophagenaufnahme, die mit CD47-vermittelter Signalübertragung verbunden ist, wie durch in vitro Aufnahmetests (Abbildung 3

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (USA)	A1310	Viabilitätsfarbe zur Flusszytometrie-Unterscheidung von lebend/toten
Alexa Fluor 488-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Thermo Fisher Scientific (USA)	A-11008	Sekundärer Antikörper für CD68-Immunfluoreszenzfärbung
Anti-Maus-CD47-Antikörper	Abcam (USA)	ab214453	Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der CD47-Expression
Anti-Maus-Integrin & Alpha; 4-Antikörper (B-2)	Santa Cruz Biotechnologie (USA)	SC-376334	Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Verifikation von Integrin & Alpha; 4 Ausdruck
Anti-Maus-Integrin & Beta; 1 Antikörper (A-4)	Santa Cruz Biotechnologie (USA)	SC-374429	Verwendet für die Western-Blot-Analyse zur Verifikation von Integrin & Beta; 1-Ausdruck
ApoE-/- Mäuse	Das Jackson-Labor (USA)	N/A	Verwendung für das Arteriosklerose-Modell in vivo
BCA-Testkit	Thermo Fisher Scientific (USA)	23225	Verwendet zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Schwarze Silikonplatte	N/A	N/A	Zur Montage der Aorta für ex-vivo-Bildgebung verwendet
CD47-Plasmid (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Enthält das Maus-Cd47-Gen zur Überexpression
Colchicin	Sigma-Aldrich (USA)	C9754	Therapeutische Nutzlast in Nanopartikeln
Konfokales Laserscanningmikroskop	Leica Microsystems	TCS SP8	Verwendet für Fluoreszenzbildgebung und Kolokalisationsanalyse
Citratpuffer (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (USA)	N/A	Verwendet zur Antigenabfindung bei der Immunfluoreszenzfärbung
Dialyserohr (MWCO 3.500 DA)	Sigma-Aldrich (USA)	PURD35030	Verwendet zur Nanopartikelreinigung
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2447	Lösungsmittel zur Herstellung von Nanopartikeln
DiI (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat)	Beyotime (China)	C1036	Fluoreszierende Markierung des Nanopartikelkerns
DiO (3,3&prim;-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat)	Beyotime (China)	C1038	Fluoreszierende Markierung der Makrophagenmembran
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Verwendet für die Fluoreszenzbildgebung in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (USA)	D3571	Kern-Gegenfarbe für die Fluoreszenzbildgebung
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	11965092	Zellkulturmedium
Dynamischer Lichtstreuungsanalysator (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (UK)	N/A	Verwendet für dynamische Lichtstreuung (DLS)-Messungen der Nanopartikelgröße, PDI und Zetapotenzials
ELISA-Kit	R& D Systems (USA)	Das hängt vom Zielzytokin ab	Zur Quantifizierung von entzündlichen Zytokinen verwendet
Endothelin-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (USA)	E7764	Wird verwendet, um Integrin & Alpha zu stimulieren; 4/Β 1-Ausdruck
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)	10091148	Ergänzungsmittel für Zellkulturmedium
Durchflusszytometer	BD Biosciences (USA)	FACSCalibur	Verwendet zur Aufnahme von Fluoreszenzsignalen
Software zur Durchflusszytometrieanalyse (FlowJo v10.8.1)	BD Biosciences (USA)	N/A	Verwendung für die Analyse von Durchflusszytometriedaten
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVECs)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Verwendet für In-vitro-Targeting-Assays
Bildanalyse-Software (ImageJ)	National Institutes of Health (USA)	N/A	Verwendung für quantitative Bildanalysen
In-vivo-Bildgebungssystem	PerkinElmer (USA)	IVIS Lumina III	Verwendet für die Ganzkörper-Fluoreszenzbildgebung
Isopropanol (60 %)	Sigma-Aldrich (USA)	34863	Verwendet zur Differenzierung während der Oil Red O-Färbung
Lipofektamin 3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Transfektionsreagenz
Magnetischer Rührer und Rührstange	N/A	N/A	Verwendet zur Herstellung von Nanopartikeln
Masson' s Trichrome Beiz-Kit	Abcam (USA)	ab150686	Verwendet zur Kollagenfärbung
Mini-Extruder	Avantipolare Lipide (USA)	610000	Verwendung für die Membranextrudion
Murine RAW 264.7 Zelllinie	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Quelle der Makrophagen
Glatte Muskelzelllinie der Maus	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Verwendung für die Sicherheitsbewertung
Oil Red O	Sigma-Aldrich (USA)	O0625	Verwendet zur Lipidfärbung
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (USA)	31985062	Reduziertes Serummedium für Transfektion
Oxidiertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Verwendet zur Induzierung der Bildung von Schaumstoffzellen
Penicillin– Streptomycin	Thermo Fisher Scientific (USA)	15140122	Antibiotikumpräparat zur Zellkultur
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	Sigma-Aldrich (USA)	78830	Proteaseinhibitor
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific (USA)	10010023	Wasch- und Verdünnungspuffer
Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotechnologie (China)	MB5649-1	Polymer zur Herstellung von Nanopartikeln
Polycarbonat-Membranfilter (200 nm, 400 nm)	Whatman (UK)	800282	Verwendung für Extrusion
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma-Aldrich (USA)	P9333	Komponente des Lysispuffers
P3000-Reagenz	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Transfektionsverstärker
Rotierendes Mikrotom	Leica Biosystems (Deutschland)	RM2235	Verwendung für Paraffinschnitte
Spritzenpumpe	Harvard-Apparat (USA)	70-3007	Verwendet zur kontrollierten Nanopartikelbildung
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	Talos F200S	Verwendung für die Nanopartikelbildgebung
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (USA)	T2663	Pufferkomponente
Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α)	R& D Systems (USA)	410-MT	Zur Aktivierung von Endothelzellen verwendet
Ultrareines Wasser	Milli-Q (Merck, USA)	ZMQSV0T01	Verwendet für die Herstellung und Dialyse von Nanopartikeln