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Forschungsartikel

P. gingivalis/F. nucleatum bei chronischer apikaler Parodontitis sind über den TLR4/MyD88/NF-κB-Weg mit einer Schwangerschaftsverkürzung assoziiert

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DOI:

10.3791/70793

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15. Mai 2026

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1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Chronische apikale Parodontitis-assoziierte orale Krankheitserreger (P. gingivalis, F. nucleatum) werden mit Maus-CAP-Modellen und humanen Trophoblast-Infektionstests untersucht. Eine Gestationsverkürzung wird zusammen mit der Aktivierung der Plazenta sowie der Aktivierung der Plazenta beobachtet, die mit der TLR4/MyD88/NF-κB-Signalübertragung übereinstimmt. Bakterielle DNA ist in Plazenta- und Gefäßgeweben nachweisbar und unterstützt eine hämatogene Verbindung sowie potenzielle Interventionsziele.

Zusammenfassung

Spontane Frühgeburt (sPTB; Geburt vor der 37. Woche) bleibt eine der Hauptursachen für Neugeborenensterblichkeit, und eine intrauterine Infektion ist in einem erheblichen Teil der Fälle in Verbindung gebracht. Neue Evidenz verbindet orale Krankheitserreger wie Porphyromonas gingivalis und Fusobacterium nucleatum mit ungünstigen Gestationsfolgen; die mechanistischen Bahnen, die chronische apikale Parodontitis (CAP) mit dem Gestationsrisiko verbinden, bleiben jedoch unvollständig definiert. Bei trächtigen C57BL/6J-Mäusen wurde CAP durch Wurzelkanal-Inokulation etabliert und durch ein Schwanzvenen-Challenge-Modell mit bakteriellen Suspensionen ergänzt (1 × 108 CFU/mL). Die Gestationslänge, Plazentahistopathologie, Entzündungsmarker und bakterielle DNA-Signale wurden mittels qPCR bewertet. Parallel dazu wurden humane Trophoblasten P. gingivalis oder F. nucleatum (MOI = 50, 24 H) ausgesetzt, um die entzündliche Signalübertragung zu untersuchen, die mit der Aktivierung der TLR4/MyD88/NF-κB-Achse übereinstimmt. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen zeigten CAP-assoziierte Gruppen eine Verkürzung der Schwangerschaft (Median 19,5 vs. 20,5 Tage), begleitet von erhöhten Platzentusiasinfektionswerten (einschließlich erhöhter IL-1β und TNF-α) sowie histopathologischen Merkmalen, die mit einer entzündlichen Schädigung übereinstimmen. qPCR zeigte außerdem das Vorhandensein bakterieller DNA-Signale in Plazenta und Gefäßgewebe. In Trophoblast-Assays löste F. nucleatum stärkere proinflammatoriske Reaktionen hervor als P. gingivalis, in Verbindung mit einer erhöhten NF-κB-Phosphorylierung. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CAP-assoziierte orale Krankheitserreger zur Verkürzung der Schwangerschaft beitragen können, indem sie die Plazentaentzündung über TLR4/MyD88/NF-κB-Signale antreiben und so eine oral-plazenta-mikrobielle Achse als potenzielles Ziel zur Minderung des infektionsbedingten Schwangerschaftsrisikos unterstützen.

Einleitung

Spontane Frühgeburt (sPTB) ist definiert als eine Geburt, die zwischen der 20. und 37. Schwangerschaftswoche ohne medizinische Behandlung stattfindet1. Als kritisches globales Gesundheitsproblem reicht die Häufigkeit von sPTB in Industrieländern von etwa 5 % bis 9 % bis 12 % bis 18 % in ressourcenbegrenztenRegionen 2,3. Frühgeburt und ihre Komplikationen bleiben eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit bei Kindern unter 5 Jahren und verursachen jährlich etwa eine Million neonatale Todesfälle4. Überlebende erleben häufig sowohl unmittelbare Komplikationen wie Atemnotsyndrom als auch langfristige Folgen, einschließlich Zerebralparese und Entwicklungsverzögerungen 5,6, was erhebliche wirtschaftliche Belastungen für Familien und Gesellschaftdarstellt 7,8.

Die Ätiologie von sPTB ist multifaktoriell und spiegelt Wechselwirkungen zwischen mütterlichen, fetalen und Umweltfaktoren wider, darunter uteruse kontraktile Dysfunktion, zervikale Unzufügsamkeit, endokrine Störungen, Plazentastörungen und intrauterine Infektion9. Die intrauterine Infektion gilt als Hauptverursacher und macht schätzungsweise etwa 30–40 % der Fälle bei Frühgeburten aus.10,11. Krankheitserreger können durch aufsteigende (z. B. cervicovaginale) oder hämatogene Wege in die Amnionhöhle gelangen, was die Immunreaktionen des Wirts aktiviert und die Freisetzung proinflammatorer Zytokine (z. B. IL-6, TNF-α) sowie Prostaglandine fördert, die die Parturition12 auslösen können. Trophoblasten, als zentrale zelluläre Komponenten der mütterlich-fetalen Schnittstelle, tragen sowohl zur Immuntoleranz als auch zur antimikrobiellen Abwehrbei.

Orale Mikroorganismen, darunter Porphyromonas gingivalis und Fusobacterium nucleatum, wurden in sPTB-bezogene Entzündungsprozesse in Verbindung gebracht, möglicherweise durch Bakteriämie und/oder die Verbreitung entzündlicher Mediatoren14. Diese Arten sind etablierte parodontale Krankheitserreger, und Assoziationen zwischen Parodontitis und sPTB wurden in epidemiologischen und klinischen Studien 15,16,17 berichtet. Bemerkenswert ist, dass P. gingivalis und F. nucleatum ebenfalls häufig bei chronischer apikaler Parodontitis (CAP) nachgewiesen werden, doch die Beziehung zwischen CAP und ungünstigen Gestationsergebnissen bleibt vergleichsweise wenig untersucht, und die relevanten biologischen Wege sind nicht vollständig definiert20. Harjunmaa et al. berichteten erstmals 2015 über einen Zusammenhang zwischen apikaler Parodontitis und verkürzter Schwangerschaftsdauer sowie niedrigem Geburtsgewicht. Eine Folgestudie derselben Kohorte unterstützte keinen direkten bakteriellen Transfer auf die Plazenta und deutet darauf hin, dass systemische Entzündung einen plausiblen Zusammenhang zwischen apikaler Parodontitis und Schwangerschaftsergebnissen darstellenkönnte 22. Im Einklang mit dieser Interpretation wurde radiographisch bestätigte apikale Parodontitis mit einem erhöhten Risiko für Frühgeburten mit niedrigem Geburtsgewicht in Verbindung gebracht23. Als persistierende okkulte Infektion kann CAP durch chronische, niedriggradige systemische Entzündungen und/oder hämatogene Exposition gegenüber mikrobiellen Komponenten zum Schwangerschaftsrisiko beitragen 24,25. Eine weitere Klärung der CAP-Schwangerschaftsbeziehung ist daher erforderlich, um das Verständnis der oral-plazentaren Entzündungswege zu verfeinern und Präventionsstrategien für infektionsbedingte Schwangerschaftsrisiken zu informieren.

Neuere Studien haben die Relevanz der Signalachse TLR4/MyD88/NF-κB bei der entzündungsassoziierten Frühgeburt hervorgehoben. Robertson et al. identifizierten TLR4 als potenzielles therapeutisches Ziel bei entzündungsbedingten Frühgeburten und berichteten präventive Effekte in Tiermodellen26. Peng et al. zeigten außerdem, dass miR-199a-3p die zervikale Epithelentzündung durch Unterdrückung des HMGB1/TLR4/NF-κB-Signalwegs27 abschwächt. Darüber hinaus beschrieben Shen et al. antioxidative und entzündungshemmende Effekte von Syringin bei diabetischen Ratten, wobei die Modulation des TLR4/MyD88/NF-κB-Wegs in den beobachteten Verbesserungen in Verbindung gebrachtwurde 28. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse einen mechanistischen Rahmen, in dem die mit TLR4/MyD88/NF-κB verknüpfte entzündliche Signalübertragung zu infektionsassoziierten Signalwegen beiträgt, die die Geburt beeinflussen, während anerkannt wird, dass mehrere angeborene Immunrezeptoren je nach Pathogenkontext parallel wirken können.

Die vorliegende Studie bewertet CAP-assoziierte Schwangerschaftseffekte mithilfe komplementärer in-vitro-Trophoblast-Assays und in-vivo-Mausmodelle. Das Trophoblast-Modell ermöglicht eine kontrollierte Abfrage pathogen-induzierter entzündlicher Signale, während das schwangere Maus-CAP-Modell zelluläre Antworten unter physiologischen Gestationsbedingungen mit Schwangerschaftsphänotypen auf Organismusebene verbindet. Ein Schwanzvenen-Challenge-Modell wird einbezogen, um einen komplementären hämatogenen Expositionsweg bereitzustellen und zu bewerten, ob entzündliche Aktivierungsmuster, die in der oralen Infektion beobachtet werden, wiederholt werden, wenn bakterielle Komponenten in den mütterlichen Kreislauf gelangen. Konkret wird die Trophoblast-Exposition gegenüber P. gingivalis und F. nucleatum verwendet, um Zytokinantworten und Aktivierung der TLR4/MyD88/NF-κB-Achse zu profilieren, während Tierversuche die Gestationslänge, Plazentaentzündung und qPCR-basierte Detektion bakterieller DNA-Signale in Karotisbifurkation und Plazentumgewebe bewerten. Da qPCR auf das Vorhandensein von bakterieller DNA und nicht auf Lebensfähigkeit oder zelluläre Lokalisation hinweist, bleiben Interpretationen der mikrobiellen Präsenz an der mütterlich-fetalen Grenzfläche vorsichtig. Darüber hinaus können Artunterschiede und kontrollierte experimentelle Exposition die direkte klinische Translation einschränken, was die Notwendigkeit einer anschließenden Validierung in menschenrelevanten Kontexten unterstreicht.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in strikter Einhaltung der ethischen Richtlinien durchgeführt, die vom Ethics Committee für Tierforschung des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Xinjiang Medical University festgelegt wurden (Zulassungsnummer: IACUC-20231121-13) und gemäß dem Leitfaden des National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Ausgabe 2011). Darüber hinaus wurde diese Studie gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Alle Materialien (Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Ausrüstung und Software) sowie deren entsprechende Herstellerinformationen und Katalognummern sind in der Materialtabelle bereitgestellt, um die Reproduzierbarkeit zu erleichtern.

1. Bakterienkultur

Referenzstämme von Porphyromonas gingivalis und Fusobacterium nucleatum (Stammkennungen in der Materialtabelle angegeben) wurden unter anaeroben Bedingungen behandelt. Primärkulturen wurden auf vorreduzierten Columbia-Blutagarplatten hergestellt und anaerob (85 % N₂, 10 % H₂ und 5 % CO₂) bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Für experimentelle Präparate wurde eine einzelne gut isolierte Kolonie in 40 ml Herzinfusionsbrühe geimpft und unter identischen anaeroben Bedingungen bis zum Wachstum der mittleren Logaritumphase (OD660 = 0,6–0,8) inkubiert. Um die Sauerstoffbelastung zu minimieren, wurden Impfungen und Transferschritte in einer anaeroben Arbeitsstation mit vorreduzierten Medien und Werkzeugen durchgeführt. Die Bakterienkonzentrationen wurden für die Tierexposition auf 1 × 10à 8 CFU/mL standardisiert, mittels OD660-basierter Quantifizierung mit einer stammspezifischen OD–CFU-Standardkurve, die unter denselben Kulturbedingungen erzeugt wurde; Die Kalibrierungskurve wurde durch serielle Verdünnung und Kolonienzählung auf anaeroben Agarplatten mit mindestens drei unabhängigen Kalibrierungen ermittelt. Für Studien zu Trophoblast-Infektionen wurden bakterielle Suspensionen mit einer validierten Enumerationsmethode quantifiziert und in einem antibiotikafreien vollständigen Kulturmedium verdünnt, um unmittelbar vor der Kokultur die angegebene Multiplizität der Infektion (MOI) zu erreichen.

2. Tierhaltung und Gruppierung

Spezifische pathogenfreie C57BL/6J-Mäuse (n = 90; 60 Weibchen, 30 Männchen) im Alter von 6–7 Wochen wurden unter kontrollierten Bedingungen (22 °C ± 2 °C, 60 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Lichtzyklus) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Mäuse zufällig in sechs Versuchsgruppen eingeteilt (n = 15/Gruppe): Normale Kontrolle (NC), CAP mit P. gingivalis (AP), CAP mit F. nucleatum (AF), normale Kochsalz-Schwanzveneninjektion (VN ), P. gingivis Schwanzveneninjektion (VP) und F. nucleatum-Schwanzveneninjektion (VF). Randomisierung und Käfigzuweisung wurden erfasst, um Zuteilungsverzerrung und mögliche Käfigeffekte zu minimieren.

3. Einführung des CAP-Modells

Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Anästhesie wurde durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbitalnatrium (1,62 mg/30 g Körpergewicht) in Kombination mit Atropinsulfat (12,5 μg/30 g Körpergewicht) induziert, und eine angemessene Anästhesietiefe wurde durch das Ausbleiben eines Pedalrückzugsreflexes bestätigt. Die Mäuse wurden auf dem Rücken auf ein Wärmepad gelegt, um die Körpertemperatur zu halten, und der Mund wurde sanft geöffnet, um eine stabile Sichtbarkeit der beidseitigen ersten Backenzähne des Oberkiefers zu ermöglichen. Bei Vergrößerung wurden die Pulpakammern der beiden ersten Backenmolaren des oberen Kiefers mit einem sterilen Rundbur geöffnet, gefolgt von der Entfernung des koronalen Pulpagewebes mit sterilen Mikroinstrumenten. Die Wurzelkanalöffnungen wurden mit einer kleinen endodontischen Feile (Größe 06–10) identifiziert, und die Kanäle wurden vorsichtig durchführt, um eine Öffnung zu erreichen, wobei übermäßiger Druck vermieden und das Risiko einer Perforation minimiert wurde. Die Kammer wurde mit steriler Kochsalzlösung (oder sterilem PBS) abgespült und vor der Impfung mit sterilen Papierspitzen getrocknet.

Die bakterielle Impfung erfolgte mit einer standardisierten Suspension von 1 × 108 CFU/mL. Um die Dosierung reproduzierbar zu machen, wurde das abgegebene Volumen operativ auf 2 μL pro Zahn fixiert (etwa 2 × 105CFU pro Zahn) und mit einer kalibrierten Mikropipettenspitze am Kammereingang abgegeben. Ein steriler, saugfähiger Papierspitze, der mit derselben Suspension vorgetränkt war, wurde dann in die Zellstoffkammer gelegt, um eine lokale Belichtung zu gewährleisten. Die erfolgreiche Entbindung wurde durch sichtbares Benetzen der Papierspitze und das Ausbleiben von Leckagen in die Mundhöhle bestätigt. Nach der Impfung wurde die Kammer an der Luft getrocknet, bis keine sichtbare Flüssigkeit mehr übrig war, dann mit einem leicht ausgehärteten Zahnklebstoff (20 s) versiegelt, gefolgt von der Restaurierung mit einem leicht ausgehärteten, fließbaren Harzkomposit (20 s). Die Dichtungsintegrität wurde durch Sichtprüfung und sanfte Sondierung bestätigt; Restaurierungen, die Lücken oder frühen Verlust zeigten, wurden sofort wieder versiegelt. Postprozedurale Analgesie und Überwachung wurden gemäß den institutionellen Tierpflegehinweisen durchgeführt.

Zwei Wochen später wurden periapikale Röntgenaufnahmen erstellt, um die Etablierung von CAP zu bestätigen. Die erfolgreiche Etablierung war durch eine klare periapikale Radioluzenz mit umgebenden Knochenveränderungen gekennzeichnet, die mit chronischer periapikaler Entzündung und Knochenabbau übereinstimmen. Die Paarung begann zwei Wochen nach der Infektion/Aufbau des Modells.

4. Etablierung des Modells der Schwanzveneninjektion

Bakterielle Suspensionen wurden mit einer Konzentration von 1 × 108 CFU/mL in steriler Kochsalzlösung hergestellt. Die Mäuse wurden zurückgehalten, und der Schwanz wurde 1–2 Minuten lang erwärmt, um die seitlichen Schwanzvenen zu erweitern. Die Injektionen wurden mit einer feinen Nadel (typischerweise 29–30 G) durchgeführt, die mit dem Abschräg nach oben in die laterale Schwanzvene in einem flachen Winkel (ca. 10–15°) eingeführt wurde. Die korrekte intravenöse Platzierung wurde durch einen Blutblitz in der Nabe und eine glatte Infusion mit geringem Widerstand bestätigt; Erfolglose Platzierung zeigte sich durch erhöhten Widerstand und/oder Bildung eines subkutanen Bleb, wobei die Infusion nach kurzer Wiedererwärmung an einer näheren Stelle wiederholt wurde. Mäuse erhielten täglich Injektionen an drei aufeinanderfolgenden Tagen (jeweils 100 μL pro Maus). Nach drei Tagen wurden die Frauen mit Männern zusammengebracht, und am folgenden Morgen wurden die Vaginalplugs überprüft. Nach der Bestätigung der Vaginalplugs (GD 0,5) wurden Injektionen alle drei Tage (jeweils 100 μL pro Maus) bis zum Gestationstag 15 verabreicht.

5. Etablierung des schwangeren Mausmodells

Weibliche und männliche Mäuse wurden über Nacht ab 20:00 Uhr im Verhältnis 2:1 (Weibchen:Männchen) zusammengehalten. Das Vorhandensein eines Vaginalplugs oder eines spermienpositiven Vaginalabstrichs um 08:00 Uhr am nächsten Morgen wurde als Gestationstag (GD) 0,5 eingestuft. Für jede Maus wurden das anfängliche Körpergewicht, das Gewicht vor der Geburt, das Gewicht nach der Geburt, die Schwangerschaftslänge, das Gewicht der Neugeborenengeburt, die Größe des Wurfs und die Anzahl der Totgeburten erfasst. Basierend auf früheren Studien 29,30 wurde die Geburt vor GD 18.5 operationell als Frühgeburt bei Mäusen definiert. Da eine Schwangerschaftsverkürzung im Terminbereich auftreten kann, wurden die Schwangerschaftsergebnisse mit Aufmerksamkeit auf die Unterscheidung zwischen echter Frühgeburt und Schwangerschaftskürzung interpretiert.

6. Probenentnahme und -verarbeitung

Am Gestationstag 15 wurden pro Gruppe zufällig drei trächtige Mäuse für Plazenta- und Gefäßproben ausgewählt (NC/AP/AF und VN/VP/VF). Nach einer Anästhesie, die durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatrium (1,62 mg pro 30 g Körpergewicht) und Atropinsulfat (12,5 μg pro 30 g Körpergewicht) induziert wurde, wurden Blutproben mittels retroorbitaler Blutung entnommen. Mäuse wurden in einer Kohlendioxidkammer eingeschläfert, bis der Tod durch fehlende Atmung, Herzschlag und Hornhautreflex bestätigt wurde; Die Lieferung von Kohlendioxid folgte einem schrittweisen Auffüllansatz, der mit den institutionellen Tierschutzrichtlinien übereinstimmt. Die Bifurkation der Halsschlagader und das Plazentagewebe wurden umgehend mit sterilen Instrumenten entnommen, um die Kreuzprobenkontamination zu reduzieren. Das Plazentagewebe wurde in zwei Teile unterteilt: Ein Teil wurde bei −80 °C gelagert, der andere Teil wurde 24 Stunden lang in 10 % neutralem gepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von graduierter Ethanoldehydration und Paraffin-Einbettung. Die übrigen Mäuse wurden hinsichtlich des täglichen Körpergewichts, der Schwangerschaftslänge, der Wurfgröße und des neonatal Geburtsgewichts überwacht.

7. Zellkultur und Behandlung

Die humane Trophoblast-Zelllinie HTR-8/SVneo wurde in RPMI 1640-Medium kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum bei 37 °C und 5 % CO₂. Für Infektionsexperimente wurden HTR-8/SVneo-Zellen (1 × 106 Zellen) in der logarithmischen Wachstumsphase in 6-Well-Platten eingepflanzt und über Nacht haften lassen. Vor der bakteriellen Herausforderung wurde das Medium durch ein antibiotikafreies, vollständiges Medium ersetzt, um antibakterielle Übertragungseffekte während der Kokultur zu vermeiden. Bakterielle Suspensionen von P. gingivalis oder F. nucleatum wurden bei MOI = 50 zugesetzt, und jede Bohrung wurde mit einem vollständigen Kulturmedium auf ein Endvolumen von 2,5 ml angepasst. Die Platten wurden für 24 Stunden inkubiert. Supernatanten wurden bei 24 Stunden gesammelt und durch kurze Zentrifugation klarisiert, um Rückstände vor der Zytokinmessung zu entfernen. Adhärente Zellen wurden zweimal mit sterilem PBS gewaschen, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen, und anschließend sofort für RNA- oder Proteinextraktion gemäß den unten beschriebenen Arbeitsabläufen verarbeitet.

8. Histologische Analyse der Mausplazenta

Das Plazentagewebe wurde in 10 % neutralem gepuffertem Formalin für 24 Stunden fixiert, paraffin-eingebettet und mit einer Schnittlänge von 4,5 μm durchschnitten. Zur Untersuchung der Plazentamorphologie wurde routinemäßig eine Färbung von Hämatoxylin und Eosin (H&E) durchgeführt. Für die immunhistochemische Färbung wurde die Antigenlokalisierung mit einem chromogenen Peroxidasesubstrat visualisiert, das an positiven Stellen braune Ablagerungen erzeugte, gefolgt von Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Negative Kontrollen wurden durchgeführt, indem primäre Antikörper durch nicht-immunes Serum ersetzt wurden.

Um die Reproduzierbarkeit und Transparenz zu erhöhen, verwendete die immunhistochemische Bewertung einen vorgegebenen semi-quantitativen Bewertungsansatz. Die Färbungsintensität wurde mit 0 (keine), 1 (schwach), 2 (moderat) oder 3 (stark) bewertet, und der Prozentsatz positiver Zellen mit 0 (<5 %), 1 (5–25 %), 2 (26–50 %), 3 (51–75 %) oder 4 (>75 %). Ein Immunreaktivitätswert wurde berechnet, indem die Intensitäts- und Prozentwerte für jedes Fachgebiet multipliziert wurden. Für jede Plazenta wurden mindestens fünf nicht überlappende Hochleistungsfelder aus vergleichbaren anatomischen Regionen bewertet. Die Bewertung wurde unabhängig von zwei Beobachtern durchgeführt, die für die Gruppenzuweisung blind waren, und Meinungsverschiedenheiten wurden durch gemeinsame Überprüfung gelöst.

9. Quantitative Echtzeit-PCR-Detektion bakterieller DNA-Signale in der Karotisbifurkation und Plazenta der Maus

Gewebe-DNA wurde mittels eines auf Siliziumdioxid basierenden Gewebe-DNA-Extraktions-Workflows extrahiert. Gewebelysate wurden durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 5 Minuten bei 20–25 °C klariert, und Supernatanten wurden auf Siliziumkolonnen aufgetragen, um durch Zentrifugation bei 12.000 ×g bei 20–25 °C an Siliziumspalten gebunden zu werden. Die Waschschritte wurden gemäß dem Arbeitsablauf durchgeführt, wobei jede Waschphase von einer Zentrifugation mit 12.000 × g für 1 Minute bei 20–25 °C erfolgte. Ein abschließender trockener Dreh wurde bei 12.000 × g für 2 Minuten bei 20–25 °C durchgeführt, um restliches Ethanol zu entfernen. Die DNA wurde nach einer 2-minütigen Inkubation bei 20–25 °C in einem 50-μL-Elutionspuffer elutiert und durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 1 Minute bei 20–25 °C gesammelt. Bakterielle genomische DNA wurde mittels eines auf Siliziumdioxid basierenden bakteriellen DNA-Extraktions-Workflows extrahiert und mit denselben Bindungs-/Wasch-/Trocken-Spin-/Elutions-Zentrifugationsparametern gewonnen, sofern der Workflow es nicht anders verlangt.

Die DNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit einem Mikrovolumen-Nukleinsäurequantifizor gemessen, und die Integrität wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese bewertet. Qualifizierte DNA-Proben wurden bei –20 °C für die anschließende Analyse aufbewahrt. Zielbakterielle Gene wurden amplifiziert und klont mit Primern, die in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt sind, wobei PCR-Bedingungen in ergänzender Tabelle 2 und ergänzender Tabelle 3 detailliert dargestellt sind. Verstärkte Zielbänder wurden gereinigt, gemäß den Spezifikationen der ergänzenden Tabelle 4 geklont und in kompetente Escherichia coli DH5α-Zellen umgewandelt. Rekombinante, plasmidhaltige Stämme wurden überprüft, um korrekte Insert-Sequenzen sicherzustellen, und Plasmid-DNA wurde für die Standardpräparation extrahiert. Standardkurven wurden durch die Durchführung von qPCR auf seriell verdünnten Plasmidstandards erzeugt, die Ziel-bakterielle Genfragmente enthalten. Die bakteriellen DNA-Signale von P. gingivalis 16S und F. nucleatum 16S in Proben der Karotisbifurkation und der Plazenta wurden quantitativ mittels Echtzeit-PCR nachgewiesen, wobei DNA-Kopien aus Ct-Werten mit der Standardkurve berechnet wurden. Reaktionssysteme und -programme sind in der ergänzenden Tabelle 5 bzw . in der ergänzenden Tabelle 6 detailliert dargestellt. Da qPCR bakterielle DNA-Signale anzeigt und nicht auf Lebensfähigkeit oder zelluläre Lokalisation, bleiben Interpretationen der mikrobiellen Präsenz an der mütterlich-fetalen Grenzfläche vorsichtig.

10. ELISA-Nachweis von Entzündungsfaktoren in Mausserumproben und Zellkultur-Supernatanten

Alle Reagenzien und Proben wurden vor dem Test auf Raumtemperatur ausgeglichen. Die Serumspiegel von TNF-α und IL-1β wurden mit Maus-ELISA-Workflows gemessen, und TNF-α und IL-1β-Spiegel in Zellkultur-Supernatanten wurden mit humanen ELISA-Workflows gemäß den Kit-Verfahren bestimmt. Standards und Proben wurden in doppelten Bohrlöchern gemessen, und für jede Platte wurden Standardkurven erzeugt. Technische Duplikate wurden gemittelt, um einen Wert pro biologischer Replikat zu ergeben.

11. Weitere molekularbiologische Analysen

Für qRT-PCR wurde die gesamte RNA aus kultivierten Zellen mittels eines phenolchloroformbasierten RNA-Extraktionsprozesses extrahiert. Nach der Phasentrennung wurde die wässrige Phase durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C klarisiert, und RNA wurde gemäß dem Arbeitsablauf ausgefällt, gewaschen und wieder suspendiert. Die RNA-Konzentration wurde mit einem Nukleinsäureanalysator gemessen, und die RNA-Integrität wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese bewertet. Reverse Transkription wurde durchgeführt, um cDNA zu erzeugen, und quantitative Echtzeit-PCR wurde verwendet, um TNF-α- und IL-1β-mRNA-Spiegel zu quantifizieren. Primer-Sequenzen sind in ergänzender Tabelle 7 aufgeführt, Reaktionsmischungen in ergänzender Tabelle 8 und Reaktionsprogramme in ergänzender Tabelle 9.

Für Western Blotting wurden Proteinlysate aus Maus-Plazentageweben oder Trophoblastzellen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C klarisiert, quantifiziert und mit SDS-PAGE gefolgt von Membrantransfer und antikörperbasierter Detektion mittels eines Fluoreszenzbildgebungs-Workflows. Die gleiche Proteinbelastung wurde auf 30 μg pro Lane festgelegt. Originale, unbeschnittene Membranbilder, einschließlich Molekulargewichtsmarker, wurden für alle in den Abbildungen gezeigten Flecken beibehalten und sind verfügbar DOI: 10.57760/sciencedb.28254. Sofern nicht anders angegeben, bezeichnet "n" biologische Replikate (einzelne Tiere oder unabhängige Zellkulturen), während technische Wiederholungen zur Qualitätskontrolle verwendet werden und die biologische Replikation nicht ersetzen.

12. Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit einer Analysesoftware durchgeführt, und die Figuren wurden mit Grafiksoftware erstellt (aufgeführt in der Materialtabelle). Normal verteilte kontinuierliche Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert und mit Einweg-ANOVA mit entsprechenden Post-hoc-Tests analysiert, während nicht-normalverteilte Daten als Median (Interquartilbereich) ausgedrückt und mit dem Kruskal–Wallis-Test mit entsprechenden paarweisen Vergleichen analysiert wurden. Die statistischen Signifikanzschwellen wurden bei P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001 festgelegt. Sofern nicht anders angegeben, bezeichnet "n" biologische Replikate, und technische Replikate (z. B. doppelte ELISA-Bohrungen) wurden gemittelt, um pro biologischer Replikat einen einzelnen Wert zu erhalten.

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Ergebnisse

Eine Infektion mit P. gingivalis oder F. nucleatum ist bei Mäusen mit einer Verkürzung der Schwangerschaft und erhöhten proinflammatorischen Zytokinen im Serum verbunden
Die grundlegenden Statistiken zu Gewichtsänderungen der Mutter, neonatalen Ergebnissen und Schwangerschaftsdauer sind in Tabelle 1 und Abbildung 1 zusammengefasst. Mütterliche Gewichtsverläufe und neonatale Erkrankungen unterschieden sic...

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Diskussion

In den letzten Jahren haben sich zunehmende Evidenzen auf enge Zusammenhänge zwischen der Mundgesundheit und Schwangerschaftsergebnissen hingewiesen, was die Aufmerksamkeit für mögliche Zusammenhänge zwischen chronischer apikaler Parodontitis (CAP) und negativen Schwangerschaftsfolgen, einschließlich der Phänotypen31 durch Frühgeburten, verstärkt hervorruft. Eine systematische Übersichtsarbeit zeigt, dass die derzeitige klinische Evidenzbasis weiterhin begrenzt un...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu deklarieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Key Laboratory der Stiftung für Entwicklung und verwandte Krankheiten von Frauen und Kindern der Provinz Sichuan unterstützt (Zuschuss Nr. FYYFEJB2025002).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Chromogenices Peroxidase-Substrat für IHC
Defibriertes Schafsblut, sterilThermo Fisher (Remel)R54012Additiv für Blutagar (5%)
Zahnröntgeneinheit / RöntgensystemPlanmecaIntra (Modell)Periapikale Röntgenaufnahmen zur CAP-Bestätigung
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Silika-Säulen-DNA-Extraktion aus Geweben/Bakterien
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Transformation für Plasmid-Standard-Konstruktion
Eosin Y Lösung, alkoholischSigma-Aldrich (Merck)HT110132H&E Färbung
Fetal Bovine Serum (FBS), qualifiziert, AustralienGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Ergänzung zum kompletten Medium 
Flowable Resin-Komposit3MFiltek Supreme Flowable 6010Restauration nach Versiegelung; Lichthärtung
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ReferenzstammATCC25586Anaerobe Kultur; CAP und Schwanzvenen-Exposition
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (Version)Statistische Analyse und Figurenerstellung
Hämatoxylin-LösungSigma-Aldrich (Merck)HHS32H&E Gegenfärbung
HTR-8/SVneo humane Trophoblasten-ZellinieATCCCRL-3271In-vitro-Infektionstests 
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA-KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50IL-1β-Messung im Zellüberstand
Human TNF-α Quantikine ELISA-KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DTNF-α-Messung im Zellüberstand
Immobilon-FL PVDF-Membran, 0,45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Fluoreszierende Western-Blot-Übertragung
IRDye 680RD Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)LI-COR925-68071Fluoreszierende sekundäre Antikörper
IRDye 800CW Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)LI-COR926-32211Fluoreszierende sekundäre Antikörper
IκBα (44D4) Kaninchen mAbCell Signaling Technology4812Primärantikörper (WB)
K-File (endodontische Datei)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Kanalinstrumentierung (Beispielgröße 15)
LED-Zahnärztlichhärtendes Licht3MElipar DeepCure-S (Modell)20 s Härtung (pro Protokoll)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA-KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CSerum IL-1β-Messung
Mouse TNF-α Quantikine ELISA-KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BSerum TNF-α-Messung
MyD88 (D80F5) Kaninchen mAbCell Signaling Technology4283Primärantikörper (WB)
NanoDrop One Mikrovolumen-UV-Vis-SpektrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA/RNA-Quantifizierung
Nahinfrarot-BildgebungssystemLI-COROdyssey CLx (Modell)Fluoreszierende Western-Blot-Bildgebung
NF-κB p65 (D14E12) Kaninchen mAbCell Signaling Technology8242Primärantikörper (WB)
PBS, pH 7,4, ohne Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Zellwäsche und Reagenzienzubereitung
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiotika 
Pentobarbital-NatriumsalzSigma-Aldrich (Merck)P3761Anästhesieinduktion (Dosierung gemäß Protokoll)
Peroxidase-BlockierungslösungAgilent DakoS2023Endogene Peroxidase für IHC blockieren
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Kaninchen mAbCell Signaling Technology3033Primärantikörper (WB)
Porphyromonas gingivalis ReferenzstammATCC33277Anaerobe Kultur; CAP und Schwanzvenen-Exposition
PrimeScript RT Reagenz-Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AcDNA-Synthese
Real-Time-PCR-SystemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (Modell)qPCR-Quantifizierung von 16S-Zielen
Rundbohrer (steril)Dentsply SironaH1-010Zugangsöffnung für die Pulpakammer des oberen ersten Molars
RPMI 1640-MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093HTR-8/SVneo Kulturmedium-Basis
SYBR-safe DNA-Gel-FärbemittelInvitrogenS33102DNA-Visualisierung
TaKaRa MiniBEST Plasmid-Reinigungs-Kit Ver.4.0TaKaRa9760Plasmid-Miniprep für Standards
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AqPCR-Mastermix (farbstoffbasiert)
TLR4 (D8L5W) Kaninchen mAbCell Signaling Technology14358Primärantikörper (WB)
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596-026Phenol–Chloroform-RNA-Extraktion
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Zellablösung
T-Vektor pMD19 (Einfach)TaKaRa3271PCR-Produkt-Klonierung für Standardkurven
Universeller Zahnadhäsiv3MScotchbond Universal Adhäsiv 26200Pulpakammer nach Inokulation versiegeln

Referenzen

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