Entwicklung effizienter, stammzellbasierter Mausblastozystenmodelle für Umweltstudien

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Analyse von iGATA4-Blastoiden, einem skalierbaren, stammzellbasierten Modell, das zentrale Merkmale der Maus-Blastozyst, einschließlich der Abstammungsorganisation und Kavitation, wiederholt und eine reproduzierbare, hochdurchsatzfähige Bewertung von Umwelt- und molekularen Störungen ermöglicht, die die frühe embryonale Entwicklung beeinflussen.

Abstract

Stammzellbasierte Embryomodelle bieten eine leistungsstarke Plattform zur Untersuchung der frühen Säugetierentwicklung und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Umweltstörungen. Hier wird ein robustes und zugängliches Protokoll zur Erzeugung hochauflösender Maus-Blastoide präsentiert, die embryonale Stammzellen (ESCs), Trophoblast-Stammzellen (TSCs) und embryonale Stammzellen für induzierbare GATA4-Expression (iGATA4-ESCs) entwickelt haben. Dieses System erzeugt iGATA4-Blastoide, die die natürliche Morphologie der E4.5-Blastozysten, die Linienverhältnisse und die transkriptionellen Signaturen genau nachbilden und so ein zuverlässiges in-vitro-Modell der primitiven Endoderm- (PE), Epiblast- (EPI) und Trophectoderm-(TE)-Kompartimente liefern. Dieses Protokoll demonstriert zunächst, wie man die drei für die Blastoidbildung erforderlichen Stammstoffpopulationen erhalten und vorbereitet. Anschließend wird die schrittweise Montage der iGATA4-Blastoide unter präimplantatorischen Kulturbedingungen dargelegt und kritische experimentelle Parameter hervorgehoben. Um eine rigorose Charakterisierung zu ermöglichen, wird ein getesteter Arbeitsablauf für Blastoidfixierung, Färbung und Bildgebung bereitgestellt. Abschließend wird ein Beispiel präsentiert, das zeigt, wie iGATA4-Blastoide für Hochdurchsatz-Assays eingesetzt werden können. Indem große Kohorten von Blastoiden definierten Umweltfaktoren ausgesetzt werden, können Veränderungen in Morphologie, Abstammungszuordnung und Entwicklungsfortschritt schnell und reproduzierbar quantifiziert werden. Gemeinsam schafft dieses Protokoll eine skalierbare Plattform zur Modellierung der Entwicklung vor der Implantation, zur Analyse früher Linienentscheidungen und zur Durchführung multiparametrischer Screens, um Umwelt- oder molekulare Einflüsse auf die Blastozystenbildung zu bewerten.

Introduction

Um zu verstehen, wie sich frühe Säugetierembryonen selbst zusammensetzen und wie häufige Umweltfaktoren ihre Entstehung negativ beeinflussen können, sind Modellsysteme erforderlich, die reproduzierbar, experimentell zugänglich und skalierbar sind. Integrierte embryoähnliche Modelle, die durch die Kombination von embryonalen und extraembryonalen Stammzellen erzeugt werden, bieten eine solche Plattform ^1,2. Dieses Protokoll beschreibt, wie embryonale Stammzellen (ESCs), Trophoblast-Stammzellen (TSCs) und ESCs, die für induzierbare GATA4-Expression entwickelt wurden (iGATA4-ESCs), unter Präimplantationsbedingungen zusammengesetzt werden können, um Blastoide mit robusten und korrekt proportionierten primitiven Endodermlinien (PE), Epiblasten (EPI) und Trophektodermen (TE) zu produzieren. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass diese Strukturen, als iGATA4-Blastoide³ bezeichnet, dem E4.5-Blastozyst in Bezug auf Linienverhältnisse, Transkriptionssignaturen und funktionelle Markerexpression ähneln. Bei der Kultivierung in vitro gehen 12,5 % dieser Strukturen in eine postimplantationelle Morphologie über. Wichtig ist, dass sie toxikologischen und Umweltuntersuchungen unterliegen.

Die Entwicklung dieser Technik wurde durch Einschränkungen in bereits bestehenden Blastoidsystemen ^2,4,5 motiviert. Obwohl viele Protokolle 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 erzeugen kavitierte Strukturen, die frühen Blastocysten ähneln, wobei die meisten dies mit relativ geringer Effizienz tun oder Strukturen mit unvollständiger PE-Bildung, undefinierten Zellidentitäten oder falschen Abstammungsverhältnissen hervorbringen. Diese Inkonsistenzen verringern ihre Eignung für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Störungsscreens. Da die PE-Spezifikation in vivo auf die Aktivierung von GATA6, SOX17, GATA4 und SOX7²² folgt, behindern Defekte entweder im PE oder im Derivat, dem viszeralen Endoderm (VE), die Entwicklung der Peri-Implantation 23,24,25,26,27, was dieses Transkriptionsprogramm in vitro durchsetzt Verbessert die Blastoid-Genauigkeit. ESCs, die ein bedingtes GATA4-Transgen tragen, transdifferenzieren robust in VE und erzeugen in Kombination mit ESCs und TSCs unter postimplantatorischen Bedingungen integrierte Embryomodelle, die gastruléieren und die Organogenese einleiten 28,29,30,31. Hier wird dieses Prinzip an die Präimplantationsbedingungen angepasst und zeigt, dass iGATA4-ESCs zuverlässig PE erzeugen und Blastoide erzeugen, die natürlichen Blastocysten³ sehr ähnlich sind.

Diese Methode überwindet frühere Einschränkungen der Blastocystenmodellierung mit Stammzellen und bietet eine hohe Blastoidbildungseffizienz (80 % der gebildeten Strukturen sind Blastoide, von denen 75 % eine korrekte Abstammungsorganisation und -proportionen aufweisen) sowie eine hohe Embryo-Ähnlichkeit. Darüber hinaus ermöglicht die modulare Assemblierung der iGATA4-Blastoide, bei der jede Blastozystenlinie aus einer unabhängig kultivierten Stammzellpopulation stammt, direkten experimentellen Zugang zu jedem Embryo-Kompartiment. Diese Eigenschaften machen das System besonders geeignet für multiparametrische Screening-Anwendungen. Da es große Kohorten morphologisch konsistenter Strukturen mit genau proportionierten TE-, EPI- und PE-Linien liefert, ermöglicht es parallele Störungen und Quantifizierung linienspezifischer Reaktionen mit statistischer Stärke, die mit natürlichen Embryonen nicht erreichbar ist.

Als Prinzipbeleg wurden die Auswirkungen häufiger Umweltfaktoren in physiologischen Bereichen^{32, 33, 34, 35, 36, 37, 38} auf die Blastoidentwicklung gemessen. Die Auswirkungen von Koffein-, Nikotin-, Ethanol- und Aminosäuremodifikationen auf Kavitationsrate, Morphologie, Fitness und Abstammungsverhältnisse wurden über verschiedene Konzentrationen und zeitliche Behandlungsfenster hinweg bewertet. Die meisten Erkrankungen (Koffein, Ethanol, Nikotin und solche, die proteinarme Diäten nachahmen) führten zu abweichender Blastoidbildung und einer beeinträchtigten strukturellen Qualität. Im Gegensatz dazu verbesserte die Erhöhung der Konzentration verzweigter Aminosäuren (ähnlich wie hochproteinreiche Diäten) die Effizienz und Qualität der Blastoidbildung. Diese Ergebnisse spiegelten Effekte wider, die in in vitro kultivierten natürlichen Mausblastocysten³ beobachtet wurden, was zeigte, dass dieses System subtile, dosisabhängige Phänotypen erfasst und skalierbare, multidimensionale Screening-Pipelines unterstützt, die mit natürlichen Embryonen nicht möglich sind.

Im weiteren Kontext der Embryomodellierung zeigt diese Technik, dass dieselben Zellen, die zur Modellierung der integrierten postimplantationären Entwicklung verwendet werden, auch als Präimplantationsmodelle eingesetzt werden können. Diese Methode eignet sich besonders für Anwendungen, die skalierbare Modellierung blastozystenähnlicher Strukturen mit genauer PE-Bildung und robuster Linienintegration erfordern. Wie bei anderen stammzellbasierten Modellen der Maus-Blastozyste nistieren sich iGATA4-Blastoide jedoch nicht und entwickeln sich nach dem Transfer auf eine Wirtsmaus nicht weiter und sind daher nicht für Studien zu Embryo-Mütter-Interaktionen geeignet. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen zuverlässigen und zugänglichen Ansatz zur Erzeugung hochpräziser Blastoide, die frühe Zelltypentscheidungen im Säugetierembryo modellieren.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren beinhalten etablierte Zelllinien und wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien des California Institute of Technology durchgeführt. Es wurden keine Arbeiten mit lebenden Tieren oder Menschen durchgeführt.

Mehrere ESC- und TSC-Leitungen wurden getestet und haben festgestellt, dass sie die Bildung von iGATA4-Blastoiden unterstützen. ESCs, iGATA4-ESCs und TSCs aus früheren^{Studien 28} wurden erfolgreich verwendet, um alle in diesem Protokoll beschriebenen Schritte abzuschließen. Die gleichen Autoren beschreiben die Erzeugung von iGATA4-ESCs aus einer bereits etablierten CD1 (ICR) Maus-ESC-Linie.

TSCs werden auf kommerziell erhältlichen embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) kultiviert. Alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien, Reagenzien, Kits, Ausrüstungen und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Kultur von Mausstammzellen zur Bildung von Blastoiden

1. Vorbereitung von MEF-Zuführplatten
   1. Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit 1,5 mL 0,2 % (w/v) Gelatine in deionisiertem (DI) Wasser pro Bohrloch. Inkubieren Sie bei 37 °C in Normoxia für mindestens 45 Minuten.
   2. Während der Inkubation bereiten Sie ein 15-mL Zentrifugenrohr mit 4 mL FC-Medien (Tabelle 1) vor, das auf 37 °C vorgewärmt ist.
   3. Taue das MEF-Fläschchen in einem Wasserbad mit einer Achtbewegung auf, bis nur noch eine kleine Eiskugel übrig bleibt. Geben Sie den Inhalt in das vorbereitete Rohr und pipettieren Sie dann auf und ab, um gründlich zu mischen. Zentrifugiere bei 500 × g für 4 Minuten.
   4. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml FC-Medium. Stellen Sie ein ausreichendes Volumen ein, um ~160.000 Zellen pro Bohrloch in 1,5 mL pro Bohrloch zu vernetzen.
   5. Aspirieren Sie die Gelatine und Platte 1,5 ml MEFs pro Well. Über Nacht ohne Störung in Normoxia brüten.
   6. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches 1,5 mL pro Bohrloch-FC-Medium. Wechsle das Medium alle 48 Stunden. Verwenden Sie MEFs 2–7 Tage nach dem Anrichten. MEFs könnten länger gesund bleiben, aber ihre Fähigkeit, das Wachstum des TSC zu unterstützen, könnte beeinträchtigt sein.

VORSICHT: Führen Sie alle Mauszellkulturen in Biosicherheits-Level (BSL) 1 laminaren Strömungsschränken mit der BSL-2-Technik durch.

2. Auftauen und Weitergabe von embryonalen Mausstammzellen (WT ESCs und iGATA4-ESCs)
   1. Tauen Sie WT-ESCs oder iGATA4-ESCs gemäß den Schritten 1.1.1–1.1.3 auf. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in 1 mL N2B27/2i/LIF-Medium (Tabelle 1) wieder suspendiert und ~50.000 Zellen pro Bohrloch in einer gelatinebeschichteten 6-Well-Platte mit ~1,5 mL pro Bohrloch ausgesät. Inkubieren Sie bei 37 °C in Normoxia und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien dicht gepackt und rund sind, mit minimalen Vorsprüngen, bevor Sie vorbeigehen. Durchfahrt alle 2–3 Tage.
      HINWEIS: WT-ESCs und iGATA4-ESCs sind morphologisch bis zur Induktion mit Doxycyclin (DOX) nicht zu unterscheiden.
   3. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1,5 ml 0,2 % Gelatine in DI-Wasser pro Bohrloch. Mindestens 45 Minuten bei 37 °C bebrüten.
   4. Fügen Sie pro Bohrloch 500 μL Zelldissoziationsreagenz hinzu und inkubieren Sie 3 Minuten. Füge 2 ml FC Medium hinzu und spritze vorsichtig um die Ränder herum. Bestätigen Sie >90 % Ablösung unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen noch angebracht sind, pipette vorsichtig zur Unterstützung der Resuspension.
   5. Die Zellsuspension wird in ein 15-mL-Zentrifugenrohr übertragen und 4 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert.
   6. Aspiratiere das Supernatant und suspendiere das Pellet in 1 mL N2B27/2i/LIF Medium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit 10 μL auf einem Hämozytometer. Stellen Sie das Volumen an, um ~50.000 Zellen pro Bohrloch zu säen.
   7. Aspirieren Sie die Gelatine und säen Sie die Zellen aus. Brüte in der Normoxia. Wechsele das Medium am nächsten Tag und danach alle 48 Stunden.
3. Auftauen und Weitergabe von Maus-Trophoblast-Stammzellen (TSCs)
   1. Tau TSCs gemäß den Schritten 1.1.1–1.1.3 auf. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in 1 mL TSF4H-Medium (Tabelle 1) (Tabelle 1) wieder suspendiert und ~20.000 Zellen pro Bohrloch in einer MEF-beschichteten 6-Well-Platte ausgesät. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂, 5 % O₂ (Hypoxie) und wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien groß (>75 μm Durchmesser) und abgeflacht sind, bevor Sie durchziehen. Fügen Sie pro Bohrloch 500 μL Zelldissoziationsreagenz hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten. Füge 2 ml FC Medium hinzu, während du sanft pipettierst. Bestätigen Sie >90 % Ablösung.
   3. Zellen in ein Zentrifugenrohr übertragen und 4 Minuten lang bei 500 × g drehen.
   4. Wieder in 1 mL TSF4H-Medium aufhängen. Bestimme die Konzentration und passe sie auf ~20.000 Zellen pro Bohrloch an.
   5. Platte auf MEFs und inkubiere bei Hypoxie. Medium alle 24 Stunden wechseln und alle 2–3 Tage durchgehen, bevor die Kolonie zusammenwächst.

2. Bildung von iGATA4-Blastoiden

1. Vorbereitung der Mikrowell-Aggregationsplatte für die Zellaggregation
   1. Fügen Sie 500 μL Anti-Adhärenz-Spüllösung zu jedem Brunnen einer Mikrowell-Aggregationsplatte hinzu. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 5 Minuten mit richtigem Ausgleich, um die eingeschlossene Luft aus den Mikrobrunnen zu entfernen. Inkubieren Sie bei 37 °C in Normoxia mindestens 1 Stunde oder über Nacht.
2. Blastoid-Präparation, Tag 0 — Vorbereitung und Beschichtung von WT und iGATA4-ESCs
   1. Vorwarme N2B27/2i/LIF, FC und FCYL-Medien (FC + 10 ng/mL Mausrekombinant LIF (mLIF) + 2 μM ROCK-Inhibitor Y27632) bis 37 °C. Bereite 0,2 % Gelatine in DI-Wasser vor und bereite das Zelldissoziationsreagenz bereit.
   2. Aspiriere Anti-Adhärenzlösung, ohne den Brunnenboden zu berühren. Wasche zweimal mit 1 ml PBS und einmal mit 1 ml FCYL Medium. Pipettieren Sie entlang der Wand, um die Mikrowellen nicht zu beschädigen.
   3. Bereiten Sie eine gelatinebeschichtete 6-Well-Platte (≥45 Minuten Inkubation) für die Übertragung der Zellen vor.
   4. Ernten Sie WT- und iGATA4-ESCs durch Aspirationsmedium und Zugabe von 500 μL Zelldissoziationsreagenz pro Bohrloch. Inkubiere 3 Minuten bei 37 °C. Füge 2 ml FC Medium hinzu und pipette vorsichtig. Vollständige Ablösung unter dem Mikroskop bestätigen. Auf ein 15-ml-Rohr übertragen und 4 Minuten bei 500 × g zentrifugieren.
   5. Wieder in 1 ml FCYL-Medium aufhängen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit 10 μL auf einem Hämozytometer. Einstellen Sie auf 500.000–700.000 Zellen/mL. Berechnen Sie das benötigte Volumen für 5 WT-ESCs und 5 iGATA4-ESCs pro Mikrobohrloch (6.000 Zellen pro Bohrloch).
      HINWEIS: Optimiere bei Bedarf auch für andere ESC-Leitungen. Ein Anfangsbereich beträgt 4–7 ESCs pro Mikrowell mit einem Verhältnis von 1:1 zwischen ESCs und iGATA4-ESCs.
   6. Bereite 500 μL Zellsuspension pro Bohrloch vor. Geben Sie tropfweise der Microwell-Aggregationsplatte mit einer 1000-μL-Pipette zu. Zentrifugiere bei 100 × g für 3 Minuten und verifiziere die gleichmäßige Verteilung. Inkubieren Sie 6 Stunden, bis sich Zuschlagstoffe bilden.
   7. Passage der verbleibenden ESCs wie in Abschnitt 1.2 beschrieben.
3. Blastoid-Präparation, Tag 0 — Vorbereitung des TX-Mediums
   1. Bereiten Sie ~20 mL TX-Basalmedium mit DMEM/F12 (Tabelle 2) vor. Bereiten Sie für jedes Experiment frisch vor.
      1. Fügen Sie 200 μL 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Supplement hinzu (letzte 2 mM). Vorrat bei 4 °C aufbewahren.
      2. Fügen Sie 200 μL 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin hinzu (jeweils 100 U/mL). Lagern Sie bei −20 °C.
      3. Fügen Sie 40 μL 32 mg/mL L-Ascorbinsäure hinzu (letztlich 64 μg/mL). In DI-Wasser vorbereiten, filtern und sterilisieren und bei −20 °C lagern.
      4. Fügen Sie 20 μL Natriumselenit hinzu (letztlich 14 ng/mL). Vorbereiten und lagern Sie bei −20 °C.
      5. Fügen Sie 240 μL NaHCO₃ hinzu (endgültige 543 μg/mL). Nach dem Auftauen gründlich mischen.
      6. Fügen Sie 20 μL Holo-Transferrin hinzu (finales 10,7 μg/mL). Nach dem Auftauen mischen.
      7. Fügen Sie ~37,5 μL Insulin hinzu (endgültig 19,4 μg/mL; batchabhängig). Lagern Sie bei 4 °C.
   2. Unmittelbar vor der Verwendung fügen Sie Y27632 zu einer Endkonzentration von 20 μM, CHIR99021 auf 3 μM, IL-11 auf 30 ng/mL, FGF4 auf 25 ng/mL, Heparin auf 1 μg/mL, mLIF auf 10 ng/mL, TGFβ auf 15 ng/mL und 8Br-cAMP auf 25 μM.
4. Blastoid-Präparation, Tag 0 — Vorbereitung und Beschichtung der TSCs
   1. Vorwarme TSF4H, FC (Tabelle 1) und TX-Medien (Abschnitt 2.3). Bereiten Sie gelatinebeschichtete Platten (≥45 Min) für die MEF-Erschöpfung vor.
   2. TSCs entnehmen, indem man pro Bohrloch 500 μL Zelldissoziationsreagenz zufügt und bei Hypoxie 5 Minuten inkubiert. Füge 2 ml FC Medium hinzu und pipette vorsichtig. Ablösung bestätigen. In ein Rohr übergeben und bei 500 × g für 4 Minuten zentrifugieren.
      HINWEIS: TSCs, die >4 Tage kultiviert werden, können bis zu 10 Minuten Zelldissoziationsreagenz erfordern.
   3. Wieder in 1 mL TSF4H-Medium aufhängen und auf das passende Volumen für die Plattenierung mit einem 1:2-Split einstellen.
   4. Schichten Sie auf gelatinebeschichtete Brunnen zur MEF-Erschöpfung. Inkubiere ~45 Minuten bei Hypoxie. Stellen Sie sicher, dass MEFs befestigt sind, während TSCs größtenteils nicht angeschlossen bleiben.
   5. Ersetzen Sie 900 μL Medium aus Mikrowell-Aggregationsplattenbohrungen durch 500 μL TX-Medium. Zurück zur Hypoxie.
   6. TSC-haltiger Supernatant in ein Rohr übertragen, ohne die angesetzten MEFs zu stören. Bestimmung der Konzentration (Ziel 500.000–700.000 Zellen/mL).
   7. Berechnen Sie das Volumen für 12 TSCs pro Mikrowell (14.400 Zellen pro Brunnen). Zentrifugieren, wenn weitere Konzentration erforderlich ist.
      HINWEIS: Optimieren Sie für andere TSC-Linien (empfohlen werden 10–15 Zellen pro Mikrowell).
   8. Fügen Sie pro Bohrloch 500 μL Zellsuspension tropfweise hinzu. Zentrifugiere bei 100 × g für 3 Minuten. Verteilung bestätigen und 24 Stunden in Hypoxie inkubieren.
   9. Verbleibende TSCs werden bei Bedarf passiert (Abschnitt 1.3).
5. Blastoid-Präparation, Tag 1 – Einleitung
   1. Etwa 24 Stunden nach TSC-Zugabe werden 20 μL 5 mM 8Br-cAMP und 1 μL 1 μg/mL DOX pro Bohrloch hinzugefügt. Inkubieren Sie 48–72 Stunden bei Hypoxie.
6. Blastoid-Präparation, Tag 3 – Fixierung
   1. Suspendieren Sie die Zuschlagstoffe mit einer geschnittenen 1000 μL Pipettenspitze wieder. Auf 2-mL-Röhren übertragen und 5 Minuten Sedimentation ermöglichen.
   2. Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie 250 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Sanft wieder aufhängen.
      VORSICHT: Behandle PFA in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA.
   3. Inkubiere 15 Minuten, schnippe alle 5 Minuten.
   4. Entfernen Sie PFA und fügen Sie 300 μL PBST (PBS + 0,1 % Tween-20) hinzu. Mische vorsichtig. Lagere bei 4 °C für <1 Woche vor dem Flecken.
7. Immunfluoreszenz von Blastoiden
   1. Übertragen Sie 150 μL pro Probe auf eine 96-Well-U-Bodenplatte.
   2. Fügen Sie 100 μL Permeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten. Ersetzen Sie sie durch eine primäre Antikörperlösung und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
   3. Wasche 3 × mit PBST (jeweils 5 Minuten). Fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu.
   4. Inkubiere 2 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln.
   5. Waschen Sie 3× und übertragen Sie sie in die Bildgebungsschale.
   6. Abbildung mit Konfokalmikroskopie (≥25× Objektiv, NA ≥0,8).

3. Hochdurchsatzsiebe mit dem iGATA4-Blastoid-Modell

1. iGATA4-Blastoid-Präparation und Prüfung von Umweltfaktoren
   1. Bereite Mikrowell-Aggregationsplatte wie in Abschnitt 2.1 beschrieben vor und generiere iGATA4-Blastoide gemäß den Abschnitten 2.2–2.4. Bereiten Sie ausreichende Brunnen vor, einschließlich geeigneter Kontrollen. Beinhaltet eine Blank-Steuerung (Blastoide mit dem Standardprotokoll vorbereitet), eine Trägersteuerung und eine oder mehrere experimentelle Bedingungen.
   2. Inkubiere Blastoide über Nacht bei Hypoxie. Etwa 24 Stunden nach der TSC-Aussaatung bereiten Sie TX-Medium vor, ergänzt mit 8Br-cAMP, Doxycyclin (DOX) und der interessierenden Verbindung (oder Trägerkontrolle). Die folgenden Bedingungen wurden getestet:
      1. Koffein: 3,5 mg/L, verdünnt aus ultrareinen Wasservorräten.
      2. Nikotin: 330 ng/L, verdünnt aus 100% Ethanol (EtOH) Beständen.
      3. Ethanol: 17 mM, verdünnt von absolutem EtOH.
      4. Hohe verzweigte Aminosäuren (BCAA): +5 %, +25 %, +50 % relativ zu den Ausgangskonzentrationen (0,45 mM L-Leucin, 0,45 mM L-Valin, 0,42 mM L-Isoleucin), hergestellt aus konzentrierten Beständen in ultrareinem Wasser.
      5. Niedriges Methionin und Leucin: −5 %, −25 %, −50 %, −100 % relativ zu den Ausgangskonzentrationen (0,12 mM L-Methionin, 0,45 mM L-Leucin), hergestellt mit Met-/Leu-freiem DMEM/F12. Met-/Leu-free DMEM (LM-DMEM) wird vor der Anwendung mit 1x Ham's F-12 Nutrient Mix ergänzt.
         VORSICHT: Bereiten Sie konzentrierte Koffein- und Nikotinbestände in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA; Handschuhe, Laborkittel, Augenschutz) vor und behandeln Sie sie. Ethanol ist brennbar und muss von Wärmequellen ferngehalten werden.
   3. Saugen Sie das Medium aus jedem Bohrloch ab und fügen Sie 1 ml zusammenstoffhaltiges TX-Medium hinzu. Verarbeiten Sie jeweils einen Brunnen nach dem anderen, um ein Trocknen zu vermeiden. Die Platte zurück in den Hypoxie-Inkubator bringen und bis Tag 3 kultivieren.
   4. Nehmen Sie am dritten Tag repräsentative Hellfeldbilder mit einem Durchgangslichtmikroskop auf. Fixieren Sie die Strukturen und führen Sie Immunfluoreszenz wie in den Abschnitten 2.6 und 2.7 beschrieben durch.
      HINWEIS: Passen Sie die Behandlungsfenster je nach experimentellem Ziel an. Behandlungen können während der frühen Aggregation (Tag 1) oder späteren Stadien (z. B. Karieserweiterung) angewendet werden. Beispielfenster sind Tag 1–3, Tag 1–2 (gefolgt vom Medienaustausch) und Tag 2–3.
2. Multiparametrische iGATA4-Blastoid-Analyse
   1. Verwenden Sie Hellfield-Bilder, um den Prozentsatz der Brunnen mit kavitierten Strukturen (d. h. Strukturen mit klar definierter zentraler Kavität) zu quantifizieren und den Blastoiddurchmesser zu messen.
      1. Öffnen Sie Bilder in der Bildanalyse-Software.
      2. Verwenden Sie das Geraden-Werkzeug, um eine Linie über jede Struktur zu ziehen.
      3. Messen Sie den Durchmesser mit Analyze > Measure.
   2. Wählen Sie repräsentative immungefärbte Proben aus (20–40 Strukturen pro biologischer Replikat, mit mindestens drei biologischen Replikaten pro Erkrankung) und bilden Sie sie wie in Abschnitt 2.7 beschrieben.
   3. Quantifizieren Sie die Gesamtzellzahl und die Linienzusammensetzung mithilfe von Immunfluoreszenzmarkern: TE (CDX2-positiv), EPI (SOX2-positiv und SOX17-negativ) und PE (SOX17-positiv).
   4. Bewertung der strukturellen Organisation und Morphologie, indem festgestellt wird, ob PE-Zellen räumlich von EPI-Zellen innerhalb der inneren Zellmasse (ICM) getrennt sind (binäre Klassifikation: ja/nein).
   5. Klassifizieren Sie die Morphologie als gut (klare blastozystenartige Struktur mit definierter Kavität und richtig organisierten TE-, EPI- und PE-Kompartimenten), mittelmäßig (geringfügige Auffälligkeiten wie unregelmäßige Form oder teilweise geformte Höhle) oder schlecht (größere Auffälligkeiten wie das Fehlen einer Kahle oder desorganisierte/unsortierte Linien).
   6. Quantifizieren Sie zusätzliche Parameter, einschließlich Hohlraumgröße oder -volumen, wo anwendbar. Verwenden Sie bioinformatische Werkzeuge oder andere Werkzeuge für das Plotten und die statistische Analyse sowie 3D-Bildanalyse-Software für Zellzählung und/oder Bildvorbereitung für die Darstellung.

Results

Die Aufrechterhaltung von ESCs und iGATA4-ESCs (Normoxie) sowie TSCs (Hypoxie) unter geeigneten Kulturbedingungen ist für eine erfolgreiche Blastoid-Generierung unerlässlich. Bei der Kultivierung wie beschrieben sollten ESCs und iGATA4-ESCs weitgehend ununterscheidbar sein und nach 3 Tagen mittelgroße, runde und gut definierte Kolonien bilden. Das Auftreten abgeflachter Kolonien oder hervorstehender Ränder deutet auf beginnende Differenzierung hin, und solche Kulturen sollten nicht zur Blastoidbildung verwendet werden. TSCs sollten flache Epithelkolonien mit leicht erhöhten Rändern und flacheren Zentren bilden. Überwucherte oder zusammenwachsende TSC-Kolonien (typischerweise nach >3 Tagen in Kultur) führen oft zu schlechten Blastoid-Ergebnissen (Abbildung 1).

Während der iGATA4-Blastoid-Montage deuten mehrere frühe Merkmale auf den Erfolg des Protokolls hin (Abbildung 2A, B). Ungefähr 6 Stunden nach der Aggregation von ESC und iGATA4-ESC sollten am Boden der Mikrowellen enge Zellaggregate sichtbar sein. Lockere Aggregate deuten auf eine übermäßige Exposition der Zelldissoziation hin, was die Zell-Zell-Adhäsion verringert. Fortschritt zum nächsten Schritt (TSC-Ergänzung; Abschnitt 2.4) sollte erst auftreten, wenn enge Aggregate beobachtet sind (Abbildung 2B, Zeitpunkt D0.5). Die Immunfärbung in diesem Stadium sollte homogene SOX2⁺- und GATA4⁻-Aggregate zeigen (Abbildung 2B, Zeitpunkt D0,5).

Nach der TSC-Addition und der nächtlichen Inkubation sollte ein einzelnes kohäsives Aggregat, umgeben von CDX2⁺-Zellen, sichtbar sein (Abbildung 2B). Das Vorhandensein großer, nicht aggregierter Zellen an der Oberfläche der Aggregate deutet oft auf verbleibende MEFs hin. MEF-Kontamination kann die Effizienz der Blastoidbildung verringern; daher ist eine ausreichende MEF-Depletion entscheidend, um vor der Aggregation eine überwiegend TSC-Population zu erhalten. Ein 40-μm-Zellsieb kann verwendet werden, um restliche MEFs zu entfernen, wobei dies die TSC-Ausbeute verringern kann. Unvollständige oder übermäßige CDX2⁺-Abdeckung kann korrigiert werden, indem die Anzahl der pro Mikrobohrloch hinzugefügten TSCs angepasst wird (empfohlener Bereich: 10–15).

Nach der Zugabe von DOX und 8Br-cAMP werden Karies typischerweise ab Tag 2 beobachtet und können bis Tag 3 bestehen bleiben. Bei der Hellfeldmikroskopie erscheinen Hohlräume als klare, leere Räume innerhalb der Blastoide (Abbildung 2B, C; weiße gestrichelte Linie). GATA4⁺-Zellen erscheinen kurz nach der DOX-Induktion und sortieren sich schrittweise auf die Oberfläche des ICM-ähnlichen Kompartiments (Abbildung 2B). Eine erfolgreiche Blastoidbildung ist durch eine hohe Kavitationseffizienz gekennzeichnet (typischerweise ~80 % der Strukturen pro Mikrowell-Aggregationsplatte; Abbildung 2D), ein einschichtiges CDX2⁺-TE-ähnliches äußeres Epithel, eine blastocoel-ähnliche Höhle und ein abgerundetes, ICM-ähnliches Kompartiment, das SOX2⁺-EPI-ähnliche Zellen enthält, überlagert von GATA4⁺-PE-ähnlichen Zellen (Abbildung 2C–E).

Häufige suboptimale Ergebnisse sind nicht-kavitierte Strukturen, unregelmäßig geformte Blastoide mit mehreren Hohlräumen oder ICM-ähnlichen Kompartimenten sowie Brunnen mit wenigen Strukturen oder zellulärem Abfall. Obwohl etwa 20 % abnormale Strukturen erwartet werden (Abbildung 2C), können höhere Raten auf Probleme wie falsche TX-Mediumvorbereitung, schlechte Qualität der Startzelle, das Fehlen von DOX oder 8Br-cAMP am ersten Tag oder Verschiebung von Strukturen bei Medienwechsel hinweisen.

Für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen sollten unbehandelte und Fahrzeugkontrollbrunnen Blastoide liefern, die mit positiven Kontrollbedingungen vergleichbar sind (Abbildung 3A,B). Experimentelle Behandlungen können mehrere Qualitätskennzahlen beeinflussen, darunter Blastoidgröße (Abbildung 3C), Kavitationseffizienz, Gesamt- und Linien-spezifische Zellzahlen (Abbildung 3D), PE-Sortierung und Gesamtmorphologie (Abbildung 3E). Beispielsweise führte die Behandlung mit Koffein, Nikotin oder Ethanol während der Blastoidbildung zu kleineren Strukturen mit verminderter Kavitationseffizienz, geringeren Gesamt- oder ICM-Zellanzahl, beeinträchtigter PE-Sortierung und schlechterer Morphologie. Im Gegensatz dazu führten zunehmende Konzentrationen verzweigter Aminosäuren zu größeren, stärker kavitierten Blastoiden mit erhöhter Zellzahl und verbesserter Morphologie (Abbildung 3C–E). Biologische Variabilität zwischen den Experimenten wird erwartet, was die Bedeutung unterstreicht, sowohl Blank- als auch Trägerkontrollen in jedes Experiment einzubeziehen.

Abbildung 1: Beispiele für gute und schlechte WT-ESCs, iGATA4-ESCs und TSCs. Brightfield-Mikrographen von WT-ESCs, iGATA4-ESCs und TSCs zeigen erwartete Koloniemorphologien nach 2–3 Tagen Kultur in N2B27/2i/LIF (ESCs) oder TSF4H-Medium (TSCs). Das Panel mit dem Titel "WT ESCs – schlechte Qualität" zeigt Zellen mit suboptimaler Morphologie, darunter abgeflachte Kolonien mit hervorstehenden Rändern (rote Pfeilspitzen). Das Panel "TSC überwuchert" zeigt verschmolzene und vergrößerte TSC-Kolonien nach 4 Tagen Kultur. Maßstabsanzeige: 100 μm für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Schematische und erwartete Morphologie der iGATA4-Blastoide. Nachdruck aus Developmental Cell, Bd. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Efficient stem cell-derived mouse embryo models for environmental studies, S. 193–207.e6, Copyright (2025)³, mit Erlaubnis von Elsevier. (A) Schematische Darstellung der natürlichen Maus-Blastozystenentwicklung (oben) und stammzellbasierter Blastozystenmodellierung mit WT-ESCs, iGATA4-ESCs und TSCs.
(B) Mikrographen, die erwartete Morphologie und Markerexpression in verschiedenen Phasen des Protokolls zeigen. Maximalintensitätsprojektion (MIP); gestrichelte Linien markieren die Höhlung. Maßstabsanzeige: 20 μm. (C) Hellfeldbild der iGATA4-Blastoide am Tag 3. Skalenleiste: 100 μm.
(D) Kavitationsraten von iGATA4-Blastoiden, die mit TSCs erzeugt werden, die in Normoxie oder Hypoxie vorkultiviert wurden; Aggregate wurden unter hypoxischen Bedingungen kultiviert. n ≥ 4; Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. (E) Immunfärbung von E4.5-Blastocysten und iGATA4-Blastoiden am Tag 3 für Linienmarker (CDX2, Cyan; OCT4, rot; GATA4, grün). Maximalintensitätsprojektion (MIP); eine einzelne Z-Ebene dargestellt, wo angegeben. Maßstabsleiste: 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Bildung und Qualität von Blastoiden. (A) Repräsentative Immunfluoreszenz-3D-Bilder (oben) und IMARIS-Oberflächenrekonstruktionen (unten) von iGATA4-Blastoiden, die mit Umweltfaktoren behandelt wurden (Koffein, Nikotin, Ethanol und Bedingungen, die hoch- und proteinarme Diäten nachahmen). Skalenbalken: 25 μm für alle Bilder. (B) Schaltplan des experimentellen Arbeitsablaufs. (C) Blastoiddurchmesser unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. Der Bereich umfasst die 10. bis 90. Perzentile; Kästchen zeigen den Interquartilbereich an; Die Linie zeigt den Median an. Die statistische Analyse wurde mit Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. (D) Quantifizierung der Gesamtzahl (grauer), trophektoderm (cyan), Epiblasten (rot) und primitiver Endodermzellen (grüner) Zellen in kontrollierten und behandelten Blastoiden. Balken stellen den Mittelwert dar; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Die statistische Analyse wurde mit Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. (E) Quantifizierung des Anteils der Blastoide, die unter Kontroll- und Behandlungsbedingungen als "gut" (korrekte Liniensortierung mit minimalen morphologischen Auffälligkeiten), "mittelmäßig" (weitgehend korrekte Morphologie mit geringfügigen Auffälligkeiten, einschließlich unvollständiger EPI–PE-Sortierung) oder "schlecht" (stark abnorme Morphologie mit unterbrochener Linienorganisation) klassifiziert werden. Die statistische Analyse erfolgte mit zweiseitiger ANOVA im Verhältnis zu den Kontrollbedingungen. Für alle Panels, N ≥ 3. Die statistische Signifikanz ist angegeben als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Medien	Reagenz	Abschließende Schwerpunkte
FC
	DMEM	n.a.
	Hitzeinaktiviertes FBS (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoethanol (2-ME)	0,1 mM
	Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	1x
	Na Pyruvat	1x
	Penicillin–Streptomycin	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	B27-Ergänzungsmittel	1x
	N2-Ergänzung	0,5x
	2-ME	100 μM
	Penicillin–Streptomycin	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	Mausrekombinante LIF	10 ng/mL
TSF4H
	Megacell RPMI-1640 Medium	n.a.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvat	1x
	Penicillin–Streptomycin	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparin	1 μg/mL

Tabelle 1: Medienrezepte für FC, N2B27/2i/LIF und TSF4H. Rezepte zur Herstellung von FC-Medien, N2B27/2i/LIF-Medien und TSF4H-Medien mit Endkonzentrationen.

Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Bestandskonzentration	Lösungsmittel und Speicher	Lautstärke bis ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, bei -20 °C lagern	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, bei -20 °C lagern	6 μL
DMEM/F12	N/A	N/A	Lagern bei 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1 % BSA in PBS, bei -20 °C gelagert	5 μL
L-Alanyl-L-Glutamin-Supplement	2 mM	200 mM	Lagern bei 4 °C	200 μL
Heparin	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, bei -20 °C lagern	20 μL
Holo-Transferrin	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	DI-Wasser, bei -20 °C lagern	20 μL
Menschliches TGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1 % BSA, bei -20 °C gelagert	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1 % BSA in PBS, bei -20 °C gelagert	24 μL
Insulin	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	Die Konzentration hängt von der Charge ab, bei 4 °C gelagert	33,7–40,8 μL, Volume entsprechend der Lagerkonzentration anpassen.
L-Ascorbinsäure-2-phosphat-Magnesium	64 μg/mL	32 mg/mL	DI-Wasser, bei -20 °C lagern	40 μL
Mausrekombinante LIF	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1 % BSA, bei -20 °C gelagert	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	DI-Wasser, bei -20 °C lagern	240 μL
Penicillin/Streptomycin	1x	100x	Lagern Sie bei -20 °C	200 μL
Natriumselenit	14 ng/mL	14 μg/mL	DI-Wasser, bei -20 °C lagern	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, bei -20 °C lagern	20 μL

Tabelle 2: Medienrezept für TX. Rezept zur Herstellung von TX-Medien, mit Details zur Herstellung und Lagerung kleiner Moleküle und anderer Reagenzien sowie zu den Endkonzentrationen.

Discussion

iGATA4-Blastoide liefern ein hocheffizientes, embryonas, stammzellbasiertes Modell der Maus-Blastozyst, indem sie drei in vitro kultivierte Zelltypen selbst organisieren: ESCs, induzierbare GATA4-ESCs (iGATA4-ESCs) und hypoxiekultivierte TSCs. Diese Strukturen spiegeln zentrale Merkmale des E4.5-Blastozysten wider, einschließlich geeigneter Abstammungsverhältnisse und der transkriptionellen Identität, und können für multiparametrische Umweltscreenings verwendet werden, wobei sie zuverlässig Entwicklungsdefekte im Blastozystenstadium^{widerspiegeln 3}. Eine aktuelle Studie zeigt außerdem, dass die Aggregation von ESCs, iGATA4-ESCs und TSCs in basalen Blastoidmedien ebenfalls zu hocheffizienter Blastoidbildung führt, was die Robustheit und Anpassungsfähigkeit dieses Ansatzes über Labore und Kulturbedingungen hinweg unterstreicht³⁹. iGATA4-ESCs haben zuvor gezeigt, dass sie die Funktionen von VE-Zellen in postimplantationsbasierten Embryo-Modellen 28,29,30,31 nachbilden. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, wie iGATA4-ESCs als flexible und zuverlässige Stellvertreter für PE/VE-Zellen in stammzellbasierter Embryonalmodellierung über Entwicklungsstadien hinweg dienen können.

Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend, um hochwertige Blastoide zu erreichen. Dazu gehören die Qualität der Startzellpopulationen, insbesondere hypoxiekultivierte TSCs (Abbildung 1); die Zubereitung von TX-Medium, das am Tag 0 frisch zubereitet werden sollte (Tabelle 2; Abschnitt 2.3); und sorgfältige Handhabung der Platten nach der Aggregation. Wichtige Ergebnisse des Protokollerfolgs umfassen die Kavitationseffizienz (typischerweise ~80 %), eine angemessene Morphologie (~100 μm Durchmesser Strukturen mit einer blastocoelartigen Kavität, eine CDX2⁺-TE-ähnliche Außenschicht sowie eine sortierte SOX2⁺- und GATA4⁺-innere Zellmasse mit einem ungefähren 3 TE:1 EPI:1 PE-Verhältnis) sowie das Vorhandensein einer korrekt sortierten GATA4⁺-PE-ähnlichen Schicht. Dies sind Metriken, die häufig im Bereich 1,2,4,5 verwendet werden. Unter kavitierten Blastoiden weisen etwa 75 % der Strukturen all diese Merkmale auf. Diese Kennzahlen können als erste Indikatoren für die Fehlerbehebung dienen. Suboptimale Zellqualität spiegelt sich typischerweise in abnormer Koloniemorphologie wider, was zu schlecht aggregierten oder nicht kavitierten Strukturen führt. Eine unsachgemäße Mediumvorbereitung kann zu unvollständiger Aggregation oder Abstammungsfehlern führen, während grobe Handhabung zu mehreren Zuschlagungen pro Mikrobohrloch oder leeren Bohrlöchern führen kann.

Weitere Optimierungen können die Anpassung der Anzahl der gesamenten Zellen umfassen (empfohlene Anfangsbereiche: 4–7 ESCs und iGATA4-ESCs sowie 10–15 TSCs pro Mikrowell), die Verfeinerung von MEF-Depletionsmethoden (z. B. Filtration durch ein 40 μm Zellfilter) und die Modifikation der Zusammensetzung des TX-Mediums. Zum Beispiel kann die Entfernung von FGF4 und Heparin weiterhin die effiziente Blastoidbildung unterstützen und gleichzeitig eine eher murale TE-ähnliche Identität fördern. iGATA4-Blastoide können bis zu 6 Tage in Kultur aufbewahrt werden; Strukturen von Tag 4 bis 6 nehmen jedoch oft an Größe zu, während sie blastozystenähnliche Proportionen der Linie beibehalten. Das Protokoll liefert konsistente Ergebnisse über biologische Replikate hinweg, aber geeignete Kontrollen sollten in jedes Experiment einbezogen werden.

Im Vergleich zu anderen Maus-Blastoidsystemen, die sich in den Startzellpopulationen und den Kulturbedingungen unterscheiden: 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , erreichen iGATA4-Blastoide sowohl eine hohe Formationseffizienz als auch eine genaue Abstammungsrepräsentation. Während viele bestehende Protokolle kavitierte Strukturen erzeugen und für spezifische biologische Anwendungen wertvoll sind, zeigen sie oft eine unvollständige PE-Bildung, heterogene oder undefinierte Zellidentitäten oder falsche Linienverhältnisse. Durch die Zusammenführung von drei linienorientierten Stammzellpopulationen in schrittweiser Weise überwinden iGATA4-Blastoide diese Einschränkungen und bieten ein reproduzierbares, modulares und experimentell zugängliches System.

Trotz dieser Vorteile bestehen mehrere Einschränkungen. Eine verlängerte In-vitro-Kultur im TX-Medium über 4–6 Tage hinaus führt zu Überwucherung, selbst wenn die Linienverhältnisse blastozystenähnlich bleiben. Ungefähr 12,5 % der iGATA4-Blastoide wechseln in vitro zu peri-implantationsähnlichen Morphologien, gekennzeichnet durch ein becherförmiges, pseudogeschichtetes Epiblast, das eine pro-amnionologische Höhle umgibt, ein erweitertes, extraembryonales ektodermähnliches Kompartiment neben dem proximalen Epiblast und eine äußere viszerale endodermähnliche Schicht. Allerdings können iGATA4-Blastoide sich nicht implantieren und entwickeln sich nach dem Transfer in eine Wirtsmaus weiter. Daher sind iGATA4-Blastoide und Blastoide im Allgemeinen nicht geeignet für die Untersuchung von Einnistung oder Embryo-Mütter-Interaktionen.

Die molekulare Grundlage für das Versagen der Blastoide, sich zu implantieren, bleibt unklar, obwohl aktuelle Erkenntnisse darauf hindeuten, dass unvollständige Trophektoderm-Modellierung ein beitragender Faktor sein könnte. TE-ähnliche Zellen in iGATA4-Blastoiden zeigen eine übermäßig polare molekulare Identität. Zukünftige Bemühungen, TSCs zu entwickeln, die eher muralen TE-Zellen ähneln, oder alternative Zelllinien einzuführen, die implantationsfähiges TE besser repapitulieren, stellen vielversprechende Richtungen dar, um diese Einschränkungen zu überwinden. Die modulare Natur der iGATA4-Blastoide, bei denen TE-spezifische Modifikationen unabhängig von EPI- und PE-Bildung implementiert werden können, macht dieses System besonders geeignet für solche Entwicklungen.

Zusammengenommen bietet das iGATA4-Blastoid-Protokoll eine robuste und skalierbare Plattform zur Untersuchung der Linienspezifikation und früher Entwicklungsprozesse im Säugetierembryo. Seine Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit machen es gut geeignet für Hochdurchsatzanwendungen im Umwelt-, pharmakologischen und genetischen Screening. Daher stellen iGATA4-Blastoide ein leistungsstarkes System zur Untersuchung früher Entwicklungsmechanismen dar und zur Untersuchung der Auswirkungen unterschiedlicher Störungen auf die Entwicklung vor der Implantation.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Verwendet für allgemeine Medienzubereitung
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Verwendet für TX-Medienzubereitung und Blastoid-Kavitation
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Mikro-Aggregationsplatte; Verwendet für die Blastoid-Vorbereitung
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Verwendet für die Blastoid-Vorbereitung
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Breite Bohrungs-Pipettenspitzen für Blastoid-Bewegung während der Immunfärbung.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Verwendet für Medienzubereitung
Caffeine	Sigma	58-08-2	Verwendet als Umgebungsfaktor zum Testen in iGATA4-Blastoiden
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:200
CellXpert (Normoxia-Inkubator)	Eppendorf	6731010015	Andere Marken/Modelle können ebenfalls funktionieren.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Verwendet für Medienzubereitung
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Verwendet für allgemeine Gewebekulturzwecke
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500-1:1.000
DMEM	Gibco	11995040	Verwendet für FC-Medienzubereitung
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Verwendet für N2B27 und TX-Medienzubereitung
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Ergänzen Sie DMEM-LM mit Ham's F-12 Nutrient Mix Pulver auf eine abschließende 1x Konzentration, um Met- und Leu-freies DMEM/F12 zu erhalten
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500-1:1.000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor® 647	Invitrogen	A-31571	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500-1:1.000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor® 568	Invitrogen	A10042	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500-1:1.000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500-1:1.000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Verwendet für Immunfluoreszenz. Bei 4°C schmelzen und aliquotiert bei -20°C lagern.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Für iGATA4 Induktion während der Blastoid-Vorbereitung
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	Verwendet in unserem Labor, andere funktionieren auch. Benötigt Röhrchen- und Plattenadapter.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Verwendet für Immunfluoreszenz
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Verwendet für Medienzubereitung
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Verwendet für Bildanalyse
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Verwendet für Immunfluoreszenz, verwendet bei 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Verwendet für allgemeine Gewebekulturzwecke
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Für Immunfluoreszenz und Bildgebung
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-Alanyl-L-Glutamin-Supplement; Verwendet für Medienzubereitung
Ham's F-12 Nutrient Mix Pulver	Thermo Fisher Scientific	21700075	Verwendet als Ergänzung für DMEM-LM, für fettarme Ernährungsbedingungen.
Heparin	Sigma	H3149	Verwendet für Medienzubereitung
Heracell VIOS 160i (Hypoxie-Inkubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Andere Marken/Modelle können ebenfalls funktionieren.
Holo-Transferrin	Sigma	T4132	Verwendet für TX-Medienzubereitung.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Verwendet für TX-Medienzubereitung.
IL-11	PeproTech	200-11	Verwendet für TX-Medienzubereitung.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Verwendet für Bildanalyse und Bildvorbereitung.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Verwendet für Medienzubereitung
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	N/A	Zelllinie verfügbar vom Zernicka-Goetz-Labor auf Anfrage
Insulin	Sigma	I9278	Verwendet für TX-Medienzubereitung.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Verwendet als Feeder-Schicht für TSC-Kultur. Schmelzen wie im Protokoll angegeben und innerhalb einer Woche verwenden.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Verwendet für TX-Medienzubereitung.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Verwendet zur Ergänzung von TX-Medien.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Verwendet zur Ergänzung von TX-Medien.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Verwendet zur Ergänzung von TX-Medien.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	Verwendet für Medienzubereitung
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	N/A	Für allgemeine Flüssigkeitshandhabung
Mouse recombinant LIF