Integrierte Netzwerkpharmakologie, Metabolomik und in vivo Validierung des Liangxue-Dihuang-Abkoks bei DSS-induzierten ulcerativen Kolitis-Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Workflow, der Netzwerkpharmakologie, ungezielte Metabolomik und in vivo-Validierung integriert, um die multikomponentigen Mechanismen des Liangxue-Dihuang-Abkoks in einem von Dextransulfat induzierten Mausmodell der Colitis ulcerosa zu erläutern.

Zusammenfassung

Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung, die durch anhaltende Darmentzündungen und metabolische Dysregulation gekennzeichnet ist. Formeln der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) werden in der klinischen Praxis bei entzündlichen Erkrankungen weit verbreitet verwendet; systematische experimentelle Ansätze zur Aufklärung ihrer Mehrkomponenten- und Multi-Zielmechanismen bleiben jedoch begrenzt. Dieser Artikel präsentiert ein reproduzierbares experimentelles Protokoll, das Netzwerkpharmakologie, ungezielte Metabolomik und in vivo-Validierung integriert, um die entzündungshemmenden Effekte des Liangxue Dihuang-Decoctions (LXDHD) in einem von Dextran Sulfate Sodium (DSS)-induzierten Mausmodell von UC zu untersuchen. Der Arbeitsablauf umfasst die Vorbereitung des pflanzlichen Abkoks, DSS-induzierte Kolitis-Modellierung, Bewertung der Krankheitsaktivität, histopathologische und hämatologische Bewertung, Serum-Zytokin-Messung, LC–MS-basierte metabolomische Profilierung sowie Analyse des rechnergestützten Netzwerks. Mit diesem integrierten Ansatz wurde die durch DSS induzierte Kolitis erfolgreich etabliert, und die LXDHD-Behandlung führte zu messbaren Verbesserungen des Krankheitsaktivitätsindex, der Dickdarmlänge, der histopathologischen Schäden, der entzündlichen Zytokinspiegel und der Stoffwechselprofile. Netzwerkpharmakologie und Metabolomik-Analysen zeigten zudem, dass dieses Protokoll die Identifikation von Schlüsselzielen, Signalwegen und Metaboliten ermöglicht, die mit therapeutischen Interventionen verbunden sind. Dieser visualisierte und standardisierte Arbeitsablauf bietet einen praktischen methodischen Rahmen zur Untersuchung der pharmakologischen Mechanismen mehrkomponenten TCM-Formeln bei entzündlichen Darmerkrankungen und kann an andere pflanzliche Verschreibungen und Krankheitsmodelle angepasst werden.

Einleitung

Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung, die durch eine kontinuierliche schleimhautentzündung des^{Dickdarms 1} gekennzeichnet ist und zu Symptomen wie Bauchschmerzen, Durchfall, rektalen Blutungen und^{Gewichtsverlust führt}. Die Inzidenz von UC nimmt weltweit zu, was die Gesundheitssysteme erheblich belastet und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigt³. Obwohl die Ätiologie von UC noch unvollständig verstanden ist, zeigen sich zunehmende Belege, dass dysregulierte Immunantworten, übermäßige Produktion entzündlicher Zytokine, oxidativer Stress und metabolische Störungen zentrale Rollen bei der Krankheitspathogenese^{spielen 4,5}.

Aktuelle therapeutische Strategien für UC umfassen hauptsächlich Aminosalicylate, Kortikosteroide, immunsuppressive Wirkstoffe und Biologika, die auf entzündliche Zytokine^abzielen. Obwohl diese Behandlungen Symptome lindern und eine Remission herbeiführen können, ist ihre langfristige Anwendung oft mit Nebenwirkungen, hohen Kosten und variablen therapeutischen Wirkungen verbunden ^7,8,9. Darüber hinaus gelingt es einem beträchtlichen Teil der Patienten nicht, eine nachhaltige Remission zu erreichen, was die Notwendigkeit alternativer oder komplementärer therapeutischer Ansätze mit verbesserter Sicherheit und Multi-Ziel-Wirksamkeit unterstreicht.

Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) wird seit Jahrhunderten häufig zur Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen eingesetzt und wird zunehmend für ihre potenziellen Vorteile bei komplexen entzündlichen Erkrankungen wie UC¹⁰ anerkannt. Im Gegensatz zu Single-Target-Therapien bewirken TCM-Formeln typischerweise therapeutische Effekte durch mehrere Komponenten, die auf verschiedene Ziele und Wege wirken, was die multifaktorielle Natur von UC¹¹ besser abdecken kann. Klinische und experimentelle Studien haben nahegelegt, dass bestimmte TCM-Verschreibungen die Immunantworten modulieren, Entzündungen unterdrücken, die Integrität der Darmbarriere schützen und die metabolische Homöostase regulieren^können.

Liangxue Dihuang Decoction (LXDHD) ist eine klassische TCM-Formel, die traditionell verwendet wird, um "das Blut zu kühlen und Wärme zu entfernen", und klinisch bei entzündlichen und hämorrhagischen Erkrankungen angewendet^{wurde 16}. Das Rezept besteht aus mehreren Kräutern, darunter Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis und Glycyrrhiza uralensis. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass mehrere Bestandteile und ihre Wirkstoffe entzündungshemmende, antioxidative und immunmodulatorische^{Eigenschaften} besitzen. Die allgemeinen therapeutischen Effekte und zugrundeliegenden Mechanismen von LXDHD bei UC sind jedoch noch nicht systematisch aufgeklärt.

Netzwerkpharmakologie hat sich als effektiver Ansatz erwiesen, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen mehrkomponenten pflanzlichen Formeln und krankheitsbezogenen molekularen Zielen zu erforschen²⁰. Durch die Integration von Informationen aus mehreren Datenbanken kann die Netzwerkpharmakologie potenzielle Wirkstoffe, therapeutische Ziele und Signalwege vorhersagen und so ein systemweites Verständnis der TCM-Mechanismen^ermöglichen. Dennoch stützt sich die Netzwerkpharmakologie hauptsächlich auf Datenbankvorhersagen und spiegelt nicht direkt die metabolischen Veränderungen in vivo wider.

Die Metabolomik, als leistungsstarkes Werkzeug zur Profilierung globaler metabolischer Veränderungen, bietet ergänzende Einblicke in die Pathophysiologie der Krankheit und therapeutische Reaktionen²². Im UC haben metabolomische Analysen signifikante Störungen im Lipid- und Aminosäurestoffwechsel sowie oxidative-stressbedingte Signalwege 23,24,25 gezeigt. Die Integration von Metabolomik mit Netzwerkpharmakologie kann helfen, die Lücke zwischen vorhergesagten molekularen Zielen und tatsächlichen metabolischen Phänotypen zu überbrücken und so die Zuverlässigkeit mechanistischer Interpretationen zu verbessern.

In der vorliegenden Studie wurde eine integrierte Strategie eingesetzt, die Netzwerkpharmakologie, ungezielte Metabolomik und experimentelle Validierung kombiniert, um die entzündungshemmenden Effekte und potenziellen Mechanismen von LXDHD in einem von Dextran Sulfate Sodium (DSS)-induzierten Mausmodell von UC zu untersuchen (Abbildung 1A). Dieses gesamtmethodische Design, das in silico-Vorhersagen mit in vivo metabolomischer und phänotypischer Validierung integriert, entspricht etablierten rigorosen Forschungsrahmenwerken²⁶. Die Netzwerkpharmakologieanalyse wurde verwendet, um Wirkstoffe, potenzielle therapeutische Ziele und durch die LXDHD-Behandlung angereicherte Signalwege zu identifizieren. Untargeted Metabolomics wurden durchgeführt, um die durch UC induzierten Stoffwechsel und deren Modulation durch LXDHD zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden wichtige Ergebnisse durch in vivo-Experimente validiert, darunter Bewertungen der Krankheitsaktivität, histopathologischer Veränderungen, hämatologischer Parameter und entzündlicher Zytokinspiegel.

Durch die Integration von computergestützten Vorhersagen, metabolischem Profiling und biologischer Validierung zielt diese Studie darauf ab, ein umfassendes Verständnis der Multi-Komponenten-, Multi-Target- und Multi-Pathway-Mechanismen zu vermitteln, die den therapeutischen Effekten von LXDHD bei UC zugrunde liegen. Diese Arbeit bietet nicht nur experimentelle Belege zur Unterstützung der Anwendung von LXDHD als potenzielle komplementäre Therapie für UC, sondern bietet auch einen methodischen Rahmen zur Untersuchung der Mechanismen anderer komplexer TCM-Formeln.

Protokoll

Alle tierischen Versuchsverfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Tierethikkomitee des angeschlossenen Krankenhauses der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin genehmigt (Genehmigungsnummer Nr. #2025DW-034-01; Genehmigungsdatum: 24. März 2025). Die Zubereitung des Liangxue Dihuang-Sukts erfolgte gemäß den Verfahren der chinesischen Artikhabok²⁷. Die im Protokoll verwendeten Reagenzien, Chemikalien und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zubereitung des Liangxue Dihuang-Skoks (LXDHD)

1. Bereiten Sie die getrockneten Kräuter nach der Standardformulierung von LXDHD vor. Die genaue Kräuterzusammensetzung, botanische Namen und die exakt vorgeschriebenen Dosierungen der elf Bestandteile sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   HINWEIS: Authentifizieren Sie alle pflanzlichen Materialien vor der Anwendung von einem qualifizierten Pharmakognisten, um die botanische Identität und Qualitätskonsistenz sicherzustellen. Bewahren Sie Authentifizierungsdatensätze zur Reproduzierbarkeit auf.
2. Pulvervorbereitung
   1. Lassen Sie alle pflanzlichen Materialien bei Zimmertemperatur in einer sauberen, gut belüfteten Umgebung an der Luft trocknen.
   2. Pulverisieren Sie jedes Kraut einzeln mit einer mechanischen Mühle, bis ein feines Pulver erhalten ist.
   3. Kombinieren Sie die Pulver gemäß den vorgeschriebenen Verhältnissen.
   4. Führen Sie das gemischte Pulver durch ein 80-Mesh-Sieb (Innendurchmesser 180 μm ± 7,6 μm), um eine gleichmäßige Partikelgröße zu gewährleisten.
   5. Das Siebpulver gründlich homogenisieren.
      HINWEIS: Eine gleichmäßige Partikelgröße ist für eine konstante Extraktionseffizienz unerlässlich. Unvollständiges Mahlen oder ungleichmäßiges Mischen kann zu Variabilitäten in der chemischen Zusammensetzung führen.
3. Herstellung von LXDHD-wässrigem Extrakt
   1. Wiegen Sie das gemischte Kräuterpulver genau und geben Sie destilliertes Wasser im Verhältnis 1:10 (w/v) dazu.
   2. Erhitze die Mischung bis zum Kochen und dekokte 20 Minuten.
   3. Filtere den Extrakt und sammle das Filtrat.
   4. Frisches destilliertes Wasser zum Rückstand hinzufügen und den Abzug für weitere 20 Minuten wiederholen.
   5. Kombinieren Sie die beiden Filtrate, um den endgültigen LXDHD-Wasserextrakt zu erhalten.
      HINWEIS: Ein doppelter Abzug ist unerlässlich, um eine effiziente Extraktion sowohl wasserlöslicher als auch mäßig löslicher Komponenten zu gewährleisten.
4. Konzentration und Speicher
   1. Konzentrieren Sie den kombinierten Skok unter reduziertem Druck oder sanftem Erhitzen, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
   2. Lassen Sie den Extrakt auf Zimmertemperatur abkühlen.
   3. Lagern Sie den vorbereiteten LXDHD-Extrakt bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von 48 Stunden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen, da sie bioaktive Verbindungen abbauen und die experimentelle Reproduzierbarkeit verringern können.
5. Verwaltung
   1. Bringen Sie den Extrakt vor der Verabreichung auf Zimmertemperatur.
   2. Verabreichen Sie den konzentrierten wässrigen Abkok von LXDHD an Mäuse durch orale Gabe in den festgelegten Dosierungen entsprechend der experimentellen Gruppierung.

2. Tierversuchsdesign

1. Tiere und Wohnverhältnisse
   1. Holen Sie männliche C57BL/6-Mäuse (im Alter von 6–8 Wochen, 20–25 g) von einem zertifizierten Lieferanten von Labortieren.
   2. Hausmäuse unter Standardlaborbedingungen mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, kontrollierter Temperatur (22–25 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (50%–60%).
   3. Stellen Sie Mäusen während des gesamten Experiments kostenlosen Zugang zu Standardfutter und Wasser bereit.
   4. Lassen Sie die Mäuse sich mindestens 7 Tage vor dem Experiment akklimatisieren.
      HINWEIS: Beziehen Sie in späteren Experimenten nur gesunde Mäuse mit normaler Aktivität und Körpergewicht ein.
2. Gruppierung und Dosisberechnung
   1. Berechnen Sie die Mausdosierung von LXDHD gemäß dem in der Methodik der pharmakologischen Experimente beschriebenen Human-Tier-Dosisumrechnungsprinzip, basierend auf einem Standardgewicht eines Erwachsenen von 70 kg und einer täglichen klinischen Dosis von 8,4 g²⁸.
   2. Mäuse werden zufällig in folgende Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): Normale Kontrollgruppe, DSS-induzierte UC-Modellgruppe, niedrig dosierte LXDHD-Gruppe (1,09 g/kg), hochdosierte LXDHD-Gruppe (2,18 g/kg) und 5ASA-positive Kontrollgruppe (100 mg/kg)²⁹.
      HINWEIS: Führen Sie eine Randomisierung mit einer Zufallszahlentabelle durch, um Selektionsfehler zu minimieren.
   3. Einleitung von UC und Medikamentengabe
      1. Bereiten Sie 2,5 % (mit /v) DSS-Lösung in Trinkwasser vor.
      2. Geben Sie DSS-Lösung ad libitum an Mäuse im Modell, LXDHD-behandelt, und 5ASA-Gruppen für 7 aufeinanderfolgende^{Tage 30} Gruppen.
      3. Stellen Sie Mäusen in der normalen Kontrollgruppe gereinigtes Trinkwasser zur Verfügung.
      4. LXDHD und 5ASA werden den Behandlungsgruppen einmal täglich oral in den entsprechenden Dosen während des gesamten Versuchszeitraums verabreicht.
      5. Verwalten Sie ein gleiches Volumen Fahrzeuglösung für die normalen Steuerungs- und DSS-Modellgruppen.
         HINWEIS: Bereite die DSS-Lösung frisch vor und ersetze sie alle zwei Tage. DSS-Chargen können in der kolitisauslösenden Potenz variieren; führen Sie Pilottests durch, wenn Sie eine neue Charge verwenden. Die erfolgreiche Etablierung des DSS-induzierten UC-Modells zeichnet sich durch fortschreitenden Körpergewichtsverlust, blutigen Durchfall, erhöhte DAI-Werte und deutliche Darmverkürzung aus. Diese Kriterien und das methodische Design der Mausexperimente stimmen mit den etablierten Referenzstandards³¹ überein.
3. Herstellung von Blank- und arzneimittelhaltigen Serum für exogene Metabolomik
   1. Verwenden Sie eine separate Kohorte gesunder männlicher C57BL/6 Mäuse.
   2. Teile Mäuse zufällig in zwei Gruppen auf: die leere Gruppe und die LXDHD-Gruppe.
   3. Verabreichen Sie LXDHD der LXDHD-Gruppe oral mit 2,18 g/kg einmal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage.
   4. Geben Sie der Blankgruppe eine gleiche Menge destilliertes Wasser.
   5. Entnehmen Sie Blutproben eine Stunde nach der letzten Verabreichung.
   6. Nehmen Sie Blutproben auf, um das Serum wie in Abschnitt 3.5 beschrieben zu erhalten.

3. Bewertung der Krankheitsaktivität

1. Überwachen Sie während des Experiments täglich das Körpergewicht, die Konsistenz des Stuhls und die Stuhlblutungen.
2. Berechnen Sie den Disease Activity Index (DAI) basierend auf Körpergewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und Stuhlblutungen. Der spezifische Bewertungsrahmen ist in Tabelle 3 detailliert beschrieben. Berechnen Sie die
   der endgültige DAI-Wert als Durchschnitt (oder Summe) dieser drei Parameter³².
3. Am Ende des 8. Tages betäuben Sie Mäuse jeder Gruppe mit 1 % Natriumpentobarbital (30 mg/kg). Entnehmen Sie etwa 400 μL Blut aus dem retro-orbitalen venösen Plexus jeder Maus. Anschließend wird die Tiere durch zervikale Verrenkung eingeschläfert, um den Tod zu gewährleisten, in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Überprüfen Sie eine ausreichende Betäubung, indem Sie sanft die Zehen und die Plantarfläche der Hinterpfoten kneifen; Das Fehlen einer Entzugsreaktion deutet auf eine ausreichende Tiefe der Anästhesie hin.
4. Sammelt das Darmgewebe und misst die Dickdarmlänge als Indikator für die Schwere der Krankheit.
   HINWEIS: Die verkürzte Dickdarmlänge gilt als Kennzeichen für durch DSS induzierte Kolitis-Schweregrad³³.
5. Beschaffung von Blutserum
   1. Lassen Sie einen Teil der gesammelten Blutproben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerinnen.
   2. Zentrifugieren Sie Proben mit 1.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um Serum zu erhalten.
   3. Quantifizieren Sie Serumspiegel von Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-17, Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-α) und IL-10.
   4. Entnahme von Dickdarmgewebeproben für histopathologische Analysen.
   5. Verwenden Sie verbleibende Blutproben für die periphere Blutanalyse.
   6. Reservieren Sie zusätzliche Serumproben für die metabolomische Analyse.

4. Hämatoxylin–Eosin (H&E)-Färbung

1. Dickdarmgewebe in 4 % Paraformaldehyd für mindestens 24 Stunden fixieren.
2. Trocknen Sie das Gewebe durch eine graduierte Ethanolserie.
3. Klares Gewebe mit Xylol und Paraffin einbetten.
4. Schneiden Sie Gewebeschnitte (3–5 μm dick) mit einem Mikrotom.
5. Deparaffinisiert Schnitte mit Xylen.
6. Rehydratiere Abschnitte durch graduales Ethanol.
7. Färbeschnitte mit Hämatoxylin zur nuklearen Visualisierung.
8. Gegenfärbungsschnitte mit Eosin zur zytoplasmatischen Färbung.
9. Beobachten Sie histopathologische Veränderungen unter einem Lichtmikroskop und nehmen Sie repräsentative Bilder mit der zugehörigen Bildgerätesoftware auf.
10. Bewerten Sie histologische Werte (HCS) anhand der Schwere der Entzündung, der Verletzungstiefe und Kryptenschäden.
11. Siehe Tabelle 4 für detaillierte histologische Bewertungskriterien.
    HINWEIS: Erfassen Sie repräsentative Bilder von Gewebeeinbettung, Schnitt und Färbung, um die Protokoll-Visualisierung zu verbessern.

5. Periphere Blutanalyse

1. Periphere Blutproben werden in EDTA-K2-Antikoagulantenröhrchen (1,5 mg EDTA pro mL Blut) entnommen.
2. Wenden Sie die Röhren vorsichtig 8–10 Mal um, um eine richtige Mischung zu gewährleisten.
3. Analysieren Sie die Blutzellzahlen mit einem dreiteiligen veterinärmedizinischen Hämatologie-Analysator (Mindray BC-2600vet) mit artspezifischer Kalibrierung.
4. Transportproben bei 4 °C.
5. Analysieren Sie die Proben innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme.
   HINWEIS: Proben mit Hämolyse oder Gerinnung werden aus der Analyse ausgeschlossen.

6. Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)

HINWEIS: IL-6, IL-17, IL-1β und TNF-α sind wichtige proinflammatorische Zytokine, während IL-10 ein zentrales antiinflammatorisches Zytokin ist. Diese Zytokine spiegeln das Vorhandensein und die Schwere von Entzündungsreaktionen^{wider 34}.
Die Messung dieser Zytokine ist entscheidend, um entzündliche Prozesse zu verstehen und die Wirksamkeit entzündungshemmender Behandlungen zu bewerten.

1. Sammeln Sie Blutproben vom retro-orbitalen Venenplexus.
2. Lassen Sie die Proben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerinnen.
3. Zentrifugiere Proben mit 1.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um Serum zu erhalten.
4. Messung der Serumwerte von IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α und IL-10 mit kommerziellen ELISA-Kits.
5. Messen Sie die Absorption mit einem Mikroplattenleser, der mit Standard-Datenerfassungssoftware ausgestattet ist.
6. Berechnen Sie die Zytokinkonzentrationen basierend auf Standardkurven.
   HINWEIS: Testen Sie alle Proben und Standards doppelt, um die technische Variabilität zu verringern.

7. LC–MS-Analyse des Liangxue-Dihuang-Abkoks

1. Probenvorbereitung
   1. Genau 10 g des LXDHD gemischten rohen Kräuterpulvers wiegen.
   2. Lösen Sie das Pulver in 30 ml heißem Wasser auf.
   3. Führen Sie eine Ultraschallextraktion für 30 Minuten durch.
   4. Mische 100 μL des Extrakts mit 400 μL Methanol.
   5. Vortex für 10 Minuten.
   6. Zentrifugiere bei 14.000 × g für 10 Minuten.
   7. Sammle das Supernatant als Testlösung.
2. LC–MS-Bedingungen
   1. Führen Sie chromatographische Trennung mit einem LC-System in Kombination mit einem Q-Massenspektrometer durch.
   2. Verwenden Sie eine C18-Säule (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Stellen Sie die mobile Phase wie folgt ein: Lösungsmittel A, 0,1 % Ameisensäure in Wasser; Lösungsmittel B, Methanol.
   4. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,30 mL/min ein.
   5. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 35 °C ein.
   6. Stellen Sie das Einspritzvolumen auf 5 μL ein.
   7. Wenden Sie folgendes Gradienten-Elutionsprogramm an:
      0–2 Min, 5 % B;
      2–15 Min, 5–95 % B;
      15–18 Min, 95 % B;
      18–18,1 Min, 95–5 % B;
      18,1–22 Min, 5 % B.
   8. Setze die Massenspektrometrieparameter wie folgt: Gasflussrate der Schicht, 35 arb; Aux-Gas-Durchflussrate 10 ARB; Sprühspannung, 3,5 kV (positiv) und 2,8 kV (negativ); Kapillartemperatur, 320 °C; Temperatur des Hilfsgasheizers, 350 °C.
   9. Erfassung von MS-Daten sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus mit einem vollständigen MS-Scanbereich von m/z 100–1500 (Auflösung: 70.000).
   10. Führen Sie datenabhängige MS2 (dd-MS2) Scans mit einer Auflösung von 17.500 durch.
   11. Verarbeiten Sie Rohdaten und identifizieren Sie Verbindungen mithilfe der mzCloud-Datenbank.

8. Serum-untargeted Metabolomics-Analyse

1. Serumprobenvorbereitung und Qualitätskontrolle (QC)
   1. Tau-Serumproben auf Eis auf.
   2. Übertragen Sie 50 μL Serum in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr.
   3. Fügen Sie 200 μL kaltes Methanol/Acetonitril (1:1, v/v) hinzu.
   4. Vortex für 1 Minute, um Proteine auszufällen.
   5. 15 Minuten auf Eis ausbrüten.
   6. Zentrifugiere bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
   7. Übertragen Sie das Supernatant in ein neues Rohr.
   8. Trocknen Sie den Extrakt mit einem Vakuumkonzentrator.
   9. Rekonstituiert in 100 μL Acetonitril/Wasser (1:1, v/v).
   10. Vortex gründlich.
   11. Zentrifugiere erneut mit 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
   12. Sammeln Sie das Supernatant für die LC-MS-Analyse.
   13. Stellen Sie QC-Proben vor, indem Sie 10 μL-Aliquoten aus jeder Probe zusammenführen.
   14. Injizieren Sie eine QC-Probe pro 8–10 experimentelle Proben, um die Instrumentstabilität und Wiederholbarkeit zu überwachen.
2. LC-MS-Erfassungseinstellungen
   1. Führen Sie chromatographische Trennung mit dem LC-System mit einer C18-Säule (150 × 2,1 mm, 1,8 μm) durch.
   2. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 35 °C ein.
   3. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,30 mL/min ein.
   4. Stellen Sie das Einspritzvolumen auf 2 μL (positiver Modus) oder 5 μL (negativer Modus) ein.
   5. Verwenden Sie Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) und Lösungsmittel B (Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure).
   6. Wenden Sie ein lineares Gradienten-Elutionsprogramm an.
   7. Betreiben Sie das Massenspektrometer in positiven und negativen HESI-Modi.
   8. Stellen Sie den Massenabtastbereich auf m/z 100–1500 ein.
   9. Stellen Sie die Sprühspannung auf 3,5 kV (positiv) und 2,8 kV (negativ) ein.
   10. Stellen Sie die Kapillartemperatur auf 320 °C ein.
3. Datenverarbeitung und differenzielle Metabolitenidentifikation
   1. Importiere rohe LC-MS-Daten (.raw Dateien) in die Software.
   2. Führen Sie Peak-Ausrichtung, Peak-Picking und Baseline-Korrektur durch.
   3. Normalisiere extrahierte Spitzenflächenmerkmale auf die Gesamtintensität der Ionen.
   4. Identifizieren Sie Metaboliten, indem Sie genaue Massenmuster (Massentoleranz < 5 ppm) und MS/MS-Fragmentierungsmuster mit mzCloud- und ChemSpider-Datenbanken abgleichen.
   5. Führen Sie multivariate statistische Analysen durch (PCA und OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Differenzielle Metaboliten werden anhand folgender Schwellenwerte definiert: VIP > 1,0 und p < 0,05 (Schüler-t-Test).

9. Netzwerkpharmakologische Analyse

HINWEIS: Netzwerkpharmakologie wurde eingesetzt, um aktive Bestandteile und Schlüsselziele von LXDHD in UC^35,36 vorherzusagen. Die Methodik umfasst Datenbankmining, chemische Informationsverarbeitung, Bioaktivitätsdatenerfassung, Proteinzielabruf, Genexpressionsprofilierung, Interaktionsnetzwerkaufbau und Analyse der Weganreicherung^37,38.

1. Wirkstoff-Screening
   1. Aktive Verbindungen aus der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis (TCMSP) Datenbank (abgerufen am 10. Dezember 2025) mit OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18 abgerufen.
   2. Ergänzen Sie Substanzen durch Literaturrecherchen in PubMed und Web of Science (10.–15. Dezember 2025).
   3. Standardisierte Ziele mit der UniProt-Datenbank (abgerufen am 15. Dezember 2025).
2. Zielidentifizierung der Krankheit
   1. Sammeln Sie UC-bezogene Ziele aus den Datenbanken GeneCards, OMIM, TTD und DrugBank (Zugriff am 15. Dezember 2025).
3. Netzwerkaufbau und -analyse
   1. Identifizieren Sie sich kreuzende Ziele mit dem VennDiagram-Paket in der R-Software.
   2. Bauen Sie das Netzwerk mit Cytoscape-Software auf.
   3. Analysieren Sie die Topologie mit dem NetworkAnalyzer-Plugin und dem CytoNCA-Plugin.
4. PPI-Netzwerk und Kernziel-Identifikation
   1. Importiere schneidende Ziele in die STRING-Datenbank.
   2. Beschränke die Art auf Homo sapiens.
   3. Entferne isolierte Knoten.
   4. Wenden Sie eine PPI-Schwelle > 0,9 an.
   5. Exportiere die Daten und analysiere sie in der Software.
   6. Berechnen Sie DC, BC, EC, CC, NC und LAC.
   7. Führen Sie medianbasierte Filterung durch, um Subnetze zu erzeugen und Kernziele zu identifizieren³⁹.
5. GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse
   1. Führen Sie GO- und KEGG-Anreicherungen mit R- und Bioconductor-Paketen durch.
   2. Verwenden Sie R-Pakete einschließlich Org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, Enrichplot, stringi und ggplot2.
   3. Setzen Sie die Signifikanzschwellenwerte auf p = 0,05 und q = 0,05.
   4. Führen Sie GO-Analysen für MF-, BP- und CC-Kategorien durch.
   5. Durchführung der KEGG-Anreicherung und -Klassifikation⁴⁰.
6. Molekulare Andockung
   1. Laden Sie zusammengesetzte Strukturen von TCMSP im SDF-Format herunter.
   2. Laden Sie Proteinstrukturen von AlphaFold im PDB-Format herunter.
   3. Führen Sie das Andocken über den CB-DOCK2-Webserver (CADD Lab, Sichuan University, Chengdu, China) durch.
   4. Definiere Rezeptor- und Liganddateien entsprechend.
   5. Zeichnen Sie die optimale Bindungspose und Bindungsenergie auf.
      HINWEIS: Das Andocken wurde mit einem genetischen Algorithmus⁴¹ durchgeführt. Die Ergebnisse wurden nach Bindungsenergie bewertet.

10. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit der GraphPad Prism-Software durch.
2. Drücken Sie quantitative Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus.
3. Test auf Normalität mit dem Shapiro–Wilk-Test.
4. Teste auf Varianzhomogenität mit dem Brown–Forsythe-Test.
5. Führen Sie Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test für normalverteilte Daten durch.
6. Führen Sie den Kruskal–Wallis-Test mit Dunns Test für nichtparametrische Daten durch.
7. Betrachte p < 0,05 als statistisch signifikant.
   HINWEIS: Ein kleinerer p-Wert weist auf einen größeren statistischen Unterschied zwischen den Gruppen hin.

Ergebnisse

Netzwerkpharmakologische Analyse von LXDHD in UC

Die Netzwerkpharmakologie wurde angewandt, um die potenziellen therapeutischen Ziele und molekularen Mechanismen von LXDHD im UC vorherzusagen. Insgesamt wurden 211 Verbindungen mit günstigen pharmakokinetischen Eigenschaften aus der TCMSP-Datenbank gescreent, darunter 36 aus Scutellaria baicalensis, 37 aus Phellodendron chinense, 10 aus Rehmannia glutinosa, 11 aus

Diskussion

Diese Methode präsentiert einen visualisierten, reproduzierbaren experimentellen Workflow, der Netzwerkpharmakologie, ungezielte Metabolomik und in vivo-Validierung integriert, um die entzündungshemmenden Effekte von TCM-Formeln in einem DSS-induzierten Mausmodell von UC zu untersuchen. Im Gegensatz zu konventionellen pharmakologischen Studien, die sich hauptsächlich auf isolierte mechanistische Schlussfolgerungen konzentrieren, betont dieses Protokoll die Robustheit des methodi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-Aminosalicylsäure (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Positiv kontrollierendes Medikament bei Colitis ulcerosa; Verabreicht mit 100 mg/kg oral.
Acetonitril (LC-MS-Qualität)	Merck	100030	Verwendet für die Probenvorbereitung in der Metabolomik und LC-MS in der Mobile-Phase.
AlphaFold Proteinstrukturdatenbank	EMBL– Europäisches Institut für Bioinformatik	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Datenbank, die zur Ermittlung vorhergesagter dreidimensionaler Strukturen von Zielproteinen verwendet wird.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 1,6 g).
CB-Dock2	CADD-Labor	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Webbasierte Plattform für molekulare Andocken und Vorhersage von Liganden; Proteinbindungsmodi.
Zitrus-Aurantium (Zhi Ke)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Compound Discoverer Software	Thermo Fisher Scientific	Version 3.3	Verwendet für LC–MS-Datenverarbeitung und Zusammensetzungsidentifikation.
CTAn-Software	Bruker	Version 1.17	Verwendet für die Rekonstruktion von Micro-CT-3D-Bilden und die Analyse der Knochenerosion.
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium	Version 3.8.0	Software, die für den Netzwerkaufbau und die Visualisierung verwendet wird.
Dextran Sulfatnatrium (DSS)	MP Biomedizin	160110	Molekulargewicht 36.000 %; 50.000 Da; wird verwendet, um Colitis ulcerosa bei Mäusen auszulösen.
EDTA-K2 Antikoagulantenröhrchen	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Zur peripheren Blutentnahme verwendet.
Eosin-Färbelösung	Biosharp	N/A	Verwendet für zytoplasmatische Gegenfärbung bei H& E-Flecken.
Ethanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Wird gegen Gewebedehydrierung verwendet.
Ameisensäure (LC-MS-Qualität)	Merck	5.33002	Verwendet für die LC-MS-Vorbereitung der mobilen Phase.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,5 g).
GraphPad-Prisma	GraphPad-Software	Version 9.0	Verwendet für statistische Analysen und grafische Darstellungen.
Hämatologie-Analysator	Mindray	BC-2600vet	Dreiteiliger veterinärer Hämatologie-Analysator für Blutroutineuntersuchungen.
Hämatoxylin-Färbelösung	Biosharp	BL700B	Verwendet für H& E-Färbung von Darmgewebeschnitten.
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Hitachi	CT15E/CT15RE	Verwendet zur Serum- und Probevorbereitung.
IL-10 ELISA Kit (Maus)	MEIMIAN	MM-0176M2	Wird zur Beurteilung der Serumspiegel von IL-10 verwendet.
IL-17 ELISA Kit (Maus)	Abklonal	RK00039	Verwendet zur Messung der IL-17-Serumspiegel.
IL-1β ELISA Kit (Maus)	Abklonal	RK00006	Verwendet zur Detektion des Serums IL-1β Levels.
IL-6 ELISA-Kit (Maus)	Abklonal	RK00008	Verwendet zur Quantifizierung der Serum-IL-6-Werte.
ImageJ (Fiji) Software	Nationale Gesundheitsinstitute (NIH)	Version 1.53c	Open-Source-Software zur Bildverarbeitung und Quantifizierung.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Version 3.7	Bildgebungssoftware, die zur Erfassung histopathologischer Objektträger verwendet wird.
Methanol (LC-MS-Qualität)	Merck	106035	Verwendet für die Probenvorbereitung in der Metabolomik und LC-MS in der Mobile-Phase.
Mäuse (männlich C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Versuchstiere (im Alter von 6 Jahren; 8 Wochen, 20 Wochen; 25 g) verwendet für das DSS-induzierte UC-Modell.
mzCloud Datenbank	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Datenbank, die für MS/MS-Spektralabgleich verwendet wird.
Optisches Mikroskop	Leica	DM500	Wird für histopathologische Beobachtungen verwendet.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,6 g).
Paeonia suffruticosa cortex (Mu Dan Pi)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Paraformaldehyd (4 %)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Wird zur Fixierung von Darmgewebe verwendet.
Pathologisches Mikrotom	Leica	RM2016	Verwendet zur Vorbereitung von Paraffingewebeschnitten.
Phellodendron chinense (Huang Bo)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,7 g).
Q Exaktives hochauflösendes Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific	Q Exaktiv	Orbitrap-basiertes Massenspektrometer für LC–MS-Analyse.
R Software	R-Stiftung für statistische Berechnung	Version 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Software, die für GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen verwendet wird.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Jiangsu-Provinz-Krankenhaus für Chinesische Medizin	Charge: 2409001	Bestandteil von LXDHD (Dosis: 0,5 g).
Natriumpentobarbital (1 %)	Sigma-Aldrich	P3761	Wird für die Tieranästhesie vor der Probenentnahme verwendet.
SoftMax Pro Software	Molekulare Bauelemente	Version 7.1	Datenerfassungs- und Analysesoftware, die mit dem Mikroplattenleser für ELISA verwendet wird.
STRING-Datenbank	STRING-Konsortium	https://string-db.org/	Datenbank, die für protein&ndash verwendet wird; Analyse der Proteinwechselwirkungen.
TCMSP-Datenbank	TCMSP-Plattform	https://tcmsp-e.com/	Datenbank, die zur Überprüfung von Wirkstoffen und zur Vorhersage von Arzneimittelzielen verwendet wird.
TNF-α ELISA Kit (Maus)	Abklonal	RK00027	Verwendet zur Bestimmung von Serum-TNF-& Alpha; Konzentrationen.
Ultimatives 3000 RS LC-System	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	UHPLC-System gekoppelt mit Massenspektrometrie.
Ultraschallreiniger	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Verwendet für die Ultraschallextraktion von LXDHD.
UniProt-Datenbank	UniProt-Konsortium	https://www.uniprot.org/	Datenbank, die zur Standardisierung von Gen- und Proteinnamen verwendet wird.
Vortex-Mixer	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortex-P1	Wird zum Sample-Mixing verwendet.
Welch AQ-C18 Säule (150 & mal; 2,1 mm, 1,8 & mu; m)	Welch-Materialien	AQ-18-15021	Säule, die zur Trennung von Metaboliten und pflanzlichen Bestandteilen verwendet wird.
Xylen	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Wird zur Gewebereinigung während der histologischen Verarbeitung verwendet.