Methodenartikel

Messung der Translationsdynamik von mRNA in lebenden Zellen mittels getaggter lumineszenter Spaltung in HEK293-Zellen

DOI:

10.3791/70840

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14. August 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir eine flexible, hochdurchsatztaugliche Methode zur Messung der Dynamik der lebenden mRNA-Translation in Zellen von HEK293 mittels getaggter lumineszenter Spaltung vor. Dieser vielseitige Test unterscheidet strukturelle Effekte, unterstützt die Optimierung der In-vitro-Transkription und beschleunigt die Entwicklung von mRNA-Therapeutika.

Zusammenfassung

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Die schnelle Entwicklung von Impfstoffen zur Bekämpfung von COVID-19 verdeutlichte das Potenzial von Boten-RNA-(mRNA-)Therapeutika, die Arzneimittelentwicklung zu verändern. Wie reife mRNA besitzt auch in vitro transkribierte mRNA dieselben Elemente, darunter eine 5’-Cap-Struktur, nicht übersetzte Bereiche (UTRs), eine kodierende Sequenz und einen Poly(A)-Schwanz. Frühere Arbeiten zur Untersuchung der Auswirkungen dieser Komponenten auf die mRNA-Translation verwendeten hauptsächlich stark optimierte Reportereiweiße, die eine effiziente Translation und hohe Proteinstabilität aufweisen. Da die strukturellen Elemente jeder mRNA ihre Translation unterschiedlich beeinflussen, ist es entscheidend, das optimale Design zu identifizieren, das für das jeweilige therapeutische Protein von Interesse (POI) geeignet ist. Zur Charakterisierung der POI-Translation wurde ein System zur komplementären Spaltung von Luciferase eingesetzt. Ein kurzer Peptid-Tag (HiBiT), der an einem der beiden Enden des POI fusioniert werden kann, bindet an sein komplementäres Heterodimer (LgBiT) und rekonstituiert so die enzymatische Aktivität in Gegenwart eines zellgängigen Substrats. Bisher wurde die lumineszenz-basierte Spalt-Tagging-Methode vor allem in Hochdurchsatz-Studien zum Proteinumsatz eingesetzt. Wir konnten bereits zeigen, wie sich diese Methode nutzen lässt, um die Translation von mRNA zeitlich aufgelöst in cellulo in HEK293-Zellen, die das komplementäre Heterodimer konstitutiv exprimieren, hochdurchsatzfähig zu quantifizieren. Hier zeigen wir zusätzlich die Vielseitigkeit des Assays und beschreiben detailliert, wie er zur Optimierung der in vitro-Transkription zur Kostensenkung eingesetzt werden kann. Das Assay-System kann einzigartig Veränderungen in strukturellen Komponenten unterscheiden und gleichzeitig die Auswirkungen der Optimierung der kodierenden Sequenz anhand nicht optimierter Gene aufzeigen. Außerdem demonstrieren wir, dass eine vierfache Reduktion der 5’-Cap-Konzentration bei der in vitro-Transkription zu einer äquivalenten Translation in cellulo führt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie sich die lumineszenz-basierte Spalt-Tagging-Methode problemlos in den Workflow für mRNA-Therapeutika integrieren lässt, wodurch die Echtzeit-Überwachung der mRNA-vermittelten Proteindynamik in cellulo ermöglicht wird und somit eine vielseitige Methode für die Weiterentwicklung mRNA-basierter Therapeutika bereitsteht.

Einleitung

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Die Anwendungsbereiche und Forschung zu Boten-RNA (mRNA)-Therapeutika haben in den letzten Jahren rapide zugenommen, angetrieben durch den Erfolg von mRNA-Impfstoffen1,2 und das wachsende Bewusstsein für die Vielseitigkeit von RNA als programmierbares Biomolekül. Eine zentrale Herausforderung in diesem Bereich besteht darin, die Translationseffizienz von mRNA quantitativ und dynamisch in unterschiedlichen Kontexten bewerten zu können. Die hier beschriebene Methode – basierend auf einem geteilten lumineszenten Markierungssystem – stellt eine flexible und skalierbare Plattform zur Untersuchung der lebenden mRNA-Translation in cellulo3 bereit. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Forschenden die Möglichkeit zu geben, zu messen, wie Sequenzmerkmale, chemische Modifikationen und strukturelle Elemente die Translationskinetik und anschließend den Proteinausstoß beeinflussen, und bietet somit ein leistungsfähiges Werkzeug zur Optimierung von mRNA-Konstrukten für therapeutische und grundwissenschaftliche Anwendungen.

In-vitro-transkribierte mRNA spiegelt die wesentliche Architektur reifer Transkripte wider und enthält eine 5′-Cap, nicht übersetzte Bereiche (UTRs), eine kodierende Sequenz sowie einen Poly(A)-Schwanz, häufig zudem modifizierte Nukleotide zur Verringerung der Immunogenität4,5. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass sich jedes dieser Elemente – einzeln und in Kombination – gezielt verändern lässt, um die Translations-Effizienz und die Proteinausbeute stark zu beeinflussen6,7. Die meisten früheren Studien stützten sich jedoch auf stark optimierte Reportproteine wie das grüne Fluoreszenzprotein (GFP)7, NanoLuc8 oder das Spike-Protein von SARS-CoV-28,9, die dafür konstruiert sind, mit hoher Effizienz zu translatieren und äußerst stabile Proteine zu erzeugen, und daher die in therapeutischen Anwendungen auftretenden Herausforderungen nicht widerspiegeln. Da therapeutische mRNA-Moleküle eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine von Interesse (POIs) kodieren, die jeweils spezifischen strukturellen Zwängen und zelltypspezifischen Regulationsmechanismen unterliegen, lassen sich die Gestaltungsprinzipien, die die Translation eines bestimmten Konstrukts maximieren, möglicherweise nicht auf ein anderes übertragen, wie zuvor berichtet wurde3. Die Identifizierung der optimalen Konfiguration für einen gegebenen therapeutischen POI ist daher unerlässlich und erfordert Methoden, die empfindlich und systematisch bewerten können, wie einzelne Merkmale des Transkripts zur Proteinausbeute beitragen.

Ribosomzentrierte Methoden wie die Polysomenprofilierung unterscheiden Translationsfraktionen mittels Dichtegradientenzentrifugation10, während die Ribosomenprofilierung (Ribo-seq) eine Auflösung auf Nukleotidebene hinsichtlich Ribosomenbesetzung, Initiierungsstellen und Pausen ermöglicht11. Wie Ribo-seq liefern auch andere sequenzbasierte Ansätze wie die Hochdurchsatz-Sequenzierung von durch Vernetzung und Immunpräzipitation isolierter RNA (HITS-CLIP) und die Affinitätsreinigung übersetzender Ribosomen (TRAP) zusätzliche Charakterisierungen der Translation von RNA-bindenden Protein-assoziierten oder Ribosomen-assoziierten RNAs12. Obwohl leistungsfähig, erfordern diese Techniken aufwändige Probenvorbereitungen, spezielle Geräte und bioinformatische Expertise, wodurch sie für die Hochdurchsatz-Entwicklung therapeutischer mRNA nicht geeignet sind. Die Immunpräzipitation neugebildeter Peptidketten13 misst die Translationseffizienz anhand von FLAG-markierten Proteinen, die aus Ribosomen immunpräzipitiert und mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) quantifiziert werden. Obwohl diese Methode auf therapeutische mRNA anwendbar ist, ist sie arbeitsintensiv, weist eine geringe zeitliche Auflösung auf und eignet sich nicht für Hochdurchsatzanwendungen. Das SunTag-System14 ermöglicht Live-Cell-Messungen der Proteinsyntheseleistung und der translationalen Regulation einzelner mRNA-Moleküle und beruht auf der Wechselwirkung eines an GFP fusionierten einzelketten variablen Fragments (scFv) mit tandemartig wiederholten Peptid-Epitopen. Dieses System erlaubt dynamische Messungen von Translation und Lokalisation mit Auflösung auf Ebene einzelner mRNA-Moleküle und wurde daher zur Entwicklung zahlreicher Systeme zum Verfolgen neugebildeter Peptidketten genutzt15,16. Allerdings ist dieser Ansatz durch einen geringen Durchsatz gekennzeichnet und erfordert den Einsatz leistungsstarker Mikroskope.

Während die Markierung des neu synthetisierten Proteins unvermeidbar ist, wurde die potenzielle Verwendung eines kleinen Peptid-Tags identifiziert, das aus der NanoLuc-Luciferase abgeleitet ist und zur Untersuchung der mRNA-Translation in lebenden Zellen dient. Die NanoLuciferase wurde so konstruiert, dass sie in eine kleine, 11 Aminosäuren umfassende Untereinheit (HiBiT) und eine größere, 158 Aminosäuren umfassende Untereinheit (LgBiT) aufgeteilt wird, die sich schnell dimerisieren und in Gegenwart eines Substrats eine funktionelle Luciferase rekonstituieren können17,18. Das geteilte lumineszente Markierungssystem bietet mehrere entscheidende Vorteile für die Untersuchung der mRNA-Dynamik. Erstens ermöglicht die minimale Größe der kleinen Untereinheit, die mit dem Protein von Interesse (POI) fusioniert ist, dass der codierende Konstrukt so nah wie möglich am nativen Protein von Interesse bleibt. Da die Länge der kodierenden Sequenz die Translationsraten direkt beeinflussen kann19, verbessert die Minimierung der Tag-Länge die Vorhersage der Translationsdynamik synthetischer mRNA-Moleküle. Entscheidend ist, dass diese minimale Markierungsstrategie die Detektion von Unterschieden in der Translation ermöglicht, die durch synonyme Variationen der kodierenden Sequenz verursacht werden, wodurch die Translations-Effizienz unabhängig von der Proteinsequenz oder -stabilität untersucht werden kann3. Aus diesem Grund sind größere Tags, wie fluoreszierende Proteine oder vollständige Luciferasen, suboptimal. Zweitens ermöglicht das hier verwendete geteilte lumineszente Markierungssystem eine sofortige Signalgenerierung. Die schnelle und effiziente Komplementationsreaktion in cellulo weist eine hohe Affinität (KD = 700 pM) auf und wurde bereits verwendet, um Modulationen des Proteinumsatzes mit Messintervallen von nur 30 Sekunden zu erfassen18. Während das ursprüngliche geteilte lumineszente Markierungssystem hauptsächlich im Vergleich zu anderen geteilten Luciferase-Systemen evaluiert wurde17,18, liegt der entscheidende Vorteil in diesem Kontext darin, dass die Signalgenerierung nicht durch die Proteinreifung begrenzt ist. Im Gegensatz dazu erfordern fluoreszierende Proteine die Reifung des Chromophors, was Minuten bis Stunden dauern kann20 und dadurch die zeitliche Auflösung einschränkt. Schließlich überwindet das hier verwendete etablierte geteilte lumineszente Markierungssystem die Limitationen geteilter fluoreszierender Proteinsysteme, die typischerweise nach der Komplementation die Bildung eines Chromophors benötigen21, was eine zusätzliche Verzögerung verursacht und ihre Eignung für die Erfassung schneller, dynamischer Prozesse einschränkt. Frühere Studien haben die Nützlichkeit der geteilten lumineszenten Markierung in Assays zum Proteinumsatz und in Degradationsstudien gezeigt22,23,24. Die Erweiterung dieser etablierten Technologie auf die Translationskinetik stellt einen bedeutenden methodischen Fortschritt dar. Beispielsweise kann das Ribosomen-Profil zwar die Ribosomen-Dichte entlang von Transkripten aufzeigen, erfasst jedoch nicht leicht dynamische Veränderungen der Translationsinitiierung oder der Elongationsraten unter unterschiedlichen Bedingungen. Wie zuvor gezeigt3, kann dieses geteilte lumineszente Markierungssystem Unterschiede detektieren, wenn die Kap-Struktur, die Zusammensetzung des 5′-unübersetzten Bereichs (UTR), die Codon-Optimierung, Nukleotid-Modifikationen oder die Länge des Poly(A)-Schwanzes verändert werden – all diese Faktoren sind entscheidende Bestimmungsgrößen der Translations-Effizienz. Diese breite Anwendbarkeit macht die Methode besonders leistungsfähig, um den Beitrag einzelner mRNA-Merkmale zur Gesamtproteinproduktion zu analysieren. Es ist erwähnenswert, dass je nach verwendeter Instrumentierung sowohl Einzelzell- als auch Ganztwellendaten mit dieser Technologie erfasst werden können. Bildgebende Plattformen, die lumineszenzbasierte Aufnahmen ermöglichen, können diese Technologie für die Untersuchung der Translationsdynamik auf Einzelzellebene nutzbar machen. Hier konzentrieren wir uns jedoch auf eine plattenbasierte Anwendung mittels Plattenreadern aufgrund ihres mittleren bis hohen Durchsatzes und des geringen Aufwands bei der Datenanalyse.

Forscher, die diese Methode in Betracht ziehen, sollten deren Eignung im Hinblick auf ihre spezifischen experimentellen Zielsetzungen bewerten. Der Assay ist besonders wertvoll in Kontexten, in denen eine Hochdurchsatz-Screening synthetischer mRNA-Konstrukte erforderlich ist, wie beispielsweise in Entwicklungsverfahren für mRNA-basierte Therapeutika. Er eignet sich gut für vergleichende Analysen synthetischer mRNA-Sequenzmerkmale – einschließlich nichttranslatierter Regionen, Codonnutzung oder Nukleotidmodifikationen – bei denen subtile Unterschiede in der Translations-Effizienz detektiert werden können3. Da das System mit zellfreien Translationssystemen, Lebendzell-Assays und einem zeitpunktspezifischen lytischen Assay kompatibel ist, bietet es Flexibilität für Untersucher, die ihr experimentelles Design entweder auf mechanistische Studien oder anwendungsorientierte Forschung zuschneiden möchten. Gleichzeitig ist es wichtig, die Grenzen der Technik zu erkennen. Kritisch ist, dass der gespaltene lumineszente Markierungs-Assay keine Auflösung der Ribosomenbesetzung ermöglicht, eine Fähigkeit, die weiterhin ausschließlich ribosomalen „Footprinting“-Verfahren vorbehalten bleibt, und dass er weder die RNA-Stabilität noch den Abbau direkt misst, was möglicherweise mit ergänzenden Methoden überprüft werden muss. Aufgrund der Einschränkungen bestehender ribosomenzentrierter Techniken sind Forscher jedoch auf markierungsbasierte Assays wie das gespaltene Lumineszenzsystem angewiesen, um die zeitlich aufgelöste, mRNA-vermittelte Proteinsynthese als Proxy für Translationsdynamik zu untersuchen. Daher hängt die Eignung dieses Systems, obwohl es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung der synthetischen, mRNA-vermittelten Proteinsynthese darstellt, davon ab, ob die Forschungsfrage auf der dynamischen Proteinausbeute und nicht auf feinabgestufter Ribosomenpositionierung oder RNA-Abbau liegt.

Zusammenfassend stellt das aufgeteilte lumineszente Markierungssystem eine leistungsfähige und vielseitige Methode zur Untersuchung der mRNA-Translation dar. Ihr übergeordnetes Ziel ist es, Forschenden ein flexibles, systemerweiterbares und hochdurchsatzfähiges Verfahren bereitzustellen, das in der Lage ist, Unterschiede in der Proteinausbeute zu detektieren, die aus synthetischer mRNA mit variierenden strukturellen und sequenziellen Elementen hervorgehen3. Die Motivation für ihre Entwicklung ergibt sich aus der Überwindung der Einschränkungen bestehender Techniken und bietet Vorteile hinsichtlich Empfindlichkeit, Skalierbarkeit und zeitlicher Auflösung. Eingebettet in die breitere Literatur zur RNA-Biologie und -Therapeutika leistet diese Methode einen wertvollen Beitrag zum experimentellen Methodenspektrum und ermöglicht sowohl grundlegende Erkenntnisse als auch translationale Fortschritte. Indem die Stärken und Grenzen des Assays sorgfältig abgewogen werden, können Forschende deren Eignung für ihre spezifischen Anwendungen beurteilen und so ihren Einfluss im sich rasch entwickelnden Bereich der RNA-Forschung maximieren.

Protokoll

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Eine grafische Darstellung des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung der Vorlage für die in vitro-Transkription (IVT)

HINWEIS: Um die DNA-Vorlage für die IVT vorzubereiten, stellen Sie sicher, dass die Plasmid-DNA einen RNA-Polymerase-Promotor (im Allgemeinen T7 oder SP6), 5’- und 3’-UTRs sowie das offene Leseraster des Zielproteins (POI) enthält (Abbildung 1).

  1. Linearisieren Sie die Plasmid-DNA mithilfe eines Restriktionsenzyms mit einer Einzelschnittstelle nach dem 3’ UTR und stellen Sie die Reaktion gemäß den Herstelleranweisungen zusammen. Reinigen Sie die Restriktionsverdauungsreaktion nach der Inkubation mit einem Säulchen-basierten DNA-Reinigungs-Kit. Quantifizieren Sie die DNA mittels Spektrophotometer.
  2. Zur Bestätigung der Linearisierung bereiten Sie ein 1 % Agarose-TAE-Gel mit dem DNA-Farbstoff Ethidiumbromid (0,1 µg/mL) vor. Mischen Sie 150 ng verdauter DNA mit Wasser und Farbstofflösung. Laden Sie das Agarosegel mit der Probe, ungeschnittener Plasmid-DNA und einer DNA-Leiter und führen Sie das Gel 40 min bei 100 V in 1× Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer laufen. Sichtbarmachen mit einem Gel-Imager.
    ACHTUNG: Ethidiumbromidlösung ist ein starkes Mutagen und muss unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) vorsichtig gehandhabt werden.
  3. Falls die Plasmid-DNA unmittelbar nach dem 3’ UTR keinen Poly(A)-Schwanz aufweist, fügen Sie diesen mittels PCR ein. Führen Sie die PCR gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung einer hochfidelitären Polymerase und geeignet gestalteter Primer durch. Stellen Sie sicher, dass das Amplifikat den T7-Promotor, den offenen Leserahmen und einen Poly(A)-Schwanz enthält.
    HINWEIS: Capping-Technologien können spezifische Sequenzanforderungen am T7-Promotor haben; diese Anforderungen können durch geeignete Gestaltung des Vorwärtsprimers erfüllt werden. Das Rückwärtsprimer bindet am Ende des 3’ UTR und führt einen Poly(A)-Schwanz ein (empfohlene Länge von mindestens 80 T). Für Konstrukte mit hohem GC-Gehalt werden schrittweise PCR und/oder 3 % DMSO empfohlen.
  4. Zur Bestätigung des erfolgreichen PCR-Ergebnisses bereiten Sie ein Agarose-TAE-Gel mit Ethidiumbromid vor (siehe Schritt 1.2). Falls die Konstruktgröße ≥1 kb oder <1 kb beträgt, bereiten Sie ein 1 % bzw. 2 %iges Gel vor. Mischen Sie 5 µL der PCR-Reaktion mit Wasser und Farbstofflösung. Laden Sie das Agarosegel mit der Probe und einer DNA-Leiter und führen Sie es 40 min bei 100 V in TAE-Puffer durch. Sichtbarmachen mit einem Gel-Imager.
  5. Nach der Bestätigung der PCR-Produktgröße reinigen Sie die PCR-Reaktion mithilfe eines Säulchen-basierten DNA-Reinigungs-Kits. Eluieren Sie in 15–20 µL Elutionspuffer (häufig im Lieferumfang des DNA-Reinigungs-Kits enthalten) oder nukleasefreiem Wasser, um die DNA-Vorlage für die in-vitro-Transkription (IVT) zu konzentrieren. Quantifizieren Sie die DNA mittels Spektrophotometer.

2. In-vitro-Transkription

  1. Vor Beginn die Arbeitsfläche, Handschuhe und Pipetten mit einer RNase-Entkontaminationslösung besprühen und abwischen. Um Ausbeute und Qualität zu verbessern, diesen Vorgang in einer sterilen Haubenumgebung durchführen.
  2. Tauen Sie die Komponenten eines auf T7 basierenden In-vitro-Transkriptions-(IVT-)Kits gemäß den Herstelleranweisungen auf und stellen Sie sie zusammen.
    HINWEIS: Einige Hersteller empfehlen die Verwendung von Dithiothreitol (DTT, 0,1 M), um die Oxidation der Reaktion zu begrenzen und die Effizienz zu verbessern. Dieser Schritt wird empfohlen, sofern er mit dem Kit kompatibel ist. Bei Verwendung modifizierter dNTPs sollte das entsprechende unmodifizierte Nukleotid durch die gleiche Menge des modifizierten Nukleotids ersetzt werden. Beurteilen Sie die Ausbeute anhand einer halben Reaktion, da bei einer vollen Reaktion keine wesentliche Verbesserung der Ausbeute beobachtet wurde. Bei der Synthese mehrerer mRNA-Proben wird empfohlen, eine Master-Mix-Lösung herzustellen, um Pipettierfehler und Variabilität zu reduzieren.
  3. Gründlich pipettieren und kurz mischen, dann 5 h bei 37 °C mit beheiztem Deckel zur Vermeidung von Kondensation inkubieren. Bei Bedarf die Inkubation über Nacht verlängern, da dies nur einen geringen Einfluss auf die mRNA-Ausbeute oder -Integrität hat.
  4. Geben Sie 1 µL DNase I hinzu und pipettieren Sie gründlich. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min.
  5. Reinigung von in vitro in vitro transkribierte (IVT) RNA
    1. Reinigen Sie die IVT-Reaktion mithilfe eines säulenbasierten RNA-Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen (verschiedene Kits können zu unterschiedlichen Rückgewinnungsraten führen und weisen unterschiedliche Bindungskapazitäten auf). Zum Eluieren geben Sie 60 µL nukleasefreies Wasser hinzu und inkubieren 5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie zentrifugieren.
    2. Alternativ kann die Fällung mit Lithiumchlorid als kostengünstigere und flexiblere Methode verwendet werden.
      1. Geben Sie ein gleiches Volumen von 7,5 M Lithiumchlorid zur Reaktion hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie über Nacht bei -20 °C.
      2. Zentrifugieren Sie 20 min bei 18.300 × g und 4 °C und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne den RNA-Pellet zu stören.
      3. Mit 950 µL 70 %igem Ethanol waschen und 5 min bei 4 °C mit 18.300 × g zentrifugieren. Das Überstand entfernen, das Pellet etwa 5 min bei Raumtemperatur trocknen lassen und in nukleasefreiem Wasser resuspendieren (60 µL ist üblich; das Volumen je nach Pelletgröße reduzieren, um die Konzentration zu erhöhen).
        ACHTUNG: Lithiumchlorid kann bei fehlender geeigneter persönlicher Schutzausrüstung Haut- oder Augenreizungen verursachen. Tragen Sie beim Umgang Handschuhe und Augenschutz. Ethanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und kann Augenreizungen verursachen. Von offenen Flammen fernhalten und geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Augenschutz, tragen.
  6. Quantifizieren Sie die mRNA mithilfe eines Spektrophotometers. Stellen Sie sicher, dass das A260/A280-Verhältnis der mRNA bei etwa 2,0 liegt, und überprüfen Sie, dass das A260/A230-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 liegt.
  7. Zur Bestätigung einer erfolgreichen IVT bereiten Sie ein 1 %iges Agarose-TAE-Gel (nicht-denaturierend) mit Ethidiumbromid vor. Mischen Sie 500 ng mRNA mit Wasser und Farbstofflösung und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Vorbereitung der RNA-Leiter und deren Denaturierung. Laden Sie das Agarosegel auf und führen Sie es 40 Minuten lang bei 80 V in TAE-Puffer durch. Visualisieren Sie das Gel mit einem Gel-Imaging-System.
  8. Zur weiteren Bestätigung der korrekten mRNA-Größe die Proben auf einem Bioanalyzer laufen lassen.
  9. Um Freeze-Thaw-Zyklen zu vermeiden, portionieren Sie die mRNA in die für das Experiment benötigte Volumenmenge ein. Verwenden Sie beispielsweise 1,2 pmol mRNA pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte. Portionieren Sie daher das entsprechende Volumen für 1,2 pmol × n Replikate ab und lagern Sie es bei -80 °C.

3. HEK293-Rückwärtstransfektion

HINWEIS: Für zeitliche Messungen wird eine Zelllinie benötigt, die konstitutiv das komplementäre Luciferase-Fragment exprimiert. Dies kann erreicht werden, indem eine stabile Zelllinie durch Transfektion eines Plasmids, das das erforderliche Luciferase-Fragment exprimiert, erzeugt und anschließend eine klonale Selektion durchgeführt wird. Dadurch kann der Anwender translationsdynamische Vorgänge von mRNA mit zeitlicher Auflösung in jedem gewünschten zellulären Hintergrund messen. Alternativ können Zelllinien, die das erforderliche Luciferase-Fragment exprimieren, bezogen werden. Diese Experimente wurden mit HEK293-Zellen durchgeführt, die konstitutiv das komplementäre Heterodimer exprimieren.

  1. Tauen Sie die mRNA vor Beginn auf Eis auf, um eine Degradation zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie die Transfektionskomplexe vor. Für eine 96-Loch-Platte werden 1,2 pmol mRNA pro Loch benötigt. Wenn in Duplikaten gearbeitet wird, bereiten Sie ausreichend Menge für 2,5 Duplikate vor, um Pipettierfehler auszugleichen. Mischen Sie daher 3 pmol mRNA mit Opti-MEM Reduced Serum Medium auf ein Endvolumen von 50 µL (20 µL/Loch).
  3. Geben Sie 0,5 µL eines kationischen, lipidbasierten Transfektionsreagenz (0,2 µL/Loch) hinzu, mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und inkubieren Sie bei Raumtemperatur. Nach einer 5-minütigen Inkubation erneut durch Auf- und Abpipettieren mischen und dann jeweils 20 µL pro Loch in eine weiße, flachbodige 96-Loch-Mikrotiterplatte geben. Es wird empfohlen, die Transfektionslöcher in der Mitte der Platte anzubringen und die Randlöcher frei zu lassen.
  4. Bereiten Sie die HEK293-Zellen vor, indem Sie das Medium entfernen und mit 2 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2+ und Mg2+ waschen. Entfernen Sie die Waschlösung und geben Sie 500 µL Trypsin-EDTA hinzu, anschließend 3 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Während der Zelldissoziation füllen Sie die Randlöcher der 96-Loch-Platte mit PBS, um die Verdunstung des Mediums während der Zellkultur zu verringern. Falls alle Löcher benötigt werden, kann die Platte zwischen den Löchern mit PBS überflutet werden.
  6. Geben Sie 4,5 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 1× L-Glutamin und 10 % fetalem Kälberserum (FBS), hinzu, um die Zellen zu sammeln. Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler durch.
  7. Überführen Sie die benötigte Menge an Zellen (ausreichend für 1 × 105 Zellen pro Loch) plus 3 zusätzliche Löcher (für Pipettierfehler) in ein frisches Röhrchen und zentrifugieren Sie 2 min bei 500 × g.
  8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in dem erforderlichen Volumen an Leibovitz’s L-15-Medium (phenolfrei), ergänzt mit 10 % FBS und Endurazine Live Cell Substrate (1:200), um eine Endkonzentration von 1 × 106 Zellen/mL zu gewährleisten. Mischen Sie gründlich mit einer serologischen Pipette, um eine homogene Verteilung von Endurazine sicherzustellen. Pipettieren Sie 100 µL (1 × 105 Zellen) der resuspendierten Zellen pro Loch.
    HINWEIS: Bei Zeitverlaufsversuchen über 72 h erhöhen Sie das Volumen auf 200 µL, um Verdunstung zu vermeiden.
  9. Unmittelbar nach der Transfektion platzieren Sie die Zellen in einem Plattenreader (Luminometer), der auf 37 °C eingestellt ist. Nehmen Sie Messungen in regelmäßigen Abständen mit einer Integrationszeit von 1 s vor. Aufgrund der effizienten Komplementation des Systems ist das Signal bereits innerhalb weniger Minuten nachweisbar. Um eine genaue Basislinienmessung zu erhalten, muss dieser Schritt daher unverzüglich durchgeführt werden. Die Intervalle hängen vom Experiment und vom Gerät ab; in diesen Experimenten erwies sich jedoch ein Messintervall von jeweils 12 min bei 18-h-Zeitverläufen und von 48 min bei 72-h-Zeitverläufen als optimal. Für die Lumineszenzmessung ist kein Filter erforderlich; ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wurde jedoch bei Verwendung eines Filters von 530–540 nm beobachtet.
    HINWEIS: Ein Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-Signal wird von einem geteilten Luciferase-markierten eGFP erzeugt, weshalb ein Filter bei 530–540 nm sowohl ein lumineszentes als auch ein fluoreszentes Signal erfasst. Um die Erfassung von BRET zu vermeiden, verwenden Sie einen Filter bei 460–480 nm oder alternativ ein nicht-fluoreszierendes Protein wie MYL3 als Referenz.

4. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die Fold-changes in relativen Lumineszenzeinheiten (RLUs), indem Sie das Signal jeder Bedingung auf den ersten Zeitpunkt (t0, normiert auf den Mittelwert der technischen Replikate) beziehen, da das Signal zu Beginn des Assays dem Hintergrund entspricht.
  2. Verringern Sie die Variabilität zwischen biologischen Replikaten durch Normierung auf eine Kontrollbedingung.
  3. Wählen Sie die statistische Analyse für das Assay entweder als Einzelzeitpunkt oder als Fläche unter der Kurve (AUC) – abhängig von der zu beantwortenden Fragestellung.
    1. Verwenden Sie für einen Einzelzeitpunkt die Zeitpunkte, an denen die maximale Expression auftritt (dies ist abhängig vom Protein des Interesses, POI), sowie den Endzeitpunkt. Tragen Sie die in Schritt 4.1 berechneten RLUs zum jeweiligen Zeitpunkt (z. B. 240 min) auf und analysieren Sie sie mit einem geeigneten statistischen Test.
    2. Erfassen Sie die Dynamik der Proteinsynthese und des Abbaus, indem Sie die AUC entweder für einen bestimmten Zeitraum (z. B. t0 bis 240 min) oder für die gesamte Dauer des Assays (z. B. t0 bis Endzeitpunkt) berechnen. Normieren Sie den AUC-Wert jedes biologischen Replikats auf den Mittelwert der Referenz-mRNA, um ein Maß für die Fold-change in der AUC zu erhalten, das mit geeigneten statistischen Tests ausgewertet werden kann.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Kosteneffizienz dieses Protokolls zu optimieren. Beispielsweise wurde die IVT-Reaktion auf die Hälfte des vom Hersteller empfohlenen Volumens verkleinert, wobei sich zeigte, dass die erhaltene Ausbeute ausreicht, um die für in cellulo-Experimente benötigte Menge zu decken. Es ist zu beachten, dass die Länge und Komplexität der Sequenz die IVT-Ausbeute beeinflussen; eine erfolgreiche Protokolloptimierung sollte daher mindestens 50 µg mRNA pro IVT-Reaktion liefern. Ebenso wie IVT-Reaktionskits sind auch Capping-Reagenzien häufig sehr kostspielig. Da pro mRNA-Molekül lediglich eine Cap-Struktur benötigt wird, vermuten wir, dass die IVT-Reaktion eine Überschussmenge an Cap-Molekülen gegenüber der resultierenden Anzahl an mRNA-Molekülen enthält. Daher wurde untersucht, ob das Protokoll durch Titration der Menge an Capping-Reagenz, das der IVT-Reaktion zugesetzt wird, weiter optimiert werden kann. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abbildung 2 dargestellt. Es wurden 100 % (10 mM Cap endgültig), 50 %, 25 % oder 0 % (unkappt) des Capping-Reagenzes zu 10 µL IVT-Reaktionen hinzugefügt, und die resultierende eGFP-mRNA wurde in HEK293-Zellen transfiziert, die konstitutiv das komplementäre Heterodimer exprimieren. Als Normalisierungskontrolle wurde MYL3 (100 % kappt) ebenfalls transfiziert, da dieses endogene Gen, das für ein muskelangereichertes Strukturprotein kodiert, ähnliche Translationsdynamiken wie eGFP aufweist, jedoch ein Signal erzeugt, das dem anderer endogener Gene näherkommt3. In Übereinstimmung mit früheren Daten3 führte unkappierte eGFP-mRNA zu keiner Translation, vergleichbar mit der Mock-Kontrolle (Abbildung 2A). eGFP-mRNA, die mit 25 % oder 50 % des empfohlenen Capping-Reagenzes synthetisiert wurde, zeigte vergleichbare Expressionsniveaus wie die mit 100 % kappte mRNA (Abbildung 2A), ohne Unterschiede in den Flächen unter der Kurve (AUC-Werte) über den 18-stündigen Zeitverlauf (Abbildung 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unter diesen Bedingungen das Capping-Reagenz im Überschuss vorliegt und dass eine Verringerung seiner Konzentration die translationelle Ausbeute nicht beeinträchtigt, was auf eine ausreichende Cap-Inkorporation hindeutet. Die in Abbildung 2 dargestellten Ergebnisse gelten spezifisch für die verwendete Marke des Capping-Reagenzes und sollten für andere Reagenzien entsprechend optimiert werden.

Während Fortschritte in der Kap-Technologie und die Einbindung modifizierter Nukleotide die mRNA-Expression verbessert haben, haben sich durch die Entwicklung von mRNA-Design-Algorithmen weitere Verbesserungen ergeben. Diese Algorithmen konzentrieren sich darauf, die mRNA-Stabilität und die Codon-Nutzung zu optimieren, indem sie die minimale freie Energie (MFE) beziehungsweise den Codon-Anpassungsindex (CAI) verbessern. Um die Auswirkungen der Optimierung auf die mRNA-Expression zu testen, wurde LinearDesign9 verwendet. Dieser Algorithmus basiert auf der Eingabe eines Lambda-Werts, eines Skalierungsparameters in den Optimierungsformeln, der bestimmt, wie stark der Algorithmus entweder die MFE oder den CAI begünstigt. Dieselben Optimierungseinstellungen (d. h. derselbe Lambda-Wert) wurden auf vier Transkriptionsfaktoren angewandt – HAND2, GATA4, MEF2C und TBX5. Abbildung 3 untersucht die Auswirkungen der Optimierung auf die Translationsraten. Die Optimierung verbesserte die Werte sowohl für die MFE als auch für den CAI bei allen Transkriptionsfaktoren, wobei MEF2C die stärksten Veränderungen bei beiden Parametern zeigte (Abbildung 3A). Ein geteilter lumineszenter Marker wurde an das C-Terminus jedes Konstrukts angefügt, vorangestellt von einem GS-Linker, und mRNA wurde für alle vier Transkriptionsfaktoren sowohl in nicht optimierter als auch in optimierter Form synthetisiert. Um sicherzustellen, dass jede mRNA translatiert werden kann und ein Protein mit dem erwarteten molekularen Gewicht erzeugt, wurde das zellfreie Translationssystem aus Kaninchen-Reticulozyten-Lysat3 verwendet. Die resultierenden Proteine wurden mittels Western Blot aufgetrennt, wobei die enzymatische Untereinheit des geteilten Luciferase-Proteins und ein geeigneter Substrat zur Detektion des geteilten lumineszenten Markers eingesetzt wurden. Der Western Blot zeigte, dass die optimierten Formen weiterhin Proteine produzierten, die mit ihrem erwarteten molekularen Gewicht übereinstimmten (Abbildung 3B). HEK293-Zellen wurden mit den nicht optimierten oder optimierten Formen jedes Transkriptionsfaktors transfiziert, und Live-Zell-Aufnahmen wurden über 18 h durchgeführt. Bei allen 18-h-Experimenten wurden Messungen aus drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, und pro Wiederholungsexperiment wurden jeweils drei technische Wiederholungen pro Probe verwendet. Die Optimierung von HAND2 (Abbildung 3C) und GATA4 (Abbildung 3D) hatte keinen Einfluss auf die Expression (gemessen mittels ungepaarter Zweistichproben-t-Test), mit einer 1,07-fachen Zunahme bzw. einer 1,25-fachen Abnahme im Vergleich zu den nicht optimierten Formen. Im Gegensatz dazu führte die Optimierung von MEF2C (Abbildung 3E) und TBX5 (Abbildung 3F) zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Expression, mit einer 2,25-fachen (P = 0,0486, n = 3, ungepaarter Zweistichproben-t-Test) und 1,72-fachen (P = 0,0379, n = 3, ungepaarter Zweistichproben-t-Test) Steigerung der AUC gegenüber den jeweiligen nicht optimierten Versionen. Konsistent damit zeigen sich Unterschiede nicht nur in der Endpunkt-Expression, sondern auch in der Form und der Rate der Expressionskurven, was darauf hinweist, dass der Assay zeitabhängige Veränderungen in der Translationsdynamik auflösen kann. Um zu bestimmen, ob diese Erhöhung der Expression über einen längeren Zeitraum anhält, wurden HEK293-Zellen mit MEF2C-mRNA transfiziert und Aufnahmen über 72 h durchgeführt (Abbildung 3G). Wie bei den 18-h-Experimenten wurden Messungen aus drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, und pro Wiederholungsexperiment wurden jeweils drei technische Wiederholungen pro Probe verwendet. Ähnlich wie nach 18 h führte die optimierte MEF2C-Form zu einer signifikanten Erhöhung der Expression mit einer 2,5-fachen (P = 0,0061, n = 3, ungepaarter Zweistichproben-t-Test) Verbesserung der AUC im Vergleich zur nicht optimierten Version. Obwohl die Expression durch die Optimierung deutlich ansteigt, zeigen diese Ergebnisse, dass die Optimierung in diesem Fall den Abbauprozess über 72 h nicht verhindert, da beide MEF2C-Formen ab 24 h ähnliche Abbausteigungen aufweisen. Dieser Abbau ist wahrscheinlich auf den Abbau linearer mRNA und/oder auf Zellteilung zurückzuführen. Insgesamt verdeutlichen diese Ergebnisse das Potenzial von mRNA-Design-Algorithmen zur Verbesserung der mRNA-Expression; sie zeigen jedoch auch, dass die Optimierung abhängig vom jeweiligen Zielprotein (POI) durchgeführt werden muss.

figure-results-1
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die mRNA-Synthese und den Split-Lumineszenz-Tag-Assay in HEK293-Zellen. Um die In-vitro-Transkription (IVT) für den Split-Lumineszenz-Tag-Assay durchzuführen, stellen Sie sicher, dass das Plasmid einen RNA-Polymerase-Promotor (T7 oder SP6), 5’- und 3’-UTRs sowie die kodierenden Sequenzen für das Protein der Wahl, das mit einer kurzen Luciferase-Untereinheit HB (HiBiT) fusioniert ist, enthält. Das Plasmid wird mit einem restriktionsenzym, das an einer einzelnen Stelle schneidet, linearisiert und dient als Vorlage für die Poly-T-PCR, die anschließend als Template für die IVT verwendet wird. Die mRNA wird synthetisiert, mit Liposomen komplexiert und mittels Reverse-Transfektion in HEK293-Zellen eingeführt, die kontinuierlich die größere Luciferase-Untereinheit (LB) exprimieren, und kann unmittelbar in einen Plattenreader eingebracht werden, wo Live-Aufnahmen gemessen werden. Nach Abschluss des Experiments erfolgt die Datenanalyse zur Normalisierung und anschließenden statistischen Auswertung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Eine vierfache Verringerung der Kappliganden-Konzentration führt zu einem vergleichbaren Expressionsniveau von eGFP wie die volle Konzentration. (A) Kinetischer Assay an lebenden Zellen in HEK293-Zellen, die mit eGFP-mRNA transfiziert wurden, wobei unterschiedliche Konzentrationen des Kappliganden, MYL3 oder Mock verwendet wurden; die Daten wurden auf t0 normalisiert; die Punkte stellen den Mittelwert von mindestens drei biologischen Wiederholungen pro Zeitpunkt dar. (B) Die relativen Änderungen der Fläche unter der Kurve (AUC) über einen Zeitraum von 18 h, basierend auf mindestens drei biologischen Wiederholungen, wurden durch Normalisierung auf die Referenzprobe MYL3 ermittelt und mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys Test für multiple Vergleiche verglichen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt, wobei jeder Punkt den Mittelwert einer biologischen Wiederholung repräsentiert. ***P < 0,001. (eGFP – verbessertes grün fluoreszierendes Protein; AUC – Fläche unter der Kurve; RLU – relative Lumineszenzeinheiten) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Die Sequenzoptimierung verbessert die mRNA-Translation in einer POI-abhängigen Weise. (A) Die LinearDesign-Optimierung der mRNA-Sequenz führte bei jedem Transkriptionsfaktor zu einer Verringerung der Werte für die minimale freie Energie (MFE) und einer Erhöhung des Codon-Anpassungsindex (CAI). (B) RRL-Reaktionen wurden 120 Minuten lang mit mRNA durchgeführt, die nicht optimiertes oder optimiertes HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 oder keine RNA kodiert. Die resultierenden Proteine wurden für die Western-Blot-Analyse aufgearbeitet und mittels Chemilumineszenz nach Inkubation der Membran mit der enzymatischen Untereinheit im geteilten Luciferase-System und dem geeigneten Substrat detektiert. Lebende zelluläre kinetische Assays in HEK293-Zellen, die mit nicht optimiertem oder optimiertem HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E) oder TBX5 (F) sowie MYL3 und Mock transfiziert wurden. Die Daten wurden auf t0 normalisiert, und die Punkte repräsentieren den Mittelwert von drei biologischen Wiederholungen pro Zeitpunkt. Die relative Änderung der Fläche unter der Kurve (AUC) über einen Zeitraum von 18 Stunden für drei biologische Wiederholungen wurde durch Normalisierung auf die Referenzprobe MYL3 ermittelt und mittels ungepaarten t-Tests mit Welch-Korrektur verglichen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei jeder Punkt den Mittelwert einer biologischen Wiederholung repräsentiert. *P < 0,05. (G) Lebender zellulärer kinetischer Assay in HEK293-Zellen, die mit nicht optimiertem oder optimiertem MEF2C, MYL3 und Mock transfiziert wurden; die Daten wurden auf t0 normalisiert, die Punkte repräsentieren den Mittelwert von drei biologischen Wiederholungen pro Zeitpunkt. Die relative Änderung der Fläche unter der Kurve (AUC) über einen Zeitraum von 72 Stunden für drei biologische Wiederholungen wurde durch Normalisierung auf die Referenzprobe MYL3 ermittelt und mittels ungepaarten t-Tests mit Welch-Korrektur verglichen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei jeder Punkt den Mittelwert einer biologischen Wiederholung repräsentiert. **P < 0,01. (MFE – minimale freie Energie; CAI – Codon-Anpassungsindex; RRL – Kaninchen-Reticulozyten-Lysat; AUC – Fläche unter der Kurve; RLU – relative Lumineszenz-Einheiten) Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

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Das Gebiet der mRNA-Therapeutika hat sich in den letzten Jahren rasant entwickelt, wobei die Bedeutung der Sequenzgestaltung und -optimierung als entscheidender Schritt in der Entwicklungsphase hervorgehoben wurde. Erhebliche Anstrengungen konzentrierten sich darauf, computergestützte Werkzeuge zu entwickeln, um die effektivsten RNA-Strukturen und -Zusammensetzungen vorherzusagen, wobei der Sequenzoptimierung besondere Aufmerksamkeit gilt8,9. Obwohl diese Werkzeuge leistungsstark sind, bleibt die experimentelle Validierung dieser Designs ein wesentlicher Bestandteil des Verfahrens. Bisher erfolgte diese Validierung jedoch weitgehend mithilfe von Reportereiweißen wie GFP7, NanoLuc8 und dem SARS-CoV-2-Spikeprotein9 , die bereits äußerst stabile und hochgradig translatable Proteine darstellen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde ein geteiltes Luciferase-System in einen Arbeitsablauf integriert, um die Translationsdynamik in vitro transkribierter mRNA in HEK293-Zellen mit zeitlicher Auflösung zu untersuchen3 und um die Grenzen der Verwendung von Reportereiweißen bei der Detektion von Translationsänderungen nach mRNA-Engineering aufzuzeigen. Der vorliegende Artikel beschreibt die erforderlichen Schritte zur Durchführung dieses Assays, veranschaulicht, dass die IVT-Reaktion miniaturisiert werden kann und die Konzentration der 5’-Cap-Struktur ohne Auswirkungen auf die Translation reduziert werden kann, wodurch Kosten gesenkt werden. Aufbauend auf unseren früheren Beobachtungen betonen wir, dass ein ZI-abhängiger Ansatz zur mRNA-Sequenzoptimierung erforderlich ist, um eine erhöhte Expression zu erreichen.

Wie hier beschrieben, ist der Split-Lumineszenz-Tag-Assay eine relativ einfache Methode, die die messbare Analyse der mRNA-Translation mit mittlerer Durchsatzleistung ermöglicht und es Anwendern erlaubt, die zeitliche Expression ihres Proteins von Interesse (POI) in Echtzeit zu untersuchen. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte und Überlegungen, die notwendig sind, um robuste Ergebnisse zu erzielen. Zunächst hängen alle nachgeschalteten Ergebnisse von der Qualität der mRNA ab, die bereits bei der In-vitro-Transkription (IVT) und der Dekontamination der dafür verwendeten Geräte beginnt. Nach der Synthese ist die Lagerung der mRNA entscheidend: Sie sollte nach der Elution auf Eis gehalten werden; nach Bestätigung der mRNA-Größe wird die mRNA in Arbeitsportionen aliquotiert, um Freeze-Thaw-Zyklen zu vermeiden, und anschließend bei -80 °C gelagert. Zweitens ist die verwendete 96-Well-Platte von größter Bedeutung und muss zwischen Experimenten konsistent sein. Für dieses Protokoll muss sichergestellt werden, dass eine vollständig weiße 96-Well-Platte verwendet wird. Platten mit klarem Boden und weißen Wänden können verwendet werden, wenn die Beobachtung der Zellmorphologie erforderlich ist; diese führen jedoch zu einem deutlich schwächeren Signal, weshalb die beiden Plattentypen nicht austauschbar sind. Es wurde beobachtet, dass bei der Messung der Translation derselben mRNA in einer Platte mit klarem Boden und weißen Wänden das resultierende lumineszente Signal fünfmal geringer war als bei einer parallel durchgeführten Messung in einer vollständig weißen Platte. Dieser technische Hinweis kann sich bei der Untersuchung von Genen mit ineffizienter Translationsdynamik erheblich auswirken. Abgesehen von der Einführung von Inkonsistenzen in die Daten könnte die Signalreduktion die Detektion subtiler Unterschiede verhindern, die durch mRNA-Sequenz- oder Strukturveränderungen hervorgerufen werden. Drittens ist die Verwendung von L-15-Medium für diesen Assay entscheidend, da es die Zellviabilität unter Bedingungen ohne CO2-Zufuhr ermöglicht25, was Flexibilität bei der Wahl des Luminometers bietet. Außerdem verringert die Verwendung von phenolfreiem L-15 das Hintergrundsignal während der Lumineszenzmessung. Schließlich ist das Kultivieren und Messen der Lumineszenz bei 37 °C (oder den Kulturbedingungen des jeweiligen Zelltyps) wichtig. Die Durchführung des Experiments bei Raumtemperatur würde die Ergebnisse stark verändern, da die Translationselongationsrate reduziert ist26, wodurch die normalen Kinetiken nicht beobachtet werden können.

Die Vielseitigkeit des Designs von in vitro transkribierter mRNA kann auf den Syntheseprozess übertragen werden, was zahlreiche Modifikationen ermöglicht. Wie beobachtet wurde, kann die Konzentration der 5’-Cap-Struktur um das Vierfache reduziert werden, während weiterhin ein vergleichbarer Expressionsgrad erreicht wird, wodurch Forscher Kosten senken können. Obwohl die Cappungseffizienz nach der IVT nicht direkt gemessen wurde, würde ein zunehmender Anteil an nicht gecappter mRNA im IVT-Pool zu einem verringerten Signal führen, wie durch nicht gecappte mRNA gezeigt; dies wurde jedoch nicht beobachtet. Zudem, da eGFP ein relativ kleines Protein mit nur 27 kDa ist, sollte diese Modulation der Cap-Konzentration leicht auf größere Gene übertragbar sein, da es nach der IVT weniger Transkripte zu cappen gibt. Es existieren mehrere Cap-Analoga mit unterschiedlichen Methylierungsmodifikationen, die die Immunogenität3 und die Proteinsynthese27 beeinflussen. Zusätzlich kann der Cappungsprozess ko-transkriptionell (wie hier gezeigt) oder post-transkriptionell unter Verwendung des Vaccinia-Virus durchgeführt werden, was eine Cappungseffizienz von 100 %28 ermöglicht, jedoch zusätzliche Reinigungsschritte erfordert. Für die Labor-skalige Produktion von mRNA werden häufig Reinigungssäulen verwendet, da sie schnell und effizient sind, jedoch kostspielig. Ein günstigerer und vielseitigerer Ansatz ist die Fällung mit Lithiumchlorid, die zwar zeitaufwändiger ist, es dem Anwender aber ermöglicht, die mRNA zu konzentrieren und die Ausbeute nicht an die Bindungskapazität der Säule zu binden; daher eignet sie sich gut für die Hochskalierung. Wie die Reinigungssäulen entfernt auch dieser Ansatz doppelsträngige RNA und abgekürzte RNA-Fragmente nicht vollständig, die Immunogenität hervorrufen können29. Analog zur 5’-Cap-Struktur kann die Einbindung des poly(A)-Schwanzes auf alternative Weise erfolgen, als hier beschrieben. Ähnlich wie bei der PCR-basierten Einführung des Schwanzes kann die Plasmid-DNA so konstruiert werden, dass sie einen poly(A)-Schwanz enthält; diese langen Strecken können jedoch Rekombinationen unterliegen, was zu heterogenen und verkürzten poly(A)-Sequenzen führt. Die Segmentierung des poly(A)-Schwanzes – das Einfügen von heteronukleotidischen Abstandshaltern – hat diese Effekte jedoch minimiert30,31. Alternativ kann der poly(A)-Schwanz mithilfe einer templatesunabhängigen poly(A)-Polymerase erzeugt werden, was die Herstellung längerer poly(A)-Schwänze ermöglicht32, jedoch das Risiko einer Heterogenität birgt, die die regulatorischen Anforderungen beeinflussen kann33.

Obwohl der beschriebene Spalt-Lumineszenz-Tag-Assay äußerst effektiv zur Messung der Proteinexpression exogen zugeführter mRNA ist, gibt es einige Einschränkungen, die je nach Forschungsfrage berücksichtigt werden müssen. Erstens ist es notwendig, eine Zelllinie zu etablieren, die kontinuierlich eine Hälfte des gespaltenen Luciferase-Proteins exprimiert. Obwohl solche Zelllinien fertig erhältlich sind, beschränken sie sich derzeit ausschließlich auf HEK293-Zellen. Falls die Erzeugung einer stabilen Linie im gewünschten Zelltyp schwierig ist, existiert ein lytischer Assay, der nach unseren Beobachtungen vergleichbare Ergebnisse in HEK293-Zellen, humanen embryonalen Stammzellen und differenzierten Kardiomyozyten liefert3. Der für diesen lytischen Assay gewählte Zeitpunkt in der zuvor veröffentlichten Studie3 orientierte sich jedoch an den Live-Cell-Daten von HEK293-Zellen. Zweitens bietet der Assay eine zeitliche Auflösung an lebenden Zellen, jedoch keine räumliche Auflösung, was für bestimmte Forschungsfragen von Interesse sein könnte. Es steht jedoch ein Primärantikörper zur Verfügung, der sich gut für die fluoreszenzbasierende immunzytochemische Detektion des kurzen Luciferase-Peptid-Tags eignet, das in diesen Experimenten verwendet wird, und somit eine räumliche Analyse des übersetzten Zielproteins (POI) ermöglicht. Zusätzlich könnten Mikroskope, die zur lumineszenzbasierten Bildgebung fähig sind, Daten mit Einzelzellauflösung liefern. Ein Ansatz, der sowohl räumliche als auch zeitliche Informationen liefert, ist SunTag, welches aktive Translation und Lokalisation mittels Live-Cell-Bildgebung über Wechselwirkungen zwischen GFP-markierten scFv und Peptid-Epitopen misst14,34. Allerdings sind 24 tandemartige Wiederholungen dieser Epitope erforderlich, was die Translation möglicherweise stört, und der Workflow weist eine vergleichsweise geringe Durchsatzkapazität auf. Drittens ermöglicht der gespaltene lumineszente Tag die Messung der mRNA-Menge, jedoch nicht an lebenden Zellen. In unserer früheren Arbeit3 wurde eine qRT-PCR an extrahierter RNA mit primerspezifischen Sequenzen für den exogen zugeführten Transkript durchgeführt, um die mRNA-Konzentrationen hinsichtlich der Transfektionseffizienz zwischen Konstrukten sowie des Abbaus über verschiedene Zeitpunkte hinweg zu bestätigen. Ein anderer Ansatz nutzt die Northern-Blot-Analyse zur Bestimmung der mRNA-Stabilität35. Beide Methoden sind jedoch aufwendig und können keine kontinuierlichen Messungen bereitstellen. Derzeit existiert keine Methode, die simultane Messungen von mRNA-Translation und mRNA-Menge in lebenden Zellen ermöglicht, was eine mögliche Richtung für die Weiterentwicklung von Assays in diesem Bereich darstellt.

Das Split-Luciferase-System wurde ursprünglich zur Untersuchung von Proteindynamiken eingesetzt, doch hier zeigt sich, dass dieser Assay auch in anderen Forschungsbereichen bedeutende Implikationen hat. Angesichts der mRNA-Therapeutika, die bei neuen Ansätzen der Gentherapie im Vordergrund stehen, eignet sich dieser Assay hervorragend dafür, Forschenden die Charakterisierung der Expression ihres potenziellen Therapeutikums zu ermöglichen und diese zur Verbesserung der Expression zu optimieren. Wie bereits erwähnt, hat sich die Codon-Optimierung durch die Entwicklung mehrerer Werkzeuge8,9,36 zu einem leistungsfähigen neuen Instrument in der mRNA-Designstrategie entwickelt. Wurde ein einheitlicher Ansatz zur Sequenzoptimierung auf vier Transkriptionsfaktoren angewandt, verbesserte sich sowohl die MFE als auch die CAI für alle Gene, doch nur MEF2C und TBX5 wiesen eine erhöhte Expression auf. Bemerkenswerterweise ermöglicht dieser Ansatz durch die Detektion von Expressionsunterschieden, die allein auf synonymer kodierender Sequenzvariation beruhen, eine einzigartige Plattform, um die Translations-Effizienz in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Sequenzoptimierung den Ausgangs-GC-Gehalt, die Codon-Nutzung und die RNA-Sekundärstruktur abhängig vom jeweiligen POI berücksichtigen muss, um eine verbesserte Expression zu erreichen. Obwohl möglicherweise noch weitere Konstrukte getestet werden müssen, bietet der Split-Lumineszenz-Tag-Assay das Potenzial für Hochdurchsatzanalysen, um den optimalen Kandidaten für das POI zu identifizieren. Außerdem kann dieser Assay, wie zuvor gezeigt3, die Auswirkungen von Störungen jeglicher Sequenz- oder Strukturkomponente der mRNA messen und unterstreicht damit seine Anwendungsmöglichkeiten. Neben der Untersuchung von Veränderungen an der mRNA könnte der Split-Lumineszenz-Tag-Assay auch in der Forschung zu Abgabesystemen und Formulierungen eingesetzt werden. Selbst bei Verbesserungen an 5’-Caps und der Verwendung modifizierter Nukleotide benötigt exogen zugeführte mRNA ein Verpackungssystem, um den Abbau zu verhindern und die zelluläre Aufnahme zu ermöglichen37. Obwohl lipidbasierte Nanopartikel38, extrazelluläre Vesikel39 und biomimetische Systeme40 derzeit führend in der mRNA-Abgabe sind, ist weiterhin Entwicklungsbedarf gegeben. Die Einschließung von mit Split-Lumineszenz-Tags markierter mRNA in einen dieser Träger würde es ermöglichen, deren Abgabeeffizienz zu charakterisieren, und Forschenden erlauben, modifizierte Trägersysteme in mittlerer bis hoher Durchsatzkapazität zu testen. Abseits der translationsorientierten Forschung ist der Split-Lumineszenz-Tag-Assay leicht für die Grundlagenforschung biologischer Prozesse nutzbar. Egal, ob die Auswirkungen von Störungen in Sequenz- und Strukturelementen auf die mRNA-Translation untersucht werden, die Funktion der Translationsmaschinerie beeinträchtigt wird oder der Proteasom erforscht wird – das Split-Lumineszenz-Tagging-System stellt eine attraktive Option dar.

Insgesamt bietet das hier beschriebene System mit geteiltem lumineszentem Marker einen flexiblen und robusten Assay, um die zeitliche Expression von synthetischer mRNA-gesteuerten Proteinen als Messgröße für transkriptionelle Dynamik zu überwachen. Die Durchführung eines Assays an lebenden Zellen überwindet viele der früheren Einschränkungen im Bereich der mRNA-Translation und erschließt entscheidende Informationen über die Dynamik der Proteinsynthese und den Abbau des Zielproteins (POI). Da Transkripte unterschiedliche regulatorische Eigenschaften und Expressionsprofile aufweisen, ist es unerlässlich, das therapeutische Zielprotein (POI) genau zu charakterisieren, um die Weiterentwicklung von mRNA-Therapeutika und deren Übergang in die klinische Anwendung zu ermöglichen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Laura Itzhaki für die HEK293-LgBiT-Zelllinie. Diese Arbeit wurde durch einen Projektzuschuss und einen Translationspreis der British Heart Foundation (G114642 und G919651 an CHW) sowie durch ein Forschungsstipendium der GenScript Life Science Research Grant (CAPB) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSigma-AldrichA6283Bestandteil des TAE-Puffers
AgaroseSigma-AldrichA9539Gel-Elektrophorese
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalyzer zur Qualitätskontrolle von mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FPlattenlesegerät/Luminometer zur Messung der Lumineszenz
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-71135'-Cap für die IVT verwendet
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatThermo Fisher Scientific41966029Für die Kultur von HEK293-LgBiT-Zellen verwendete Medien
DNase INew England BiolabsM0303Degradiert die DNA-Vorlage nach der IVT-Reaktion
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichD8537Zum Waschen der Zellen und Hinzufügen zur Platte, um Verdunstung zu verhindern
EDTA, pH 8,0, RNase-freiThermo Fisher ScientificAM9260Bestandteil des TAE-Puffers
ÄthidiumbromidSigma-AldrichE1510Färbung für die Gelelektrophorese
Fetales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF7524Zusatz hinzugefügt zu DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Kit für die In-vitro-Transkription (IVT)
Leibovitzs L-15-Medium, ohne PhenolrotThermo Fisher Scientific21083027Medien, die für die Kultur von HEK293-LgBiT während der Lumineszenzmessungen verwendet wurden
L-GlutaminThermo Fisher Scientific25030-024Zusatz, der zu DMEM hinzugefügt wurde
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Lipidbasiertes Transfektionsreagenz
Lösung zur Fällung mit LithiumchloridThermo Fisher ScientificAM9480Alternative Methode zur mRNA-Reinigung nach IVT
Monarch Spin PCR && DNA-Aufreinigungs-KitNew England BiolabsT1130Reinigungs-Kit nach Plasmid-Linearisierung
NanoDrop One Mikrovolumen-UV-Vis-SpektrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpektralphotometer zur Quantifizierung der DNA- und mRNA-Konzentration
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratPromegaN2570Substrat, das für die Lumineszenz erforderlich ist, zu L-15-Medien hinzugefügt 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Reinigt mRNA nach der IVT-Reaktion
Nunc MicroWell 96-Loch, Nunclon Delta-behandelt, flachbodigThermo Fisher Scientific136101Platte zur Anzucht von HEK293-LgBiT und anschließenden Messungen
Opti-MEM Medium mit reduziertem SerumThermo Fisher Scientific31985062Medien, die für die Transfektionsreaktion verwendet werden
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553PCR-Kit
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993RNA-Leiter für die Gelelektrophorese
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020RNase-Entkontaminierungsspray
TRIZMA-BasisSigma-AldrichT6066Bestandteil des TAE-Puffers
Trypsin-EDTA-LösungSigma-AldrichT4174Zelldissoziationsreagenz
UltraPures, DNase/RNase-freies destilliertes WasserThermo Fisher Scientific10977035Wird zur Vorbereitung der Vorlage und für die In-vitro-Transkription (IVT) verwendet

Referenzen

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