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Methodenartikel

Zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten

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DOI:

10.3791/70844

⸱

12. Juni 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier geben wir Details zur Herstellung von Lysaten und zur Durchführung von In-vitro-Übersetzungen mit Drosophila-Embryonen .

Zusammenfassung

Die zellfreie mRNA-Translation in vitro spielte eine entscheidende Rolle beim Verständnis des Proteinsyntheseprozesses während der Genexpression bei Eukaryoten. Die Entwicklung von Lysaten aus verschiedenen Systemen für die In-vitro-Translation war maßgeblich daran beteiligt, die Rolle der meisten Komponenten der Translationsmaschinerie zu untersuchen und viele Schritte des Proteinsyntheseprozesses zu analysieren. Verschiedene Aspekte der Translation und translationalen Kontrolle wurden mit Drosophila melanogaster-Lysaten untersucht. Dieses Papier bietet detaillierte Protokolle zur Herstellung synthetischer mRNA-Vorlagen, zum Anbau groß angelegter lebender Fliegenkulturen, zur Herstellung translationsfähiger Lysate aus Drosophila-Embryonen und zur Durchführung zellfreier in-vitro-Translationsreaktionen . Dieses Protokoll ist für jede Art der Gattung Drosophila geeignet – Melanogaster, Virilis, Pseudoscura, Grimshawi, Hydei usw. Wir vergleichen dieses Protokoll weiter mit anderen Übersetzungssystemen und diskutieren Einschränkungen, kritische Schritte und Fehlersuche. Repräsentative Ergebnisse werden einbezogen, um die Leistung und Reproduzierbarkeit des Protokolls zu bewerten. Abschließend diskutieren wir mögliche Anwendungen in Biotechnologie und Forschung.

Einleitung

Seit über einem Jahrhundert erweist sich Drosophila als mächtiges, genetisch handhabbares Modellorganismus zur Untersuchung vieler biologischer Phänomene und Moleküle, darunter translationale Kontrolle und die Translationsmaschinerie 1,2,3,4. Die zellfreie In-vitro-Translation von Drosophila ist zu einem wirkungsvollen Werkzeug zur Untersuchung der Proteinsynthese geworden, da sie viele in vivo beobachtete Ereignisse wiederholen kann. Daher ist Drosophila ein ideales System zur Entdeckung neuer Funktionen und Moleküle, die Translation und translationale Kontrolle durchführen. Frühe Studien etablierten ein in vitro, translational kompetentes System im fliegerverwandten Arthropoden Artemia salina5 und später in Drosophila hydei6.

Später wurden in Drosophila melanogaster Lysate entwickelt, die auf exogene mRNAs reagieren. Die meisten Studien zur Drosophila-In-vitro-Translation wurden an Embryonen unterschiedlichen Alters durchgeführt, obwohl einige Varianten des Translationsreaktionspuffers von verschiedenen Forschungsgruppen verwendet wurden. Zum Vergleich sind die verschiedenen untersuchten Phänomene und die Translationsreaktionsbedingungen in Tabelle 1 aufgeführt. Neben Embryonen wurden auch Protokolle für zellfreie in-vitro-Translation mit Drosophila-Oocyten 10,22,23,24,25,26 und kultivierten Schneider- oder Kc-Zelllysaten entwickelt. Eine Beschreibung der für die In-vitro-Übersetzung erforderlichen Komponenten und ein Vergleich zwischen Lysaten verschiedener Arten sind in den Quellen33,34 beschrieben.

Obwohl der Prozess der mRNA-Translation über Eukaryoten erhalten bleibt, werden signifikante Unterschiede zwischen den Taxa meist im Beginnstadium der Translation festgestellt, wo verschiedene Moleküle die Translation während der Entwicklung auf taxon- oder artspezifische Weise unterdrücken oder fördern35,36. Dieses Protokoll eignet sich sehr gut zur Untersuchung der mRNA-Translation bei Insekten während der gesamten Entwicklung, für die Lysate von phylogenetisch entfernten Metazoen nicht verwendet werden können, einschließlich der kommerziellen Lysate aus Weizen oder Kaninchen. Tatsächlich kann dieses Protokoll die Translationsereignisse während der Embryogenese wiederholen, was bei der Verwendung von Ozytenlysaten23 nicht möglich ist. Bis heute wurde kein Vergleich zwischen Embryo-, Oocyten- und kultiviert-zelligen Drosophila-Systemen durchgeführt. Das Hinzufügen posttranslationaler Modifikationen zu den in vitro synthetisierten Proteinen ist eine Einschränkung dieses Protokolls in seinem aktuellen Zustand. Außerdem liefert diese Methode keine präparativen Proteinmengen im Vergleich zu Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine in Bakterien.

Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle, um routinemäßig großflächige Käfige von Drosophila-Fliegen zu züchten, synthetische mRNA-Vorlagen herzustellen, translationsfähige Lysate aus Embryonen herzustellen und zellfreie in-vitro-Translationstests durchzuführen. Die Materialübersicht zeigt die im gesamten Protokoll benötigten Reagenzien.

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Protokoll

1) Template-Plasmidkonstruktion für die In-vitro-Transkription

  1. Wählen Sie Plasmide, die eine 5' untranslate Region (UTR), einen Reporter-Cistron, einen 3' UTR und einen Poly(A)-Schwanz stromabwärts eines T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase-Promotors enthalten. Stellen Sie sicher, dass jedes Konstrukt eine eindeutige Restriktionsstelle unmittelbar stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes für die Plasmidlinearisierung vor der Transkription enthält (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die verwendete Restriktionsenzym-Stelle sollte sorgfältig ausgewählt werden, sodass die Erkennungsstelle außerhalb der transkribierten Sequenz liegt oder eine, die es der linearisierten DNA ermöglicht, in A zu enden. Außerdem sollte das Restriktionsenzym am 3'-Ende der Vorlage einen stumpfen oder 5' Überhang hinterlassen. 3'-Überhänge können zu aberranten Transkriptionsprodukten führen. Wenn ein Enzym mit einem Überhang von 3 Fuß verwendet wird, sollte das Fragment vor der Verwendung abgestumpft werden.
  2. Verifizieren Sie alle Konstrukte durch Sequenzierung, bevor Sie sie als Vorlagen für die In-vitro-Transkription verwenden.
    HINWEIS: Firefly luciferase (FLuc) Reporter-Konstrukte mit poly(A)71-Schwanz wurden für diesen Workflow verwendet. Die FLuc-Konstrukte leiten sich von der pLUC-Kassette12 ab. Vektor- und Bausatzinformationen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

2) In-vitro-Transkription von gekappten und polyadenylierten mRNAs

  1. Linearisieren Sie jedes Plasmid-Konstrukt mithilfe des eindeutigen Restriktionsstelles stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes (hier KpnI).
  2. Lösen Sie die linearisierte DNA durch eine 1%-Agarose-Gelelektrophorese bei 100 V für 1 Stunde auf.
  3. Gel-extraktionieren Sie die DNA und überprüfen Sie ihre Integrität sowie korrekte Linearisierung durch identische Agarose-Gel-Elektrophorese.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die linearisierte DNA zu gelreinigen – wenn die DNA vollständig geschnitten ist, reicht eine Säulenreinigung oder Phenol-Extraktion/ETOH-Fällung aus.
  4. Transkribiere die gereinigte, linearisierte DNA mit einem In-vitro-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Integrieren Sie ein 5'-Cap-Analogon in die Transkriptionsreaktion, um die RNA zu stabilisieren und die Translation zu stimulieren.
    HINWEIS: Ein funktionelles Cap-Analog, wie etwa m7G(5′)ppp(5′)G RNA, unterstützt die Stabilisierung und Translationsstimulation des Transkripts. Ein nicht-funktionales Cap-Analog, wie G(5′)ppp(5′)A, unterstützt Transkriptstabilisierung, aber keine Translationsstimulation. Dieser Translationshemmer wird verwendet, wenn bicistronische Transkripte transliert werden, um das Vorhandensein interner Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) zu testen, die die Translation des zweiten Cistron7 antreiben. Um die Abhängigkeit eines Poly(A)-Schwanzes zu testen, kann dieser vor der Transkription im Template-Plasmid gelöscht werden.
  5. Behandle alle Transkriptionsreaktionen mit RNase-freiem DNase, um die DNA-Vorlage nach der Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers zu entfernen. Alle in-vitro-Transkriptionskits liefern das RNase-freie DNase.
  6. Reinigen Sie das Transkript durch Lithiumchlorid-Präzipitation oder säulenbasierte RNA-Reinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Alle In-vitro-Transkriptionskits liefern die Lithiumchlorid-Reagenzien.
  7. Quantifizieren Sie das gereinigte Transkript mittels Spektroskopie und bewerten Sie die mRNA-Integrität mit einer 1%-Agarose-Gelelektrophorese bei 100 V für 1 Stunde.
  8. Aliquot die mRNA und bis zur Verwendung bei -70 °C lagern.

3) Routinemäßige Pflege einer großflächigen Drosophila-Kultur

  1. Verwenden Sie die Referenz Drosophila melanogaster Wildtyp-Stamm Oregon-R.
  2. Bereite Fliegenfutter nach einem festgelegten Referenzrezept zu.
    HINWEIS: Die Autoren haben das Bloomington Drosophila Stock Center Rezept37 als Referenz für die Zubereitung verwendet. Details zu diesem Rezept sind in Tabelle 237 aufgeführt. Abbildung 2 zeigt den gesamten Arbeitsablauf von der Embryoentnahme bis zur Quantifizierung der Luciferase-Aktivität.
  3. Stellen Sie einen kubischen oder zylindrischen Acrylkäfig auf, der etwa 1 m lang und 50 cm im Durchmesser ist.
  4. Mach ein Loch mit etwa 30 cm Durchmesser im oberen Teil des Käfigs und versiegele es mit einem Netz (Abbildung 3).
  5. Lege nasses Papier auf das Netz, um den Fliegen Wasser zu geben, und ersetze das nasse Papier täglich (Abbildung 3).
  6. Halten Sie den vorderen Teil des Käfigs offen und mit Stoff bedeckt, um Zugang zum Inneren des Käfigs zu ermöglichen. Klebe Acryl auf die Rückseite des Kunststoff-Fliegenkäfigs, komplett versiegelt.
  7. Verstärkt den Fliegenbestand vor der Embryoentnahme und setzt ~1.000 junge Fliegen in den Käfig. Halten Sie den Käfig der Fliegen konstant bei 22–25 °C.
    HINWEIS: Mehrere Fliegenkäfige mit gleicher Größe und Fliegendichte können gleichzeitig gepflegt werden. Fliegen legen etwa 15 Tage lang Eier ab und beginnen ab Tag 20 zu sterben.
  8. Füttere die Fliegen jeden Tag mit Agar-Fruchtsaft-Tellern, garniert mit einem Löffel rehydrierter Bäckerhefe mit 200 μL Essigsäure oder -essig.
  9. Um die nächste Fliegengeneration zu etablieren, sammeln Sie mehrere Platten von 0–12 Stunden alten Embryonen. Platzieren Sie die Embryonen in 22 cm × 17 cm × 10 cm große Plastikboxen mit Fliegenfutter in einer Tiefe von 3 cm. Stellen Sie sicher, dass die Boxen ein Loch mit Gitter verschlossen haben, um Luftzirkulation zu ermöglichen und das Entkommen der Larven zu verhindern (Abbildung 4). Füge trockene aktive Hefe auf das Futter und lasse die Embryonen bei 25 °C wachsen.
  10. Nach 3 Tagen legt man gefaltetes 5 cm hohes Papier in die Schachteln, damit die Larven des dritten Stadiums hochklettern und Puppen werden können.
  11. Nach 10 Tagen werden die Kisten mit frisch geschlüpften erwachsenen Fliegen in den Käfig gesetzt. Lass die Fliegen die Boxen verlassen und sich zwei Tage lang im Käfig paaren.
  12. Um Embryonen eines bestimmten Alters für die Lysatpräparation zu erhalten, öffnen Sie den Käfig sorgfältig und legen Sie Agar-Saftplatten für die erforderliche Eiablage in den Käfig.
  13. Nehmen Sie die Teller heraus und sammeln Sie die Eier mit einem Haufen Sieb.
    HINWEIS: Für 0–12 h-alte Embryolysate werden um 8:00 Uhr zwei Agar-Saftplatten in den Käfig gelegt und um 20:00 Uhr zur Embryoentnahme entnommen.
    1. Sammeln Sie Embryonen zur Lysatpräparation zwischen Tag 3 und 10 nach dem Schlüpfen der erwachsenen Fliegen.
    2. Parallel dazu werden Embryonen an den Tagen 2–4 gesammelt und eine neue Generation von Fliegen in nahrungsmittelhaltigen Boxen wie oben beschrieben etabliert.

4) Herstellung von Translationslysaten aus 0–12 h-alten Drosophila-Embryonen

HINWEIS: Dieses Protokoll beinhaltet keine Behandlung mit Mikrokokkalnuklease. Dieser Schritt wurde weggelassen, um eine mögliche Degradierung der exogenen Reporter-mRNA zu vermeiden, falls die Nuklease-Inaktivierung unvollständig ist. Die Hintergrundtranslation sollte in jedem Experiment mit einer No-mRNA-Kontrolle überwacht werden.
HINWEIS: Diese Methode leitet sich aus den zuvor beschriebenen Protokollen 7,12,14,15,16,17,22 ab.

  1. Bereiten Sie den Embryo-Lysepuffer wie in Tabelle 2 beschrieben vor und lagern Sie ihn bei -20 °C in 1 mL Aliquot.
    HINWEIS: Tauen Sie jeden Aliquot bis zu 2x für die sofortige Nutzung auf.
  2. Sammeln Sie Embryonen mit einem Sieb.
    HINWEIS: Das Standardprotokoll verwendet 0–12 h-alte Embryonen, aber auch andere Embryoalter können für die Lysatpräparation geeignet sein.
  3. Waschen Sie die Embryonen ausgiebig mit Leitungswasser und anschließend mit einem Embryopuffer mit 0,9 % NaCl + 0,03 % Triton X-100.
    HINWEIS: Embryonen können bis zu 24 Stunden bei 4 °C vor der Verarbeitung gelagert werden.
  4. Dechorionieren Embryonen für 5 Minuten in 50 % Embryopuffer und 50 % Hausbleichmittel (Natriumhypochlorit [NaOCl] 4–6 % und Natriumhydroxid [NaOH] 0,02–0,1 %).
    VORSICHT: Verwenden Sie Handschuhe und transparente Kunststoffbrillen beim Umgang mit Bleichmittel.
  5. Waschen Sie ausgiebig mit Leitungswasser. Trockne die Embryonen mit Papier und wiege sie.
  6. Übertrage verpackte Embryonen in einen Glasgewebe-Schleifer auf Eis. Fügen Sie 1 ml Embryo-Lysepuffer pro 1 g Embryonen hinzu. Homogenisiere die Embryonen auf Eis mit 20 Schlaganfällen.
  7. Übertragen Sie das Homogenat auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren. Zentrifugiere bei 15.900 × g für 20 Minuten bei 4 °C.
  8. Die Interphase wird in 50 μL Aliquots auf Eis zurückgewonnen. Aliquots in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Die Interphase ist eine trübe flüssige Lösung zwischen der oberen und unteren Phase. Die obere Phase ist eine Schicht hochviskoser, undurchsichtiger weißer Lipide. Die untere Phase ist ein festes Pellet.
    VORSICHT: Vermeiden Sie eine Kontamination der Zwischenphasenlösung durch benachbarte Phasen.
    VORSICHT: Verwenden Sie Handschuhe und transparente Kunststoffbrillen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.

5) In-vitro-Translationsreaktion

  1. Richten Sie die Translationsreaktionen in einer 96-Well-Platte oder in einzelnen 0,2-mL-PCR-Röhren auf einem PCR-Thermocycler ein. Bereite jede Translationsreaktion in einem finalen Volumen von 17 μL vor, einschließlich 5 μL Embryolysat und der übrigen Reaktionskomponenten, die in Tabelle 2 beschrieben sind.
    HINWEIS: Embryo-Lysat macht 30 % des gesamten Reaktionsvolumens aus.
  2. Wenn rekombinante Proteine zur Translationsreaktion hinzugefügt werden, dialysieren Sie das Protein gegen 20 mM HEPES-KOH pH 7,4. Wählen Sie das Dialysekassettenvolumen und die molekulare Gewichtsgrenze entsprechend dem Probenvolumen und der Proteingröße aus.
    HINWEIS: Die Zugabe rekombinanter Proteine ist relevant für die Untersuchung translationaler Repressoren oder dosisabhängiger Tests mit Initiationsfaktoren. Vermeiden Sie es, PBS zu rekombinanten Proteinen hinzuzufügen, die in der Translationsreaktion verwendet werden. Glycerol in der Proteinprobe oder Translationsreaktion bei 5 % oder darunter halten. Wenn möglich, vermeiden Sie es, der Reaktion Glycerol hinzuzufügen.
  3. Denaturieren Sie die mRNA durch Erhitzen auf 65 °C für 2 Minuten und schnelles Abkühlen auf Eis für 2 Minuten vor der in-vitro-Translationsreaktion .
  4. Führen Sie eine Translation jeder mRNA in dreifacher Ausführung durch. Richten Sie die Reaktion wie folgt auf: 2,7 μL Reaktionscocktail (Tabelle 2) + 5 μL Embryolysat + mRNA (30 ng) + H2O bis 17 μL Endvolumen. Als Basis-Master-Mischung folgen Sie dem Reaktionscocktail für eine Reaktion in Tabelle 2 und skalieren Sie entsprechend der Anzahl der durchzuführenden Reaktionen. Die Reaktion 60 Minuten bei 25 °C inkubieren lassen.
    HINWEIS: ATP und GTP werden nicht getrennt zur hier beschriebenen Standardreaktion hinzugefügt. In unseren Händen verbesserte die Ergänzung der Reaktion mit zusätzlichem ATP/GTP die FLuc-Ausgabe nicht und reduzierte die Translation unter den getesteten Bedingungen. Daher wird die Reaktion mit dem in Tabelle 2 beschriebenen Energieregenerationssystem ohne zusätzliche Nukleotidergänzung durchgeführt.
  5. Programmieren Sie den Thermocycler mit einem Anfangsschritt von 5 Minuten bei 4 °C, gefolgt von 60 Minuten bei 25 °C und einem letzten Schritt von 10 Minuten bei 4 °C.
  6. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 20 μL kalten 1× passiven Lysepuffer hinzufügen. Lege die Reaktion für weitere 10 Minuten auf Eis.
  7. Lagern Sie die Proben bei -20 °C oder machen Sie mit der Quantifizierung der Luziferase.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

6) Quantifizierung der synthetisierten Luziferase

  1. Bringen Sie die Reaktionen für 20 Minuten auf Raumtemperatur, bevor Sie die Aktivität quantifizieren.
  2. Bringen Sie 10 μL jeder Translationsreaktion und 50 μL Luziferasesubstrat (mindestens 2 Stunden vor der Verwendung) auf Zimmertemperatur.
  3. Füge das Luziferase-Substrat zur Translationsreaktion hinzu. Erfassen Sie relative Lichteinheiten mit einem automatischen oder manuellen Luminometer. Programmieren Sie das Luminometer so, dass es 10 Messwerte im Abstand von 1 Sekunden macht.

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Ergebnisse

Wir führten Translationsreaktionen durch, um die Effizienzvariabilität zwischen sechs unabhängigen Lysatpräparaten (d. h. biologische Wiederholungen) mit 0–12 H alten Embryonen zu analysieren. Jeder Takt stellt ein technisches Dreifach dar (Abbildung 5). Eine ähnliche translationale Effizienz wurde beobachtet, wenn auch mit gewisser Variabilität. Wir verglichen außerdem die Übersetzungseffizienz zwischen Embryonen unterschiedlicher Altersgruppen. So testeten...

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Diskussion

Drosophila-Lysate für zellfreie In-vitro-Translation können reproduzierbare Ergebnisse liefern. Embryonen unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Pufferzusammensetzung wurden verwendet, um eine Vielzahl grundlegender Phänomene in der Proteinsynthese und ihrer Maschinerie zu untersuchen (Tabelle 1). Hier beschrieben wir eine Standardmethode, die für Embryonen jeden Alters geeignet ist, um Studien präzise und quantitativ durchzuführen (

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

N.B-Á und G.H. wurden durch das intramurale Förderprogramm des Nationalen Krebsinstituts (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), Mexiko, unterstützt; D.E.V. ist Posdoktorand des Programms der Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". Wir danken Fannis Missirlis und Bety Osorio (CINVESTAV, Mexiko) für die Fliegen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AluminiumfolieReynoldsN/AStandard Haushaltsaluminiumfolie; jede gleichwertige kommerzielle Marke akzeptabel.
AminosäurenmischungPromegaL4461N/A
ApfelessigHeinzN/AKommerzieller Apfelessig (5% Säure); jede gleichwertige Marke akzeptabel.
Apfel- oder TraubensaftJumexN/AKommerzieller Traubensaft; oder jede gleichwertige kommerzielle Marke.
Bakteriologischer Agar Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Borsäure (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Molecular Biology Grade, ≥99.5%, Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.
Kappe: Anti-Reverse-Cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA-KappenstrukturBioLabsS1411SN/A
Kappe: m7G(5')ppp(5')G RNA-KappenstrukturanalogNew England BiolabsS1404SN/A
Kappe: Nicht-funktionelles Kappenanalogon G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Zentrifugenröhrchen (15 ml)Corning 430053N/A
Vollständiger, EDTA-freier ProteasehemmercocktailRoche11836170001N/A
Creatinphosphokinase aus KaninchenmuskelMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatinphosphorsäure, DinatriumsalzMerck1120A47950N/A
Dehydrierte BäckergärhefeFleischmann'sN/AKommerzielle aktive Trockenhefe; jede gleichwertige Marke akzeptabel.
Diethylpyrocarbonat Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Konzentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster Wildtypstamm Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; Mutantenstämme von Drosophila melanogaster sowie Wildtyp-Referenzstämme anderer Drosophila-Arten, wie virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, usw. werden ebenfalls von diesem Stock Center bereitgestellt.
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS-Reagenz, 99,4-100,6%, Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.
HEPESSigmaSLBH4583V99,5%(Titration)
Wasserstoffperoxid (H2O2)EquateN/AKommerziell (~2,5-3,5% Wasserstoffperoxidlösung; jede gleichwertige Marke akzeptabel.
In-vitro-Transkriptions-mMessage-mMachine-T7-, T3- oder SP6-KitThermo Fisher ScientificAM1344 und AM1348N/A
KOAc, auch als KCH3COO bezeichnetMerck/Sigma-AldrichMehrereN/A
Lb-Bouillon (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Luzernase-Assay-SystemPromega E1501N/A
MAXIscript T7, T3 oder SP6 in-vitro-Transkriptions-KitInvitrogenAM1316 und AM1312N/A
Mg(OAc)2, auch als Mg(CH3COO)2 bezeichnetMerck/Sigma-AldrichMehrereN/A
NaCl (Natriumchlorid)J.T Baker B17W53ACS-Reagenz
OligonucleotideJede FirmaN/ASequenzspezifisch.
Pasive Lysis 5X-PufferPromegaE1941N/A
PipettenspitzenAxygenT-200-Y200 Mikroliter gelbe Spitzen.
PipettenspitzenAxygenT-1000-B1ml blaue Spitzen.
Pipettenspitzen AxygenT-3000,5-10 Mikroliter klare Spitzen.
PropionsäureMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS-Reagenzgrad, ≥99,5%, flüssig.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder  PYREX®  7724-5N/A
QIAprep Spin Plasmid Miniprep KitQiagen27106N/A
QIAquick GelextraktionskitQiagen28704N/A
Kaninchenretikuozytenlysat (RRL)Promega L4960N/A
Renilla-Lucerase (RLuc)-Assay-SystemPromega E2820N/A
RNasin-Ribonuclease-InhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy Minielute RNA Clean up KitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer-DialysekassettenThermo Scientific87735 (Es hängt jedoch von der molekularen Größenabtrennung ab).N/A
Natriumhypochlorit (Bleach)CloroxN/AKommerzielle Bleiche (~5-6% NaOCl); jede gleichwertige kommerzielle Marke mit ähnlicher Konzentration akzeptabel.
SpermidinMerck85558N/A
EdelstahlsiebN/AN/AJeder kommerzielle Lieferant.
Taq plus Precision DNA-PolymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer-Ribonucleinsäure (tRNA) aus Rinderleber Typ XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 oder R4752N/A
Tris (Tris-Base)IBI ScientificIB70145Molecular Biology Grade Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.
Triton X-100SigmaSLBX9437Labor

Referenzen

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