Ein kostengünstiger, markerloser DeepLabCut-basierter Workflow für spontane Gang- und Lokomotionsanalyse bei frei bewegenden Mäusen

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen kostengünstigen, markerlosen Workflow mit DeepLabCut, um spontanen Gang und Fortbewegung bei frei bewegenden Mäusen zu quantifizieren. Dieses Protokoll integriert Einzelkamera-Videoaufnahme, markerlose Verfolgung anatomischer Orientierungspunkte und die Extraktion räumlich-temporaler Lokomotorikparameter und bietet so einen nicht-invasiven und zugänglichen Rahmen für die Analyse des motorischen Verhaltens ohne spezielle Ausrüstung.

Zusammenfassung

Gait ist ein weit verbreiteter funktioneller Biomarker zur Erkennung motorischer Veränderungen bei verschiedenen Krankheiten und Zuständen, da er Veränderungen in Koordination, Kraft, Gleichgewicht und sensorimotorischer Integration widerspiegelt. Traditionelle Methoden zur Analyse des Gangs in Tiermodellen erfordern jedoch oft teure Ausrüstung, komplexe Einrichtungen oder invasive Verfahren, die das natürliche Verhalten verändern können. Hier präsentieren wir einen kostengünstigen, markerlosen Workflow basierend auf DeepLabCut, einer Open-Source-Pose Estimation-Software, zur quantitativen Analyse von Gang und spontaner Fortbewegung bei frei bewegenden Mäusen. Die Methode basiert auf Einzelkamera-Videoaufnahme, markerloser Verfolgung anatomischer Orientierungspunkte und der Extraktion von raumzeitlichen Lokomotorparametern, ohne physische Markierungen oder spezielle Hardware. Um die Anwendbarkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurde es im dreifach-transgenen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit (3xTg-AD) als repräsentatives Anwendungsbeispiel implementiert. Dieser Ansatz bewahrt die freie Bewegung und minimiert handhabungsbedingten Stress, wodurch eine nicht-invasive Beurteilung des motorischen Verhaltens möglich ist. Das Protokoll ist mit Standard-Verhaltenstestumgebungen kompatibel. Insgesamt bietet diese Methode einen zugänglichen und nicht-invasiven Rahmen für die quantitative Analyse von Gang und Fortbewegung in präklinischer Forschung.

Einleitung

Gang ist ein komplexer motorischer Prozess, der aus der Echtzeit-Wechselwirkung von motorischen, sensorischen und kognitiven Systemen entsteht und eine koordinierte Verarbeitung von sensorischem Feedback, Haltungskontrolle, motorischer Planung und Muskelaktivierung erfordert, um stabile, adaptive Bewegungen^zu erzeugen. Aufgrund dieser integrativen Natur werden Gangveränderungen zunehmend als funktionelle Indikatoren für neurologische Dysfunktion sowohl in der klinischen Praxis als auch in der experimentellen Forschung anerkannt. In menschlichen und tierischen Modellen ermöglicht die Ganganalyse die Erkennung von Veränderungen in Mobilität, Sturzgefahr, Gebrechlichkeit und funktioneller Kapazität und wurde als Biomarker für Krankheitsprogression und Wirksamkeit der Intervention bei mehreren Zuständen vorgeschlagen ^2,3,4.

In der Basisforschung, insbesondere in Mausmodellen, stellt die Bewertung des spontanen Ganges und der Lokomotorik eine weit verbreitete Strategie dar, um motorische Phänotypen zu charakterisieren und die Auswirkungen physiologischer Störungen und therapeutischer Interventionen zu bewerten. Die objektive Quantifizierung von Lokomotorparametern ermöglicht die Erkennung subtiler motorischer Veränderungen, die nicht zuverlässig nur durch visuelle Inspektion erfasst werden – eine Einschränkung, die besonders in präklinischen Studien mit frühen oder milden Phänotypen⁵ relevant ist. In diesem Zusammenhang hat sich die Ganganalyse als wertvolles Werkzeug erwiesen, um Veränderungen im motorischen Verhalten zu untersuchen und funktionelle Veränderungen im Zusammenhang mit verschiedenen experimentellen Erkrankungen wie neurologischen und neurodegenerativen^Erkrankungen zu identifizieren.

Die Analyse von motorischem Verhalten und Gang in Mausmodellen stützte sich traditionell auf spezialisierte technologische Plattformen, die zur Quantifizierung räumlicher und zeitlicher kinematischer Variablen entwickelt wurden. Systeme wie beleuchtete Gehwege, instrumentierte Plattformen und kommerzielle Bewegungsverfolgungssoftware werden häufig verwendet; Ihre Abhängigkeit von teurer Hardware und dediziierter Infrastruktur schränkt jedoch den Zugang für viele Labore^erheblich ein. Über wirtschaftliche Erwägungen hinaus bringen diese Ansätze zusätzliche experimentelle Einschränkungen mit sich. Mehrere Systeme erfordern, dass Tiere enge Korridore oder stark beleuchtete Fahrspuren durchqueren und erzwungene Bewegungsmuster erzeugen, die spontanes Verhalten verringern, während andere auf physische Markierungen, Farbflecken oder Klebeetiketten an den Gliedmaßen angewiesen sind. Solche Interventionen können Stress auslösen, die Gangmechanik verändern und die physiologische Interpretation motorischer Ergebnisse verhindern^. Diese Einschränkungen unterstreichen zusammen die Notwendigkeit von Methoden, die den Gang unter natürlichen, frei bewegenden Bedingungen ohne invasive Verfahren oder teure Infrastruktur erfassen können.

Die Bewertung des Gangs während uneingeschränkter Fortbewegung ermöglicht die Beobachtung natürlicher motorischer Muster und vermeidet äußere Einschränkungen, die künstlich Geschwindigkeit, Flugbahn oder Haltung regulieren. Dieser Ansatz erleichtert die Charakterisierung des Bewegungsverhaltens unter minimal eingeschränkten Bedingungen. DeepLabCut ist ein Open-Source-basiertes, auf Deep-Learning basierendes Pose-Schätzungsframework, das konvolutionelle neuronale Netzwerke nutzt, um benutzerdefinierte anatomische Orientierungspunkte ohne physische Markierungen zu verfolgen. Durch die Ermöglichung anatomischer Punktverfolgung aus Standardvideoaufnahmen ermöglicht DeepLabCut die Extraktion kinematischer Parameter und reduziert dabei erheblich Kosten und experimentelle Komplexität 15,16,17,18. Wichtig ist, dass markerloses Tracking experimentelle Interferenzen minimiert und daher für Studien zum spontanen Verhalten geeignet ist. Dieser markierungslose Ansatz ohne Einzelkamera eignet sich am besten für Studien, die eine zugängliche, nicht-invasive Quantifizierung der spontanen Lokomotorik und zweidimensionaler gangbezogener Merkmale unter frei bewegenden Bedingungen erfordern. Allerdings sind instrumentierte Gangplattformen oder dreidimensionale Motion-Capture-Systeme erforderlich, wenn direkte biomechanische Variablen wie Bodenreaktionskräfte, Plantardruck, Gelenkwinkel oder vollständige dreidimensionale Gliedmaßenkinematik benötigt werden.

Ziel dieses Artikels ist es, einen kostengünstigen, markerlosen Workflow auf Basis von DeepLabCut für die nicht-invasive Quantifizierung von Gang und spontaner Fortbewegung bei frei bewegenden Mäusen zu präsentieren, wobei eine Einzelkamera-Videoaufnahme, anatomisches Meilenmarken-Tracking und die Extraktion von raumzeitlichen Lokomotorparametern in einem zugänglichen Workflow integriert wird, der keine spezialisierte Hardware oder invasive Manipulation erfordert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die methodische Implementierung und repräsentative Ergebnisse des Workflows.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Bioethikkomitee des Instituts für Neurobiologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko gemäß Protokollnummer 117 genehmigt.

1. Studienkontext

1. Verwenden Sie Mäuse unter den experimentellen Bedingungen, die für die Studie erforderlich sind. In diesem Protokollartikel verwenden wir das dreifach-transgene Mausmodell der Alzheimer-Krankheit (3xTg-AD), das die Transgene APPSwe und tauP301L auf einem PS1M146V Knock-in-Hintergrund beherbergt, zusammen mit nicht-transgenen Mäusen als Kontrollgruppen, als repräsentatives Beispiel für Workflow-Implementierung.
2. Genotypisieren Sie alle Tiere vor Beginn der Studie.
3. Pflegen Sie Mäuse mit Futter und Wasser ad libitum unter kontrollierten Bedingungen mit einem 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus, einer Temperatur von 22 °C ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % ± 5 %, unter tierärztlicher Aufsicht.
4. Führen Sie während der Lichtphase nach einer 60-minütigen Gewöhnungsphase Aufnahmen durch, wobei pro Tier nur eine offene Feldsitzung verwendet wird, um spontanes Erkundungsverhalten zu bewahren und reduzierte Aktivitäten durch wiederholte Exposition in der Arena zu vermeiden.
   HINWEIS: In diesem Protokollartikel präsentieren wir repräsentative Aufzeichnungen, die ausschließlich den Arbeitsablauf sowie die Art der von der Methode erzeugten Bewegungs- und Gangausgänge veranschaulichen, anstatt biologische Vergleiche zwischen Gruppen zu unterstützen.

2. Materialien

1. Wirverwenden die Materialien und Ausrüstungen, die in der Tabelle der Materialien und Ausrüstung aufgeführt sind, zur Aufzeichnung und Analyse spontaner Fortbewegung und Gangart. Siehe Abbildung 1 für die Gesamtmontage des experimentellen Setups.

3. Gewöhnung und Aufzeichnung spontaner Fortbewegung

1. Tiervorbereitung und Gewöhnung
   1. Bringen Sie die Maus vorsichtig mindestens 60 Minuten vor dem Experiment aus ihrem Unterbringungsraum in den Verhaltenstestraum, um eine Umweltgewöhnung zu ermöglichen.
   2. Halten Sie den Verhaltenstestraum unter kontrollierten Umgebungsbedingungen, einschließlich einer konstanten Temperatur von 20 °C–22 °C, standardisierter Lichtintensität (120–150 Lux gemessen auf Arenaniveau) und kontinuierlichem weißem Rauschen zur Minimierung äußerer akustischer Reize.
   3. Während der Gewöhnungsphase sollten Sie das Tier in seinem Hauskäfig halten, ohne zusätzliche Reize oder Beschäftigung einzuführen. Tiere gemäß institutionellen Tierschutzrichtlinien behandeln, um stressbedingte Verhaltensvariabilität zu minimieren.
   4. Führen Sie das Tier mit sauberen Handschuhen und langsamen, bedachten Bewegungen. Heben Sie das Tier vorsichtig an der Schwanzbasis an und stützen Sie den Körper mit der gegenüberliegenden Hand, bevor Sie es in die offene Feldarena legen.
      Hinweis: KRITISCHER SCHRITT: Inkonsistenter Umgang oder unzureichende Gewöhnungszeit können angstbedingte Verhaltensweisen verstärken und Variabilität der Lokomotorikparameter einführen. Stellen Sie identische Gewöhnungsverfahren bei allen Tieren und Sitzungen sicher.
2. Freifeld-Arena und Kameravorbereitung
   1. Vor jeder Aufnahmesitzung reinigen Sie die Acryl-Openfield-Arena gründlich mit 70 % (v/v) Ethanol, um Rückstände und vorherige Dufthinweise zu entfernen. Lassen Sie die Oberfläche vor der Anwendung vollständig trocknen.
   2. Behandle 70 % Ethanol in einem gut belüfteten Bereich, halte es von Wärme oder Zündquellen fern und lass die Arena vor der Nutzung vollständig trocknen.
   3. Stellen Sie die offene Feldarena sicher auf die Holzplattform und stellen Sie sicher, dass die Struktur stabil und vibrationsfrei ist.
   4. Überprüfen Sie die transparenten Acrylwände und die matten Bodenoberfläche, um sicherzustellen, dass sie frei von Staub, Feuchtigkeit oder reflektierenden Rückständen sind, die die Videoaufnahme beeinträchtigen könnten.
   5. Positionieren Sie außen seitliche weiße Lichtlampen auf beiden Seiten der Arena in einem ungefähren Winkel von 30–45° relativ zur Arenaebene, um eine gleichmäßige Beleuchtung über den Aufnahmebereich zu gewährleisten und Schatten, Reflexionen oder übermäßige Helligkeit zu minimieren. Passe die Lampenplatzierung vor jeder Sitzung an und stelle sicher, dass die Beleuchtung auf Arena-Ebene im Zielbereich von 120-150 Lux bleibt.
   6. Positioniere die Kamera unterhalb der Arena in einer Bottomview-Konfiguration in einem festen Abstand von etwa 80 cm von der Arenaebene, um eine vollständige Sicht auf den Aufnahmebereich zu gewährleisten. Beachten Sie, dass dieser optimale Abstand je nach Blende und Sichtfeld (FOV) der jeweiligen Kamera angepasst werden muss, um eine vollständige Arenaabdeckung zu gewährleisten.
   7. Schließen Sie die Kamera an das Computersystem an und starten Sie die Videoaufnahmesoftware, bevor Sie das Tier einführen.
   8. Stellen Sie den Kamerafokus und das Sichtfeld an, um sicherzustellen, dass die gesamte Arenafläche sichtbar und scharf aufgelöst wird.
   9. Erfassen Sie ein Referenzbild für die räumliche Kalibrierung, indem Sie das Schachbrettraster oder Kalibrierungsmuster mit bekannten Maßen auf der Arenaebene platzieren.
      HINWEIS: KRITISCHER SCHRITT: Genaue Kameraausrichtung, fester Kameraabstand und konstante Beleuchtung sind für eine zuverlässige Punktenlos-Pose-Schätzung unerlässlich. Abweichungen in Geometrie oder Lichtbedingungen können die Genauigkeit der Nachverfolgung verringern und die Vergleichbarkeit der Daten zwischen den Sitzungen beeinträchtigen.
      HINWEIS: Alternative Materialien, einschließlich Edelstahl, können für die äußere Stützstruktur verwendet werden, sofern die Einrichtung stabil bleibt und die Aufzeichnungsausrichtung erhalten bleibt.
      HINWEIS: Eine undurchsichtige Arena oder alternative Wandmaterialien können ebenfalls verwendet werden, insbesondere wenn eine zusätzliche Kontrolle über externe visuelle Eingaben gewünscht ist, vorausgesetzt, die Aufzeichnung bleibt stabil und externe visuelle Störungen werden minimiert.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Arenamaße entsprechen der Konfiguration, die zur Aufnahme frei bewegender Mäuse verwendet wird. Diese Maße können je nach verwendetem Nagetier und dem übernommenen Open-Field-Protokoll angepasst werden, vorausgesetzt, vollständige Tiersicht, räumliche Kalibrierung und konsistente Erfassungsbedingungen bleiben gewährleistet.
3. Aufzeichnung des spontanen Lokomotorikverhaltens
   1. Bevor Sie die Maus in die Arena setzen, zeigen Sie kurz die Tierkennung im Videorahmen an, um eine direkte visuelle Verbindung zwischen der Aufnahme und der entsprechenden experimentellen Sitzung sicherzustellen.
   2. Starten Sie die Videoaufnahme, bevor Sie die Maus in die Mitte der offenen Arena setzen, um sicherzustellen, dass das anfängliche Erkundungsverhalten von Beginn der Sitzung aufgenommen wird.
   3. Stellen Sie die Maus vorsichtig in die Mitte der offenen Feldarena.
   4. Zeichnen Sie spontane Fortbewegung kontinuierlich 3 Minuten lang auf, ohne visuelle, auditive oder taktile Störungen einzuführen. Im aktuellen Protokoll wurde pro Maus nur eine Aufnahmesitzung durchgeführt.
   5. Überwachen Sie den Live-Videofeed auf dem Computerbildschirm, um eine ununterbrochene Aufzeichnung und die ordnungsgemäße Erfassung der Tierbewegungen zu bestätigen.
   6. Überprüfen Sie regelmäßig die Kameraausrichtung und die Beleuchtungsgleichmäßigkeit zwischen den Sitzungen, um einheitliche Aufzeichnungsbedingungen bei allen Tieren sicherzustellen.
   7. Am Ende der Aufnahmephase wird die Videoaufnahme gestoppt und das Tier vorsichtig mit dem oben beschriebenen Handhabungsverfahren aus der Arena entfernt.
   8. Bringen Sie das Tier zurück in seinen Stammkäfig und lassen Sie es sich vor weiteren Eingriffen ausruhen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Tier während der Aufnahme neu zu positionieren, da äußere Störungen spontane Gangmuster verändern und die nachgeschaltete Analyse beeinflussen können.
4. Bereinigung, Datenspeicherung und Sitzungsabschluss
   1. Reinigen Sie die Freifeldarena nach jeder Sitzung erneut mit 70 % (v/v) Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen, bevor Sie das nächste Tier einführen.
   2. Stellen Sie sicher, dass vor dem Einführen des nächsten Tieres kein Ethanol oder Geruch auf der Arena zurückbleibt.
   3. Dokumentieren Sie die Tierkennung, das Sitzungsdatum und -zeit, den experimentellen Zustand und den Namen des Bedieners unmittelbar nach jeder Aufnahme.
   4. Wenn weitere Tiere getestet werden, wird das Verfahren ab Schritt 3.1.1 unter identischen Umwelt- und experimentellen Bedingungen wiederholt.
   5. Speichere jede Videodatei in einem eigenen Ordner mit einer standardisierten Benennungskonvention (z. B. AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. Am Ende des Experimentaltages wurde das Kamerasystem und die Beleuchtungsausrüstung abgeschaltet, um Schwankungen in den Beleuchtungseinstellungen über die Sitzungen hinweg zu vermeiden.
      HINWEIS: Obwohl im aktuellen Protokoll 70 % Ethanol verwendet wurden, da es ein häufig verwendetes Desinfektionsmittel für diese Art von Verfahren ist, können auch acrylkompatible Desinfektionsmittel verwendet werden, um eine fortschreitende Oberflächenverschlechterung zu vermeiden, vorausgesetzt, die Arena ist vor der nächsten Aufnahme vollständig trocken und frei von Restgeruch.
      HINWEIS: Wenn möglich, können mehrere Arenen vorbereitet werden, um sofortigen Wechsel zwischen den Sitzungen zu ermöglichen und den kontinuierlichen Fortschritt des Experiments über Tiere hinweg zu erleichtern.
      Siehe Abbildung 1 für die Materialien und den Zusammenbau des experimentellen Setups, einschließlich der Holzplattform (Abbildung 1A), der Acrylarena (Abbildung 1B), des seitlichen Beleuchtungssystems (Abbildung 1C), der Positionierung der Kamera von unten (Abbildung 1D) und der vollständigen experimentellen Einrichtung (Abbildung 1E).

Abbildung 1: Experimenteller Aufbau zur Videoaufnahme der Fortbewegung in der offenen Feldarena. (A) Stützstruktur für die Arena; (B) Acryl-Openfield-Arena, die auf der Plattform platziert wird; (C) seitliche Beleuchtung zur Gewährleistung einer gleichmäßigen Beleuchtung; (D) Kamerapositionierung zur Aufzeichnung von Bewegungen von unten; (E) Komplettes Setup. Weiße Pfeilspitzen zeigen die Ausrichtung der Lichtquelle in Abbildung 1C und der Kamera in Abbildung 1D an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Videoverarbeitung und kinematische Analyse

1. Videovorbereitung und Qualitätskontrolle
   1. Besorge dir Rohvideos in . MOV-Format verwenden und sie in .avi Format konvertieren, um mit DeepLabCut kompatibel zu sein, während konstante Bildraten- und Auflösungsparameter beibehalten werden.
   2. Baacte alle Rohvideodateien sofort nach der Erfassung in einen eigenen Ordner auf dem Analysecomputer und wende eine standardisierte Benennungskonvention an (z. B. AnimalID_Session_Date).
   3. Überprüfen Sie jedes Video in seiner Gesamtheit, um sicherzustellen, dass die Aufnahme vollständig und frei von Unterbrechungen, ausgefallenen Frames oder Beschädigungen ist. Videos mit Erfassungsfehlern sollten von der Analyse ausgeschlossen werden.
   4. Konvertiere die Videos in MP4 (H.264) oder unkomprimierte AVI-Formate, wenn das Originalformat nicht mit DeepLabCut kompatibel ist.
   5. Optional wird zeitliches Kürzen des Videomaterials durchgeführt, um nicht-experimentelle Intervalle zu Beginn und am Ende der Sitzung (z. B. während der Einführung oder Entfernung des Tieres aus dem experimentellen Bereich) zu eliminieren.
   6. Bestätigen Sie, dass Auflösung und Bildrate mit den während der Aufnahme verwendeten Aufnahmeparametern übereinstimmen und über alle Sitzungen hinweg konsistent bleiben.
   7. Überprüfen Sie, dass die gesamte Arenafläche im Videobild sichtbar ist und keine Körperteile während der Fortbewegung dauerhaft blockiert sind.
   8. Place alle verifizierten und bearbeiteten Videos in ein spezielles Projektverzeichnis für DeepLabCut-Analysen.
      HINWEIS: KRITISCHER SCHRITT: Inkonsistente Bildraten, teilweise Arena-Sichtbarkeit oder Bewegungsunschärfe verringern direkt die Verfolgungsgenauigkeit. Videos, die keine Qualitätskriterien erfüllen, sollten nicht in das Modelltraining oder in die Inferenz aufgenommen werden.
2. Projektgründung und -konfiguration
   1. Bestimmen Sie eine Videobibliothek für das Projekt, entweder mit denselben Videos, die für die Analyse gedacht sind, oder mit einer repräsentativen Teilmenge für das Netzwerktraining.
   2. Starte die Python-Umgebung und importiere das DeepLabCut-Paket.
   3. Erstelle ein neues DeepLabCut-Projekt mit dem Befehl:
   4. deeplabcut.create_new_project('ProjektName', 'Autor', 'VideoPfad').
   5. Definieren Sie die anatomischen Landmarken (Körperteile) von Interesse in der config.yaml-Datei und gewährleisten Sie klare und anatomisch konsistente Definitionen.
   6. Körperteildefinitionen sollten für die experimentelle Frage optimiert und bei allen Tieren und Sitzungen identisch bleiben.
3. Rahmenextraktion und Beschriftung von Karosserieteilen
   1. Gib start, stop, numframes2extract und cropping_parameters in der config.yaml-Datei entsprechend Videolänge und räumlichem Layout an.
   2. Extrahieren Sie repräsentative Rahmen mit: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automatisch', 'kmeans'/'uniform').
   3. Überprüfen Sie die extrahierten Frames, um die Einbeziehung von Variationen in Körperhaltung, Orientierung, Gliedmaßenposition und Gangphasenabdeckung in der gesamten Aufnahme zu bestätigen. Wenn bestimmte Haltungen, Gliedmaßenkonfigurationen oder Lokomotorphasen unterrepräsentiert sind, entnehmen Sie zusätzliche Rahmen, um diese Bedingungen besser darzustellen.
   4. Wenn bestimmte Gangzyklusphasen erforderlich sind, extrahieren Sie manuell Frames mit: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manuell').
   5. Starten Sie die grafische Beschriftungsoberfläche mit: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Beschriften Sie alle vordefinierten anatomischen Orientierungspunkte, die in Abbildung 2 gezeigt werden, einschließlich des repräsentativen Videoframes während der Aufnahme (Abbildung 2A), der automatisierten Körperpunkterkennung, die auf dem ursprünglichen Bild überlagert wurde (Abbildung 2B), sowie der schematischen Darstellung der definierten Körpermarkierungen und Arena-Referenzpunkte, die für die Analyse verwendet werden (Abbildung 2C). Folgen Sie konsistenten anatomischen Kriterien (z. B. Nase: vordere Spitze der Schnauze; Schwanzbasis: Verbindung zwischen Wirbelsäule und Schwanz)
   7. Beschriften Sie alle vier Gliedmaßen konsequent, indem Sie jedes Orientierungszeichen in der Mitte der Pfote über den Plantarpads beim Bodenkontakt platzieren.
   8. Speichere und inspiziere die Etiketten mit: deeplabcut.check_labels(config_path) und korrigiere bei Bedarf ungenaue Anmerkungen.
   9. Wenn möglich, bitten Sie einen zweiten geschulten Evaluator, eine Teilmenge von Frames zu labeln, um die Konsistenz zwischen den Ratern zu bewerten.
      HINWEIS: KRITISCHER SCHRITT: Inkonsistente oder anatomisch ungenaue Kennzeichnung ist eine Hauptquelle für nachgelagerte Nachverfolgungsfehler. Achten Sie auf strikte Einhaltung der Definitionen von Meilenmarken in allen Rahmen.
4. Training von neuronalen Netzwerken
   1. Trainieren Sie das Pose-Schätzungsmodell für 200 Epochen und erhalten Sie einen endgültigen mittleren Trainingsfehler (RMSE) von 3,27 Pixeln und einen mittleren Testfehler von 3,59 Pixeln, was der stabilen Verfolgungsleistung unter den beschriebenen Aufnahmebedingungen entspricht.
   2. Erstellen Sie die Trainings- und Evaluierungsdatensätze mit: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Passen Sie den Training Fraction-Parameter in config.yaml an, um den Anteil der für das Training verwendeten Bilder zu definieren.
   4. Überprüfen Sie die GPU-Verfügbarkeit, indem Sie folgendes verwenden: nvidia-smi.
   5. Beginnen Sie mit dem Netzwerktraining mit: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, Epochen=200).
   6. Überwachen Sie den Trainingsverlust und beenden Sie das Training, sobald sich die Verlustwerte stabilisieren und keine weitere Verbesserung festgestellt wird.
   7. Wenn das Training unterbrochen wird, setze du vom zuletzt gespeicherten Checkpoint fort.
   8. Bewerten Sie das trainierte Modell mit: deeplabcut.evaluate_network(config_path) und erfassen Sie den durchschnittlichen Pixelfehler.
   9. Wenn der Fehler die zulässige Schwelle für das experimentelle Setup überschreitet, fügen Sie zusätzliche beschriftete Frames hinzu oder verfeinern Sie Annotationen und wiederholen Sie das Training.
      HINWEIS: Akzeptable Pixelfehlerschwellenwerte können je nach Kameraauflösung und Arenagröße variieren, sollten aber zwischen den Experimenten konsistent bleiben.
5. Videoanalyse und Gangquantifizierung
   1. Betrachte Punkte mit einem Likelihood-Wert unter 0,3 als fehlend.
   2. Lineart interpolieren fehlende Punkte nur, wenn Lücken ≤3 aufeinanderfolgende Frames betragen; Längere Lücken aus der Analyse ausschließen.
   3. Definieren Sie Lokomotor-Phasen mit einer Körperzentrumsgeschwindigkeitsschwelle von 10 cm/s.
   4. Bewegungen unterhalb dieses Schwellenwerts und transiente Ereignisse kürzer als 3 Frames werden ausgeschlossen.
   5. Führen Sie Inferenz auf experimentellen Videos durch mit: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=True).
   6. Generiere beschriftete Videos mit: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]), um die Tracking-Qualität visuell zu bestätigen (Abbildung 2).
   7. Setzen Sie den pcutoff-Parameter in config.yaml auf 0.6, um während der Visualisierung und Auswertung eine Konfidenzgrenze anzuwenden.
   8. Importieren Sie die ausgegebenen CSV-Dateien in die statistische Rechenumgebung, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, zusammen mit dem entsprechenden Analysepaket und den benutzerdefinierten Skripten aus Supplementary Material 1 zur Verhaltensquantifizierung.
   9. Frame-Indizes werden mit der ursprünglichen Video-Abtastrate in Zeit umgewandelt.
   10. Kalibrieren Sie räumliche Dimensionen, indem Sie Pixelkoordinaten in physische Einheiten umwandeln, anhand der bekannten Arena-Dimensionen und der getrackten Arena-Eckenmarken.
   11. Führen Sie vor der metrischen Extraktion eine Qualitätskontrolle an den verfolgten Koordinaten durch.
   12. Betrachten Sie Punkte mit einem Likelihood-Wert unter 0,3 als fehlend und ersetzen Sie sie bei Bedarf durch lineare Interpolation.
   13. Identifizieren Sie Ausreißerbahnen während der Sichtprüfung und korrigieren oder schließen Sie sie bei Bedarf aus.
   14. Definieren Sie Gangsegmente anhand synchronisierter kinematischer Kriterien, die auf der Verschiebung des Körperzentrums und der Bewegung der Hintergliedmaßen basieren.
   15. Nicht-bewegungsbezogene Verhaltensweisen wie Aufbäumen, Drehen und Pflegen ausschließen.
   16. Manuell kalibrieren und verfeinern Sie die Definitionsschwellenwerte entsprechend den experimentellen Bedingungen und dem Tiermodell, um nur robuste, kontinuierliche Lokomotor-Phasen für die Analyse zu erhalten.
   17. Berechnen Sie Gangmetriken, die aus geometrischen und zeitlichen Beziehungen zwischen verfolgten Orientierungspunkten abgeleitet sind, mithilfe der gefilterten kontinuierlichen Bewegungssegmente (Tabelle 1). Dazu gehörten Schrittlänge, Schrittlänge, Schrittbreite, Schritt, Schrittdauer, Schrittdauer, Standzeit, Schwungzeit, ipsilaterale Amplitude und gliedmaßenspezifische Verschiebungsmaße.
   18. Extrahieren Sie offene Feldmetriken aus der vollständigen Aufzeichnung mit denselben Tracking-Daten (Tabelle 1). Dazu gehörten die gesamte zurückgelegte Strecke, Durchschnittsgeschwindigkeit, Bewegungszeit, Prozentsatz der Bewegungszeit, Anzahl und Dauer der Spaziergänge sowie die kumulierte zurückgelegte Distanz in den Zentrums-, Rand- und Eckzonen.
   19. Kompiliere alle Ausgaben in eine strukturierte Masterdatei für die nachgelagerte statistische Analyse.
   20. Erzeugen Sie visuelle Darstellungen (z. B. Flugbahnen, Heatmaps, zeitbasierte Verschiebungen, Gangmuster und Koordinationsdiagramme zwischen Gliedmaßen) mithilfe der in der Materialtabelle aufgeführten Rechenumgebungen und der oben beschriebenen Plottskripte.
   21. Repräsentative synchronisierte Visualisierungen von Punktsicherheit, Gangkampferkennung, Klassifikation von Erkundungszonen und Koordination zwischen Gliedmaßen werden im Ergänzungsvideo 1 und Ergänzendes Video 2 bereitgestellt, um die Interpretation des analytischen Arbeitsablaufs zu erleichtern.
6. Qualitätskontrolle und Datensicherung
   1. Untersuchen Sie visuell eine zufällige Teilmenge beschrifteter Videos, um die anatomische Konsistenz zwischen Frames und Sitzungen zu bestätigen.
   2. Vergleichen Sie vorhergesagte Landmark-Positionen mit annotierten Labels, um die Modellstabilität und Verallgemeinerung zu überprüfen.
   3. Speichere eine vollständige Kopie des Projekts, einschließlich config.yaml, originalen Labels, trainierten Netzwerkgewichten und Ausgabedateien.
   4. Dokumentieren Sie die im Workflow verwendeten Softwareversionen, einschließlich DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA und der statistischen Rechenumgebung, zusammen mit GPU-Spezifikationen und dem Analysedatum.
   5. Erstellen Sie einen zusammenfassenden Bericht über durchschnittliche Fehler und Bearbeitungszeiten aus evaluation-results.csv.
   6. Sichere das gesamte Projekt in einem lokalen Archiv und auf einem institutionellen Server oder einem sicheren Cloud-Speicher.
7. Rechenumgebung und Ressourcen zur Reproduzierbarkeit
   1. Originale Videoaufnahmen aufnehmen in . MOV-Format mit einer Auflösung von 1080 × 1920 Pixel und etwa 60 FPS.
   2. Verarbeiten und transkodieren Sie die Videos in .avi Format.
   3. Während dieses Umwandlungsschritts schneiden Sie den interessierten Bereich zu, vergrößern ihn auf eine quadratische Auflösung von 720 × 720 Pixel und standardisieren Sie die Bildrate auf konstante 60 FPS, um eine genaue zeitliche Quantifizierung bei der anschließenden kinematischen Analyse sicherzustellen.
   4. Implementiere den markerlosen Tracking-Workflow mit DeepLabCut Version 3.0.0rc13 in einer Python-Umgebung, die mit Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 und CUDA 11.8 konfiguriert ist.
   5. Trainieren Sie das Pose-Schätzungsmodell für 200 Epochen und erhalten Sie einen endgültigen mittleren Trainingsfehler (RMSE) von 3,27 Pixeln sowie einen mittleren Testfehler von 3,59 Pixeln.
   6. Führen Sie eine Nachverfolgungsanalyse mit der statistischen Rechenumgebung und den benutzerdefinierten Skripten aus Supplementary Material 1 für Gang- und Open-Field-Quantifizierung durch.
   7. Verwenden Sie eine Körpermittelgeschwindigkeitsschwelle von 10 cm/s, um Gehphasen zu erkennen. Füllen Sie Lücken von bis zu 3 Frames zwischen den Lokomotor-Epochen und schließen Sie transiente Bewegungen kürzer als 3 Frames aus, um kontinuierliche Gangsegmente für die Analyse zu erhalten.
   8. Stellen Sie in Supplementary Material 1 die entsprechenden config.yaml-Einstellungen, repräsentative Analyseskripte, Beispielvideo- und Tracking-Dateien sowie Modellgewichte bereit.
   9. Geben Sie zusätzliche Implementierungsdetails, Modellbewertungsmetriken, Hardware-Spezifikationen und fallspezifische Analyseparameter in Ergänzungsmaterial 1, sofern zutreffend, bereit.
      HINWEIS: Passen Sie diese Parameter entsprechend den in jedem Experiment verwendeten Erfassungsbedingungen an.

Abbildung 2: Repräsentativer Workflow für markierungsloses Körperpunkttracking und Ganganalyse aus Videoaufnahmen. (A) Repräsentatives Videobild einer Maus, die sich während der Erfassung frei innerhalb der offenen Feldarena bewegt. (B) Beispiel für eine automatisierte Körperpunkterkennung, die nach der Posenschätzung auf das ursprüngliche Videobild gelegt wird und die anatomischen Orientierungspunkte für die Analyse illustriert. (C) Schematische Darstellung der definierten Körpermarkierungen und Arena-Referenzpunkte, die für Gangrekonstruktion, räumliche Kalibrierung und quantitative Lokomotorikanalyse verwendet werden. Orientierungspunkte und Arena-Referenzpunkte: Schnauze, Kehle, Körpermitte, Körpermitte links (bcl), Körpermitte rechts (BCR), linke Hüfte (hipl), rechte Hüfte (hipr), Schwanzbasis, Schwanzmitte, Schwanzspitze, linke Vorderpfote (lfp), linke Hinterpfote (lhp), rechte Vorderpfote (rfp), rechte Hinterpfote (rhp), oben links (TL), oben rechts (tr), unten links (bl) und unten rechts (BR). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Nach Anwendung des Tracking- und Analyse-Workflows rekonstruierte die automatisierte Verarbeitung spontane Freifeld-Lokomotive anhand des definierten Körper-Zentrums-Orientierungspunkts und erzeugte quantitative Ergebnisse, die für die nachgelagerte Analyse geeignet waren. Repräsentative Trajektoriendiagramme zeigen, wie das Protokoll räumliche Verschiebung über die Arena, zeitliche Belegung und Geschwindigkeitsdynamik während der freien Erkundung erfasst. Die in diesem Abschnitt gezeigten Open-Field-Variablen wurden aus...

Diskussion

Diese Studie präsentiert einen kostengünstigen, markerlosen Ansatz zur Analyse spontaner Fortbewegung und Gang bei frei bewegenden Mäusen unter Verwendung von Standard-Videoaufnahme und DeepLabCut-basierter Pose-Schätzung innerhalb eines zugänglichen Workflows. Der Workflow ermöglicht die Extraktion von lokomotorischen und gangbezogenen Variablen aus Videoaufnahmen, während das natürliche Bewegungsverhalten erhalten bleibt und experimentelle Interferenzen reduziert werden. In diesem Sinn...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
70% Ethanol	Generisch	N/A	Arena-Reinigung zwischen den Sitzungen
Einstellbare weiße Lichtlampen	Generisch	N/A	Konstante Beleuchtung aufrechterhalten (100–150 lx)
Schwarze Vorhänge/Blendschutz	Generisch	N/A	Externes Licht/Reflexionen reduzieren
Schachbrettmuster-Vorlage	Generisch	N/A	Räumliche Kalibrierungsreferenzbild
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-Source	N/A	Pose-Schätzungssoftware
Digitale Videokamera (HD, 16:9; ≥60 fps)	Generisch	N/A	Feste Einstellungen über Sitzungen hinweg
Nvidia GPU-Workstation	Benutzerdefiniertes Build	N/A	Hardware für Modelltraining/Inferenz
Luxmeter	Generisch	N/A	Beleuchtung auf Arena-Ebene überprüfen
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Von DeepLabCut benötigtes Framework
Transparenter Acryl-Open-Field-Arena (42 × 42 × 42 cm)	Kundenspezifisch / In-House	N/A	Open-Field-Arena
Unter-Arena-Kamerahalterung (90° Ansicht)	Kundenspezifisch / In-House	N/A	Stabile Halterung für Bodenaufzeichnung
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	GPU-beschleunigte parallele Verarbeitung
R Programmiersprache	R Foundation	N/A	Programmiersprache für Datenanalyse