Diese Studie präsentiert eine gelatinebasierte Fütterungsmethode, die eine präzise, nicht-invasive, körpermassenbasierte orale Arzneimittelabgabe bei erwachsenen Zebrafischen ermöglicht. Das Protokoll zeigt eine zuverlässige Futteraufnahme und als Beweis für das Prinzip die erfolgreiche Abgabe von MK-801, was zu den erwarteten Verhaltenseffekten führte.
Methodenartikel
Ein einfacher und präziser, futterbasierter Ansatz zur oralen Arzneimittelabgabe bei Fischen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Typische Methoden zur Medikamentenabgabe bei Fischen (z. B. Becherdosierung, intraperitoneale Injektionen oder orale Wandabgabe) sind zeitaufwendig, ungenau und/oder verschwenderisch. Da diese Methoden auch für die Tiere stressig sind, eignen sie sich schlecht für wiederholte oder langfristige Medikamentenverabreichung und Verhaltensexperimente, die empfindlich auf handhabungsbedingte Störungen reagieren, was den Nutzen von Fischmodellen in der biomedizinischen Forschung einschränkt. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurde eine gelatinebasierte Fütterungsmethode entwickelt, die eine schnelle, präzise Medikamentendosierung bei Fischen mit minimalen Störungen ermöglicht. Die Methode besteht darin, individuell angepasste Futterhäppchen herzustellen, bestehend aus Gelatine, Salzgarnelenextrakt, Spirulina und dem bevorzugten Medikament. Die wärmeformbaren Eigenschaften der Gelatine ermöglichen es, eine einzelne homogene Vorbereitung zu verflüssigen, entsprechend der Körpermasse genau portioniert und in angepasste Stückchen wieder zu verfestigen. Als Prinzipientest wurde der NMDA-Rezeptorantagonist MK-801 (4 mg kg⁻1) vor dem neuen Aquariumtest erwachsenen Zebrafischen verabreicht, was zu Verhaltenseffekten führte, die mit einem reduzierten angstähnlichen Verhalten übereinstimmen. Dieser Ansatz eignet sich gut für die Verhaltenspharmakologie und lässt sich leicht an andere aquatische Modellorganismen anpassen.
Einleitung
Zebrafische (Danio rerio) werden in der biomedizinischen Forschung weit verbreitet eingesetzt, um Entwicklung, Physiologie, Verhalten und Pharmakologiezu untersuchen 1,2,3. Der Nutzen von Zebrafischen für pharmakologische Studien, insbesondere an erwachsenen Tieren, ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Arzneimittelabgabemethoden begrenzt, die sowohl präzise als auch minimal störendsind 4.
Häufig verwendete Arzneimittelverabreichungstechniken bei Zebrafischen, wie Becherdosierung, intraperitoneale Injektion und orales Gavage, weisen jeweils erhebliche Nachteile auf. Die Exposition durch Ganzkörperimmersion mittels Becherdosierung bietet eine begrenzte Kontrolle über die Medikamentenaufnahme, führt zu erheblichem Abfall von Verbindungen und führt zu Variabilität aufgrund von Unterschieden in Absorptionsrate und Verbindungsstabilität 5,6,7. Injektionsbasierte Ansätze und orales Gavage ermöglichen eine präzisere Dosierung, erfordern jedoch Anästhesie, Fesselung und wiederholtes Handeln, was alle Stressreaktionen auslösen und das Risiko von Verletzungen oder Hypoxie erhöhen kann, was Verhaltens- und physiologische Messungen potenziell stört 8,9,10. Diese Einschränkungen sind besonders problematisch bei Experimenten mit wiederholter oder langfristiger Medikamentenverabreichung.
Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurde eine gelatinebasierte Fütterungsmethode entwickelt, die eine schnelle, präzise und nicht-invasive Arzneimittelabgabe an Zebrafishermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht es, pharmakologische Verbindungen in kleine, individuell angepasste Futterhäppchen aus Gelatine, Salzwassergarnelenextrakt und Spirulina einzubringen. Die futterbasierte Arzneimittelabgabe ist eine nicht-invasive Alternative, die mit den Prinzipien von 3Rs (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) in der ethischen Tierforschung übereinstimmt. Obwohl frühere Studien die Machbarkeit der futterbasierten Arzneimittelabgabe bei erwachsenen Zebrafischen 12,13,14 gezeigt haben, basieren bestehende Ansätze auf heterogenen Futtermatrizen oder festen Futtermengen, die keine individuelle Variation der Körpermasse berücksichtigen. Die hier beschriebene Methode adressiert diese Einschränkungen, indem sie eine gewichtsbasierte Dosiskalibrierung ermöglicht.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte, schrittweise Beschreibung einer gelatinebasierten Futterzubereitung und -verabreichung bei erwachsenen Zebrafischen. Obwohl die Methode mit einem Verhaltenstest, dem neuartigen Beckentest, demonstriert wird, ist sie weitgehend auf andere Bereiche der Zebrafischbiologie anwendbar und wird voraussichtlich für den Einsatz bei anderen aquatischen Modellorganismen angepasst sein. Dieses Protokoll bietet eine praktische Lösung für Forscher, die eine effiziente, reproduzierbare und stressarme Arzneimittelabgabe bei Zebrafischen suchen, insbesondere für Studien, die präzise, wiederholte und/oder langfristige pharmakologische Manipulationen erfordern.
Protokoll
Erwachsene männliche und weibliche AB- und TL-Zebrafische (4–12 Monate alt) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere wurden an der Wayne State University gezüchtet und untergebracht. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee gemäß den Richtlinien der Wayne State University genehmigt. Die Fische wurden unter Standardbedingungen auf hochdichten Racks gehalten (Temperatur 27,5 ± 0,5 °C, Wasserleitfähigkeit 500 μS ± 10 μS und pH 7,5 ± 0,2) mit einem Licht-Dunkelheits-Zyklus von 14 Stunden zu 10 Stunden (Licht an um 08:00 Uhr). Die Fische wurden zweimal täglich gefüttert, morgens mit Trockenfutter und am Nachmittag frisch geschlüpften Salinengarnelen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Fischwiegung und Berechnung des Futtervolumens
- Füllen Sie einen 100 ml Glasbecher mit etwa 50 ml Systemwasser und stellen Sie ihn auf eine digitale Waage. Tare die Waage.
- Einen einzelnen Fisch aus ihrem Heimaquarium vorsichtig mit einem feinen Netz netzen. Berühren Sie das Netz kurz mit einem trockenen Küchenpapier, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Legen Sie den Fisch vorsichtig in den Becher, damit kein Wasser auf die Waage verschüttet wird.
- Zeichnen Sie das Gewicht auf und verwenden Sie dieses gemessene Gewicht, um das erforderliche Futtervolumen basierend auf 1 % Volumen pro Körpergewicht (V/BW) für jeden einzelnen Fisch zu berechnen.
2. Zubereitung von Salzwassergarnelenextrakt
- Sole-Garnelenpulver in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 250 mg/mL suspendieren. Rühren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 12.500 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und behalten Sie das Überstandsmittel.
- Wiederholen Sie die Zentrifugation erneut und sammeln Sie erneut das Supernatant.
- Lagern Sie den Salzgarnelenextrakt bei −20 °C bis zu 6 Monaten.
3. Herstellung von gelatinebasiertem Futter
- Tauen Sie den Salzgarnelenextrakt vor der Zubereitung auf und berechnen Sie die Zielmassen von Gelatine (12 % W/V), Spirulina (4 % W/V) und, falls zutreffend, pharmakologischen Verbindungen, die für das gewünschte Volumen Gelatinefutter benötigt werden.
- Wiege Spirulina und Gelatinepulver (schweinebasiert; Bloom ≈ 300 g) in separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren und die tatsächliche Masse in jedem Röhrchen aufzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die gemessene Masse bei oder über der Zielmasse für das vorgesehene Endvolumen liegt.
- Gib die entsprechenden Mengen an Salzlake-Garnelenextrakt, Arzneimittelverbindung und Wasser in das spirulinahaltige Rohr, um die Endkonzentration von 4 % W/v Spirulina und 80 mg/mL Salzwassergarnelenextrakt zu erreichen.
- Vortex gründlich homogenisieren. Übertragen Sie das erforderliche Volumen der Mischung aus dem vorherigen Schritt auf das gelatinehaltige Rohr, um eine Endgelatinekonzentration von 12 % w/v zu erhalten.
- Stellen Sie das Rohr für 5 Minuten auf einen vorgewärmten 45 °C Heizblock und wirbeln zwischendurch vor, bis die Gelatine vollständig aufgelöst ist. Ist die Auflösung unvollständig, rühren Sie vorsichtig mit einem sterilen Holz- oder Metallrührstab um, um die Homogenisierung zu unterstützen.
- Aliquot das vollständig homogenisierte Gemisch (bis zu 100 μL pro Röhre) in beschriftete 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren.
- Die Aliquoten werden über Nacht bei −20 °C gelagert, um eine vollständige Verhärtung zu ermöglichen und die Handhabung während der Fütterung zu erleichtern.
4. Bildung einzelner Futterstückchen
- Erhitze die aliquotierte Gelatinemischung auf 45 °C, bis sie vor der Fütterung vollständig verflüssigt ist.
- Wirbel die verflüssigte Gelatinemischung gründlich vor.
- Pipettieren Sie das Volumen, das 1 % der Körpermasse des Fisches entspricht, auf eine Paraffinfolie, um einzelne Stückchen zu bilden (Abbildung 1).
HINWEIS: Zur Erleichterung der Handhabung und Aufbewahrung werden vor dem Abgeben des Volumens ein Blatt Paraffinfolie in eine Petrischale gelegt. Dadurch bleibt das Paraffin flach und die vorbereiteten Stückchen auf −20 °C für die Lagerung umgebettet werden. - Legen Sie Stückchen mindestens 20 Minuten bei −20 °C hin, damit sie wieder fest werden können.
- Lass die Bissen bis zum Füttern auf Eis.
5. Gelatinefutterverwaltung
- Bringen Sie die Fische vom Stall in den Verhaltensraum und lassen Sie sie sich eine Stunde lang gewöhnen.
- Isolieren Sie jeden Fisch im Aquarium vorübergehend mit transparenten Barrieren für 2–5 Minuten vor dem Füttern.
- Mit einer Zange legt man das individuelle Gelatinefutterstück, das 1 % des Körpergewichts des Fisches entspricht, vor jeden isolierten Fisch auf die Wasseroberfläche.
- Beobachten Sie jeden Fisch, um den gesamten Futterbissen innerhalb von 5 Minuten zu verzehren.
- Nachdem die Fische das Futter gefressen haben, entfernen Sie die Barrieren und bringen Sie die Fische entweder zurück in ihre eigenen Becken oder beginnen Sie mit experimentellen Verfahren.
HINWEIS: Ein ausgearbeitetes Beispiel zur Futterzubereitung und Berechnung der Ziel- und tatsächlichen Dosierungsmengen ist in der Supplementary File 1 enthalten, wobei Beispielwerte ebenfalls in Tabelle 1 dargestellt werden.
Ergebnisse
Gelatinefutterschmackhaft
Um die Geschmacksbarkeit des Futters zu beurteilen, erhielten erwachsene AB- und TL-Zebrafische fünf Tage lang eine gelatinebasierte Nahrung anstelle ihrer Morgenmahlzeit (Abbildung 2). Alle TL-Fische verzehrten das Futter innerhalb von 5 Minuten bei der ersten Exposition, während AB-Fische eine wiederholte Exposition benötigten, wobei 15 von 16 Individuen das Futter nach vier aufeinanderfolgenden Akklimatisierungstagen konsequent verzehrten (Abbildung 2A). Die Analyse der Zeit zum Konsum des Futters mittels einer Dreifach-ANOVA (Stamm × Sex × Tag) zeigte signifikante Haupteffekte des Stammes (F₁,₁₂₅ = 19,4, P < 0,0001) und des Tages (F₄,₁₂₅ = 5,80, P < 0,001), aber keinen Haupteffekt des Geschlechts (F₁,₁₂₅ = 0,24, P = 0,63). Signifikante Wechselwirkungen wurden zwischen Stamm und Tag (F₄,₁₂₅ = 3,35, P = 0,012) sowie zwischen Strain, Tag und Geschlecht (F₄,₁₂₅ = 2,55, P = 0,04) beobachtet. TL-Fische beider Geschlechter verzehrten das Futter ab der ersten Exposition (4–20 s), während AB-Fische längere Anfangsverzehrzeiten (7–144 s) zeigten, die über Tage abnahm (Abbildung 2B). An den Tagen vier und fünf verzehrten alle Fische bis auf ein AB-Männchen das Futter innerhalb von 10 Sekunden. Ungefähr 95 % der Fische konsumieren das Gelatinefutter innerhalb von 30 Sekunden nach der Präsentation nach 2–3 Tagen Eingewöhnung, wie zuvor15,16 berichtet wurde.
Verhaltenseffekt von MK-801 unter Verwendung von Gelatinefutter
Um die Wirksamkeit der gelatinebasierten Arzneimittelabgabe zu demonstrieren, wurde MK-801, ein N-Methyl-D-Aspartatrezeptor (NMDAR)-Antagonist, mit Gelatinefutter verabreicht. Die Bodendistanz während der Erkundung eines neuartigen Beckens wurde als Verhaltensanzeige gemessen. MK-801 ist dafür bekannt, das Fortbewegungs- und angstähnliches oder räubervermeidendes Verhalten bei erwachsenen Zebrafischenzu verändern. Erwachsene AB-Zebrafische wurden an das Fütterungsverfahren gewöhnt, indem sie zwei aufeinanderfolgende Tage Gelatine ohne das Medikament erhielten, um Vertrautheit und zuverlässigen Verzehr zu gewährleisten. Am dritten Tag erhielten die Fische, die der Behandlungsgruppe zugeordnet waren, eine einzelne Dosis MK-801 (4 mg kg⁻1), die in das Gelatinefutter eingebaut wurde. Kontrollfische erhielten einen identischen Gelatine-Happen mit nur Fahrzeug (Wasser). Das Futter wurde 30 Minuten vor der Verhaltensbeurteilung im neuen Beckentest verabreicht.
Angstähnliches oder prädatorisches Vermeidungsverhalten, gemessen als Entfernung vom Boden, wurde mit einer 2 × 2 ANOVA (Sex × Medikament) analysiert, die einen signifikanten Haupteffekt von MK-801 zeigte (Abbildung 3) (F₁,₆₉ = 24,5, P < 0,001). Medikamentös behandelte Fische verbrachten mehr Zeit in der Nähe des oberen Beckens, ein Muster, das gemeinhin als vermindertes ängstliches oder räuberfreundliches Verhalten interpretiert wird. Es gab keinen Haupteffekt von Geschlechtsverkehr (F1,69=2,52, P=0,12) oder Wechselwirkung zwischen Medikamenten und Geschlecht (F1,69=1,0, P=0,32). FDR-korrigierte paarweise T-Tests bestätigten, dass MK-801 sowohl bei Frauen (P = 0,0076) als auch bei Männern (P = 0,023) den Unterbodenabstand erhöhte.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass gelatinebasiertes Futter eine effektive orale Abgabe pharmakologischer Verbindungen ermöglicht, was zu erwarteten medikamentinduzierten Veränderungen im Bodenverhalten im neuartigen Tanktest führt.
Abbildung 1: Zubereitung von Gelatinefutter. Die Gelatine wurde in individuell angepassten Portionen, die 1 % der Körpermasse entsprachen, auf Paraffinfolie pipettiert und bei −20 °C einsetzen. Diese Abbildung wurde aus Ochocki et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Verzehr von gelatinebasiertem Futter durch erwachsene Zebrafische. (A) Prozentsatz der AB- und TL-Fische beider Geschlechter, die das Futter innerhalb von 5 Minuten nach der Verabreichung verzehrten. (B) Zeit zum Fütterungsessen von AB- und TL-Fischen nach Geschlecht. Fische, die das Futter nicht konsumierten, wurden aus der Time-to-Eat-Analyse ausgeschlossen. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. angezeigt; n = 8 Fische pro Sorte und Geschlecht. Diese Abbildung wurde aus Ochocki et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Verhaltenseffekte der Verabreichung des NMDA-Rezeptor-Antagonisten. MK-801 (4 mg/kg) wurde 30 Minuten vor dem neuartigen Aquariumtest bei erwachsenen AB-Zebrafischen beider Geschlechter verabreicht. Der Abstand vom Boden des Beckens wurde als Maß für angstähnliches/raubtierähnliches Verhalten verwendet. Die Daten werden als Box-and-Whisker-Diagramme präsentiert, die den Median (Mittellinie), den Interquartilbereich (Box) und ±1,5× den Interquartilbereich (Whiskers) zeigen. *P < 0,05 basierend auf paarweise t-Tests mit korrigierter Falschentdeckungsrate. Stichprobengrößen: weibliches Fahrzeug, n = 20; weiblich MK-801, n = 19; männliches Fahrzeug, n = 19; männlich MK-801, n = 15. Fünf Tiere wurden von der Analyse ausgeschlossen, weil sie das Gelatinefutter nicht konsumierten. Diese Abbildung wurde aus Ochocki et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
| Komponente | Bestandskonzentration | Zielkonzentration | Zielmasse/-volumen | Tatsächliche Masse/Volumen |
| Gelatine | - | 12 % (w/v) | 60 mg | 62 mg |
| Spirulina | - | 4 % (w/v) | 20 mg | 25 mg |
| Salzgarnelenextrakt | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 μL | 200 μL |
| Drogen | 10 mg/mL | 0,4 mg/μL (4 mg/kg bei 1 % Körperfett) | 20 μL | 25 μL |
| Wasser | - | - | 320 μL | 400 μL |
| Gesamtvolumen des Flüssigfutters | - | - | 500 μL | 625 μL |
| Totales Volumen des fertigen Feeds | - | - | 500 μL | 516,7 μL |
Tabelle 1: Beispiel für die Zubereitung von Gelatinefutter. Bestandskonzentrationen, Zielangabe und hypothetische tatsächliche Massen oder Volumen, die zur Herstellung eines gelatinebasierten Futters für eine 4 mg/kg Arzneimittelabgabe mit 1 % Körpergewicht verwendet werden.
Ergänzende Datei 1: Beispielzubereitung eines gelatinebasierten Futters für mehrere Fische. Ausgearbeitetes Beispiel, das die Formulierung des medikamentenhaltigen Futters und die Berechnung individueller Dosierungsmengen basierend auf dem individuellen Körpergewicht demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die hier vorgestellte gelatinebasierte Fütterungsmethode überwindet wichtige Einschränkungen gängiger Arzneimittelabgabemethoden bei Zebrafischen, indem sie eine individualisierte, körpermassenbasierte Dosierung mit minimaler Handhabung ermöglicht. Dies verbessert die experimentelle Präzision und Reproduzierbarkeit. Die hitzeformbare Natur der Gelatine ermöglicht es, eine einzelne homogene Zubereitung zu verflüssigen, genau zu portionieren und wieder zu individualisierten Häppchen zu verfestigen, wodurch eine gleichmäßige Arzneimittelverteilung gewährleistet und gleichzeitig die Größenvariabilität zwischen den Individuen berücksichtigt wird. Darüber hinaus vermeidet die orale Abgabe über Gelatinefutter den Stress und die potenziellen Verletzungen, die mit injektionsbasierten Methoden verbunden sind, was eine wichtige Verfeinerung im 3R-Rahmendarstellt.
Die Vorteile dieses Ansatzes hängen von einer genauen Ausführung ab. Mehrere Verfahrensfaktoren sind entscheidend für eine erfolgreiche Umsetzung. Eine genaue Messung der Körpermasse ist unerlässlich, da erwachsene Zebrafische auch innerhalb von Alters-, Geschlechts- und Stammgruppen eine erhebliche Größenvielfalt aufweisen können, wobei die Körpermasse bei den Individuenfast das Dreifache variiert. Eine gründliche Homogenisierung der Verbindung innerhalb der Gelatinematrix ist ebenso wichtig, um eine gleichmäßige Dosierung über die Futterbereiche hinweg zu gewährleisten. Schließlich reduziert die Gewöhnung der Fische an Gelatinefutter vor der Verabreichung der Arzneimittelvergabe die Futterverweigerung; Eine visuelle Bestätigung der Futteraufnahme wird empfohlen, um eine genaue Dosierung zu gewährleisten.
Selbst bei ordnungsgemäßer Ausführung gibt es jedoch einige praktische Herausforderungen bei der futterbasierten Arzneimittelabgabe. Ein mögliches Problem ist das falsche Einsetzen von Futterbissen, was zu einer schnellen Auflösung des Futters nach dem Einlegen ins Wasser führen kann. Dies resultiert typischerweise aus unzureichender Temperaturkontrolle und/oder Mischung während der Vorbereitung, längerem Erhitzen oder wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen der Rohstoffe. Um dies zu verhindern, sollte eine vollständige Gelatineauflösung durch richtiges Erhitzen und Mischen gewährleistet werden, und vorbereitete Brühe sollten in Einwegportionen abgelagert werden, die nur einmal aufgetaut und umgehend verwendet werden. Für empfindliche Zubereitungen wird empfohlen, ein zusätzliches Futterstück zuzubereiten, das in einen Becher mit Wasser gegeben werden kann, um die richtige Einstellung vor dem Versuch zu überprüfen. Für Verbindungen, die die Geschmacksfähigkeit des Futters verringern, kann die Akzeptanz durch die Einbeziehung von Lockstoffen wie Muschelsaft12˒13 oder kommerziellen Fischanlockern20 verbessert werden. In der vorliegenden Studie wurde Salzkrebsextrakt zur Verbesserung der Geschmacksbarkeit verwendet und erwies sich als wirksam. Alternativ kann die Verabreichung mehrerer kleinerer Dosen den Konsum verbessern und gleichzeitig die gewünschte kumulative Exposition erreichen. Über diese praktischen Überlegungen hinaus hat die futterbasierte Abgabe auch inhärente pharmakokinetische Einschränkungen. Wie bei allen oralen Verabreichungsmethoden kann die gastrointestinale Absorption die Bioverfügbarkeit im Vergleich zu injektionsbasierten Ansätzen verzögern oder verringern, und die Stabilität der Verbindungen innerhalb der Futtermatrix kann variieren.
Trotz der Akklimatisierung konsumiert ein kleiner Teil der Tiere möglicherweise nicht das Gelatinefutter und sollte von der Analyse ausgeschlossen werden, da sie möglicherweise nicht die erwartete Medikamentendosis erhalten. Die Ablehnungsraten liegen typischerweise zwischen 2,4 % und 6,4 % und stellen daher keine größere methodische Hürde dar. Auch die Futteraufnahme kann je nach Sorte variieren. Dieser Stammeffekt stimmt mit früheren Berichten überein, die darauf hindeuten, dass der genetische Hintergrund die Latenz beim Annähern an Food20 beeinflussen kann. Diese Faktoren sollten bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden. Die Meldung der Fütterungscompliance zusammen mit der Stammidentität wird empfohlen, um Transparenz und Reproduzierbarkeit zu verbessern.
Eine weitere wichtige Einschränkung der vorliegenden Studie ist, dass das Protokoll ausschließlich bei erwachsenen Zebrafischen entwickelt und validiert wurde und daher nicht direkt auf das Larvenstadium übertragen werden kann. Diese Methode basiert auf einer individualisierten, auf Körpermasse basierenden Dosierung und Aufnahme diskreter Gelatinestückchen. Dies ist bei erwachsenen Tieren machbar, aber bei Larven aufgrund ihrer kleinen Lückengröße, ihres suspendierten Fressverhaltens und der Schwierigkeiten, verlässliche individuelle Körpermassenmessungen zu erhalten, unpraktisch. Folglich würde die Anpassung an Larvenanwendungen erhebliche Modifikationen erfordern. Diese Veränderungen könnten die Entwicklung von Mikroteilchen und alternativen Abgabestrategien umfassen.
Im Vergleich zu zuvor beschriebenen futtermittelbasierten Methoden bietet dieser Ansatz eine überlegene Dosierungsgenauigkeit und einfache Anwendung. Kommerzielle Gelatinefuttermittel erfordern eine Portionierung heterogenen Materials, wobei die Dosisgenauigkeit12 begrenzt wird, während andere Methoden gleichmäßige Mengen an alle Tiere verabreichen und von einer identischen Körpermassevon 14,21 annehmen. Durch die Möglichkeit einer individuellen Dosierung vermeidet die hier beschriebene gelatinebasierte Fütterungsmethode Unter- oder Überdosierung und verbessert die experimentelle Kontrolle; Dies bringt auch die Medikamentendosierung bei erwachsenen Zebrafischen in Einklang mit bewährten Praktiken bei Nagetieren, die typischerweise nach Gewicht dosieren. Diese Methode eignet sich auch gut für Studien, die präzise, wiederholte pharmakologische Manipulationen erfordern, da sie zu minimalem Stress führt. Dies umfasst Anwendungen in der Verhaltensneurowissenschaft, Neuropharmakologie und Alterungsforschung. Es ist auch vorteilhaft für Verbindungen, die mit Anästhetika interagieren oder in wässrigen Umgebungen eine schlechte Stabilität aufweisen. Obwohl er hier bei adulten Zebrafischen demonstriert wurde, lässt sich dieser Ansatz leicht an andere aquatische Modellorganismen anpassen. Insgesamt verbessert diese Technik die Dosierungspräzision, das Tierwohl und die methodische Flexibilität und erweitert den Nutzen von Fischmodellen in der biomedizinischen Forschung.
Offenlegungen
Dieses Protokoll basiert auf Arbeiten, die zuvor im Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 2023,11, veröffentlicht wurden. Der vorliegende Artikel bietet eine detaillierte und erweiterte methodische Anleitung zur Reproduzierbarkeit.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R35GM142566) von J.W.K. unterstützt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| Gelatin aus Schweinehautpulver | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | Gelstärke ~300 g Bloom, Typ A, Bioreagens |
| Mikro Feine getrocknete Artemialarven | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | Fein < 400 Mikron |
| Spirulina-Pulver | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% reine blaugrüne Algen |
Referenzen
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