Universelles Druckladegerät für die Bildgebung von lebenden Zellen unter anhaltender physiologisch-mechanischer Belastung

Summary

Das hier beschriebene Druckbelastungsgerät ermöglicht zeitrafferbasierte optische Bildgebung kultivierter Zellen und ist kompatibel mit Standard-Zellkulturschalen und invertierten Mikroskopen. Mit diesem Gerät wird bestätigt, dass die hydrostatische Druck-Mikroumgebung des Tumors die Kalziumsignaltransduktion verbessert und so eine praktikable Grundlage für die Untersuchung der mechanischen Signaltransduktion in der Tumormikroumgebung bietet.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein hydrostatisches Druckladegerät, das eine mikroskopische Echtzeitbeobachtung der adhärenten Zellen während anhaltender hydrostatischer Druckstimulation ermöglicht und mit 3,5 cm kommerziellen Zellkulturschalen kompatibel ist. Das Gerät besteht aus einer luftdichten Kulturkammer aus einer Aluminiumbasis, einer optisch transparenten Poly(Methylmethacrylat)-Abdeckung, in die Abdeckung integrierten Gasein- und Auslassöffnungen und einem versiegelten Beobachtungsfenster. Durch den Anschluss an eine regulierte Gasquelle hält das Gerät einen stabilen hydrostatischen Druck (0–200 kPa, einstellbar) und ermöglicht gleichzeitig kontinuierliche Phasenkontrast- oder Fluoreszenzbildgebung. Mit diesem Druckladegerät können druckinduzierte, dosisabhängige Effekte auf den Zellphänotyp und -verhalten wie Morphologie, Proliferation und Migration aufgezeichnet werden. Darüber hinaus können fluoreszierende Signale auch in Echtzeit aufgezeichnet werden. Hier wurden druckausgelöste^Ca-2⁺ -Signalheterogenität und -dynamik in Brustkrebs-MDA-MB-231-Zellen und Gebärmutterhalskrebs-HeLa-Zellen beobachtet und durch eine invertierte Fluoreszenzmikroskopie mittels Zeitrafferbildgebung quantifiziert. Diese Plattform integriert mechanische Belastung mit Live-Cell-Bildgebung, um die Einschränkungen herkömmlicher Endpunktsysteme zu überwinden, und bietet ein universelles Werkzeug für mechanobiologische Studien.

Introduction

Zahlreiche Zellen, Gewebe und Organe erfahren anhaltende oder intermittierende Kompressionskräfte als Teil^{ihrer Physiologie}. Beispielsweise werden alveoläre Zellen während der Atmung² einem zyklischen Druck ausgesetzt, während die Blasenepithelzellen während der Urinretention mechanische Belastungen^{ausgesetzt sind 3}. In pathologischen Kontexten wie soliden Tumoren sind Krebszellen kontinuierlich Druckkräften ausgesetzt, die durch räumliche Einschließung und erhöhten Zwischenflüssigkeitsdruck^{entstehen 4}. Ähnlich unterliegen bei anderen Erkrankungen wie Meniskusdegeneration und Lungenfibrose Meniskalkzellen⁵ und alveoläre Epithelzellen⁶ anhaltenden mechanischen Belastungen durch Spannungs- und Matrixsteifigkeitsdruck.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass mechanischer Druck als starker Regulator des Zellphänotyps und des Verhaltens ^7,8 wirkt. In nicht-bösartigen Zellen verstärkt kompressiver Stress die Vermehrung parodontaler Stammzellen und induziert durch invasive Auswüchsungen eine Osteoklastenfusion⁹. Im Gegensatz dazu zeigt Kompression in Krebsmodellen Janus-Effekte: Sie unterdrückt die Proliferation und Migration von Melanomzellen, während gleichzeitig die transkriptomische Reprogrammierung aktiviert wird, die Chemoresistenz^10,11 fördert. Darüber hinaus kann die durch hyperosmotischen Druck verursachte volumetrische Kompression eine intrazelluläre Verengung auslösen und die Umverteilung der Proteinkonzentration sowie der Ionenstärke durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) stimulieren, was das Zellverhalten und -schicksal grundlegend verändert. Diese physische Störung fördert die Expansion der intestinalen Organoide durch aktivierte Wnt/β-Catenin-Signalübertragung und erhöht die Selbsterneuerung der Darmstammzellen¹². Darüber hinaus ist im Zellkern die durch Volumenänderungen induzierte LLPS an der gen-transkriptionellen Kontrolle durch die Koordination von Transkriptionsinitiierung, Verlängerung und -Termination^{beteiligt 13,14}.

Um diese druckinduzierten biologischen Effekte quantitativ zu untersuchen, sind experimentelle Systeme, die in der Lage sind, wohldefinierte und homogene kompressive Reize anzuwenden, unerlässlich. Für in vitro kultivierte Zellen, die von einem wässrigen Medium umgeben sind, dient der hydrostatische Druck als primäres und physiologisch relevantes Mittel zur Anwendung solcher Druckkräfte, das weit verbreitet zur Untersuchung der zellulären Mechanotransduktion¹⁵ verwendet wurde. Hydrostatischer Druck kann die alkalische Phosphataseaktivität erhöhen und die Osteogenese von menschlichen, fettabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen ohne Supplementierung von osteoinduktiven Faktoren^{beschleunigen}. Bei nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung können mechanische Kräfte wie hydrostatischer Druck zu portaler Hypertonie beitragen, ohne eine signifikante Fibrose zu haben, was ihre Rolle für die Gewebevielfalt^{unterstreicht 17}. Obwohl der hydrostatische Druck eine wichtige Rolle bei der pathophysiologischen Regulation spielt, stehen mechanistische Studien des hydrostatischen Drucks vor einer kritischen Einschränkung: Konventionelle Druckkammern verhindern die Echtzeitbeobachtung lebender Zellen während der Stimulation. Die meisten experimentellen Systeme erlauben nur Endpunktanalysen und verbergen räumliche und zeitliche Dynamiken von Mechanotransduktionsereignissen, wie etwa die Piezo1-Mechanoaktivierung, die Ca²⁺-Flussheterogenität und die Zytoskelettreorganisation. Diese Lücke begrenzte das Verständnis dafür, wie hydrostatischer Druck die Vielfalt der Phänotypen in Tumoren oder anderen Geweben antreibt.

Um diese technologische Lücke zu schließen, wurde eine neuartige experimentelle Plattform entwickelt, die eine Echtzeitbeobachtung zellulärer Reaktionen auf präzise kontrollierten hydrostatischen Druck mittels optischer Bildgebung ermöglicht. Dieses System integriert drei zentrale Funktionen: (1) Anwendung eines anhaltenden hydrostatischen Drucks im Bereich von 0–100 kPa über einen einstellbaren Gasdruckregler (Die Druckanzeige hat einen Bereich von 0–200 kPa, und die angelegten Drücke können anhand physiologischer Parameter ausgewählt werden. Zum Beispiel basierend auf den berichteten kompressiven Belastungen verschiedener Zelltypen: 8–16 kPa für menschliche Knochenmarkstromenzellen¹⁸, 12–24 kPa für glatte Gefäßzellen¹⁹ und 0–15 kPa für menschliche Mammariatepithelzellen²⁰.); (2) kontinuierliche Live-Cell-Bildgebung mit hoher zeitlicher Auflösung bei hydrostatischem Druckanwendung; und (3) die Aufrechterhaltung physiologischer Kulturbedingungen während ausgedehnter Experimente. Dieser Ansatz ermöglicht eine direkte Visualisierung dynamischer Prozesse, einschließlich der Rekrutierung und Aktivierung von Piezo1-Kanälen, Kalziumsignalwellen und zytoskelettaler Remodellierung, die als Reaktion auf mechanische Stimulation auftreten. Darüber hinaus ist dieses Gerät mit den meisten kommerziell erhältlichen Kulturschalen und umgekehrten Mikroskopen kompatibel, was die Anwendung in Laboren äußerst praktisch macht. Die Fähigkeit, diese intrazellulären biochemischen Ereignisse in Echtzeit zu überwachen, liefert beispiellose Einblicke darin, wie Zellen hydrostatischen Druck wahrnehmen und sich daran anpassen. Durch die Erfassung der zeitlichen Abfolge mechanotransduktions-Ereignisse, zu denen die anfängliche Kraftwahrnehmung, nachgeschaltete Signalübertragung und phänotypische Veränderungen gehören, bietet diese Plattform ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen, durch die hydrostatischer Druck das Zellverhalten in physiologischen und pathologischen Kontexten beeinflusst.

Protocol

1. Materialien

1. Gerätespezifikationen (siehe Abbildung 1)
   1. Bereiten Sie die Komponenten basierend auf den unten genannten Spezifikationen vor:
      Sockel: Aluminium (Ø 56 mm, Höhe 15 mm), zentrales Fenster Ø 40 mm.
      Abdeckung: PMMA (Ø 56 mm) mit: 6 × M3 Gewindelöchern, Luer-Lock-Gasanschluss, Silikondichtung (Innendurchmesser 25 mm, Außendurchmesser 32 mm, Dicke 0,8 mm)
      Druckregler: (0–200 kPa Bereich)
2. Zellen und Reagenzien
   1. Verwenden Sie in dieser Studie MDA-MB-231- und HeLa-Zellen. Verwenden Sie L-15-Medium, RPMI-1640-Medium, Neugeborenen-Kalbserum (NCS), 1%-antimykotische Lösung und eine Kalziumbildgebungssonde für Zellkultur und^Ca-2+-Markierung.

2. Gerätevorbereitung

1. Herstellung
   1. Individuelle Gestaltung ist der zentrale Bestandteil dieser Studie. Präzisionsbearbeitung des Aluminiumsockels und der PMMA-Abdeckung gemäß den Spezifikationen (siehe Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1).
   2. Schneiden Sie die Silikondichtung durch und verarbeiten Sie sie auf die gewünschte Größe.
      HINWEIS: Die optische Transmission von PMMA-Materialien ist ausreichend für die Standardbildgebung durch durchgebranntes Licht. Alle Komponenten waren sterilisierbar und biokompatibel für nachfolgende Zellkulturexperimente. An die Herstellungstoleranzen dieser Kammer werden keine besonderen Anforderungen gestellt (in dieser Studie wurde eine Toleranz von ±0,1 mm eingeführt).
2. Sterilisation
   1. Um die Basis (Aluminium) zu sterilisieren, autoklavieren Sie sie bei 121 °C für 20 Minuten.
   2. Um die Abdeckung (PMMA) zu sterilisieren, wischen Sie sie mit 75 % Ethanol ab und anschließend 30 Minuten mit UV-Sterilisation.
   3. Sterilisiere die Silikondichtung durch Autoklavierung bei 121 °C für 20 Minuten.

3. Zellverarbeitung

1. Zellkultur
   1. Samenzellen in 35 mm bilden eine Konfluenz von 30 % bis 70 %. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in RPMI-1640- oder L15-Medium (ergänzt mit 10 % NCS) in einem CO-2-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Zur Zellübergabe dissoziieren Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin und beenden Sie die Verdauung mit einem vollständigen Medium. Verwenden Sie die Zellen zum Neuaussäen, sobald sie 70–80% Zusammenfluss erreicht haben.
2. Ca²⁺ Verfärbung
   1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in einem Biosicherheitsschrank.
   2. Färben Sie das interzelluläre Ca²⁺ mit einer 5 μM großen Calcium-Bildsonde in serumfreiem Medium. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung.
   3. Entferne den Farbstoff, wasche die Zellen dreimal mit HBSS und entesterifiziere dann 30 Minuten in serumfreiem Medium.

4. Bauelementmontage (Abbildung 2)

1. Übertrage die Kulturschüssel in das zentrale Fenster der Druckkammer und entferne dann das Kulturmedium.
2. Lege die sterilisierte Dichtung in die Kulturschale.
3. Richten Sie die Abdeckung über dem Schüsseldichtungsstapel aus.
4. Ziehen Sie die Schrauben diagonal an, indem Sie sie zuerst von Hand anziehen, bis Widerstand spürbar ist, und fügen Sie dann 1,5 zusätzliche Drehungen mit einem drehmomentgesteuerten Treiber hinzu.
5. Schließen Sie das Silikongasrohr an den Luer-Lock-Port an und injizieren Sie das gemischte Gas in das Gerät, um auf Leckagen zu prüfen.
6. Trennen Sie das Silikongasrohr und spritzen Sie frisches Medium durch den Luer-Lock-Port mit einer 5-mL sterilen Spritze in die Zellkulturschüssel.

5. Druckbelastung und Bildgebung

1. Verbinden Sie Silikongasrohr (Innendurchmesser 4 mm) vom Luer-Lock-Anschluss an der Silikondichtung mit dem digitalen Druckmessgerät und dem Gastank.
2. Montage des montierten Geräts auf der Mikroskop-Bühne.
3. Kalibrieren Sie den Druck.
   1. Validieren Sie die Stabilität des 0–200 kPa-Bereichs mithilfe des Messgeräts.
      HINWEIS: Für die HeLa-Zellkultur wird ein gemischtes Gas verwendet, das 75 % Stickstoff, 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid enthält. Ein gemischtes Gas, das 80 % Stickstoff und 20 % Sauerstoff enthält, wird für die MDA-MB-231-Zellkultur verwendet. Der im Druckbelastungsexperiment verwendete Gastyp kann je nach Zelltyp, Mediumtyp oder spezifischen experimentellen Anforderungen ersetzt werden. Keine Komponenten sind modellspezifisch, und die Abmessungen des Druckmessmoduls und seines Einlassrohrs können nach Bedarf ausgewählt werden.
4. Stellen Sie den Zieldruck (z. B. 100 kPa) über den digitalen Druckregler ein.
5. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme, sobald der Zieldruck erreicht ist.
6. Bildgebung
   1. Stellen Sie die Stufe ein, bestätigen Sie den Bildbereich und stellen Sie sicher, dass die Zellen scharf sind.
   2. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder von gefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 20×-Objektiv auf, mit folgenden Parametern: 400 ms Belichtungszeit, 5 Sekunden Zeitrafferintervalle und eine Gesamtbildaufnahme von 10 Minuten (FITC-Filter: Ex/Em = 490/525 nm, Cutoff = 515 nm).
   3. Fotografieren Sie unter druckfreien Bedingungen für 10 Minuten, um den ordnungsgemäßen Betrieb des Systems sicherzustellen und Basissignaldaten zu erhalten.
   4. Nach dem Öffnen des Gasventils zum Ladedruck stellen Sie die Bühnengröße neu ein, um sicherzustellen, dass die Zellen scharf sind, und beginnen Sie dann mit der Abbildung dynamischer Kalziumsignale.
   5. Wählen Sie das Objektivobjektiv basierend auf der unteren Dicke der Kulturschale und dem Arbeitsabstand des Objektivs. Wählen Sie die Belichtungszeit, die genutzt wird, um die Überwachung der Calciumsignaloszillationen zu ermöglichen und gleichzeitig übermäßiges Photobleaching und Fotoschäden zu vermeiden.
   6. Passen Sie die Parameter entsprechend dem Sondentyp und den experimentellen Anforderungen an, wenn Sie andere dynamische Signale beobachten.

6. Fehlerbehebung

1. Siehe Tabelle 1 für Hinweise zur Fehlerbehebung.

7. Statistische Analyse

1. Präsentieren Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Die GraphPad Prism-Software (USA) wurde verwendet, um Ergebnisse zwischen zwei Gruppen mit dem ungepaarten Schüler-t-Test zu vergleichen. Betrachten Sie Unterschiede als statistisch signifikant, wenn **p < 0,01, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001.

Results

Um die Echtzeitbildgebende Funktion dieses hydrostatischen Druckbelastungsgeräts zu überprüfen, wurden die Dynamik der Kalziumsignale in Tumorzellen nach der Anwendung von hydrostatischem Druck beobachtet. Konfluente MDA-MB-231-, HeLa- und A549-Zellen wurden in 35-mm-Kulturschalen für die spätere Verwendung eingesät. Nach der Färbung mit einer Calciumbildgebenden Sonde wurden die serumfreien kultivierten Zellen einem hydrostatischen Druck von 40 kPa ausgesetzt. Nach 10 Minuten hydrostati...

Discussion

Dieses Protokoll zeigte ein universell anpassungsfähiges Druckbelastungsgerät, das eine Echtzeitbeobachtung der mechanotransduktiven Dynamik unter abstimmbarem hydrostatischem Druck ermöglichte. Durch die Integration einer optisch transparenten PMMA-Abdeckung mit einer präzisionsgefrästen Aluminiumbasis überwindet das System die kritische Einschränkung herkömmlicher Kammern, die nur Endpunktanalysen durchführen können. Dieses Druckbelastende Gerät, das mit einem Standard-Invertiertenmikr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	1 % Konzentration im vollständigen Medium
Autoklav	Panasonic, Japan	MLS-3751-PC	Zur Sterilisation des Aluminiumsockels und der Silikondichtung
Biosicherheitsschrank	Thermo Fisher Scientific, USA	1300 Serie A2 Klasse II, Typ A2 Biologische Sicherheitsschränke	Bietet eine sterile Umgebung für die Zellhandhabung
Cal-520 AM, zell-permatierter Kalziumindikator	AAT Bioquest, USA	21131	Zur dynamischen Detektion der Calciumionenkonzentration in lebenden Zellen
Zellkulturschale (35 mm)	BIOFIL, China	TCD010035	Standard-35-mm-Schüssel für die Aussaatzelle
Kammerbasis (Aluminium)	Quanyi, China	/	Maßgeschneidert Ø 56 mm, H 15 mm, zentrales Fenster & Oslash; 40 mm
Kammerabdeckung (PMMA)	Quanyi,  China	/	Maßgeschneidert Ø 56 mm, mit 6&-fach; M3-Gewindelöcher, Luer-Lock-Gasöffnung
CO2 Inkubator	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	Hält die Kulturbedingungen bei 37 °F aufrecht; C mit oder ohne 5 % CO2
HBSS (Hanks' ausgewogene Salzlösung)	Beyotime, China	C0219	Zum Waschen von Zellen vor und nach der Färbung
HeLa-Zelllinie	Zellressourcenzentrum, Institut für Basismedizinische Wissenschaften, CAMS/PUMC, China	CRM-CCL-2	Menschliche Gebärmutterhalskrebszellen
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Nikon, Japan	Eclipse Ti2	Für die Fluoreszenzbildgebung
Leibovitz' L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	Für MDA-MB-231-Zellkultur
MDA-MB-231-Zelllinie	Zellressourcenzentrum, Institut für Basismedizinische Wissenschaften, CAMS/PUMC, China	CRM-HTB-26	Menschliche Brustkrebszellen
Neugeborenenkalbserum (NCS)	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	10 % Konzentration im vollständigen Medium
Druckregler	Hongrun, China	DP20	Reichweite: 0–200 kPa
RPMI 1640 Mittel	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	Für MDA-MB-231-Zellkultur
Sterile Spritze (5 ml)	KDL, China	1101010198	Zum Einbringen von Medium oder Reagenzien durch den Luer-Lock-Port
Trypsin (0,25 %)	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	Zur Dissoziation von adhärenten Zellen zum Passaging