NetDecoder-Protokoll zum Aufbau kontextspezifischer Protein-Interaktionsnetzwerke aus transkriptomischen Daten mittels Informationsflussmodellierung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um NetDecoder, ein Netzwerkmodellierungstool, kontextspezifische Proteininteraktionsnetzwerke zu konstruieren und Gen-Utility-Modelle (GUMs) zu erstellen. Mit Transkriptomik-Daten in Kombination mit kuratierten Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) ermöglicht NetDecoder die Identifikation wichtiger Ziele und Subnetzwerke.

Zusammenfassung

Die differentielle Expressionsanalyse ist eine häufig verwendete Technik zur Bestimmung potenzieller therapeutischer Ziele, übersieht jedoch die Komplexität von Gennetzwerken über biologische Wege hinweg. Oft erklären hochexprimierte Gene nicht unbedingt die Eigenschaften eines biologischen Phänotyps. NetDecoder, ein Netzwerkbiologie-Werkzeug, das transkriptomische Daten mit Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) integriert, um kontextspezifischen Informationsfluss, Gennutzen sowie Schlüsselkanten und differenziell genutzte Gennetzwerke zu modellieren, wurde entwickelt, um diese Einschränkung der differentiellen Expressionsanalyse zu adressieren.

Dieses Protokoll ist eine anfängerfreundliche, Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Nutzung von NetDecoder, mit umfassenden Richtlinien über Datenvorverarbeitung, NetDecoder-Ausführung bis zur Analyse der Ausgaben. Der Workflow umfasst Softwarekonfiguration, Netzwerkaufbau und flussbasierte Modellierungsanalyse, um Unterschiede in Gen- (Knoten-) und Gen-Gen-Interaktionen (Edge-Level) zwischen biologischen Bedingungen zu quantifizieren. Die resultierenden Ausgaben umfassen Schlüsselziele und Router, Subnetze mit unterschiedlichen Strömungen und Randflussverteilungen, die die Identifikation wichtiger regulatorischer Gene und Signalwege ermöglichen, die mit bestimmten biologischen Zuständen assoziiert sind. Nach Befolgung der genannten Schritte können Forscher unabhängige Forschungen durchführen, um phänotypischen Genfluss über Phänotypen hinweg mithilfe transkriptomischer Daten und kuratierter PPI-Netzwerke aufzudecken.

Einleitung

Die Auswahl von Genen und zugehörigen Signalwegen für therapeutische Untersuchungen wird oft durch differentielle Expressionsanalysen^{geleitet 1}. Diese Analysemethode ist wirksam, um zu bestimmen, wie sich die Genexpression zwischen zwei oder mehr Bedingungen unterscheidet. Gene hingegen funktionieren innerhalb komplexer, miteinander verbundener biologischer Netzwerke, was bedeutet, dass die individuelle Genexpression nicht vollständig erfasst, wie Gene in einem Netzwerk interagieren und wie sie gen-gen-Beziehungen haben². Netzwerkpropagationsmethoden integrieren Genexpression mit Interaktionsnetzwerken, um biologisch wichtige Gene zu identifizieren, die durch unterschiedliche Expression allein übersehen werden könnten³. Aktuelle Ansätze quantifizieren nicht explizit die funktionelle Bedeutung von Genen und wie biologische Informationen innerhalb von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) über biologische Bedingungen hinweg umverteilt werden. Daher wurde eine Methode zur Modellierung bedingungsspezifischer Netzwerkverhalten und zur Quantifizierung von Veränderungen im Informationsfluss über biologische Systeme hinweg benötigt. Um zu erklären, wie Gene innerhalb eines größeren biologischen Netzwerks interagieren, wurde NetDecoder, eine Netzwerkbiologie-Plattform, entwickelt, um Gene mit dem größten Informationsflussunterschied zwischen den Bedingungen aufzudecken. NetDecoder verwendet einen prozessgesteuerten Flussalgorithmus, um bestehendes Wissen über das menschliche PPI-Netzwerk in Kombination mit Bulk-RNA-Sequenzierungsdaten zu übersetzen, um ein Modell informationsflussgetriebener Interaktionen zu erstellen⁴.

Mit Informationsflussdaten für phänotypische Netzwerke kann ein Gen-Utility-Modell (GUM)⁵ entwickelt werden, um Gene mit hohem Informationsfluss als Gene mit dem höchsten Gesamtgennutzen innerhalb eines Netzwerks zu identifizieren, unabhängig von ihren unterschiedlichen Expressionswerten. Dieser Ansatz unterstützt effektivere Strategien zur Zielpriorisierung und Identifikation und liefert Erkenntnisse, die traditionelle Analysen oft übersehen. Im Gegensatz zu traditionellen differenziellen Expressions- oder korrelationsbasierten Netzwerkmethoden quantifiziert NetDecoder sowohl Gen- (Knotenebene) als auch Interaktionsänderungen (Randebene) im Informationsfluss, was die Identifikation funktionell wichtiger Gene ermöglicht, auch ohne große Expressionsänderungen ^4,5. NetDecoder ist weithin anwendbar für Bulk-RNA-Sequenzierungsdatensätze, die vergleichende Analysen zwischen zwei biologischen Bedingungen erfordern und so die Identifikation von Änderungen im Informationsfluss und in der Netzwerkorganisation ermöglichen. Obwohl NetDecoder die Integration anderer Omics-Datensätze, einschließlich Proteomik und Epigenomik, unterstützt, demonstriert das vorliegende Protokoll speziell den Arbeitsablauf unter Verwendung transkriptomischer Daten. In diesen Anwendungen können Nutzer Quellgene basierend auf Proteinen oder epigenetisch regulierten Genen definieren, wodurch eine Informationsflussanalyse aus diesen molekularen Merkmalen initiiert werden kann. Diese Flexibilität ermöglicht die Einbindung von Multi-Omics-Evidenz in netzwerkbasierte Analysen und erleichtert die Entdeckung intermodaler regulatorischer Mechanismen, die phänotypischen Unterschieden zugrunde liegen.

Gängige Studiendesigns umfassen binäre Vergleiche, darunter aber nicht beschränkt auf Krankheit versus gesunde Zustände, Behandlungsresponder vs. Nicht-Responder, medikamentöse Behandlungen, Knockdowns oder Knockouts versus Kontrollexperimente sowie Analysen von Entwicklungs- oder zellulären Zustandsübergängen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren Rahmen für die Anwendung von NetDecoder zu illustrieren, um Gene mit verändertem Netzwerkeinfluss über biologische Bedingungen hinweg aufzudecken. Dies wird durch leicht verständliche Schritte zur Einrichtung und Ausführung von NetDecoder erreicht, sowie durch Beispiele und grundlegende Fehlerbehebungstechniken, und Methoden zur Ergebnisinterpretation sind ebenfalls im Protokoll festgelegt.

Protokoll

Diese Studie nutzte öffentlich zugängliche RNA-Sequenzierungsdatensätze und bezog sich nicht direkt an Menschen oder Tiere. Daher waren keine Genehmigung des Prüfungsausschusses und eine informierte Zustimmung erforderlich.

HINWEIS: NetDecoder benötigt folgende Eingabedateien: normalisierte Genexpression über zwei definierte biologische Zustände; eine Metadatendatei, die die biologischen Bedingungen beschreibt; eine Liste von Quellgenen für den Netzwerkaufbau und die Modellierung; ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) aus dem öffentlichen Bereich; und ein kantengewichtetes Netzwerk (EWN), das für jede biologische Bedingung gebaut wurde.

1. Datenvorbereitung

1. Abruf von Bulk-RNA-Sequenzierungs-Expressionsdaten und Metadaten
   1. Laden Sie RNA-Sequenzierungsdaten (Matrix der rohen Genexpressionszählungen und Probennamen) sowie entsprechende Metadaten (Probennamen, Bedingungen usw.) aus einem öffentlichen Repository wie dem Gene Expression Omnibus (GEO) herunter oder verwenden Sie laborgenerierte experimentelle Datensätze. Typischerweise handelt es sich dabei um eine Matrix, in der Zeilen Gennamen entsprechen und Spalten Stichprobennamen.
      HINWEIS: Der Beispieldatensatz, der dieses Protokoll demonstriert, stammt aus dem National Omics Data Encyclopedia (NODE) Repository (BioSino-Datenbank) unter Beitrag OEP001105⁶. Benutzer können ihre eigenen Bulk-RNA-Sequenzierungsdatensätze ersetzen.
   2. Erstelle eine Beispiel-Annotationsdatei (Metadaten), indem du Beispielnamen und deren Gruppen oder zugehörige Bedingungen einfügst; Zum Beispiel sind "Kontrolle" und "Krankheit" häufige Zustandstypen. Bestätigen Sie, dass die Beispielnamen zwischen den Metadaten- und Ausdrucksdateien übereinstimmen.
2. Aggregierte Ausdrucksdaten und Metadaten
   1. Stellen Sie sicher, dass die generierte Datenmatrix Expressionszählungen, Gennamen und eine Metadatendatei mit Probennamen und Bedingungen enthält. Falls nötig, verwenden Sie ein R-Paket wie org. Hs.eg.db (menschlich) oder AnnotationDbi, um verschiedene Genidentifikatoren abzugleichen.
   2. Entfernen Sie nicht wesentliche Informationen aus der Metadatendatei mit R oder einer ähnlichen Programmiersprache.
   3. Kombinieren Sie die Informationen aus den Ausdruckszähldateien zu einer einzigen Datei zur einfachen Bearbeitung.
3. Filterexpressionsdaten
   1. Verarbeiten Sie die Genexpressionsdatenmatrix vor, indem Sie Genduplikate, Nullwerte (NA), niedrige Expression (<10 Gesamtzählungen) und/oder Gene mit niedriger Varianz usw. ausschließen.
4. Datenvorverarbeitung
   1. RNA-Sequenzierungsnormalisierung und Analyse der differenziellen Expression
      HINWEIS: Dieser Schritt ist einer (1.4.1) von zwei (1.4.2) Ansätzen zur Auswahl von Genen für die Erstellung des Edge Weighted Network (EWN) und die Auswahl der Quellgen-Gene (Schritte 1.5–1.6) beim Beginn der Analyse aus Bulk-RNA-Sequenzierungsdaten. Alternativ kann Pearson-Korrelationsbasierte Template-Matching verwendet werden, indem man zu Schritt 1.4.3 springt.
      1. Führen Sie in dieser Phase Gen-ID-Umwandlungen mit dem R-Paket AnnotationDbi zusammen mit einzelnen Organismuspaketen durch. NetDecoder verwendet Gensymbole (d. h. Gen-ID), die mit dem Beispiel-PPI übereinstimmen.
      2. Führen Sie Normalisierungs- und Differentialexpressionsanalysen zwischen zwei Bedingungen mit den R-Paketen limma, edgeR, DESeq2 oder vergleichbaren Werkzeugen durch.
      3. Wenn DESeq2 verwendet wird, konstruiere einen DESeq-Datensatz mit der Funktion DESeqDataSetFromMatrix() mit einer Zählmatrix (Gene und Proben) und Probenmetadaten (Bedingungen) als Eingabe.
      4. Verwenden Sie die DESeq()-Funktion mit den Standardeinstellungen auf dem in Schritt 1.4.1.3 erstellten Objekt, um differenzielle Ausdruckswerte zu berechnen.
      5. Speichere die Ergebnisse in einer Datenmatrix mit Genidentifikatoren (Gen-ID) als Zeilennamen und Schlüsselausgaben, einschließlich log2-facher Änderung (log2FC), p-Wert und angepasstem p-Wert als Spalten.
      6. Optional filtern Sie die Ergebnisse nach angepasstem p-Wert (<0,05) und/oder log2FC-Werten (zum Beispiel: |log2FC| > 1) mit dplyr oder einem vergleichbaren Werkzeug.
      7. Stellen Sie sicher, dass alle verarbeiteten Genlisten und log2-fachen Änderungsmatrizen als tab-getrennte (.txt oder .csv) Dateien exportiert werden, um sie in NetDecoder einzugeben.
      8. Führen Sie paarweise Vergleiche für Schritt 1.4.1 durch, wenn mehr als zwei biologische Bedingungen verwendet werden, und erhalten Sie paarweise Ergebnisse mit der results()-Funktion aus dem DESeq-Objekt, das in Schritt 1.4.1.5 erzeugt wurde.
   2. Mikroarray-Expressionsnormalisierung – Optional
      HINWEIS: Wenn Sie Microarray-Daten verwenden, führen Sie diesen Schritt zur Datennormalisierung durch.
      1. Normalisieren Sie Daten, indem Sie das NetDecoder-Normalisierungsskript (HuLiLab/NetDecoder_Example/raw_data/NetDecoder_normalize) öffnen. R), zugänglich von https://github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main, in einer R-Entwicklungsplattform, und den kursivgedruckten Teil bearbeiten, um mit dem Arbeitsverzeichnis mit den Zellintensitätsdateien (CEL) übereinzustimmen.
         setwd(~/NetDecoder_Example/raw_data/CEL_files)
   3. Vorlagenabgleiche – Optional
      HINWEIS: Dies ist der zweite optionale Ansatz, falls keine differentielle Ausdrucksanalyse (wie in den Schritten 1.1–1.4.1 der "Datenvorbereitung" dargelegt) durchgeführt wird.
      1. Für RNA-Sequenzierungsdaten, die nicht über limma, edgeR und DESeq2 verarbeitet werden, führen Sie eine externe Normalisierung vor, bevor Sie Template-Matching anwenden. Für Mikroarray-Daten verwenden Sie direkt die normalisierten Ausdruckswerte, die in den Schritten 1.1–1.4.2 generiert wurden.
      2. Wählen Sie die Kontrollbedingung als Ausgangslage für die Genexpression und vergleichen Sie normalisierte Genexpressionswerte aus allen anderen interessanten Zuständen.
      3. Berechnen Sie die Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen dem Expressionsprofil jedes Gens und der ausgewählten Vorlage. Es wird empfohlen, Gene mit statistisch signifikanten Korrelationen (p < 0,05) und einem absoluten Korrelationskoeffizienten oberhalb einer benutzerdefinierten Schwelle (wie |r| > 0,7) beizubehalten.
5. Auswahl der Quellgene
   HINWEIS: Die Eingabe für diesen Schritt besteht aus der normalisierten Genexpressionsmatrix, die in den Schritten 1.1–1.4 entwickelt wurde.
   1. Wählen Sie einen Satz bedeutender Gene aus, die als Quellgene verwendet werden. Für differenziell ausdrucksbasierte Workflows wählen Sie angepasste p-Wert- und log2FC-Schwellenwerte (wie z. B. adj p-Wert < 0,05 und |log2FC| > 2). Für Workflows zur Vorlagenabgleichung wählen Sie Quellgene aus den signifikant korrelierten Genen, die in Schritt 1.4.3.3 identifiziert wurden, anhand der gewählten Korrelations- und Signifikanzschwellen. Schwellenwerte sollten so gewählt werden, dass etwa 300–1.000 Gene für den Aufbau eines nachgelagerten Netzwerks entstehen.
      HINWEIS: Quellgene sind der Ort, an dem der Informationsfluss beginnt und sich im Netzwerk ausbreitet.
6. Baue für jeden Phänotyp ein kantengewichtetes Netzwerk (EWN)
   HINWEIS: Für diesen Schritt sind folgende Eingaben erforderlich: die normierte Genexpressionsmatrix, die in den Schritten 1.1–1.4 entwickelt wurde; ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI), formatiert als Randliste (GenA-GenB-Paare); eine Beispielannotationsdatei (Metadaten), die biologische Zustandslabels für jede Probe angibt. Das PPI-Netzwerk wird als R-Objekt geteilt und wurde auf Basis der iRefIndex-Proteindatenbank konstruiert. Die in diesem Protokoll verwendete Version umfasst alle direkten Interaktionen, aber Selbstschleifen und mehrere Kanten wurden ausgeschlossen. Das PPI-Netzwerk enthält 15.608 Proteine und 180.044 Wechselwirkungen. Weitere Details finden Sie im Abschnitt⁴ zu NetDecoder-Methods.
   1. Öffnen Sie das NetDecoder Edge Weighted Network (EWN)-Skript (HuLiLab/NetDecoder_Example/input/NetDecoder_Create_EWN. R, zugänglich über https:/github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main)⁴, in einer R-Entwicklungsplattform.
   2. Bearbeiten Sie die durch Kommentare angezeigten Skriptabschnitte (und unten kursiv verzeichnet), um benutzerspezifische Pfade und Eingabedateien für die EWN-Entwicklung festzulegen.
      Pfad<~/NetDecoder_Example/input/
      Dies ist der Pfad zum Arbeitsverzeichnis
      expQuery <- get(load("expBreastCancer_15Set2014.R"))
      Dies ist ein Beispiel für ein normalisiertes Expressionsmatrix-Objekt Rdata.
      stQuery < read.csv("stBreastCancer.csv")
      Dies ist die Beispielmetadaten
   3. Filtere die Expressionsmatrix so, dass nur Gene im PPI-Netzwerk erhalten bleiben.
   4. Für jede Bedingung werden Stichproben nach Phänotyp unterordnet und paarweise Gen-Gen-Korrelationen über alle im PPI-Netzwerk definierten Kanten mittels Pearson-Korrelation berechnet. Berechnen Sie die Korrelationen mit der in Schritt 1.4 erzeugten prozessierten, normalisierten Ausdrucksmatrix.
   5. Für jedes Genpaar berechnen Sie den Korrelationskoeffizienten, die absolute Korrelation und den zugehörigen p-Wert.
   6. Entfernen Sie unvollständige Fälle (z. B. NA-Werte).
   7. Exportiere pro Bedingung ein kantengewichtetes Netzwerk als tab-deparierte Datei (ohne Header) mit folgenden Spalten: proteinA, proteinB, abs_cor, cor und pvalue.
   8. Führe das R-Skript aus, um Ko-Ausdrucksnetzwerke für alle relevanten Bedingungen zu erstellen.

2. Installation und Konfiguration von NetDecoder

1. NetDecoder herunterladen
   1. Greifen Sie auf die NetDecoder-Software unter (https://netdecoder.hulilab.org/#ver) zu, wählen Sie R oder Java.
2. Installation erforderlicher Software
   1. Installiere Oracle JDK und R für Arbeits- und Analyseumgebungen.
   2. Installieren Sie die erforderlichen R-Pakete, wie in der NetDecoder-Dokumentation aufgeführt, unter Verwendung von Bioconductor (https://netdecoder.hulilab.org/#ver)⁴.
3. Download-Abhängigkeiten
   1. Laden Sie die notwendigen Abhängigkeiten für NetDecoder herunter, darunter Genontologiedaten (zugänglich von https://geneontology.org/docs/download-ontology/) sowie den Genassoziationsreferenzführer (zugänglich von https://www.ebi.ac.uk/GOA/human_release).
4. Richte das Arbeitsverzeichnis ein
   1. Verschieben Sie alle heruntergeladenen Dateien (Expressionsdaten, generierte Koexpressionsnetzwerke für jede Bedingung, Genontologiedaten und Assoziationsreferenzleitfaden) in einen Ordner, der das Arbeitsverzeichnis NetDecoder ist.
5. Fügen Sie den benötigten Ordner hinzu
   1. Laden Sie den NetDecoder-Ordner (https://netdecoder.hulilab.org/wp-content/uploads/2025/07/NetDecoder_Example.zip) in das Arbeitsverzeichnis NetDecoder herunter.
   2. Entpacken Sie den NetDecoder-Ordner.

3. Ausführen von NetDecoder

1. Öffne das Analyse-Bash-Skript
   1. Öffnen Sie ein Terminal, das GNU Bash ausführt, und navigieren Sie zum Arbeitsverzeichnis NetDecoder.
   2. Führe den Befehl nano NetDecoder_Analysis.sh aus, um das Bash-Skript zu öffnen.
2. Ändern Sie die Skripte
   HINWEIS: Der Großteil des Codes ist bereits geschrieben. In diesem Schritt werden die erforderlichen Parameter im Skript an den angegebenen Stellen angegeben.
   1. Machen Sie einen kurzen Namen:
      Bearbeite den kursivgedruckten Teil zu den zu vergleichenden Bedingungen: myshortname='Your_shortname_here'
   2. Setze Softwarepfade:
      Bearbeiten Sie die folgenden drei Pfaddefinitionen zu den richtigen Pfaden, indem Sie die kursiv geschriebenen Abschnitte bearbeiten:
      JAVA="/dein/Weg/hier"
      exportieren R="/Dein/Weg/hier"
      Alias R="/dein/Weg/hier"
   3. Arbeitsverzeichnis einstellen:
      Bearbeiten Sie den kursivgedruckten Teil so, dass er das Arbeitsverzeichnis ist, aus dem alle Dateien abgerufen werden: INPUT_DIR="/your/path/here"
   4. Setze die NetDecoder-Bibliothek ein:
      Bearbeiten Sie den kursivgedruckten Teil so, dass er der Pfad zur NetDecoder-Bibliothek ist, die in Schritt 2.4 aus der ZIP-Datei installiert wurde: LIB_DIR="/your/path/here/netdecoder_lib"
   5. Set-Genontologie und Assoziationspfade:
      Bearbeiten Sie die folgenden kursivgedruckten Abschnitte der beiden Verzeichnisse zu den Standorten der bevorzugten Genontologie-/Assoziationsdateien.
      SYMBOL=$LIB_DIR/gene_association_file
      GO=$INPUT_DIR/gene_ontology_file
   6. Setze Eingabeargumente:
      Aktualisieren Sie die kursiv geschriebenen Teile der folgenden fünf Zeilen gemäß den Daten, gemäß den kommentierten Anweisungen im Referenzskript NetDecoder.
      geneList=$INPUT_DIR/gene_file
      state_trt=Behandelte Erkrankung
      state_ref=Referenzbedingung
      PPI_trt=$INPUT_DIR/treated_co_expression_network_file
      PPI_ref=$INPUT_DIR/referenz_co_expression_network_file
   7. Setzen Sie die richtige Bühne:
      Entkommentieren (durch Entfernen des #-Symbols) die gewünschte Ausführungsphase und kommentieren Sie sie erneut, sobald die Stufe abgeschlossen ist. Stufe eins ist gen_net_trt, gefolgt von gen_net_ref, dann die Analysephase und schließlich die Sammelphase.
      Stellen Sie die gewünschte Phase zur Ausführung ein, beginnend mit Stufe eins.
      #STAGE="gen_net_trt"
      #STAGE="gen_net_ref"
      #STAGE="Analyse"
      #STAGE="sammeln"
   8. Navigiere zum Haupt-Bash-Terminal:
      Drücke Strg+X, dann Y, um das Bash-Skript zu speichern und zu beenden.
3. NetDecoder ausführen
   HINWEIS: Wenn es erfolgreich läuft, erscheinen Protokollmeldungen im Terminal.
   1. Navigiere zum Terminal und führe ./NetDecoder_Analysis.sh aus.
   2. Führen Sie die Stufen in der in Schritt 3.2.7 aufgeführten Reihenfolge aus, bis alle vier einzeln abgeschlossen sind.
4. Ergebnisse abrufen
   1. Navigiere zu den Ausgabedateien und grafischen Zusammenfassungen.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1 dargestellt, arbeitet NetDecoder über einen strukturierten Workflow, der aus Datenverarbeitung, Netzwerkkonfiguration und flussbasierter Analyse besteht, wobei die Ausgaben in separate Verzeichnisse organisiert sind, die zu jeder Phase der Pipeline gehören. Diese modulare Struktur ermöglicht eine systematische Validierung der Ergebnisse, sodass die Ergebnisse auf jeden Berechnungsschritt zurückverfolgt werden können und die Gesamtreproduzierbarkeit unterstützt wird.

Eine erfolgreiche Ausführung des NetDecoders (Abbildung 2) liefert Ausgaben über vier Verzeichnisse (Analyse, Collect, Netzwerke und "your_shortname") mit Daten, die verschiedenen Bedingungen entsprechen, einschließlich Abbildungen und quantitativen Ausgaben für Flusswerte, Subnetze und andere Flussinteraktionsausgaben (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3). Das Vorhandensein von ausgefüllten Dateien und Figuren in diesen Verzeichnissen deutet darauf hin, dass die Pipeline ordnungsgemäß ausgeführt wurde. Im Gegensatz dazu sind fehlgeschlagene Durchläufe durch fehlende Ausgaben und/oder unvollständige Zahlen gekennzeichnet. Da NetDecoder Tausende von Genen innerhalb eines PPI-Netzwerks auswertet, erfordern erfolgreiche Durchläufe typischerweise mehrere Stunden Berechnung, abhängig von der Größe des Datensatzes und den verfügbaren Ressourcen. Für die hier dargestellte repräsentative Analyse des menschlichen Gallenwegskrebses erforderte die Ausführung von NetDecoder eine Laufzeit von etwa 4–6 Stunden auf der Linux-basierten Puget3 (Puget Systems) Workstation. Ungewöhnlich kurze Laufzeiten können auf falsch formatierte Eingabedaten oder unvollständige Pipeline-Ausführung hinweisen. Falsch formatierte Eingabedaten oder fehlgeschlagene Pipeline-Ausführung können zu Fehlermeldungen führen, die auf die Ursache des Problems zurückverfolgt werden können. Abbildung 3 zeigt repräsentative Ausgaben, die nach erfolgreicher Ausführung des NetDecoders vorhanden sind. Die hier präsentierte repräsentative Analyse nutzte RNA-Sequenzierungsdaten aus 255 Proben von Gallenbahnskrebs (OEP001105)⁶, was den Vergleich von Krankheitszuständen Stadium I–II und Stadium III–IV sowie den veränderten Informationsfluss zwischen den Zuständen ermöglichte.

Die drei Heatmaps in Abbildung 4 fassen die Gesamtveränderungen des Netzwerkinformationsflusses zwischen Genen unter Bedingungen zusammen, einschließlich Router-Genen, die einen erheblichen Informationsfluss im Netzwerk übertragen, wichtige nachgelagerte Zielgene oder stark betroffene Gesamtgene. Eine breite Verteilung sowohl positiver als auch negativer Differenzfluss zeigt an, dass Informationen im gesamten Netzwerk umverteilt werden, anstatt gleichmäßig zu erhöhen oder zu verringern. Diese Heterogenität und Vielfalt der Gentypen unterstützen NetDecoders Fähigkeit, Gene mit veränderter funktioneller Bedeutung zwischen Phänotypen zu identifizieren.

Abbildung 4 zeigt außerdem Kanten-Level-Balkendiagramme, die Flussänderungen für individuelle Gen-Gen-Paare-Interaktionen über Bedingungen hinweg quantifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Fluss durch bestimmte Interaktionen je nach Zustand variieren kann, was kontextabhängige Netzwerk-Neuverdrahtung widerspiegelt. So erfasst der Randfluss Veränderungen auf Interaktionsebene im Informationstransfer, während der differenzielle Fluss eine Zusammenfassung dieser Veränderungen auf Knotenebene liefert, was die Priorisierung von Genen mit der größten Gesamtverschiebung im Netzwerkeinfluss ermöglicht.

Zusammen zeigen diese Ausgaben, dass NetDecoder Gen- (Knotenebene), Gen-Gen (Randebene) und Netzwerkebene Veränderungen im Informationsfluss innerhalb biologischer Netzwerke erfasst (Abbildung 4). Die Heatmaps identifizieren Gene mit veränderter Informationsverbreitung, Routing und Empfang im Netzwerk, während Edge-Level-Analysen die spezifischen Interaktionen aufzeigen, die diese Veränderungen vorantreiben. Die phänotypspezifischen Informationsnetzwerke bieten eine visuelle Darstellung der Netzwerkverdrahtung zwischen den Bedingungen, wobei Knoten Gene repräsentieren und die Kantendicke der Informationsflussstärke entspricht (Abbildung 4). Diese systembezogene Repräsentation unterstützt die Identifikation wichtiger regulatorischer Gene und Signalwege, die mit den untersuchten Bedingungen verbunden sind. Darüber hinaus zeigt die erfolgreiche Produktion dieser Figuren, dass NetDecoder korrekt ausgeführt wurde.

Da NetDecoder eine große Anzahl von Ausgabedateien erzeugt, ist es für die Interpretation unerlässlich, die relevantesten Ergebnisse zu identifizieren. Beispielsweise können zur Untersuchung von Flussunterschieden zwischen Bedingungen (z. B. niedrige Stufe vs. Hochstufe) zwei Schlüsseldateien verwendet werden (Navigationsschritte werden von der Dateistruktur in Abbildung 3 geleitet). Die erste, "EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Krankheit.txt" (im Analyse-/Krankheitsverzeichnis ), identifiziert Wechselwirkungen (Kanten) mit den größten Veränderungen im Fluss zwischen den Bedingungen. Das zweite, "flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt" (im Verzeichnis "your_shortname", identifiziert Gene (Knoten) mit den größten Flussunterschieden. Zusammen bieten diese Dateien einen umfassenden Überblick über Veränderungen im Netzwerkverhalten auf Interaktions- und Genebene.

Allgemeiner enthält der Ordner "Analysis" Informationen über Netzwerkrouter, wichtige Ziele und wichtige Differentialfluss-Gene. Der Ordner "your_shortname" enthält Rohtextdateien mit phänotypspezifischen Daten, wie z. B. Gesamtflusswerte, Schlüsselziele und Router. Der Netzwerkordner enthält die von NetDecoder generierten Subnetzwerke, die in Cytoscape⁷ weiter analysiert und visualisiert werden können. Schließlich enthält der Ordner "collect" konsolidierte Daten und Zahlen, die eine allgemeine Zusammenfassung der Ergebnisse liefern. Weitere Visualisierungen und Analysen der NetDecoder-Ergebnisse können mit R-Paketen wie ggplot2, igraph, pheatmap usw. durchgeführt werden.

Abbildung 1: Darstellung der NetDecoder-Pipeline und der allgemeinen Funktionalität. NetDecoder benötigt drei allgemeine Schritte (gelbes Feld): Datenverarbeitung, NetDecoder-Konfiguration und Ausführung des NetDecoders. Jeder Schritt dieser Phasen muss genau befolgt werden, um erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten. NetDecoder benötigt Expressionsdaten aus zwei Bedingungen (Beispiele in Green Box), um vorherzusagen, welche Gene mit hohem Informationsfluss und Gen-Nutzen assoziiert sein könnten. In der Wasserhahn-Analogie werden die Genexpressionswerte durch die Größe des Wasserhahns illustriert, also wie weit er sich öffnen kann, während der Gennutzen oder die Aktivität den tatsächlichen Wasserfluss durch den Wasserhahn widerspiegelt und zeigt, wie stark dieser Weg funktional genutzt wird. Wie in der Abbildung gezeigt, kann ein hochexprimiertes Gen (große Wasserhahngröße) eine geringe Gennutzbarkeit (geringer Wasserfluss) haben, während ein Gen mit geringem Expressionsniveau (kleiner Wasserhahn) einen hohen Gennutzen (hoher Wasserfluss) haben kann. Dies zeigt, wie Gene in einem bestimmten Zustand eine höhere Gesamtprämianz haben können, selbst wenn das Expressionsniveau niedriger ist als das eines anderen Gens. Die Abbildung unten in der Mitte zeigt, wie Gene miteinander verbunden sein können und unterschiedliche Flussstufen (Farbe) erleben, unabhängig davon, wie stark sie exprimiert werden (Größe). Erstellt in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: NetDecoder Allgemeiner Arbeitsablauf. Das Kernprinzip des NetDecoder-Algorithmus besteht darin, den Gennutzen in einem Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) durch Informationsflussanalyse zu modellieren. Der Workflow beginnt mit der Datenvorverarbeitung und dem Aufbau von kantgewichteten Netzwerken (EWN). Genexpressionsdaten aus zwei biologischen Zuständen, Phänotyp 1 (P1) und Phänotyp 2 (P2), werden verarbeitet, um Quellgene entweder durch differentielle Expression oder Template-Matching zu identifizieren. Normalisierte Expressionsmatrizen werden dann verwendet, um zustandsspezifische EWNs zu erstellen, bei denen die Kantengewichte Genpaar-Beziehungen in jedem Phänotyp widerspiegeln. NetDecoder quantifiziert anschließend Unterschiede im Informationsfluss zwischen den Bedingungen und ermöglicht so die Identifikation von Netzwerk-Neuverdrahtungsereignissen und Veränderungen im Gen-Nutzen. Zu den Ergebnissen gehören differenzielle Informationsflusswerte, kontextspezifische Informationsnetzwerke, Impact-Score-Heatmaps sowie zusätzliche Netzwerk- und Genmetriken, die die nachgelagerte biologische Interpretation und mechanistische Entdeckungen erleichtern. Erstellt in BioRender. Correia, C. (2026) https://BioRender.com/29cmswf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: NetDecoder-Ausgaben und Ordnerstruktur. Dieses Diagramm stellt die Ausgabeverzeichnisstruktur dar, die zum Zugriff auf Ergebnisdateien zur Interpretation verwendet wird. In Kursivschrift werden Ordnernamen (auf den Ordnersymbolen) dargestellt, wobei die in Anführungszeichen spezifisch für die Analyse-Nomenklatur sind. Werte auf Posteingangs-Symbolen geben entweder Dateien oder Dateitypen an, abhängig von der Farbcodierung. Rot kennzeichnet die Dateitypen, die in jedem Ordner gefunden werden können, während Schlüsseldateien fett und unterstrichen (flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt und EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Krankheit.txt) dargestellt werden. Die Ordnersymbole stammen von icons8 (https://icons8.com). Erstellt in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Beispiel für von NetDecoder generierte Ergebnisse. Impact-Gene (A), Netzwerkrouter (B) und Key Targets (C) Heatmaps sowie kontextspezifische Netzwerke (D) und Edge-Flowbar-Graphen (E) sind Schlüsselausgaben von NetDecoder. In diesem Beispiel wurde ein Datensatz zur Expression von Gallenbahnkrebs (OEP001105) verwendet, um Patienten mit Erkrankungen im frühen Stadium (Stadien I-II, niedrig) und fortgeschrittenem Stadium (Stadium III-IV, hoch) zu vergleichen, und NetDecoder wurde eingesetzt, um Gene mit hoher differenzierter Information zwischen den beiden Gruppen zu identifizieren. Jede Fläche zeigt rot, was einen erhöhten Durchfluss anzeigt, und blau, was den Abfluss anzeigt. Netzwerkrouter (B) sind wichtige Zwischengene, durch die große Mengen an Durchfluss hindurchfließen (Collect/Disease_Network_routers.pdf), wichtige Ziele (C) wichtige nachgelagerte Regulatoren sind (Collect/Disease_Key_targets.pdf) und die Flow-Differenz-Wärmekarte die Gesamtänderung des Geninformationsflusses zwischen den Bedingungen (Analyse/flowDifference_heatmap.pdf) darstellt. Ein phänotypspezifisches Informationsnetzwerk (D) kann visualisiert werden, wobei jedes Gen einen Knoten repräsentiert und Gen-Gen-Interaktionen als Kanten (Linien) dargestellt werden (Analyse/EDGE_CENTERED_SUBNET_Disease). Die Kantendicke entspricht dem Ausmaß des Informationsflusses zwischen Genen. Das Balkendiagramm (E) zeigt Unterschiede im Kantenfluss über Gen-Gen-Interaktionen zwischen den beiden ausgewählten Phänotypen, wobei niedrige Stufenpaare in teal und hochstadiale Paare in Orange dargestellt sind (Analyse/Disease_keyEdges.pdf). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung von NetDecoder, einem netzwerkbiologischen Framework, das Genexpressionsdaten mit Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) integriert, um den bedingungsspezifischen Informationsfluss zu modellieren und Gene basierend auf ihrem funktionellen Einfluss innerhalb biologischer Systeme zu priorisieren. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methode hängt von mehreren kritischen Schritten, sorgfältigen methodologischen Entscheidungen und einer korrekten Interpretation der Ergebnisse ab.

Die Anfangsphasen des Protokolls umfassen das Abrufen von Ausdrucksdaten, die Erstellung von Metadaten und die Erstellung einer einheitlichen Ausdrucksmatrix. Diese Schritte sind entscheidend, um die Kompatibilität mit der Downstream-Analyse sicherzustellen. Die Expressionsmatrix muss mit Gene als Zeilen und Stichproben als Spalten formatiert sein, wobei die Stichprobennamen in der Matrix und die Metadatendatei identisch übereinstimmen. Jegliche Inkonsistenzen in diesem Stadium (z. B. nicht übereinstimmende Probenidentifikatoren oder duplizierte Gennamen) breiten sich durch die Pipeline aus und führen zu Ausfällen in späteren Schritten.

Das Filtern von minderwertigen Daten (z. B. Gene mit niedrigen Zahlen, fehlenden Werten oder Genen mit geringer Varianz) ist besonders wichtig, da diese Eigenschaften Rauschen in den korrelationsbasierten Netzwerkaufbau einführen können. Ein erfolgreicher Vorverarbeitungsschritt wird durch eine saubere Expressionsmatrix ohne fehlende Werte und durch konsistente Genidentifikatoren angezeigt, die mit denen im PPI-Netzwerk übereinstimmen.

Ein zentraler Entscheidungspunkt im Protokoll ist die Wahl zwischen differentieller Expressionsanalyse und Vorlagenabgleich zur Auswahl der Quellgene, die im Aufbau des Edge Weighted Network (EWN) verwendet werden. Die differentielle Expressionsanalyse ist am geeignetsten, wenn gut definierte experimentelle Gruppen mit ausreichenden Replikaten verglichen werden. Dieser Ansatz identifiziert Gene mit statistisch signifikanten Expressionsänderungen zwischen den Bedingungen und liefert quantitative Ergebnisse wie log2-fache Veränderung (log2FC) und angepasste p-Werte. Eine erfolgreiche Ausführung wird durch eine Verteilung sowohl signifikanter als auch nicht-signifikanter Gene angezeigt, anstatt durch einheitlich null Ergebnisse. Im Gegensatz dazu eignet sich das Template Matching besser, wenn das Ziel darin besteht, Gene mit Expressionsmustern zu identifizieren, die mit einem kontinuierlichen oder Referenzprofil korrelieren. Diese Methode behält Gene basierend auf der Korrelationsstärke und nicht auf dem Ausmaß der differentiellen Expression bei. Ein erfolgreicher Template-Matching-Schritt liefert eine Menge von Genen mit statistisch signifikanten Korrelationen zur Referenzbedingung. Die Wahl zwischen diesen Ansätzen beeinflusst die nachgelagerte Netzwerktopologie; Differentialexpression betont Größenänderungen, während Template-Matching koordinierte Ausdrucksmuster betont.

Der EWN-Bauschritt ist eine der wichtigsten Komponenten des Protokolls. Hier werden normalisierte Genexpressionsdaten mit einem PPI-Netzwerk integriert, um paarweise Gen-Gen-Korrelationen für alle im Netzwerk vorhandenen Interaktionen zu berechnen. Nur Gene, die zwischen dem Expressionsdatensatz und dem PPI-Netzwerk geteilt werden, bleiben erhalten, was biologische Relevanz und rechnerische Konsistenz gewährleistet. Für jede Bedingung werden Pearson-Korrelationskoeffizienten über alle Kanten berechnet, zusammen mit den entsprechenden p-Werten und absoluten Korrelationswerten. Diese Metriken definieren die von NetDecoder verwendeten Kantengewichte. Ein erfolgreicher EWN-Aufbau zeigt sich in Tausenden von Gen-Gen-Korrelationen, einer breiten Verteilung der Korrelationswerte und minimalen fehlenden Werten nach dem Filtern. Das Scheitern in diesem Stadium ist oft auf nicht übereinstimmende Genidentifizatoren, unzureichende Stichprobengröße oder falsch normalisierte Expressionsdaten zurückzuführen. Häufige NetDecoder-Fehlerpunkte können oft durch methodische Überprüfung von Eingabedateien und Softwarekonfigurationen behoben werden. Wenn NetDecoder unerwartet endet oder unvollständige Ausgaben erzeugt, müssen Nutzer überprüfen, ob die Stichprobenbezeichner zwischen Expressionsmatrizen und Metadatendateien identisch sind, ob Genidentifizéierungen zwischen Expressionsdatensätzen, Quellgenlisten und PPI-Netzwerken konsistent sind und dass die Expressionsmatrizen keine fehlenden Werte enthalten. Wenn Fehler oder getrunkene Ergebnisse auftreten, können Benutzer die Kompatibilitäten der Softwareinstallation und Version überprüfen, während der Ausführung generierte Log-Nachrichten inspizieren und den erfolgreichen Abschluss jedes Zwischenschritts bestätigen, bevor sie mit nachgelagerten Analysen fortfahren. Die Inspektion der Ausgabedateien und/oder Konsolenmeldungen kann helfen, die Quelle eines Fehlers zu lokalisieren, bevor weitere Analysen durchgeführt werden. NetDecoder erfordert eine sorgfältige Konfiguration von Dateipfaden, Eingabeargumenten und Abhängigkeiten. Wichtige Schritte umfassen die Spezifikation der Arbeitsverzeichnis- und Bibliothekspfade, Genontologie- und Annotationsdateien, bedingungsspezifische EWN-Eingaben sowie Quellgenlisten.

Da die Pipeline in Stufen ausgeführt wird (Netzwerkgenerierung beider Bedingungen, Analyse und Ergebniserfassung), verhindern Fehler in früheren Phasen den erfolgreichen Abschluss nachfolgender. Ein ordnungsgemäß funktionierender Lauf erzeugt vier Verzeichnisse (Analyse, Sammeln, Netzwerke, "your_shortname"), die jeweils bedingungsspezifische Ergebnisse enthalten. Ein weiterer praktischer Indikator für korrekte Ausführung ist die Laufzeit. Erfolgreiche Durchläufe benötigen typischerweise mehrere Stunden, da NetDecoder große Interaktionsnetzwerke auswertet; extrem kurze Laufzeiten deuten oft auf falsch konfigurierte Eingaben oder übersprungene Rechenschritte hin.

NetDecoder unterscheidet sich grundlegend von traditionellen Genpriorisierungs- und Netzwerkanalyseansätzen. Methoden wie die Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)⁸ clustern Gene basierend auf der Korrelationsstruktur, berücksichtigen jedoch keinen Richtungsfluss und quantifizieren, wie Informationen sich durch ein Netzwerk ausbreiten. Ähnlich identifizieren Pathway-Anreicherungsanalysen⁹ funktionale Überrepräsentation, berücksichtigen jedoch nicht Dynamiken auf Interaktionsebene oder Veränderungen der Netzwerkkonnektivität.

NetDecoder verwendet einen integrierten Ansatz, indem Genexpressionsdaten mit PPI-Netzwerken kombiniert werden, um den condition-spezifischen Informationsfluss zu modellieren. Durch die Quantifizierung sowohl individueller Gen- (Knoten-)Scores als auch Wechselwirkungs- (Rand-)Flussänderungen erfasst sie, wie Netzwerkstruktur und Informationsrouten zwischen den Bedingungen neu verdrahtet werden. Dies ermöglicht die Identifikation von Genen, die möglicherweise keine starke differentielle Expression zeigen, aber dennoch eine zentrale Rolle bei der Vermittlung des Netzwerkverhaltens spielen, was mit dem Gen-Utility-Modell (GUM)⁵ übereinstimmt, das besagt, dass Gene mit hohem differenziellem Informationsfluss die bedingungsspezifische Netzwerkfunktion steuern.

Trotz seiner Stärken hat NetDecoder mehrere Einschränkungen. Erstens handelt es sich um ein rechnergestütztes Rahmenwerk, das die Genbedeutung anhand modellierter Netzwerkinformationsfluss und nicht auf direkte experimentelle Evidenz^{schließt 10}. Daher sollten seine Vorhersagen als Hypothesen interpretiert werden, die durch biologische Experimente validiert werden müssen. Funktionale Validierungsansätze wie Gen-Knockout-Studien¹¹ oder gezielte Perturbationsassays¹² sind unerlässlich, um zu bestätigen, ob Gene, die von NetDecoder als hochnützlich identifiziert wurden, tatsächlich die untersuchten biologischen Prozesse oder Krankheitszustände beeinflussen. Zweitens hängt die Methode stark von der Qualität und Vollständigkeit des zugrundeliegenden PPI-Netzwerks ab. Da PPI-Datenbanken oft zugunsten gut erforschter Gene verzerrt sind, können weniger charakterisierte Interaktionen unterrepräsentiert sein, was die Entdeckung neuartiger regulatorischer Beziehungen einschränken könnte. Variabilität in Stichprobengröße, Versuchsdesign und Datenqualität kann ebenfalls den Netzwerkaufbau und die Downstream-Flussberechnungen beeinflussen. Drittens geht NetDecoder nicht davon aus, dass statische Kanten den dynamischen Informationsfluss vollständig erfassen. Stattdessen schließt NetDecoder kontextspezifische Aktivitäten ab und quantifiziert den Informationsfluss mithilfe eines PPI-Netzwerks als strukturellen Prior, das als Gerüst dient, um den Raum der biologisch plausiblen Wechselwirkungen zu definieren. Dynamisches Verhalten wird dann eingeführt, indem zustandsspezifische molekulare Daten (z. B. Genexpression) überlagert werden, wodurch Teilmengen des Netzwerks auf kontextabhängige Weise neu gewichtet oder aktiviert werden.

Das Hauptziel von NetDecoder ist es, die Informationsausbreitung über ein statisches PPI-Gerüst zu modellieren und gleichzeitig quantitative und kontinuierliche Beziehungen zwischen Genen (Knoten) zu erhalten. Im Gegensatz dazu bieten Ansätze wie boolesche Netzwerke eine vereinfachte und interpretierbare Darstellung der Dynamik, indem sie die Proteinaktivität als diskrete Ein/Aus-Zustände modellieren, die durch logische Wechselwirkungen gesteuert^{werden 13}. Diese Ansätze wurden häufig verwendet, um Genregulations- und Signalisierungsnetzwerke unter unterschiedlichen Bedingungen zu untersuchen 14,15,16. Sie erfordern jedoch typischerweise vordefinierte logische Regeln und die Diskretisierung von Proteinzuständen, was für große, heterogene biologische PPI-Netzwerke schwer in großem Maßstab zu definieren sein^{kann 17}. In diesem Zusammenhang stellt Boolesche Netzwerkmodellierung eine ergänzende Richtung zu NetDecoder dar. Während NetDecoder kontinuierlichen, quantitativen Informationsfluss erfasst, könnte die Integration logischer, regelbasierter Dynamiken oder hybrider diskret-kontinuierlicher Modelle die Interpretierbarkeit von condition-spezifischen Signalverhalten verbessern. Die Entwicklung von Boolesche Informationsflussalgorithmen stellt daher einen vielversprechenden Weg für zukünftige Arbeit dar.

Zukünftige Ausrichtungen für NetDecoder umfassen die Integration mit zusätzlichen Omic-Datentypen und die Erweiterung auf Einzelzell-Transkriptomik, um Auflösung und biologischen Kontext zu verbessern. Beispielsweise zielen Deep-Learning-basierte Ansätze zur räumlichen Transkriptom-Expressionsvorhersage und -imputation darauf ab, die Datenqualität und Signalwiederherstellung zu verbessern, modellieren jedoch den Informationsfluss zwischen Interaktionsnetzwerken^{nicht explizit 18,19}. Die Einbeziehung von multi-omischen Analysestufen könnte sowohl die Vorhersagekraft weiter steigern als auch zu zuverlässigeren Ergebnissen führen. Mit fortgesetzter methodischer Entwicklung wird NetDecoder in der Lage sein, mehrere Informationsflussebenen zu erzeugen und Forschern eine multi-omische Validierung ihrer relevanten Daten zu bieten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AnnotationDbi	Bioconductor	version 1.68.0	Annotation und Gen-Mapping
Bioconductor	Bioconductor	version 3.19	Framework für die Analyse transkriptomischer Daten und Paket-Ökosystem, das DESeq2, edgeR, limma, AnnotationDbi und Organismus-Datenbanken usw. unterstützt.
Cytoscape	The Cytoscape Consortium	version 3.10.4	Netzwerkvisualisierung und -analyse
DESeq2	Bioconductor	version 1.46.0	Differenzielle Expressionsanalyse (mit negativer binomialer Modellierung)
dplyr	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 1.1.4	Datenmanipulation und -transformation
edgeR	Bioconductor	version 4.4.2	Count-basierte differenzielle Expressionsanalyse
ggplot2	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 4.0.0	Datenvisualisierung und Plotting
GNU Bash	GNU Project	System default	Bash, Ausführung von NetDecoder-Pipeline-Skripten
igraph	igraph Development Team	version 2.1.4	Netzwerkkonstruktion und Graphenanalyse
Limma	Bioconductor	version 3.62.2	Lineare Modellierung für die Genexpressionsanalyse
NetDecoder	Hu Li Laboratory, Mayo Clinic	(2024 Hu Li Lab)	Aufbau kontextspezifischer Protein-Interaktionsnetzwerke durch Informationsflussmodellierung
org.Hs.eg.db	Bioconductor	version 3.20.0	Datenbank für die Annotation menschlicher Gene
Oracle JDK	Oracle Corporation	≥ version 1.8	Laufzeitumgebung für die Ausführung von NetDecoder
pheatmap	Raivo Kolde	version 1.0.13	Visualisierung von Expression und Korrelationsstruktur
R	The R Foundation	version 4.4.2	Kernumgebung für die Transkriptom- und Netzwerkanalyse