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Methodenartikel

Computergestütztes Protokoll zur Quantifizierung artesunatassoziierter transkriptomischer Verschiebungen im experimentellen Gehirngewebe der Gehirnmalaria mit DESeq2

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DOI:

10.3791/70870

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31. Juli 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Experimentelle zerebrale Malaria (ECM) verursacht Neuroentzündungen und eine Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke. Mit Hilfe GSE162535 vergleicht dieser reproduzierbare R-basierte RNA-Seq-Workflow Kontroll- (CB), ECM (MB) und artesunatbehandelte (AB) Gehirne und führt QC-, PCA- und DESeq2-Analysen durch. Es identifiziert ECM-gesteuerte transkriptionelle Veränderungen und bewertet artesunat-vermittelte Modulation von Entzündungs- und neurovaskulären Bahnen.

Zusammenfassung

RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wird weit verbreitet verwendet, um krankheitsassoziierte transkriptionsprogramme zu definieren, aber es sind konsistente, durchgängige Arbeitsabläufe erforderlich, um reproduzierbare Vergleiche zwischen experimentellen Gruppen sicherzustellen und biologisch interpretierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Hier wird ein vollständiges RNA-Seq-Analyseprotokoll zur Bewertung der Hirntranskriptom-Veränderungen bei experimenteller zerebraler Malaria (ECM) und zur anschließenden Artesunatbehandlung anhand des öffentlichen Datensatzes GSE162535 präsentiert. Der Workflow analysiert drei Gruppen – Kontrollgehirn (CB), ECM-Gehirn (MB) und artesunatbehandeltes ECM-Gehirn (AB) – ausgehend von einer HTSeq-Count-Matrix. Nach dem Import und Formatieren der Rohzählungen erstellt das Protokoll einen DESeq2-Datensatz mit CB als Referenzniveau, filtert Gene mit niedriger Anzahl und führt Qualitätskontrolle mittels Bibliotheksgrößenvisualisierung, Hauptkomponentenanalyse und Sample-Distance-Clustering durch. Die differentielle Expression wird dann für drei primäre Kontraste berechnet (MB vs CB, AB vs MB, AB vs CB), wobei log2-fache Änderungsschrumpfung zur stabilen Effektgrößenschätzung angewendet wird. Das Protokoll exportiert vollständige und signifikante Tabellen zur differentiellen Expression, erstellt Vulkandiagramme und MA-Diagramme und erstellt Heatmaps der variablesten Gene und der höchstplatzierten differenziell exprimierten Gene pro Kontrast. Zur Unterstützung der mechanistischen Interpretation beinhaltet der Arbeitsablauf gezielte Immunmarker-Extraktion (z. B. Zytokine, Chemokine, mikrogliale Aktivierungsmarker, BBB/Endothel-Gene) und führt Genontologie- und KEGG-Anreicherungsanalysen für deutlich hoch- und abregulierte Gensets durch. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Vorlage zur Charakterisierung von ECM-assoziierten neuroinflammatorischen Transkriptionsprogrammen und zur Quantifizierung artesunatassoziierter Modulation dieser Signaturen.

Einleitung

Die zerebrale Malaria (CM) ist eine lebensbedrohliche neurologische Komplikation der Plasmodium falciparum-Infektion und trägt trotz Fortschritten im Fallmanagement weiterhin maßgeblich zur Malariasterblichkeit bei. CM ist gekennzeichnet durch akute Enzephalopathie, mikrovaskuläre Dysfunktion, Endothelaktivierung und Störung der Blut-Hirn-Schranke (BBB), mit nachgeschalteten Neuroentzündungen, die ein Koma verursachen können, und bei Überlebenden anhaltende neurokognitive Folgen1. Die Pathogenese der CM ist multifaktoriell und beinhaltet entzündliche Reaktionen des Wirts, die mit parasiten- und wirtsabgeleiteten Faktoren an der neurovaskulären Grenzfläche interagieren, was es schwierig macht, kausale Mechanismen allein aus klinischen Endpunktenabzuleiten 1.

Experimentelle Modelle der zerebralen Malaria (ECM), insbesondere die Plasmodium berghei ANKA-Infektion bei C57BL/6-Mäusen, bieten eine handhabbare Plattform, um hirnspezifische Immunpathologie, BBB-Verletzungen und neuroinflammatorische Signalgebung in einer kontrollierten Umgebungzu untersuchen 2,3. Diese Modelle wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Reaktionen über Krankheitsstadien hinweg zu kartieren und ergänzende Interventionen in vivo 2,3 zu testen. Die ECM-Pathobiologie ist jedoch komplex und hochdynamisch, und gezielte Tests können koordinierte Verschiebungen auf Signalbahnebene übersehen, die in mehreren Immun- und neurovaskulären Programmen auftreten.

Artesunate ist die empfohlene Erstlinien-Parenteraltherapie bei schwerer Malaria und hat im Vergleich zu Chinin auf wichtigen Evidenzgrundlagen einen erheblichen Überlebensvorteil gezeigt4. Obwohl eine schnelle Parasitenbeseitigung zentral für die artesunate Wirksamkeit ist, spiegeln neurologische Ergebnisse wahrscheinlich sowohl die Parasitenreduktion als auch die sekundäre Modulation der entzündlichen und neurovaskulären Bahnenwider 1,4. Das Verständnis, wie die Artemisinin-Behandlung Gehirntranskriptionsprogramme während ECM umgestaltet, kann daher mechanistische Einblicke liefern, die klinische Wirksamkeitsdaten ergänzen und potenzielle Wege für adjunktive neuroprotektive Strategien identifizieren können.

RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene, genomweite Profilierung transkriptioneller Antworten in Krankheits- und Behandlungszuständen und unterstützt so differenzielle Expressionsanalysen und nachgelagerte funktionelle Interpretationen. Öffentliche Archive wie der NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) stellen kuratierte Datensätze bereit, die für reproduzierbare Neuanalysen geeignet sind, einschließlich GSE162535, das RNA-seq aus Kontrollgehirn (CB), ECM-Gehirne (MB) und artesunatbehandelte ECM-Gehirne (AB)5 enthält. Um reproduzierbare Entdeckungen aus solchen Datensätzen zu unterstützen, sind robuste statistische Rahmenwerke für zählerbasierte differentielle Expression erforderlich, und es werden Anreicherungswerkzeuge benötigt, um Gen-Ebenen-Veränderungen in Bezug auf biologische Signalwege und Prozesse zu interpretieren.

Diese Studie präsentiert einen reproduzierbaren, End-to-End-RNA-Seq-Analyse-Workflow für Gehirngewebe über Kontrollgruppen (CB), experimentelle zerebrale Malaria (MB) und artesunatbehandelte (AB) Gruppen. Die Neuheit dieses Artikels liegt in seiner standardisierten, DESeq2-basierten Pipeline, die vordefinierte biologisch relevante Kontraste (MB vs. CB, AB vs MB und AB vs. CB), strenge Qualitätskontrollergebnisse (Bibliotheksgrößenbewertung, Hauptkomponentenanalyse und Sample-Distanz-Heatmaps) sowie integrierte Downstream-Interpretation durch Genontologie (GO) und KEGG-Signalanreicherung mit clusterProfiler 6,7 einbezieht. Darüber hinaus implementiert der Workflow eine strukturierte, auf Immunpanels basierende Interpretation, die eine systematische Charakterisierung neuroinflammatorer, immuner und neurovaskulärer transkriptioneller Antworten ermöglicht. Durch die Kombination statistischer Strenge, Transparenz und publikationsreifer Ergebnisse bietet dieses Protokoll einen robusten und wiederverwendbaren Rahmen zur Analyse der ECM-assoziierten transkriptomischen Dysregulation und zur Bewertung therapiegetriebener Modulation in präklinischen Malariastudien.

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Protokoll

Diese Studie nutzte öffentlich verfügbare RNA-Seq-Daten und beinhaltete keine neuen Human- oder Tierversuche. Daher waren keine ethische Genehmigung und informierte Einwilligung erforderlich (Materialtabelle).

1. Bereite die Rechenumgebung und Ordnerstruktur vor.

  1. Einrichtung von Hardware und Betriebssystem
    1. Verwenden Sie eine Arbeitsstation oder einen Laptop mit mindestens 8 GB RAM (empfohlen werden 16 GB) und ≥10 GB freien Festplattenspeicher für Downloads und Ausgaben.
    2. Verwenden Sie Windows, macOS oder Linux mit Erlaubnis, um R-Pakete zu installieren und Dateien in das Arbeitsverzeichnis zu schreiben.
  2. Installation erforderlicher Software
    1. Installiere R (Version 4.2 oder neuer). Installiere RStudio Desktop (empfohlen), um den Workflow interaktiv auszuführen und das Projektverzeichnis zu verwalten.
  3. Erstelle ein Projektverzeichnis und Ausgabeordner
    1. Erstelle einen neuen Ordner für die Analyse (z. B. GSE162535_RNAseq_DESeq2). Setze diesen Ordner als Arbeitsverzeichnis R.
    2. Erstelle die Ausgabeordner genau wie folgt:
      1. Erschaffen Sie Ergebnisse/. Erstelle Ergebnisse/Fig/. Erstelle Ergebnisse/Tabellen/.
  4. Installieren Sie erforderliche R-Pakete
    1. Installiere CRAN-Pakete: tidyverse, pheatmap und RColorBrewer. Installiere Bioconductor-Pakete: DESeq2, apeglm (optional), clusterProfiler und org. Mm.eg.db.
    2. Laden Sie die erforderlichen Pakete zu Beginn des Skripts: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db und ggplot2. Setzen Sie einen Seed für die Reproduzierbarkeit, indem Sie set.seed(123) ausführen.
  5. Setzen Sie Datenschutz- und Datenschutzvorkehrungen an.
    1. Speichern heruntergeladene Dateien nur im Projektverzeichnis. Beschränken Sie den Zugriff auf das Projektverzeichnis, wenn die Umgebung sensible oder embargoierte Daten enthält. Speichern Sie Softwareversionen, indem Sie sessionInfo() am Ende des Workflows in Results/sessionInfo.txt exportieren.
      HINWEIS: Dieses Protokoll führt eine in silico-Analyse öffentlicher RNA-Seq-Zähldaten durch und beinhaltet keine Handhabung biologischer Proben.

2. Die RNA-Seq-Zählmatrix zu erhalten und die experimentellen Gruppen zu definieren

  1. Laden Sie die GEO-Datensatzdateien für GSE162535
    1. Laden Sie die HTSeq-Zähldatei für GSE162535 von GEO herunter und speichern Sie sie im Projektverzeichnis als GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. Überprüfe die Dateiintegrität, indem du mit gzfile() und read.delim() sicherstellst, dass die Datei fehlerfrei geöffnet wird.
  2. Lade die HTSeq-Zählungen in R
    1. Importiere die komprimierte Zähltabelle mit read.delim(gzfile(...), header = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). Inspize das importierte Objekt mit str(), head() und colnames(), um zu bestätigen, dass:
      1. Die erste Spalte enthält Genidentifikatoren (z. B. AccID). Die übrigen Spalten enthalten Stichproben-Level-Zählungen.
  3. Standardisieren Sie Datentypen und lösen Sie doppelte Genidentifikatoren auf
    1. Definiere Stichprobenspalten als alle Spalten außer der Gen-Identifikator-Spalte (AccID). Erzwingen Sie alle Stichprobenspalten zu ganzzahligen Zählungen. Kollabiere duplizierte Gen-Identifikatoren durch Summieren von Zählungen über Zeilen mit derselben AccID.
    2. Konvertiere die kollabierte Tabelle in einen Standard-Datenrahmen. Setze Zeilennamen auf die Genkennung und entferne die Identifikatorspalte aus der Zählmatrix.
  4. Verifizieren Sie die Struktur der Zählmatrix
    1. Bestätigen Sie, dass die Zählmatrix 12 Stichprobenspalten hat. Bestätigen Sie, dass die Beispiel-Spaltennamen dem Format AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 und MB_1.MB_4 folgen.
    2. Die Ausführung wird gestoppt, wenn die Zählmatrix keine 12 Spalten hat.
  5. Erstellen und validieren Sie Beispielmetadaten
    1. Erstellen Sie eine Beispiel-Metadatentabelle (colData), die die folgenden Spalten enthält:
      1. Stichprobe: eindeutige Stichprobenkennungen, die den Spaltennamen der Zählmatrix entsprechen. Gruppe: Biologischer Zustand, der jeder Probe zugewiesen ist.
    2. Holen Sie die entsprechenden Beispielannotationen für Datensätze GSE162535 aus dem Gene Expression Omnibus (GEO) ab.
    3. Verifizieren Sie jede Probenidentität anhand von GEO-Accessionsinformationen und Beispielannotationsfeldern, die den experimentellen Zustand beschreiben. Jede Stichprobenkennung in der Zählmatrix wird mit ihrer verifizierten GEO-Annotation zugeordnet.
    4. Jede verifizierte Probe wird einer der folgenden Gruppen zugeordnet: Kontrollgehirn (CB), experimentelles Gehirn für zerebrale Malaria (MB) oder mit Artesunat behandeltes experimentelles Gehirn für zerebrale Malaria (AB).
    5. Ordne die Metadatentabelle so an, dass die Stichprobenreihenfolge mit der Spaltenreihenfolge der Zählmatrix übereinstimmt.
    6. Vergleichen Sie die Stichprobenkennungen in der Metadatentabelle mit der Zählmatrix, um die Eins-zu-Eins-Entsprechung zu bestätigen. Kodieren Sie die Gruppenvariable als Faktor mit den Niveaus als CB, MB und AB.
    7. Setze CB als Referenzniveau, um die Kontroll-Gehirngruppe als Ausgangspunkt für die nachgelagerte differentielle Expressionsanalyse zu definieren.
    8. Setzen Sie die Zeilennamen der Metadatentabelle gleich den Stichprobenkennungen.
      HINWEIS:Gruppenlabels wurden nicht ausschließlich anhand der Reihenfolge der Proben in der Zählmatrix vergeben. Stichprobenidentitäten wurden unabhängig anhand von GEO-Metadaten und Zugangsinformationen überprüft, bevor sie mit der Ausrichtungsmatrix ausgerichtet wurden, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und das Risiko einer Fehlklassifikation der Stichproben zu verringern.

3. Erstellen Sie den DESeq2-Datensatz und führen Sie grundlegende Qualitätskontrolle durch

  1. Desinfiziere die Zählmatrix
    1. Ersetzen Sie fehlende Werte in der Zählmatrix durch Null. Bestätigen Sie das Fehlen fehlender Werte mithilfe spaltenweiser is.na()-Zusammenfassungen.
  2. Erstellen Sie den DESeq2-Datensatz
    1. Erstellen Sie ein DESeqDataSet mit DESeqDataSetFromMatrix() mit: countData = Counts; colData = sample_info; Design = ~ Gruppe.
  3. Filter-Gene mit niedriger Anzahl
    1. Entferne Gene mit Gesamtzählungen <10 über alle Proben hinweg mit dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. Erfassen Sie die Anzahl der erhaltenen Gene, indem Sie die Objektzusammenfassung ausdrucken.
  4. Bibliotheksgrößen bewerten
    1. Berechnen Sie die Bibliotheksgrößen als Spaltensummen der gefilterten Zählmatrix. Generiere ein Bibliotheks-großes Barplot und speichere es als Ergebnisse/Fig/library_sizes.pdf.
    2. Inspizieren Sie das Bibliotheksgrößendiagramm und bestätigen Sie, dass keine Probe eine extreme Sequenzierungstiefe aufweist, die nicht mit dem Studiendesign übereinstimmt.

4. DESeq2 ausführen und Transformationsobjekte für die Visualisierung generieren

  1. Passe auf das DESeq2-Modell
    1. Führen Sie differentielle Ausdrucksmodellierung mit dds <- DESeq(dds) aus. Behalte das angepasste DDS-Objekt für alle nachgelagerten Ergebnisextraktionen.
  2. Erstelle transformierte Ausdrucksmatrizen
    1. Berechnen Sie die regularisierte Log-Transformation mit rld <- rlog(dds, blind = FALSE). Berechnen Sie die varianzstabilisierende Transformation mit vsd <- vst(dds, blind = FALSE). Verwende RLD und VSD für PCA, Clustering und Heatmaps.
      HINWEIS: Verwenden Sie blind = FALSCH, um die gruppenabhängige Varianzstruktur zu erhalten.

5. Durchführung globaler Qualitätskontrolle mittels PCA und Clustering von Proben-zu-Proben-Distanz

  1. Erstelle der Hauptkomponentenanalyse (PCA)
    1. Berechnen Sie PCA mit plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE). Extrakt-Prozentvarianz erklärt für PC1 und PC2. Plott PC1 vs. PC2 mit ggplot2, kennzeichnet Punkte nach Probennamen und koloriert nach Gruppe.
    2. Speichere das PCA-Diagramm als Ergebnisse/Fig/PCA_samples.pdf. Bestätigen Sie, dass biologische Gruppen clustern und keine Probe als Ausreißer abgetrennt wird.
  2. Erzeugen Sie eine Sample-Entfernungs-Heatmap
    1. Berechnen Sie paarweise Stichprobendistanzen mit dist(t(assay(vsd)). Wandeln Sie das Distanzobjekt zur Visualisierung in eine Matrix um. Erstelle eine Spaltenannotationstabelle, die den Gruppenfaktor für jede Stichprobe enthält.
    2. Plotte die Distanzmatrix mit pheatmap() und speichere sie als results/fig/sample_distance_heatmap.pdf. Bestätigen Sie, dass die Proben hauptsächlich nach Gruppen gruppieren.

6. Berechnen Sie den Differentialausdruck für die drei Hauptkontraste

  1. Definieren Sie die Kontraste
    1. Definieren Sie den Krankheitseffekt als ECM vs. Kontrolle: MB vs. CB. Definieren Sie die Behandlungswirkung innerhalb der ECM als artesunat-behandelt vs. ECM: AB vs. MB. Definiere Behandlung vs. Baseline als artesunat-behandelte vs. Kontrolle: AB vs. CB.
  2. DESeq2-Ergebnisse mit log2-facher Änderungsschrumpfung extrahieren
    1. Extrahieren Sie für jeden Kontrast die Rohergebnisse mit Ergebnissen (dds, kontrast = c("Gruppe", GruppeA, GruppeB)). Verkleinern Sie log2-fache Veränderungen mit lfcShrink(dds, contrast = c("group", groupA, groupB), res = res, type = "normal").
    2. Konvertiere die Ergebnisse in einen Datenrahmen und speichere die Genidentifikatorin als Spalte mit dem Namen gene_id. Ordne die Ergebnisse nach nominalem p-Wert für stabile Berichterstattung.
    3. Speichere jede vollständige Ergebnistabelle in Ergebnisse/Tabellen/ als:
      1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
        HINWEIS: Wenn die Schrumpfung aufgrund der Paketkonfiguration fehlschlägt, wird erneut mit einem alternativen Schrumpftyp durchgeführt, der in der lokalen Installation unterstützt wird.
  3. Definiere Signifikanzschwellenwerte und exportiere signifikante Gensätze
    1. Definiere differenziell exprimierte Gene (DEGs) anhand von: angepasstem p-Wert (FDR) < 0,05 und absoluter log2-facher Änderung ≥ 1. Filtern Sie jeden Kontrast, um Gene mit fehlenden angepassten p-Werten auszuschließen.
    2. Exportiere bedeutende DEG-Tabellen zu: Ergebnisse/Tabellen/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, Ergebnisse/Tabellen/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, Ergebnisse/Tabellen/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
  4. Zusammenfassen Sie DEG-Zählungen pro Kontrast
    1. Berechnen Sie die Anzahl der signifikanten Gene pro Kontrast. Speichere die Zusammenfassungstabelle als Ergebnisse/Tabellen/DE_summary_counts.csv.

7. Erstellen Sie Vulkandiagramme für jeden Kontrast.

  1. Erstelle eine Vulkan-Plot-Funktion.
    1. Berechnen Sie -log10 (angepasster p-Wert) für jedes Gen. Klassifizieren Sie jedes Gen als Up, Down oder Nicht signifikant anhand der Schwellenwerte: FDR < 0,05 und |log2FC| ≥ 1.
    2. Plotte log2FC (x-Achse) vs -log10(FDR) (y-Achse) mit ggplot2. Füge gestrichelte Schwellenlinien bei log2FC = ±1 und -log10(0,05) hinzu.
  2. Export-Vulkan-Plots
    1. Speichere jede Grafik als PDF in Ergebnissen/Fig/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf.
      HINWEIS: Verwenden Sie konsistente Achsengrenzen über Kontraste hinweg, um den visuellen Vergleich zwischen den Figuren zu unterstützen.

8. Erzeugen Sie MA-Diagramme für jeden Kontrast

  1. Exportiere MA-Diagramme in ein einzelnes PDF.
    1. Öffne ein PDF-Gerät namens results/fig/MA_plots.pdf. Plote MA-Plots für jedes rohe DESeq2-Ergebnisobjekt mit PlotMA(). Beschrifte jedes Plot mit dem Kontrastnamen. Schließen Sie das PDF-Gerät.

9. Erzeugung von Expressions-Heatmaps für globale Variabilität und kontrastspezifische DE-Gene.

  1. Plotte die Gene der Topvariablen über alle Proben hinweg.
    1. Berechnen Sie die zeilenweise Varianz über Proben aus der VSD-Assay-Matrix. Wählen Sie die 100 variablesten Gene aus. Mittele jedes Gen über die Proben hinweg.
    2. Erstelle eine Heatmap mit pheatmap() und Beispielgruppenannotationen. Speichere die Abbildung als Ergebnisse/Fig/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
  2. Zeichnen Sie die obersten differenziell exprimierten Gene für jeden Kontrast auf.
    1. Wählen Sie die Top 50 Gene nach angepasstem p-Wert für jeden Kontrast aus. Extrahiere ihre VSD-Expressionsmatrix und das Mittelmittelzentrum nach Gen. Erstelle für jeden Kontrast eine Heatmap und speichere als:
    2. Ergebnisse/Figur/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, Ergebnisse/Fig/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, Ergebnisse/Fig/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
      HINWEIS: Erhöhe die PDF-Breite und -Höhe, wenn Zeilenbeschriftungen aktiviert sind.

10. Führen Sie gezielte Analyse des Immunmarkers durch.

  1. Fasse ausgewählte Immungene über Kontraste hinweg zusammen.
    1. Definiere einen Immunmarker-Satz: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21 und Icam1. Entnehmen Sie log2FC, p-Wert und angepassten p-Wert für diese Gene aus jeder Kontrastergebnistabelle.
    2. Kombinieren Sie die drei Kontrastzusammenfassungen nach Genidentifikator. Speichere die zusammengeführte Tabelle als Ergebnisse/Tabellen/immune_genes_summary.csv.
  2. Generiere eine Immunmarker-Heatmap (rlog).
    1. Identifizieren Sie Immungene, die in der transformierten Assay-Matrix vorhanden sind. Extrahiere die rlog-Expressionsmatrix für vorhandene Immungene.
    2. Mittelmittelmittel-Expression durch Gen. Erstelle und speichere die Heatmap auf Ergebnisse/Fig/heatmap_immune_genes.pdf.

11. Durchführung einer erweiterten Immunpanelanalyse nach funktioneller Kategorie

  1. Definiere Immunpanels.
    1. Definieren Sie Immunmarker-Panels nach Kategorien, einschließlich: Pro-inflammatorische Zytokine und Interferon-Response-Gene, anti-inflammatorische und regulatorische Gene, Chemokine, mikrogliale Aktivierungsmarker, Astrozytenmarker, BBB- und Endothelaktivierungsmarker, T-Zell- und Erschöpfungsmarker, Monozyten-/Makrophagenmarker, Komplement-Weg-Gene sowie Gene für oxidativen Stress und Zelltod.
  2. Extrahiere die Ergebnisse des Immunpanels (DE) für jedes Kontrastmittel.
    1. Erstellen Sie eine Mapping-Tabelle von Gensymbolen zu Immunkategorien. Filtern Sie jede Kontrastergebnistabelle auf die Gene des Immunpanels. Fügen Sie die Kategorienzuordnung jeder gefilterten Ergebnistabelle zu.
    2. Fügen Sie die drei kontrastspezifischen Immuntabellen zu einer einzigen Tabelle zusammen. Speichere die kombinierte Tabelle als Ergebnisse/Tabellen/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. Erstellen Sie eine klassifizierte Immunpanel-Expressions-Heatmap.
    3. Identifizieren Sie die Immunpanel-Gene, die in der RLD-Assay-Matrix vorhanden sind. Fügen Sie Kategoriebeschriftungen an Zeilennamen an, um die Panel-Klassifizierung in der Abbildung zu erhalten. Plotte die rlog-Heatmap mit Annotationen der Sample-Gruppen.
  3. Speichere die Ausgaben.
    1. Speichern als: results/fig/heatmap_immune_panels_all.pdf, results/fig/heatmap_immune_panels_all.png

12. Immun-Overlay-Vulkandiagramme erzeugen

  1. Erstellen Sie Vulkanplots mit Immunüberlagerungen.
    1. Markieren Sie Gene als immun oder nicht-immun, indem Sie das Immunpanel mit jeder Kontrastergebnistabelle verbinden. Plotte alle nicht-immunen Gene als graue Hintergrundpunkte. Im Vordergrund werden Immungene nach Immunkategorie gefärbt. Fügen Sie Schwellenlinien bei log2FC = ±1 und -log10(0,05) hinzu.
  2. Exportiere Immun-Overlay-Vulkanplots.
    1. Speichere MB vs. CB Immun-Overlay-Vulkanplots als:
      1. Ergebnisse/Fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
      2. Ergebnisse/Fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
    2. Speichere die AB- vs. MB-Immun-Overlay-Vulkandiagramme als:
      1. Ergebnisse/Fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
      2. Ergebnisse/Fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
        HINWEIS: Kuratierte Immungen-Panels wurden vordefiniert und in funktionelle Kategorien gruppiert; die vollständige Liste der Gensymbole mit Anmerkungen ist in der ergänzenden Tabelle S1 bereitgestellt. Diese Tabelle gewährleistet Transparenz und Reproduzierbarkeit und ermöglicht eine direkte Wiederverwendung und Validierung panelbasierter Analysen über Studien hinweg.

13. Durchführung von funktioneller Anreicherungsanalyse (GO und KEGG)

  1. Definiere Gensätze für die Anreicherung
    1. Für jeden Kontrast (MB vs. CB und AB vs. MB) werden signifikant differenziell exprimierte Gene (DEGs) unter Verwendung eines angepassten p-Schwellenwerts von < 0,05 und einer absoluten log₂-fachen Änderungsschwelle ≥ 1 extrahiert.
    2. Teile DEGs in hochregulierte Gene (log₂FC > 0) und herunterregulierte Gene (log₂FC < 0) auf.
  2. Definiere das Hintergrund-(Universum-)Genset
    1. Verwenden Sie alle nach der Zählfilterung erhaltenen Gene im DESeq2-Datensatz als Hintergrunduniversum. Extrahiere Gensymbole aus dem gefilterten DESeq2-Objekt. Konvertiere Hintergrundgensymbole mit der Bitr()-Funktion mit org in Entrez-Identifikatoren. Mm.eg.db.
      HINWEIS: Die Verwendung eines konsistenten Hintergrundgensets sorgt für unverzerrte Anreicherungsergebnisse.
  3. Kartengen-Identifizierer zur Anreicherung
    1. Konvertiere Gensymbole jeder DEG-Menge mithilfe von bitr() in Entrez-Identifikatoren. Behalten Sie nur erfolgreich kartierte Gene für die KEGG-Anreicherung. Überspringe die Anreicherungsanalyse für einen Gensatz, wenn keine Gene erfolgreich kartiert wurden.
      HINWEIS: Die Gen-Ontologie-(GO)-Anreicherung verwendet Gensymbole, während die KEGG-Anreicherung Entrez-Identifikatoren erfordert.
  4. Durchführung von Genontologie-(GO)-Anreicherung (biologischer Prozess)
    1. Führe GO-Anreicherung mit enrichGO() mit OrgDb = org aus. Mm.eg.db. Set keyType = "SYMBOL" und Ontologie (ont) = "BP". Spezifizieren Sie das Universum als alle gefilterten Gensymbole aus dem DESeq2-Datensatz.
    2. Verwenden Sie pAdjustMethod = "BH" für Mehrfachtestkorrekturen. Signifikanzschwellen pvalueCutoff = 0,05 und qvalueCutoff = 0,05 werden angewendet. Begrenze die Gensatzgrößen mit minGSSize = 10 und maxGSSize = 500.
    3. Exportiere die GO-Anreicherungsergebnisse in das Verzeichnis Ergebnisse/Tabellen. Generiere Barplots mit top-angereicherten GO-Begriffen und speichere sie auf Ergebnisse/Fig/.
  5. Durchführung der KEGG-Anreicherung des Signalwegs
    1. Führe die KEGG-Anreicherung mit enrichKEGG() mit organismus = "mmu" durch. Geben Sie Entrez-Identifikatoren von DEG-Mengen als Eingabegene an. Nutze den abgebildeten Entrez-Hintergrund als Universum.
    2. Apply pAdjustMethod = "BH". Signifikanzschwellenwerte pvalueCutoff = 0,05 und qvalueCutoff = 0,05. Begrenze die Gensatzgrößen mit minGSSize = 10 und maxGSSize = 500.
    3. Exportiere KEGG-Anreicherungstabellen in Ergebnisse/Tabellen/. Generiere Barplots mit angereicherten KEGG-Pfaden und speichere auf Ergebnisse/Fig/.
      HINWEIS: Die KEGG-Anreicherung liefert möglicherweise keine Ergebnisse, wenn Genkartierung unzureichend ist; solche Fälle werden ohne Unterbrechung des Arbeitsablaufs behandelt.

14. Durchführung einer reinen Immunanreicherungsanalyse (optionales Modul)

  1. Konstruiere immunspezifische Gensets
    1. Definieren Sie Immunpanel-Gene basierend auf kuratierten funktionellen Kategorien. Intersect DEG-Listen mit Immunpanel-Genen. Teile immunspezifische DEGs für jedes Kontrastmittel in upregulierte und downregulierte Sets auf.
  2. Führen Sie eine Anreicherung an immunspezifischen Gensätzen durch.
    1. Wenden Sie dieselben GO- und KEGG-Anreicherungsverfahren an, die in Abschnitt 13 beschrieben sind. Verwenden Sie identische Hintergrund-Universe- und Parametereinstellungen. Speichere Ausgaben mit Dateinamen, die das Label "immun" enthalten, um sie von globalen Anreicherungsergebnissen zu unterscheiden.

15. Anreicherungs-Punktdiagramme generieren (optionales Modul)

  1. Ergebnisse der Lastanreicherung.
    1. Importiere GO- oder KEGG-Anreicherungstabellen aus dem Verzeichnis Ergebnisse/Tabellen/.
  2. Transformieren Sie Anreicherungsmetriken.
    1. Konvertiere GeneRatio-Werte vom fraktionalen Format (x/y) in numerische Verhältnisse. Berechnen Sie −log₁₀(angepasste p-Werte) zur Visualisierung.
  3. Erstelle Punktdiagramme.
    1. Stellen Sie das Genverhältnis auf der x-Achse und die Beschreibungen angereicherter Terme auf der y-Achse dar. Skaliere die Punktgröße nach Genanzahl und Farbe mit −log₁₀ (angepasster p-Wert).
    2. Wählen Sie die besten angereicherten Begriffe basierend auf der angepassten p-Wert-Rangfolge aus. Speichere Punktdiagramme als PDF- und PNG-Dateien im Verzeichnis Ergebnisse/Fig/.

16. Sitzungsinformationen speichern und den Durchlauf abschließen

  1. Sitzungsinformationen exportieren.
    1. Gespeichert sessionInfo()-Ausgabe in Results/sessionInfo.txt zur Dokumentierung der R-Version und Paketversionen.
  2. Bestätigen Sie den erfolgreichen Abschluss
    1. Bestätigen Sie, dass der generierte Workflow: Figuren in Ergebnissen/Fig/, Tabellen in Ergebnisse/Tabellen/.
    2. Bestätigen Sie, dass die drei primären Kontrastausgänge existieren und nicht leer sind: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Datenqualitätsbewertung und globale transkriptomische Struktur

RNA-Seq-Daten aus 12 Gehirnproben (CB, MB, AB; n = 4 pro Gruppe) wurden mit dem standardisierten Workflow verarbeitet. Nach der Filterung von Genen mit niedriger Anzahl (≥10 Gesamtzählungen) wurde der Datensatz für nachgelagerte Analysen beibehalten. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) von rlog-transformierten Zählungen zeigte eine Trennung der Proben nach experimentellen Gruppen, wo...

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Diskussion

Diese Studie präsentiert einen reproduzierbaren, DESeq2-basierten Workflow zur Analyse von RNA-seq-Daten über vordefinierte biologische Kontraste. Das Protokoll integriert standardisierte Vorverarbeitung, verifizierte Metadatenzuweisung, Normalisierung, differentielle Ausdruckstests und strukturierte Downstream-Ausgaben, was eine konsistente und transparente Generierung transkriptomischer Ergebnisse ermöglicht. Durch explizite Definition von analytischen Schritten und Parametern ist der ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
clusterProfiler (R package)BioconductorRRID:SCR_016884Funktionale Anreicherungsanalyse (GO- und KEGG-Wege)
DESeq2 (R package)BioconductorRRID:SCR_015687Differenzielle Expressionsanalyse von Count-basierten RNA-Seq-Daten
ggplot2 (R package)CRANRRID:SCR_014601Visualisierung von PCA-Plots, Vulkan-Plots und Übersichtsfiguren
GitHub (optional)GitHub Inc.RRID:SCR_002630Versionskontrolle und Sharing von reproduzierbaren Skripten
HTSeq-count RNA-seq Datensatz (GSE162535)NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)RRID:SCR_005012Bulk RNA-Seq-Count-Matrix, die als Eingabe für die Analyse verwendet wird
matrixStats (R package)CRANRRID:SCR_016361Effiziente Berechnung von Zeilen-/Spaltenstatistiken (z. B. Varianz)
openxlsx (R package)CRANRRID:SCR_019215Export von Ergebnistabellen in Excel-Format
BetriebssystemMicrosoft / Apple / LinuxN/AWindows 10+, macOS oder Linux unterstützt
org.Mm.eg.db (R package)BioconductorRRID:SCR_002815Maus-Gen-Annotation-Datenbank für Gen-ID-Mapping
PDF-ViewerBeliebigerN/AAnzeige von Ausgabe-Figuren (PCA, Heatmaps, Vulkan-Plots)
Persönlicher Computer oder WorkstationBeliebigerN/AMindestens 16 GB RAM empfohlen für RNA-Seq-Analyse
pheatmap (R package)CRANRRID:SCR_016418Heatmap-Visualisierung der Genexpression und Clusterbildung
R Statistical Software (Version ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingRRID:SCR_001905Kern-Rechnungsumgebung für alle RNA-Seq-Analysen
RColorBrewer (R package)CRANRRID:SCR_015742Farbpaletten für Heatmaps und Plots
RStudio DesktopPosit SoftwareRRID:SCR_000432Integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) für Scripting und Reproduzierbarkeit
Stichprobenmetadatendatei (CSV-Format)Generiert / GEO-AnnotationenN/AKuraierte Stichproben-Annotation zur Verknüpfung von Stichproben mit CB-, MB- und AB-Gruppen
stringr (R package)CRANRRID:SCR_019195Stringverarbeitung für Anreicherungsvisualisierung und Formatierung
tibble (R package)CRANRRID:SCR_019186Datenrahmen-Handling und tidy Datenstrukturen
tidyverse (R package suite)CRANRRID:SCR_019186Datenmanipulation, Transformation und Visualisierung
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Referenzen

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Immunologie und InfektionAusgabe 233Ausgabe 233LeerwertAusgabeBulk-RNA-SequenzierungTranskriptomanalyseNeuroinflammationArtesunat-BehandlungDifferentielle GenexpressionProfiling von Immunpfaden

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